Information

Ligandenbindungsassays: IC50, EC50 und Kd

Ligandenbindungsassays: IC50, EC50 und Kd


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ich überprüfe mehrere MHC-Peptid-Bindungsaffinitätsprädiktoren, die auf IEDB-Daten trainiert wurden. Quantitative Aufzeichnungen für MHC-Klasse-I-Allotypen stammen aus vielen verschiedenen Assays und haben daher unterschiedliche Messtypen. Hier sind die gebräuchlichsten Beschreibungen der Messtypen (ich habe sie in keiner Weise geändert):

  1. Dissoziationskonstante KD (~IC50)
  2. Dissoziationskonstante KD (~EC50)
  3. halbmaximale Hemmkonzentration (IC50)
  4. Dissoziationskonstante KD
  5. halbe maximale effektive Konzentration (EC50)

Alle Prädiktoren, die ich bisher überprüft habe, betrachten diese Messtypen als austauschbar, was ich äußerst seltsam finde. Während IC50 und EC50 unter bestimmten experimentellen Umständen tatsächlich ähnlich sein können, fällt es mir schwer zu glauben, dass eines davon ungefähr gleich Kd sein kann (diese Seite hat bereits einen Beitrag zu diesem Thema). Ich habe mehrere Autoren und Datenbankkuratoren kontaktiert, und alle haben mir versichert, dass diese Werte tatsächlich als mehr oder weniger austauschbar angesehen werden können, aber ich kann keine Referenzen finden, die diese Behauptungen stützen.


Ein Leitfaden für einfache und informative Bindungsassays

Ziel von Bindungsassays ist es, Wechselwirkungen zwischen zwei Molekülen zu messen, beispielsweise einem Protein, das ein anderes Protein bindet, einem kleinen Molekül oder einer Nukleinsäure. Die Herstellung von Reagenzien erfordert harte Arbeit, aber Mängel im Design vieler Bindungsexperimente schränken die erhaltenen Informationen ein. Insbesondere scheitern viele Experimente daran, die Affinität der Reaktanten zueinander zu messen. Dieser Aufsatz beschreibt einfache Methoden, um in Bindungsexperimenten das Beste aus wertvollen Reagenzien herauszuholen.


Abstrakt

Schätzungen eines neuen Webserver-Tools Kich Werte aus experimentell ermittelten NS50 Werte für Inhibitoren von Enzymen und von Bindungsreaktionen zwischen Makromolekülen (z. B. Proteinen, Polynukleinsäuren) und Liganden. Dieser Konverter wurde entwickelt, um es Endbenutzern zu ermöglichen, die Qualität der diesen Berechnungen zugrunde liegenden Annahmen zu beurteilen, die von der Art des Mechanismus der Inhibitorwirkung und den Konzentrationen der interagierenden Molekülspezies abhängen. Zusätzliche Berechnungen werden für nichtklassische, fest gebundene Inhibitoren von Enzym-Substrat- oder Makromolekül-Ligand-Systemen durchgeführt, in denen freie statt Gesamtkonzentrationen der reagierenden Spezies erforderlich sind. Zu den erforderlichen benutzerdefinierten Eingabewerten gehören die Gesamtenzym- (oder ein anderes Zielmolekül) und die Substrat- (oder Liganden-) Konzentrationen, die Km des Enzym-Substrats (oder der KD der Ziel-Ligand)-Reaktion und die NS50 Wert. Annahmen und Vorbehalte für diese Berechnungen werden zusammen mit Beispielen aus der Literatur diskutiert. Die Hostdatenbank für diesen Konverter enthält kinetische Konstanten und andere Daten für Inhibitoren der proteolytischen Clostridien-Neurotoxine (http://botdb.abcc.ncifcrf.gov/toxin/kiConverter.jsp).


