Information

Kann Taq-Polymerase anstelle von Polymerase Vent exo (-) verwendet werden?

Kann Taq-Polymerase anstelle von Polymerase Vent exo (-) verwendet werden?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Anstatt Polymerase Vent exo (-) zu verwenden, kann ich mit dem Üblichen gehen? Taq Polymerase?

Ändern sich die PCR-Bedingungen (die Temperatur und die Master-Mix-Konzentrationen) unter diesen beiden Bedingungen? Ändern sich die Primer (Sequenz und Konzentrationen), wenn wir vent exo anstelle von verwenden Taq Polymerase und umgekehrt? Wenn die Primer speziell für Vent exo (-) entwickelt wurden, wie kann ich die PCR-Bedingungen so ändern, dass ich die gleichen Primer (für Vent exo gedacht) verwenden kann? Taq Polymerase?


Ich habe selbst keine ARMS-PCR durchgeführt, daher basiert meine Antwort auf Theorie und es könnte andere praktische Faktoren geben, die ich übersehen habe.

Das charakteristische Merkmal der Vent-Exo(-)-Polymerase ist die fehlende Exonuklease-Aktivität im Vergleich zur regulären Vent-Polymerase. ARMS nutzt die Tatsache, dass eine Fehlpaarung an der 3'-Position eine Primer-Extension verhindert. Damit dies funktioniert, ist es wichtig, eine Polymerase ohne Exonuklease-Aktivität zu verwenden, da eine solche Polymerase die Fehlpaarung "reparieren" könnte und das gesamte Verfahren nicht funktionieren würde. Taq-Polymerase hat auch keine Exonuklease-Aktivität, daher sollten Sie sie theoretisch für dieses Experiment verwenden können.

Die Primer müssen für verschiedene Polymerasen nicht geändert werden, der Polymerasepuffer ist jedoch unterschiedlich und ich würde nicht empfehlen, den falschen zu verwenden.


Mit zwitterionischen Cy3- oder Cy5-Fluorophor-Analoga konjugierte dUTPs sind wirksame Substrate für die DNA-Amplifikation und Markierung durch Taq-Polymerase

Die Autoren möchten wissen, dass ihrer Meinung nach die ersten drei Autoren als gemeinsame Erstautoren anzusehen sind.

Olga A Zasedateleva, Vadim A Vasiliskov, Sergey A Surzhikov, Viktoriya E Kuznetsova, Valeriy E Shershov, Timur O Guseinov, Igor P Smirnov, Roman A Yurasov, Maksim A Spitsyn, Alexander V Chudinov, dUTPs konjugiert mit zwitterionischen Cyphor3 oder analogen Cy5 effektive Substrate für die DNA-Amplifikation und Markierung durch Taq-Polymerase, Nukleinsäureforschung, Band 46, Ausgabe 12, 6. Juli 2018, Seite e73, https://doi.org/10.1093/nar/gky247


ABSTRAKT

Wir synthetisierten C5-modifizierte Analoga von 2′-Desoxyuridintriphosphat und 2′-Desoxycytidintriphosphat und untersuchten sie als Substrate für PCRs mit Taq, Tth, Entlüftung (exo-), KOD Dash und KOD(exo-) Polymerasen und pUC 18-Plasmid-DNA als Matrize. Diese Assays wurden an zwei verschiedenen amplifizierenden Regionen von pUC18 mit unterschiedlichen T/C-Gehalten durchgeführt, von denen erwartet wird, dass sie relativ hohe Barrieren für den Einbau von entweder modifiziertem dU oder dC aufweisen. Auf der Grundlage von 260 verschiedenen Assays (26 modifizierte Triphosphate × 5 DNA-Polymerasen × 2 amplifizierende Regionen) scheint es, dass die Erzeugung des Volllängen-PCR-Produkts nicht nur von den chemischen Strukturen der Substitution und der Natur der Polymerase abhängt, sondern auch ob die Substitution auf dU oder dC erfolgt. Darüber hinaus beeinflusste die Matrizensequenz die Erzeugung des PCR-Produkts stark, abhängig von der Kombination der DNA-Polymerase und des modifizierten Triphosphats. Durch die Untersuchung von Primerverlängerungsreaktionen mit Primern und Templaten, die C5-modifizierte dUs enthalten, fanden wir, dass ein modifiziertes dU am 3′-Ende des Elongationsstrangs die katalytische Effizienz von DNA-Polymerasen stark beeinflusst, während ein modifiziertes dU gegenüber der Elongationsstelle am Template Strang hat einen geringeren Einfluss auf die katalytische Effizienz.


ERGEBNISSE

Die Polymerisation eines kurzen DNA-Abschnitts (Mikrogen) wurde erstmals beobachtet, als wir eine PCR mit einem Primer-Set von KY-794 und KY-795 durchführten (Abb. ​ (Abb.1 1 EIN) unter langen PCR-Bedingungen (24). Diese Primer bilden acht komplementäre Basenpaare in der 3′-Region und haben ein einzelnes zusätzliches Nukleotid am 3′-OH-Ende (von KY-795), das nicht mit KY-794 paart (Abb. ​ (Abb. 1 1 EIN). Diese Primer ergaben nach 35 PCR-Zyklen mit allen vier dNTPs und einem Enzymgemisch aus Taq und Pwo Polymerasen (ein ähnliches Ergebnis ist in Abb. ​ Abb.2 2 B). Die Größen dieser heterogenen DNA-Produkte reichten von � bp bis 㸒 kb, und erhöhte Zykluszahlen führten zur Produktion einer größeren DNA-Population (Daten nicht gezeigt). Wir interessierten uns für den Ursprung dieser heterogenen DNA-Moleküle und bestimmten die Nukleotidsequenzen, nachdem wir sie in einen Plasmidvektor kloniert hatten. Es wurde gezeigt, dass die klonierten Produkte Tandem-Wiederholungen eines kurzen DNA-Abschnitts umfassen (Abb. ​ (Abb. 1 1 EIN). Diese sich wiederholende 36-bp-Einheit ist ein Primer-Dimer-Produkt (25) von KY-794 und KY-795.