Nichtlineare Regressionsanalyse

Die Komplexität biologischer Systeme führt zu einer nichtlinearen Dosis-Wirkungs-Beziehung, die die Berücksichtigung mehrerer Parameter während der Analyse erfordert. Die Dosis-Wirkungs-Analyse ist eine Art von Kurvenanpassungsanalyse, die eine nichtlineare Regression und ein iteratives mathematisches Modell verwendet, das Ihre Daten anpasst und diese Parameter berücksichtigt, um die Dosis-Wirkungs-Beziehung genau zu charakterisieren.

Die nichtlineare Regression kann die Wirkstärke eines Arzneimittels (EC50 oder IC50) bestimmen, am besten geeignete Werte finden, Ergebnisse aus verschiedenen Experimenten vergleichen und Unbekannte aus einer Standardkurve interpolieren. Sie können beispielsweise die Wirkung der Behandlung von Zellen mit einem Agonisten in Gegenwart und Abwesenheit eines Antagonisten (eines Inhibitors) wie unten gezeigt untersuchen.

Diese Analyse hat jedoch mehrere Annahmen und Einschränkungen.

Annahmen der nichtlinearen Regression

Der genaue Wert von X ist bekannt. Y-Werte sind die einzigen Werte, die Fehler (Streuung) aufweisen.

Die Variabilität der Y-Werte bei X folgt der Gaußschen glockenförmigen Verteilung.

Gleichmäßige Varianz: Die Streuung (Standardabweichung) ist entlang der Kurve gleich. Probieren Sie Gewichtungswerkzeuge in Prism aus, um ungleichmäßige Varianz aufzulösen.

Alle Beobachtungen (Y-Werte) sind unabhängig (3).

Einschränkungen

Biologische Systeme sind sehr komplex und eine nichtlineare Regressionsanalyse kann die Dosis-Wirkungs-Beziehung möglicherweise nicht vollständig charakterisieren. Zum Beispiel kann EC50 sowohl durch die Affinität als auch die Wirksamkeit des Arzneimittels bestimmt werden. Prism bietet verschiedene Tools zur Bestimmung von Affinität und Wirksamkeit.

o Die Affinität ist, wie gut das Medikament an den Rezeptor bindet.

o Die Wirksamkeit ist die Fähigkeit des Arzneimittels, nach der Bindung eine Reaktion hervorzurufen. Die Wirksamkeit kann stark variieren.

Die Ergebnisse können je nach Konzentrationsbereich und verwendetem Zell-/Gewebetyp variieren.

Die Anfangswerte der verwendeten Parameter wirken sich ebenfalls auf die Analyse aus und müssen möglicherweise eingeschränkt werden, um die Analysequalität zu erhöhen.


Was ist eine “gut”-Bindungsaffinität für ein Medikament?

Wenn Sie sich schon einmal Präsentationen von Biotech-Unternehmen angesehen haben, sind Sie wahrscheinlich auf eine Folie wie die folgende von den Krebsmedikamentenentwicklern Mirati gestoßen, die die Aktivität, Wirksamkeit und Selektivität ihres KRAS-Inhibitors MRTX-849 schön zusammenfasst [1] .

Das Ziel dieses Beitrags ist es, die in der Mirati-Folie oben dargestellten Konzepte (Bindungsaffinität und ihre Beziehung zu Potenz und Selektivität) zu überprüfen und eine Intuition zu geben, wie “gut aussieht” für diese Parameter. Ich möchte auch gerne ein Nachschlagewerk für Menschen ohne pharmakologischen Hintergrund erstellen, die dennoch Datenpräsentationen wie diese verstehen wollen.

Für alle, die es nur kurz zusammenfassen wollen: Eine Bindungsaffinität von weniger als 10nm (bezogen auf Kd/Ki/EC50/IC50) gilt allgemein als “gut”, doch dahinter verbirgt sich ein kniffliger Spagat, bei dem viele optimiert werden andere Eigenschaften eines Arzneimittels wie Selektivität, Löslichkeit und Molekulargewicht, um sicherzustellen, dass Patienten von einem wirksamen, minimal toxischen Arzneimittel ohne übermäßig belastende Dosierungsanforderungen profitieren können.

Was ist Bindungsaffinität?

Die Bindungsaffinität ist ein Maß für die Stärke einer Wechselwirkung zwischen einem Ligandenmolekül (d. h. einem Arzneimittel) und dem Ziel, an das es bindet (oft ein Protein, ein Rezeptor, ein Enzym, ein Zytokin usw.).

Im vereinfachten “lock and key”-Modell spiegelt die Bindungsaffinität wider, wie gut ein “key” Medikament in sein Ziel-“lock” passt. Intuitiv ergibt sich laut Modell eine enge Bindung aus einer engen Übereinstimmung der Formen “lock” und “key”, da eng anliegende Komplexe energetisch günstiger sind als lose gebundene. In Wirklichkeit sind Proteine ​​und andere große biologische Moleküle schlaffe und dynamische Strukturen ohne starre “locks”, aber die Analogie ist trotzdem nützlich.

Im Allgemeinen wird die Bindungsaffinität als Dissoziationskonstante (Kd) gemessen und in molarer Konzentration ausgedrückt. Die Dissoziationskonstante ist ein Maß für das Verhältnis von ungebundenen (dissoziierten) Liganden zu gebundenen Liganden im Gleichgewicht. Je niedriger der Wert von Kd ist, desto stärker ist die Bindungsaffinität. Sie können dieses Verhältnis auch als Hemmungskonstante (Ki) im Zusammenhang mit einem hemmenden Arzneimittel bezeichnen, was im Wesentlichen der Dissoziationskonstante entspricht. Eine Übersicht über Methoden zur Messung von Kd finden Sie im Wikipedia-Artikel zu Ligandenbindungsassays.

Eine Gleichung für eine allgemeine reversible chemische Reaktion im Gleichgewicht, an der zwei Moleküle A und B und ein Komplex der beiden Moleküle AB beteiligt sind, kann wie folgt ausgedrückt werden:

Die Dissoziationskonstante wird dann berechnet, indem die Konzentrationen der verschiedenen Moleküle im Gleichgewicht gemessen und die Werte in die folgende Formel eingesetzt werden

Für unsere Zwecke könnte A einen Wirkstoff darstellen, B seinen Zielrezeptor und AB den gebundenen Wirkstoff-Rezeptor-Komplex. Die eckigen Klammern bedeuten Konzentration. x und y stellen die Anzahl der Moleküle von A bzw. B dar, die an jedem Fall der Reaktion beteiligt sind. Je niedriger der Kd-Wert, desto mehr Moleküle des Wirkstoffs (A) werden an sein Zielmolekül (B) gebunden und desto fester ist die Bindung. Bei der Messung von Kd ist es wichtig, dass der Reaktion vor der Konzentrationsmessung ausreichend Zeit gegeben wird, um sich richtig zu äquilibrieren, da sonst der Kd-Wert überschätzt wird [2] .

Bei x=1 und y=1 (wie es in Biologie und Pharmakologie oft der Fall ist, zB wenn ein einzelnes Molekül eines Wirkstoffs an eine einzelne Rezeptorstelle bindet), ist Kd gleich der Konzentration von A, bei der A die Hälfte der Moleküle gebunden hat von B bis in den AB-Komplex im Gleichgewicht (dh die Konzentration von B ist gleich der Konzentration von AB). Nach der folgenden Berechnung:

Eine andere Methode zur Berechnung von Kd besteht darin, das Verhältnis der Geschwindigkeitskonstante für die Vorwärtsreaktion (Bindung) (kon) dividiert durch die Geschwindigkeitskonstante der Rückwärtsreaktion (Dissoziation) (koff) zu nehmen.

Allerdings werden die Werte von kon und koff in der Praxis selten ermittelt und man kann aus Kd allein keine sicheren Rückschlüsse auf die Bindungsdauer ziehen [3] . Obwohl im Allgemeinen eine höhere Bindungsaffinität dazu führt, dass das Arzneimittel einen höheren Anteil an Zeit an das Ziel gebunden verbringt als nicht.