Kopf-an-Schwanz-Tandem wiederholt die Bildung in MPR. (EIN) Primer, die in MPR verwendet werden, Primer-Dimer und schematische Darstellung des Kopf-Schwanz-Tandem-Polymers des Primer-Dimers. Nicht übereinstimmendes Nukleotid am 3′-OH-Ende ist grün. (B) Ein Beispiel für ein Mikrogen-Polymer (pYT005). Eingefügte Nukleotide oder Deletion (Δ) an Verbindungspunkten einer Mikrogeneinheit sind rot markiert.

Auswirkungen der 3′-OH-Fehlpaarung und der 3′𠄵′ Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase auf die MPR. (EIN) Vier Sätze von Primern, die doppelte, einzelne, einzelne und keine 3′-OH-Mismatch-Nukleotid(e) aufweisen. Nicht übereinstimmende Nukleotide sind grün. (B) MPR-Produkt (10 μl) wurde durch ein 1,2% Agarosegel fraktioniert. Spur M, DNA-Größenmarker (1-Kb-DNA-Leiter Life Technologies, Gaithersburg, MD). Die Größen einiger Fragmente sind links angegeben (in Kilobasen). Es wurden 45 MPR-Zyklen durchgeführt, und die Annealing-Temperatur betrug 69ଌ. (C) Vent (wt) oder Vent (exo − ) DNA-Polymerase wurde anstelle der Expand . verwendet Taq Polymerase-Mischung wurden 45 Zyklen MPR durchgeführt und die Annealing-Temperatur betrug 69ଌ. (D) Ein Beispiel für ein Mikrogen-Polymer (pYT094), das aus KY-854 und KY-795 mit Vent (exo − ) DNA-Polymerase erstellt wurde. Löschungen (Δ) an Kreuzungen sind rot markiert. Nukleotide, die aus den 3′-OH-Fehlpaarungen stammen, sind grün markiert.

Die sich wiederholende Einheit polymerisierte, soweit untersucht, ausnahmslos Kopf-Schwanz-Weise und wurde von einer Insertion oder Deletion einiger Nukleotide an ihren Verbindungsstellen begleitet. In einem Beispiel (Abb. ​ (Abb.1 1 B) von sieben Verbindungen hatten vier Insertionen von einem oder vier Nukleotiden, zwei hatten eine einzelne Nukleotiddeletion und eine Verbindung hatte keine Insertion⿞letion. Obwohl ein Tetranukleotid CCGG häufig an Verbindungsstellen von vielen Klonen inseriert wurde, umfassten andere eingefügte Nukleotide ein einzelnes T oder C oder die Trinukleotide CGG, GCG und CCA (Daten nicht gezeigt). Diese Insertionssequenzen stammen möglicherweise nicht von den Primern, da das Tetranukleotid CCGG (oder sein Komplement GGCC) nicht in den Sequenzen dieser Primer enthalten ist.

Die Primer KY-794 und KY-795 wurden auf einem DNA-Synthesizer hergestellt und durch HPLC gereinigt. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die beobachtete Polymerbildung auf eine unerwartete Modifikation der Primer während der DNA-Synthese oder HPLC-Reinigung zurückzuführen ist, wurde ein weiterer Satz von Primern mit den gleichen Sequenzen wie KY-794 und KY-795 unter Verwendung eines anderen DNA-Synthesizers synthetisiert und anschließend gereinigt eine NAP-10-Gelfiltrationssäule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Diese neu synthetisierten Primer ergaben ähnliche Polymere eines Primer-Dimers (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die Polymerisation nicht auf eine abweichende Synthese oder unerwartete Modifikation der KY-794- und KY-795-Primer zurückzuführen war. Mit diesen Primern wurden unter den beschriebenen Bedingungen reproduzierbar Polymere eines Primer-Dimers erhalten, und wir nannten diese Reaktion die Mikrogen-Polymerisationsreaktion (MPR).

Faktoren, die die Polymerisationseffizienz bei der MPR beeinflussen.

Um Faktoren zu bestimmen, die eine effiziente Polymerisation von Primer-Dimeren in MPR mit KY-794 und KY-795 ergaben, führten wir die folgenden Experimente durch. Zuerst haben wir uns auf das einzelne zusätzliche Nukleotid am 3′-OH-Ende von KY-795 konzentriert, das nicht mit KY-794 paart (Abb. ​ (Abb.1 1 EIN). Um den Beitrag der Fehlpaarung an den 3′-OH-Enden von Primern auf MPR zu beurteilen, haben wir vier Primerpaare hergestellt, die an ihren 3′-OH-Termini doppelte, einzelne und keine Fehlpaarungspaare aufweisen (Abb. & #x200B (Abb.2 2 EIN). Nach 45 Zyklen MPR mit einer Mischung aus Taq und Pwo Polymerasen produzierte das Primerpaar mit doppelten Fehlpaarungen (KY-854𯞕) die diffuseste DNA-Verschmierung, während Primer, denen an ihren 3′-OH-Enden Fehlpaarungen fehlten (KY-803𯞃), unter diesen Bedingungen keine verschmierte DNA produzierten (Abb. ​ (Abb.2 2 B). Diese Ergebnisse zeigten, dass fehlgepaarte Basenpaare an den Primer 3′-OH-Termini ein notwendiger Faktor bei der MPR sind. Die Auswirkungen einer einzelnen Fehlpaarung waren von der Nukleotidsequenz des Primers abhängig. Eine einzelne Basenfehlpaarung am 3′-OH-Terminus von KY-795 führte zur Produktion von verschmierter DNA, während die Fehlpaarung an KY-854 unter ähnlichen Bedingungen kein Polymer produzierte. Die Faktoren, die diesen Unterschied verursacht haben, sind nicht bekannt.