Die Bindungsaffinität hängt auch mit der “fraktionellen Besetzung” eines Wirkstoffs zusammen, d. h. dem Prozentsatz eines von einem Wirkstoff gebundenen Ziels, berechnet mit der folgenden Gleichung:

Die fraktionierte Besetzung ist nützlich, da die biologische Aktivität eines Arzneimittels oft von seiner Fähigkeit abhängt, einen großen Prozentsatz der verfügbaren Ziele zu binden. Aus der Gleichung können Sie ersehen, dass der Kd bei niedrigen Konzentrationen eines Arzneimittels ([A]) besonders wichtig ist. Ein Arzneimittel mit einem sehr niedrigen Kd kann selbst bei niedrigen Konzentrationen eine hohe fraktionelle Besetzung aufweisen.

Während die Bindungsaffinität Ihnen sagt, wie fest ein Medikament sein Ziel bindet, ist sie nicht dasselbe wie biologische “Potenz” oder “Aktivität”. Diese Konzepte werden in der Regel mit den folgenden Maßen ausgedrückt, die in der Praxis häufiger zum Screening von Wirkstoffen verwendet werden als Kd oder Ki:

  • Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50), das ist die Konzentration eines Arzneimittels, bei der die Aktivität seines Zielmoleküls (z. B. eines Enzyms) auf 50 % seiner maximalen Aktivität reduziert ist. Medikamente, die die Aktivität ihres Ziels hemmen, werden als “Antagonisten” . bezeichnet
  • Die halbmaximal wirksame Konzentration (EC50), die die Konzentration eines Arzneimittels ist, die eine Reaktion in seinem Ziel induziert, die 50 % der maximal möglichen Reaktion beträgt. Die Reaktion ist ein Maß für die biologische Aktivität des Ziels, beispielsweise die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion. Medikamente, die ihre Ziele aktivieren, werden “Agonisten” genannt. Inverse Agonisten sind Medikamente, die eine entgegengesetzte biologische Reaktion hervorrufen, als ein Agonist verursachen würde

EC50 und IC50 sind zwar keine formalen Maße für die Bindungsaffinität, aber Sie werden vielleicht informell als solche bezeichnet – und es stimmt, dass ein niedrigerer EC50 / IC50 einen niedrigeren Kd / Ki impliziert, wenn alles andere gleich ist.

Die Werte der EC50 / IC50 sind in der Regel höher als die Kd / Ki-Werte, können aber unter bestimmten Bedingungen (z.B. nicht kompetitive Bindung) gleich sein. Für mathematisch interessierte Leser ist dieses Papier ein schöner Überblick darüber, wie das Ki unter verschiedenen Bedingungen mathematisch mit dem IC50 zusammenhängt

Um die Beziehung grob zu veranschaulichen, habe ich Ki vs. IC50 für eine Untermenge von niedermolekularen wirkstoffähnlichen Verbindungen in BindingDB unten aufgetragen.

Obwohl die obige Grafik einige Beispiele für Medikamente mit einem höheren Ki-Wert als IC50 enthält, sollten die Kd / Ki-Werte aufgrund einer mathematischen Beziehung, die als Cheng-Prusoff-Beziehung bekannt ist, theoretisch nicht niedriger als EC50 / IC50 sein. In der Praxis kann IC50 jedoch bei instationären Reaktionen [4] oder experimentellen Fehlern manchmal niedriger als Ki sein.

Warum sind EC50 / IC50-Werte im Allgemeinen größer als die Bindungsaffinität?

Ich habe bereits erwähnt, dass die Werte des EC50 / IC50 in der Regel höher sind als die Kd / Ki-Werte. Bindungsaffinität ist also nicht dasselbe wie biologische Aktivität. Dies kann mehrere mögliche Gründe haben:

  • In Fällen, in denen ein Arzneimittel mit anderen Molekülen (wie dem natürlichen Liganden eines Rezeptors) um eine Bindungsstelle konkurriert, variieren die Werte von EC50 / IC50 in Abhängigkeit von der Konzentration der anderen Moleküle. Dies liegt daran, dass ein Überschuss des Arzneimittels erforderlich ist, um andere Moleküle um die Bindungsstelle zu verdrängen [5]
  • Die Bindungsstelle wird möglicherweise nur in einem seltenen oder vorübergehenden Zustand des Ziels zugänglich, und es kann eine hohe Wirkstoffkonzentration erforderlich sein, damit genügend Arzneimittel “bereit” ist, um die Aktivität des Ziels in den kurzen Zeiträumen effektiv zu binden und zu modulieren wenn es möglich ist [5]
  • Nicht alle Bindungen werden in biologische Aktivität umgewandelt

Dieser letzte Punkt ist es wert, weiter ausgeführt zu werden, während volle Agonisten ihr Ziel maximal aktivieren, rufen partielle Agonisten unabhängig von ihrer Konzentration nur eine submaximale Reaktion hervor. Unten ist eine schöne einfache Grafik aus dem Wikipedia-Artikel über Liganden, die dieses Konzept gut veranschaulicht.

Partielle Agonisten können in Fällen wünschenswert sein, in denen eine maximale Aktivierung des Targets mit Toxizität verbunden ist oder zu einer Desensibilisierung des Rezeptors führen würde [6] .

Inhibitoren binden entweder direkt an die aktiven Zentren ihrer Targets und blockieren die Bindung der natürlichen Liganden (kompetitive Hemmung) oder binden an anderer Stelle des Targets und hemmen die Aktivität indirekt, indem sie eine Konformationsänderung des Targets induzieren oder eine bestimmte Konformation stabilisieren (allosterische oder nicht-kompetitive Hemmung). Allosterische oder nicht-kompetitive Inhibitoren können trotz einer hohen Bindungsaffinität eine teilweise Hemmung aufweisen, indem sie die Wirksamkeit ihres Targets reduzieren, ohne die Aktivität vollständig zu eliminieren.

Welche Zielaffinität streben Medikamentenentwickler an?

Wenn ein Wirkstoffforschungsprogramm beginnt, werden Unternehmen Bibliotheken von Verbindungen [7] mit einem bestimmten Assay durchsuchen und die Bindungsaffinität/-potenz für jeden messen, um die höchste Potenz “hits” für die weitere Entwicklung voranzutreiben. Die Assays zur Messung der Wirksamkeit haben je nach biologischer Funktion des Ziels eine Vielzahl von möglichen Designs. Im Mirati-Beispiel zu Beginn dieses Beitrags haben sie die Aktivität (IC50) gemessen, indem sie den Spiegel von MRTX-849 bestimmt haben, der erforderlich ist, um die Proliferation von Krebszelllinien, die die Zielmutation (KRAS G12C) tragen, halbmaximal zu hemmen.

Als allgemeine Heuristik möchten Entwickler von niedermolekularen Arzneimitteln eine Affinität von weniger als 10 nM für ihre Arzneimittel erreichen. Der spezifische Cut-off ist etwas willkürlich, aber der Bereich unter 10 nM Kd / Ki / EC50 / IC50 ist historisch gesehen der Punkt, an dem viele wirksame Wirkstoffe gelandet sind, und er ist niedrig genug, damit Wirkstoffentwickler sicher sein können, dass sie das gewünschte Ziel ausreichend erreichen . Um Derek Lowe zu zitieren: [8]

Je niedriger [der IC50], desto besser, wenn die anderen Dinge gleich sind. Die meisten Medikamente liegen im nanomolaren Bereich – darunter liegen die ultrapotenten pikomolaren und femtomolaren Bereiche, in die sich nur wenige Verbindungen wagen. Und darüber hinaus, sobald Sie 1000 Nanomolar erreicht haben, ist es mikromolar, und dann ist 1000 Mikromolar ein Millimolar. Nach traditionellen Medizinal-Standards:

  • Einstelliger Nanomolar = gut
  • Zweistelliger Nanomolar = nicht schlecht
  • Dreistelliger Nanomolar oder niedriger Mikromolar = Ausgangspunkt, um etwas besser zu machen
  • Hoher Mikromolar = ignorieren
  • Millimolar = kann mit Sachen von der Unterseite deines Schuhs besser umgehen

Dies wird durch die folgende Folie von Miratis Präsentation auf der AACR im Oktober 2019 [9] schön demonstriert, wo sie die Modifikationen ihrer Starterverbindung skizzieren, um die Wirksamkeit zu erhöhen und zu ihrer letztendlichen Leitverbindung MRTX849 zu gelangen:

Im Vergleich zu kleinen Molekülen können sogenannte “biologische” therapeutische Modalitäten jedoch extrem starke Bindungsaffinitäten am oberen Ende dessen aufweisen, was mit kleinen Molekülen machbar ist – ein Merkmal, das dazu beigetragen hat, diese Klasse von Arzneimitteln so wirksam zu machen und im Allgemeinen sicher. Zum Beispiel:

    Monoklonale Antikörper haben typischerweise Bindungsaffinitäten im niedrigen pikomolaren Bereich, mit einem berichteten Median von etwa 70 pM [10] . Der monoklonale Megablockbuster-Anti-TNF-Antikörper Humira hat beispielsweise einen gemessenen Kd-Wert von 8,6 pM [11] Kd für ein perfekt passendes Ziel ist

Während also 10 nM für ein kleines Molekül ausreichen können, können die Entwickler von Antikörper-Medikamenten etwas mehr von ihren führenden Kandidaten erwarten, bevor sie in die klinische Entwicklung übergehen.

Welche anderen verwandten Metriken sind neben Affinität, Aktivität und Potenz potenziell wichtig?

Der Übergang vom ersten Treffer zu einem endgültigen Arzneimittel beinhaltet oft das Abwägen der verschiedenen Eigenschaften eines Moleküls, das die Bindungsaffinität gegenüber allem anderen optimiert, was zu einem insgesamt suboptimalen Arzneimittel führen kann. Um einen Artikel von J. Singh zu zitieren: [15]

Eine große Herausforderung in der Wirkstoffforschung besteht darin, eine hohe Wirksamkeit und Selektivität in einer Verbindung zu erreichen, ohne deren Molekulargewicht bis zu dem Punkt zu erhöhen, an dem vorteilhafte pharmazeutische Eigenschaften gefährdet sind

Ich habe einige zusätzliche Metriken ausgewählt, die ich in dieser Postselektivität, Ligandeneffizienz und kovalenten Bindung abdecken möchte.

Selektivität:

Die Selektivität, die Neigung eines Arzneimittels, ein Ziel gegenüber einem anderen zu binden, ist ein kritisches Merkmal eines zu handhabenden Arzneimittels. Medikamente, die „hoch selektiv“ sind, haben eine hohe Bindungsaffinität zum primären Ziel und eine niedrige Bindungsaffinität zu einem unerwünschten Ziel, und dies veranschaulicht Mirati auf der rechten Seite ihrer Folie am Anfang des Beitrags. Es kann für Verbindungen wünschenswert sein, an mehrere Ziele zu binden, wenn es mehrere Wege gibt, die zu einer Krankheit beitragen. Viele zugelassene Medikamente binden mehrere verwandte Proteine, wie die JAK-Inhibitoren und andere Pan-Kinase-Inhibitoren.

Wenn die Bindungsaffinität für das primäre Ziel so hoch wie möglich erhöht wird, kann auch dessen Neigung zur Bindung von “off-Target” erhöht werden, was zu Toxizität führt. Daher kann es eine Art “Goldilocks-Zone” für die Bindungsaffinität geben, die durch den biologischen Kontext beeinflusst wird, in dem das Medikament verwendet werden soll. Ein wichtiger Weg, auf dem Arzneimittelentwickler ihren Arzneimittelkandidaten testen, ist das Gegenscreening gegen eine Bibliothek von Zielen, die mit Toxizität verbunden sind, z. hERG (“antitargets”), um zu überprüfen, ob ihr Medikament nicht zu gut an diese “antitargets” bindet.