Zweitens haben wir die Wirkung verschiedener Polymerasen auf die MPR getestet. Das in den ersten Experimenten verwendete lange PCR-Protokoll enthielt eine Mischung aus thermostabilen Taq und Pwo DNA-Polymerasen. Das erstere Enzym hat eine 5′𠄳′ Exonuklease-Aktivität in seiner N-terminalen Domäne (26), aber keine nachweisbare 3′𠄵′ Exonuklease-Aktivität (27), während das letztere, die archaeale DNA-Polymerase 3′𠄵& hat #x02032 Exonuklease-Aktivität, aber es wird angenommen, dass 5′𠄳′ Exonuklease-Aktivität fehlt (28). Da bei den Primern keine heterogene “smeared” DNA beobachtet wurde, Taq Polymerase unter Standard-PCR-Bedingungen verwendet wurde, kamen wir zu dem Schluss, dass die 3′𠄵′ Exonuklease-Aktivität der Pwo DNA-Polymerase war für MPR entscheidend. Mehrere 3′ Exonuklease plus Polymerasen und ihre Exonuklease minus Derivate sind im Handel erhältlich. Vent DNA Polymerase stammt aus dem hyperthermophilen Archaeenbakterium Thermococcus litoralis, und seine 3′-Exonuklease-defiziente Mutante Vent exo − wurde konstruiert (28). Als nächstes führten wir MPRs mit diesen Vent wt- und Vent exo-Polymerasen − anstelle einer Mischung von . durch Taq und Pwo Polymerasen mit den Primerpaaren KY-854𯞕 (doppelte Fehlpaarungen) oder KY-803𯞃 (keine Fehlpaarungen). Die MPR mit diesen Polymerasen ergab ähnliche Ergebnisse wie die MPR mit einer Mischung aus Taq und Pwo Polymerasen (Abb. ​ (Abb.2 2 C). Primer ohne Mismatch-Paare an den 3′-OH-Enden (KY-803𯞃) produzierten keine Polymere in Gegenwart oder Abwesenheit von 3′𠄵′ Exonuklease-Aktivität, was die Bedeutung des 3′-OH-Endes bestätigt Nichtübereinstimmung. Die Kombination von Primern mit doppelten Fehlpaarungen (KY-854𯞕) und Vent (exo + ) DNA-Polymerase führte zur reichlichen Produktion heterogener DNA, was darauf hindeutet, dass a Taq Polymerase mit 5′𠄳′ Exonuklease-Aktivität ist nicht unbedingt für die Polymerbildung erforderlich. Ein unerwartetes Ergebnis war die Produktion von Polymeren aus der Kombination von Primern mit doppelten Fehlpaarungen (KY-854𯞕) und Vent (exo − ) DNA-Polymerase, obwohl die Produktmenge viel geringer war als bei der Vent wt Polymerase. Da Primerdimere durch Verlängerung eines Primers unter Verwendung des anderen Primers als Matrize (25) gebildet werden, sollten die fehlgepaarten 3′ Enden von KY-854𯞕 durch die 3′𠄵′ Exonuklease-Aktivität vor der Kettenverlängerung entfernt werden. Wir interessierten uns für die Struktur heterologer DNA-Produkte aus MPR mit KY-854𯞕 und Vent (exo − ) und bestimmten deren Nukleotidsequenzen. Die Polymere wurden im Wesentlichen aus Sequenzen hergestellt, die von zwei Primern abgeleitet waren (KY-854𯞕), es waren jedoch zusätzliche Sequenzunregelmäßigkeiten vorhanden (ein Beispiel ist in Abb. ​ Abb.2 2 . gezeigt). D). In diesen Fällen waren Primer-Dimere nicht notwendigerweise sich wiederholende Einheiten, sondern stattdessen wurden verschiedene kürzere Sequenzen, die mit dem Primer-Dimer verwandt waren, zufällig verbunden. In einigen Fällen wurden in der Sequenz Nukleotidsequenzen beobachtet, die von den 3′ Enden von zwei Primern stammten, was darauf hindeutet, dass die abweichende Kettenverlängerung in MRP aufgetreten war. In einigen Verbindungsstellen schien sich ein Primer direkt mit sich selbst oder einem Primer-Dimer zu verbinden.

Aus den obigen Ergebnissen schlossen wir, dass die Faktoren, die die Effizienz der MPR erhöhen, (ich) das Vorhandensein fehlgepaarter Nukleotide an den 3′-OH-Enden der Primer und (ii) 3′𠄵′ Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase. Die Rolle des fehlgepaarten Nukleotids an den 3′-OH-Enden auf MPR wird weiter unten diskutiert.

MPR mit gemischten Primern erhöht die molekulare Vielfalt von Polymeren.

Ziel unserer Studie war es, einen Pool proteinkodierender DNAs mit hoher molekularer Diversität zu konstruieren, der als Ausgangspunkt für in vitro Experimente zur Proteinevolution. Die Polymerisation von Mikrogenen, denen Terminationscodons fehlen, ist ein Ansatz zum Aufbau einer solchen Bibliothek. MPR kann zu diesem Zweck verwendet werden, wenn die Primer so gestaltet sind, dass die Primerdimere einer Stopcodon-freien Wiederholungseinheit entsprechen. Zufällig eingefügte Nukleotide oder Deletionen an Verbindungsstellen verändern den Leseraster eines Mikrogens in jeder sich wiederholenden Einheit, und die resultierenden MPR-Produkte sind eine kombinatorische Bibliothek, die aus 2 × 3 Leserastern besteht. Zusätzlich zu dieser molekularen Diversität, die sich aus dem Frame-Switching ergibt, testeten wir die Möglichkeit, dass Diversität durch die Verwendung einer Mischung von Primern in MPR weiter erworben werden könnte.

Zuerst verwendeten wir fünf Primer in MPR anstelle von zwei. Dazu gehörten die ursprünglichen KY-794 und KY-795 und ihre drei Derivate, deren Sequenzen sich an drei Positionen von ihrem Elternprimer unterscheiden (Abb. ​ (Abb.3 3 EIN). Sequenzanalysen von klonierten Polymeren aus MPR mit diesen Primern zeigten, dass Polymere aus Mischungen der fünf Primer hergestellt wurden (ein Beispiel ist in Abb. ​ Abb.3 3 . gezeigt). EIN). In ähnlicher Weise wurde ein an bestimmten Positionen degenerierter Primer verwendet, um die molekulare Diversität zu erhöhen. KY-812, ein Derivat von KY-794, hat zwei degenerierte Positionen (Abb. ​ (Abb.3 3 B). MPR mit KY-812 und KY-795 ergab Polymere mit zwei randomisierten Positionen (ein Beispiel ist in Abb. ​ Abb.3 3 B). Es sollte beachtet werden, dass die erste degenerierte Position (das dritte Nukleotid von KY-794) eine Präferenz für C hatte (Abb. ​ (Abb.3 3 B), wohingegen die zweite degenerierte Position (das 11. Nukleotid von KY-794) in diesem Experiment keine Präferenz hatte. Somit erhöht die Verwendung von gemischten Primern oder degenerierten Primern in der MPR die molekulare Vielfalt der resultierenden Polymere.

MPR mit Mischungen von Primern. (EIN) Fünf Primer, die in MPR verwendet werden, sind oben gezeigt. Nicht übereinstimmende Nukleotide sind grün und Sequenzen, die sich zwischen den Primern unterscheiden, sind separat gefärbt. MPR wurde mit einem Expand . durchgeführt Taq Polymerasemischung für 45 Zyklen bei 69ଌ zur Verlängerung. Ein Beispiel für ein Mikrogen-Polymer (pYT037) ist unten gezeigt. Eingefügte Nukleotide oder Deletion (Δ) an den Verbindungsstellen sind rot markiert. (B) Bei der MPR wurde ein degenerierter Primer verwendet. Ns stellen eine Mischung aus A, T, G und C dar. MPR wurde mit einem Expand Taq Polymerasemischung für 65 Zyklen bei 69ଌ zur Verlängerung. Ein Beispiel für ein Polymer (pYT020) wird gezeigt.

Designer Mikrogene.

Obwohl ein hohes Maß an molekularer Diversität durch einen zufälligen Rasterwechsel an Verbindungspunkten und die Verwendung von Primermischungen in der MPR erzeugt werden kann, erwarteten wir, dass die Art der resultierenden Bibliotheken stark von der Wahl des anfänglichen Mikrogens beeinflusst wird. Um zu zeigen, dass die MPR-Technik auf eine Vielzahl von Mikrogenen anwendbar ist, haben wir zwei Mikrogene entworfen, ausgehend von Polypeptidsequenzen, die in Proteinen mit bekannter dreidimensionaler Struktur gefunden wurden, und Bibliotheken durch MPR konstruiert. Ein Mikrogen hatte 42 bp und wurde aus einem 14-Aminosäuren-Peptid entwickelt, das einen Teil einer Coiled-Coil-α-Helix in der Seryl-tRNA-Synthetase (29) darstellt (Abb. ​ (Abb.4 4 .). EIN). Das Mikrogen wurde so entworfen, dass ein Frame für das 14-Aminosäure-Polypeptid kodiert und die anderen fünf Frames keine Terminationscodons enthalten. Das zweite 66-bp-Mikrogen wurde aus einer Windung eines parallelen β-Helix-Proteins, der Pektat-Lyase aus Erwinia Chrysantheme (32). Für dieses Mikrogen wurde zunächst eine 22-Aminosäure-Konsensussequenz aus den sich wiederholenden Einheiten entworfen, von denen jede aus drei β-Strängen besteht (Abb. ​ (Abb.4 4 B). Für diese beiden Mikrogene wurden Primerpaare entworfen, damit (ich) Primerpaare könnten 10 und 9 Basenpaare in ihren 3′ Regionen (ii) die Sequenzen von Primerdimeren könnten Mikrogensequenzen nachbilden und (iii) wurden fehlgepaarte einzelne zusätzliche Nukleotide (A oder T) an ihren 3′-OH-Enden hinzugefügt. MPR mit diesen Primern und Vent wt DNA-Polymerase produzierte wie erwartet heterologe, verschmierte DNA, und Sequenzanalysen der klonierten Produkte zeigten, dass die Mikrogene gleichzeitig mit Nukleotid-Insertionen oder -Deletionen an den Verbindungsstellen polymerisiert wurden (Abb. ​ (Abb.4 4 D und h).

Beispiele für Designer-Mikrogene. (EIN) Die Sequenz von 14 Aminosäuren wurde aus der antiparallelen Coiled-Coil-α-Helix-Region der N-terminalen Domäne von . extrahiert Escherichia coli Seryl-tRNA-Synthetase (30). Die Struktur des Enzyms aus T. thermophilus ist gezeigt (29), und die entsprechende Region in diesem Enzym ist in Blau dargestellt [gezeichnet mit Rasmol (31)]. (B) Aus der extrahierten Sequenz wurde ein Mikrogen entworfen, so dass einer von sechs Frames für die extrahierte Sequenz kodiert und die anderen keine Terminationscodons enthalten. Der sechste Rest (Val) in der extrahierten Sequenz musste im Mikrogen in Glu geändert werden, um das Auftreten eines Terminationscodons in anderen Frames zu vermeiden. (C) MPR-Primer wurden für das Mikrogen entworfen. An den 3′-OH-Enden beider Primer (grün) wurden nicht übereinstimmende Nukleotide hinzugefügt. (D) Ein Beispiel für ein Mikrogen-Polymer (pYT071) aus KY-859 und KY-860. MPR wurde für 65 Zyklen unter Verwendung von Vent (exo +) DNA-Polymerase durchgeführt. Die Annealing- und Extensionstemperatur betrug 63ଌ. Eingefügte Nukleotide an Verbindungsstellen sind in Rot dargestellt. (Eh) Design eines Mikrogens aus einem parallelen β-Helix-Protein, E. chrysanthemie Pektatlyase E (32) und ein Beispiel für ein Mikrogenpolymer. Die Strategie war dieselbe wie bei EIND, außer dass die 22-Aminosäuren-Sequenz eine Konsensussequenz war, die aus drei β-Strängen bestand.

Polymere, die aus entworfenen Mikrogenen hergestellt wurden, wurden in einen Expressionsvektor kloniert, und ein Leserahmen wurde in translatiert E coli. Exprimierte Proteine ​​wurden durch SDS/PAGE analysiert. Beispiele von 10 Klonen für jedes Mikrogen sind gezeigt (Fig. ​ (Fig.5). 5). Drei Klone des α-Helix-Mikrogens und sechs Klone des β-Strang-Mikrogens, deren Größe der Polymerinserts von 0,25 bis 0,8 kb reichte, produzierten Polypeptide mit scheinbaren Molekulargewichten von 15� kDa, was darauf hindeutet, dass das MPR Produkte können als Quelle für in vitro Experimente zur Proteinevolution. Wir analysieren jetzt die physikalischen Eigenschaften der Polypeptide, die aus Mikrogenpolymeren translatiert wurden.

SDS/PAGE von Proteinen aus E coli Zellen, die einen Leserahmen von Mikrogen-Polymeren exprimieren. (EIN) α-Helix-Mikrogen. (B) β-Strang-Mikrogen. Molekulare Marker wurden in Spur M laufen gelassen, und ihre Größen sind auf der linken Seite in Kilodalton gezeigt. Sichtbare Bänder, von denen erwartet wird, dass es sich um Produkte handelt, sind durch grüne Punkte gekennzeichnet. Einige von ihnen (Klone 3 und 8 von EIN und 4, 5 und 8 von B) wurden als Produkte von Mikrogenen bestätigt, indem sie mit Oligo-Histidin–tag gereinigt wurden (Daten nicht gezeigt).


Abstrakt

Replikationsslippage von DNA-Polymerasen ist eine potentielle Quelle spontaner genetischer Umlagerungen in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen. Hier zeigen wir, dass verschiedene thermostabile DNA-Polymerasen einem Replikationsslippage unterliegen in vitro, während der einrunden Replikation einer einzelsträngigen DNA-Matrize, die eine Haarnadelstruktur trägt. Low-Fidelity-Polymerasen, wie z Thermus aquaticus (Taq), High-Fidelity-Polymerasen, wie z Pyrococcus furiosus (Pfu) und eine hoch thermostabile Polymerase aus Pyrococcus Abyssi (Pyra™ exo − ) rutschen. Thermococcus litoralis Die DNA-Polymerase (Vent®) ist ebenfalls in der Lage zu gleiten, jedoch kann das Gleiten gehemmt werden, wenn ihre Strangverdrängungsaktivität induziert wird. Darüber hinaus können DNA-Polymerasen, die eine konstitutive Strangverdrängungsaktivität aufweisen, wie z Bacillus stearothermophilus DNA-Polymerase (Bst), Rutsch nicht aus. Polymerasen, die während der einrunden Replikation rutschen, erzeugen während der PCR-Amplifikation Haarnadeldeletionen, mit Ausnahme der Vent®-Polymerase, da ihre Strangverdrängungsaktivität unter diesen Bedingungen induziert wird. Wir zeigen, dass diese Haarnadel-Deletionen, die während der PCR auftreten, auf Replikations-Slippage zurückzuführen sind und nicht auf einen zuvor vorgeschlagenen Prozess, der eine Polymerisation über die Haarnadelbasis beinhaltet.


Polymerase-Prozessivität

Die Bedeutung der Korrekturleseaktivität für die PCR ist seit fast zwei Jahrzehnten allgemein bekannt, aber eine andere Eigenschaft, die Prozessivität, hat zunehmende Aufmerksamkeit erregt. &ldquoProcessivity&rdquo ist ein Begriff, der sich auf die Anzahl der Nukleotide bezieht, die von einer Polymerase in einem einzigen Bindungsereignis (vor der Dissoziation) eingebaut werden. Taq DNA-Polymerase fügt ungefähr 50 Nukleotide pro Bindungsereignis hinzu (8). Warum ist das wichtig? Eine Polymerase mit geringer Prozessivität oder „distributive&rdquo-Polymerase erweitert eine Population von Matrizen auf merklich andere Weise als eine prozessive Polymerase. Eine hochgradig distributive Polymerase bindet an eine Matrize, fügt einige Nukleotide hinzu und dissoziiert, wodurch eine Population von Matrizen zurückbleibt, die mit der Zeit gleichmäßig erweitert werden können. Eine hochprozessive Polymerase bindet eine Matrize und verlängert sich mit längeren Bindungsereignissen.

Daraus folgt, dass das Ergebnis einer prozessiven oder einer distributiven Polymerasereaktion bei ausreichender Zeit eine Population kopierter Matrizen sein würde. Unter bestimmten Umständen ist es jedoch möglich, dass die prozessive Polymerase eine überlegene Leistung aufweist. Die E. coli Polymerase III α-Untereinheit, die Teil der hauptsächlichen replikativen Polymerase ist, hat eine Prozessivität von < 10 Basenpaaren und eine Geschwindigkeit von < 20 Nukleotiden/Sekunde (nt/s). Wenn sich die Untereinheit jedoch mit den anderen Replisom-Untereinheiten, insbesondere der Gleitklemme, verbindet, erhöhen sich die effektive Prozessivität und Replikationsgeschwindigkeit auf > 50 kb bzw. 1.000 nt/s (9). Der Begriff „effektive Prozessivität” wird verwendet, weil es Daten gibt, die darauf hinweisen, dass die Polymerase-Untereinheit im Replisom austauschen kann, das Replisom jedoch eine schnelle, prozessive DNA-Replikation beibehält (10).

Um die Prozessivität bei der PCR zu nutzen, haben Forscher eine DNA-Bindungsdomäne mit einer archaealen Polymerase fusioniert (11). Dieses chimäre Enzym hat mehrere verbesserte Eigenschaften, aber insbesondere ist es in der Lage, DNA mit kürzeren Verlängerungszeiten zu amplifizieren und längere DNA-Produkte effizienter zu produzieren, wodurch die gesamten Thermocycling-Zeiten verkürzt werden. Diese Fusionsidee ist die Grundlage von Q5 High-Fidelity DNA Polymerase und Phusion ® High-Fidelity DNA Polymerase, zwei von NEB erhältlichen Polymerasen (Abbildung 4).

Abbildung 4: Phire Hot Start DNA Polymerase wird durch Fusion einer DNA-Polymerase (orange) und eines kleinen dsDNA-bindenden Proteins (gelb) hergestellt. Diese Technologie erhöht die Prozessivität der Polymerase und verbessert ihre Gesamtleistung.


Routine-PCR

40-60% unter Verwendung von Standardbedingungen und Reagenzien. Routine-PCR ist ein wichtiger Bestandteil vieler molekularbiologischer Arbeitsabläufe und ist im Allgemeinen schnell, robust und reproduzierbar.

Routine-PCR wird typischerweise mit Taq oder ein Taq-basierte Mischung von Polymerasen. die eine verbesserte Leistung bietet. Diese Mischungen enthalten oft eine Korrekturlese-Polymerase, die eine verbesserte Leistung und eine mäßig höhere Wiedergabetreue (z. B. 2X) bietet als Taq allein. In Fällen, in denen echte High-Fidelity erforderlich ist, sollte eine robuste Korrekturlese-Polymerase (d. h. Q5 ® ) anstelle von a . verwendet werden Taq Mischung.

Um beste PCR-Ergebnisse zu erzielen, befolgen Sie bitte die Empfehlungen, die mit jedem Enzym geliefert werden, und berechnen Sie mit dem NEB Tm-Rechner eine Annealing-Temperatur für jedes Primer-Set. Für die meisten Routine-PCR-Experimente sind begrenzte Optimierungen erforderlich, um reproduzierbare und robuste Ergebnisse zu erzielen.

Typ wählen:

Feature-Artikel

Lesen Sie mehr über die Beziehung zwischen Polymerase-Struktur und -Funktion beim Kopieren von DNA.


ERGEBNISSE

Wir untersuchten die Fähigkeit der DNA-Polymerasen aus dem thermophilen Eubakterium Thermus aquaticus (Taq) und aus den thermophilen Archaeen Pyrococcus furiosus (Pfu) und Pyrococcus woesei (Pwo), um einen Primer über eine Matrize zu verlängern, die ein einzelnes Desoxyuridin enthält. Die eubakterielle Taq DNA-Polymerase war in der Lage, den Primer auf die durch die Matrize definierte volle Länge zu verlängern. Im Gegensatz dazu war das Hauptprodukt der Primer-Verlängerung, das von den archaealen DNA-Polymerasen erzeugt wurde, signifikant kürzer (Abb. ​ (Abb.1 1 ein). Mit der äquivalenten Matrize, in der das Desoxyuridin durch Thymidin ersetzt wurde, produzierten alle DNA-Polymerasen Volllängenprodukte ohne vorzeitige Beendigung. Um die Position zu bestimmen, an der die Primerverlängerung durch die archaealen DNA-Polymerasen auf der Desoxyuridin-Matrize gestoppt hatte, wurden die Reaktionsprodukte durch Gelelektrophorese zusammen mit Sequenzierungsreaktionen derselben Matrize analysiert. Die von den archaealen DNA-Polymerasen erzeugten Hauptprodukte entsprachen der Termination der Primerverlängerung um 4𠄶 Nukleotide stromaufwärts der Position des Uracils im Matrizenstrang (Abb. ​ (Abb. 1 1 B).

Langstrecken-Primerverlängerungsreaktionen auf normalen und Einzel-Uracil-Templaten. (ein) Denaturierendes Polyacrylamidgel, das Reaktionsprodukte zeigt, bei denen ein 31-mer-Primer gegen ein 119-Nukleotid-Templat verlängert wurde (siehe Methoden) enthaltend entweder ein Desoxyuridin (U) oder ein Desoxythymidin (T) 23 Nukleotide vom 5′ Ende entfernt. Die Reaktionen wurden mit DNA-Polymerasen aus Pyrococcus furiosus (Pfu), Pyrococcus woesei (Pwo), und Thermus aquaticus (Taq). Alle drei Polymerasen produzieren Produkte voller Länge auf T-Matrizen, aber die Archaeenenzyme produzieren kleinere Hauptprodukte auf U-Matrizen. (B) Polyacrylamidgel, das die Position des vorzeitigen Hauptterminationsprodukts der Primerverlängerungsreaktion gegenüber dem U-Templat zeigt mit Pyrococcus furiosus DNA-Polymerase (Pfu exo + ), relativ zu einer Sequenzierungsleiter des Segments von pUC19, das in der Long-Range-Primer-Extension-Reaktion verwendet wurde (siehe Methoden). Die Sequenz für den Matrizenstrang ist angegeben, wobei 3′𡤥′ von unten (kürzere Primerverlängerungsprodukte) nach oben (längere Primerverlängerungsprodukte) gelesen wird. Die Position des Desoxyuridins (U) ist angegeben. Der Bürgermeister Pfu Produkte entsprechen der Beendigung der Polymerasereaktion 4𠄶 Basen stromaufwärts des Templates Desoxyuridin. Die Position des Produkts voller Länge, das aus der Primer-Extension gegen die T-Matrize (nicht gezeigt) erhalten wurde, stimmte mit der Termination am Ende der 119-Basen-Matrize überein.

Der Abstand von 4𠄶 Nukleotiden zwischen dem letzten in den Primer eingebauten Nukleotid und der Position des Uracils in der Matrize weist auf einen Uracil-Sensor hin, der die Polymeraseaktivität in den Archaeenenzymen ȁ ”” ” ”ȁ Um die Bedeutung dieses Abstands weiter zu analysieren, konstruierten wir eine Reihe von Primer-Templat-Duplexen, in denen ein Desoxyuridin zwischen ʱ- und , Pfu, Pwo, Taq, und T4-DNA-Polymerasen, um Primerverlängerungsreaktionen auf diesen Substraten zu initiieren. Da Desoxyuridin in der Matrize in den ersten vier Positionen stromabwärts des Primer-Template-Duplex vorhanden war, wurde eine minimale Primerverlängerungsreaktion mit den archaealen DNA-Polymerasen beobachtet. Bei Abständen von ʵ, ʶ und ʷ zwischen der Duplexverbindung und dem Desoxyuridin wurden einige Primerverlängerungsprodukte mit den archaealen Enzymen beobachtet, entsprechend der Zugabe von 1, 2 bzw. 3 Nukleotiden, praktisch ohne Produkt in voller Länge hergestellt (Abb. ​ (Abb.2). 2 ). Im Gegensatz, Taq und T4 produzierte mit all diesen Schablonen ein Hauptprodukt in voller Länge. Wiederum stimmen diese Ergebnisse damit überein, dass archaeale DNA-Polymerasen die DNA-Synthese 4𠄶 Nukleotide stromaufwärts eines Matrizenstrangs von Desoxyuridin blockieren. Der Polymerase-Arrest war eine sehr anhaltende Inkubation einer Matrize mit einem Desoxyuridin in der ⬐-Position mit Pfu Polymerase für bis zu 1 Stunde führte zu keinem signifikanten Readthrough (Abb. ​ (Abb.3 3 ein). Die fehlende Kündigung bei Taq legt nahe, dass diese Eigenschaft in thermophilen Polymerasen nicht überall vorhanden ist. Ebenso bestätigen die negativen Ergebnisse mit T4, dass das Desoxyuridin-gerichtete Abwürgen keine allgemeine Eigenschaft der Polymerase-α-Familie ist Taq ist ein Mitglied der Polymerase I Familie (14, 15)]. Ein ähnliches Muster der Primerverlängerung wurde bei den exo +- oder exo −-Versionen von Vent und . beobachtet Pfu Polymerasen, die die 3′-5′ Exonuklease-Aktivität zum Korrekturlesen enthalten oder nicht besitzen. Bei den exo +-Enzymen und auch bei . wurden jedoch Produkte beobachtet, die kürzer als der ursprüngliche Primer waren Pwo Polymerase, für die nur die exo +-Form verfügbar war. Diese Beobachtungen legen nahe, dass im Gegensatz zur 5′-3′ Polymerase-Aktivität die 3′-5′ Exonuklease-“proofreading”-Aktivität der Archaeenenzyme unempfindlich gegenüber der Anwesenheit von Desoxyuridin ist und nicht am Nachweis beteiligt ist Abwürgen am Template-Desoxyuridin.

Primer-Extensions mit kurzer Reichweite. Denaturierende Polyacrylamidgele, die Primerverlängerungsprodukte mit kurzer Reichweite auf ansonsten identischen Templaten zeigen, die entweder kein Uracil (kein dU) oder ein einzelnes Uracil mit 1𠄷 Basen (dU+ .) enthaltenn) vom Ende der Primer-Template-Duplex-Region. Die erste Spur (Primer) enthält nur den Primerstrang als Marker. Gele sind für Folgendes bestimmt: Vent exo + und exo − (ein), Pfu exo + und exo − (B), Pwo exo + (C), Taq (D) und T4 (e). In allen Fällen zeigt die Spur “no dU” das 44-mer-Produkt mit der maximalen Länge. Alle Archaeen-Enzyme produzieren kein Produkt voller Länge auf Uracil enthaltenden Matrizen, aber sie sind in der Lage, den Primer geringfügig zu verlängern, wenn das Uracil 5 oder mehr Basen über das Ende der Duplexregion hinausgeht. Produkte, die kürzer als der ursprüngliche Primer sind, sind in Reaktionen mit Enzymen mit funktioneller 3′𡤥′ Exonuklease-Aktivität (exo +) vorhanden.

Der vorzeitige Halt, der durch die Anwesenheit eines Templatstrangs Uracil erzeugt wurde, betrug nicht 100%, und manchmal wurde ein kleiner Anteil des Produkts voller Länge bei den Archaeenenzymen beobachtet. Das Hochskalieren der Reaktionen erzeugte genug von diesem Produkt voller Länge, um eine Maxam–Gilbert-Sequenzierung durchzuführen, die den Einbau von Adenin gegenüber dem Uracil-Templat bestätigte, wie von der Watson𠄼rick-Basenpaarung erwartet. Darüber hinaus zeigte die Analyse des Matrizenstrangs nach einer solchen Behandlung, dass er unverändert war. Als Reaktion auf ein Templat-Desoxyuridin spalten die Archaeen-Polymerasen daher nicht den Templat-Strang, hydrolysieren die glycosidische Bindung des Desoxyuridins nicht, um eine abasische Stelle zu ergeben, oder ersetzen das Desoxyuridin durch eine andere Base (Daten nicht gezeigt).

Sperrige Läsionen wie Pyrimidin-Photodimere (16) und Aminofluoren-Addukte (17) oder abasische Stellen (18) werden die DNA-Synthese durch eine Vielzahl von Polymerasen blockieren oder zumindest unterbrechen. Diese verursachen jedoch einen Arrest an der Stelle der Läsion, vermutlich wegen schlechter Basenpaarungswechselwirkungen, die für ein eintretendes Nukleosidtriphosphat verfügbar sind. Einen ähnlichen Effekt beobachten wir bei Pfu, which stalls and misincorporates nucleotides on a template containing a stable abasic site (1′,2′-dideoxyribose) (Fig. ​ (Fig.3 3 B) 10 nucleotide downstream of the primer-template duplex. In marked contrast, the equivalent template with a deoxyuridine at that position results in a shorter product (Fig. ​ (Fig.3 3 B) consistent with arrest 4𠄶 nucleotides upstream of the template strand uracil, and in agreement with the data presented in Figs. ​ Figs.1 1 and ​ and2. 2. Schließlich, Pfu polymerase binds tightly and specifically to uracil-DNA, only in a single-stranded context, and not to abasic sites (Fig. ​ (Fig.4). 4 ). Thus the specific arrest of archaeal DNA synthesis elicited by template-strand uracil, characterized by stalling 4𠄶 bases upstream of the uracil and tight binding of single-stranded uracil, is qualitatively different from the nonspecific arrest of DNA polymerases in general at abasic sites. To determine whether upstream stalling was a general response to deaminated bases, a template containing inosine (the deamination product of guanine) in place of uracil was used in similar primer extension reactions it elicited no stalling and produced only full-length product (data not shown).

DNA-binding specificity of Pfu DNA-Polymerase. (ein) Surface plasmon resonance measurements of Pfu DNA polymerase interactions with DNA. The signal in response units (RU) is proportional to the mass of enzyme bound to the oligonucleotides immobilized on the surface of the Biacore chip. The beginning and end of injection of Pfu DNA polymerase over the chip surface are indicated by the arrows. Interactions were measured with single-stranded 35-mer oligonucleotides containing either a single uracil (ssU), a single abasic site (ssab), or no modification (ssC), and with double-stranded 35-mers containing a single U⋅G mispair (U:G) or a guanine opposite and abasic site (ab:G). Pfu polymerase interacts strongly with ssU but no other oligonucleotides. (B) Dose–response curve for binding of Pfu polymerase to ssU. Experimental data (○) were fit to the equation R = RmaxC/(KD + C), wo C is the protein concentration and Rmax is the maximal response, giving an estimated KD = 0.54 μM.


INTRODUCTION TO BACTERIAL ABC PROTEINS

I. BARRY HOLLAND , in ABC Proteins , 2003

STRUCTURE AND FUNCTION OF THE ABC TRANSPORTERS

Notably, some of the most advanced structural studies of ABC transporters have come from bacterial import and, more recently, bacterial export systems. Thus, we now have high-resolution structures for ABC importers, HisP ( Hung et al., 1998) , a MalK from Thermococcus litoralis ( Diederichs et al., 2000) , one ABC in the family of branched-chain amino acid transporters and one of unknown function ( Karpowich et al., 2001 Yuan et al., 2001) . In this laboratory, we have recently obtained the high-resolution structure of the ABC domain of HlyB (Schmitt et al., in preparation), a member of the large DPL family, which includes the mammalian TAP and Pgp (Mdr1) proteins. The implications of all these structural advances will be considered in other chapters. As discussed in Chapter 7 , a very major and exciting advance in the field was made by the presentation of the first structural data at 4.5Å for the intact bacterial exporter MsbA from E coli ( Chang and Roth, 2001 ). This provides the first sign of the nature of the membrane domain, and, in particular, that of the membrane-spanning domains. These are finally shown to be helices, settling some previous controversies. Most crucially, of course, this overall structure of MsbA has profound implications for at least a global understanding of how the action of the membrane and ABC domains may be coordinated. Chang and Roth (see also Higgins and Linton, 2001 ) on the basis of this structure have already proposed an exciting solution to a long-standing puzzle – how close are the ABC domains in the transporter? – that most likely they are interfaced at some point in the catalytic cycle (see also Chapter 6 ), but under the influence of the membrane domains they are well separated in the absence of any transport substrate. Unfortunately, mechanistic studies of the nature of the catalytic cycle of ABC proteins in bacteria, and its relationship to the transport function, have lagged relatively far behind those for some of the mammalian proteins. However, recent advances in purifying and reconstituting proteins of the maltose and histidine uptake systems (see Chapter 9 ), combined with the power of microbial genetics, promise much for the future.

Excitingly, as this volume goes to press the high-resolution structure of the bacterial ABC import system for vitamin B12, BtuCD, is reported (Locher et al., Science 296, 1091–1098), providing many new insights into the mechanism of ABC-dependent transport.


Taq and Pfu polymerase give different amplification - (May/04/2006 )

I try to perform get a 500bp-PCR-Product using Pfu-Polymerase. When I do the PCR with Taq-Polymerase everything works out fine. However when I use Pfu under the same condition, no product shows up. I haven't tried out any other polymerase yet.

1. Has anybody had similar problems? Gibt es dafür eine Erklärung?

2. Can you recommend another polymerase with proofreading-ability?

3. Since the fragment is only 500 bp long I thought about gambling a bit: Just do several batches, use Taq and hope that one resulting fragment is a clean match. Was denken Sie?

4. Why is there only one female in smurf village?

1. I've used severall different polymerases and they all have different optimal conditions dependant on your template and primers. The reason is that they are derived from different bacteria/archaea etc. which have different cytoplasmic concentrations of ions etc, so that's why PCR-buffers for different polymerases as well as optimal cycling conditions will be different.

2. Don't give up yet, you have the Pfu now, try playing around with annealing temp, Mg-concentration etc. Polymerases are too expensive to just throw away after one failure. If it keeps occuring: stratagene has PfuTurbo, PfuUltra and PfuUltraII (optimised versions of Pfu), invitrogen has platinum Pfx, accuprime Pfx and Pfx50, Roche has Pwo and Tgo, Finnzyme has Phusion, NEB has Vent and Deep Vent, there's probably countless others and then you still have all the "high fidelity enzyme mixes" (taq + a proofreading enzyme).

3. That might be a good idea. But, this means you would have to clone them and sequence a lot of colonies which will also be expensie (on the other hand: even if you use a proofreading enzyme: there's no guarantee that no error is incorporated, just the chances of errors are lower, but you would still need to do the cloning and sequencing, but most likely you will get a clean match after a smaller number of attempts). If you would just sequence your PCR product right away: you will very likely see a nice match, because for instance taq incorporates ONE mistake in the first cycle of PCR on just ONE of your template (at a specific position) and you started with for instance 10 template molecules, you will only see this mutation in 10% of your PCR products (assuming that this mistake will not be made a again. ), so on the electropherogram you will most likely not notice this one.

4. Smurf's are a bunch of sexists and only need women for procreation? just my 5 cents.

You can use a polymerase cocktail. I have done 10:1 Taq:Pfu. That way, you get the best of both worlds - good amplification from Taq, proof-reading from Pfu.

also, PFU has exonuclease activity. Are you adding the PFU last, on ice and perhaps doing a hostart. This will minimse degradation of your template.

acutally, origninally there were no girls in the smurf village. Gargamel created the smurfette to infiltrate the village, but she felt bad and switched sides to join the smurfs. Does anyone else think that vanity smuf may have been gay?

1. yes. Pfu is pickey. I overcame it by addng more Magnesium, and dmso. Now, with that, i can pfu to amplify things taq won't touch.

2. There are a few out there. The one's i've tried usually flop. Triplemaster seems to work ok.

3. The error rate for Taq is not that high, especially when you consider that you're product isn't that big. You could use Taw, but remember to sequence a number of colonies, just incase.

4. There are 3 female smurfs:
The first was Smurfette, who was created by a magical potion. Her list of ingredients include: "Sugar and spice but nothing nice. A dram of crocodile tears. A peck of bird brain. The tip of an adder's tongue. Half a pack of lies, white, of course. The slyness of a cat. The vanity of a peacock. The chatter of a magpie. The guile of a vixen and the disposition of a shrew. And of course the hardest stone for her heart. "
The second was Sassette. Sassette actually has the same origins as Smurfette (with a minor difference, she wasn't made by Gargamel). The smurflings (Slouchy, Nat, and Snappy) were pitying Smurfette who felt lonely, being the only girl in the village, so they decided to help her. They learned from Papa Smurf that Smurfette was indeed created magically by Gargamel out of clay. They then went to steal Gargamel's formula and magical recipes for creating Smurfette. They successfully created Sassette, who this time didn't need plastic surgery (though her rude behavior and attitude needed a bit of chemical tweaking). As they introduced Sassette to Smurfette, Smurfette was overjoyed at having a female friend, albeit a bit of a tomboy.
The last was Nanny, an old flame of Grandpa Smurf's, Nanny enters the cartoon series after being trapped inside a cursed castle for centuries. Grandpa and the others rescue her, and she makes her home with them in the village.

Wow, you can see where my interests really are.

Ps. vanity gay? never. he was just sensitive, and very handsome.

Check out your extension time and annealing temperature. Pfu polymerase activity is very slow as compared to Taq polymerase and since Pfu prefers sulphate over chloride, you would end up using probably ammonium sulphate in the buffer so you may have to reduce annealing temperature.

That female smurf history is nothing short of amazing. you should publish a review!

Cheers guys.
I never heard about differences in temperature-specifity but I rechecked annealing-temperature and extension time with a gradient-pcr and it worked.


Schau das Video: Simplified RT -- Reverse Transcription Animation (September 2022).