Ligandeneffizienz:

Ein weiterer metrischer Wirkstoff, den Entwickler wahrscheinlich betrachten werden, ist die Ligandeneffizienz, ein Maß für die erreichte Bindungsaffinität für das Molekulargewicht der Verbindung. Niedrigere Molekulargewichte sind im Allgemeinen vorzuziehen, da größere Wirkstoffe weniger löslich sind und schwerer in die Zielzellen gelangen. Lipinskis berühmte “Rule of five” Heuristik fordert ein Molekulargewicht von weniger als 500 Dalton, obwohl in letzter Zeit immer mehr große orale Medikamente auf den Markt kommen – orales Semaglutid ist ein besonders gutes Beispiel.

Kovalente Bindung

Die meisten Medikamente binden reversibel an ihr Ziel. MRTX-849 ist eigentlich ein zielgerichteter kovalenter Inhibitor, was bedeutet, dass es (möglicherweise irreversible) chemische Bindungen mit seinem Ziel eingeht. Aufgrund von Bedenken hinsichtlich Toxizität und Off-Target-Reaktivität zögerten Arzneimittelentwickler in der Vergangenheit, kovalente Arzneimittel systematisch zu verfolgen. Um J. Singh noch einmal zu zitieren: [15]

Inhibitoren, die auf kovalenten Bindungen beruhen, begünstigen dramatisch die gebundene Form, was zu außergewöhnlich hohen oder für irreversible kovalente Wechselwirkungen sogar im Wesentlichen unendlichen Potenzen und Ligandeneffizienzen führt. Die kovalente Bindung ermöglicht es daher, in Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht routinemäßig eine hohe Wirksamkeit zu erreichen, zusammen mit allen vorteilhaften pharmazeutischen Eigenschaften, die mit einer geringen Größe verbunden sind

Die Affinitätsberechnung für kovalente Inhibitoren erfolgt anders als für nicht-kovalente Inhibitoren, da die Reaktionen nicht reversibel sind. Der IC50 ist theoretisch aufgrund des Einflusses der Reaktionszeit auf den Wert von begrenztem Wert – Mirati hat sich jedoch dennoch dafür entschieden, ihn zu melden.

Andere Überlegungen

Bei der Entwicklung eines Wirkstoffs, der kompetitiv bindet, ist es auch wichtig, die relative Affinität des natürlichen Liganden für das Target im Vergleich zu den Wirkstoffen zu berücksichtigen, da stark bindende natürliche Liganden schwerer zu verdrängen sind und möglicherweise besonders hohe Bindungsaffinitäten erfordern.

Andere Faktoren, die wichtig sein können, sind die Form und Steilheit der Dosis-Antwort-Kurve (bezogen auf die Breite des therapeutischen Fensters), die Variabilität von Zelle zu Zelle innerhalb einer Screening-Assay-Probe [16] , Reaktionskinetik und Ligandenbindungsthermodynamik [17] .


Durch die Anwendung der RIGHT-Technologien und der RIGHT-Assays liefern wir eine vollständige biochemische und biophysikalische Charakterisierung von Ligand-Target-Interaktionen selbst für die anspruchsvollsten Wirkstoffforschungsprojekte.

Die Proteros-Screening-Plattform ermöglicht Einblicke in verschiedene Arten von Hemmungen:

  • Screening auf allosterische Hemmstoffe
  • Protein-Protein-Interaktionsinhibitoren und -verstärker
  • Quantifizierung von Bindungsaffinität und Verweilzeit mit hohem Durchsatz
  • Dekonvolution des nicht-kovalenten und kovalenten Bindungsbeitrags

Proteros eröffnet Wege zu kinetisch optimierten Wirkstoffkandidaten mit erhöhter Wirksamkeit und Selektivität.


HSPMdb: ein rechnergestütztes Repository von Hitzeschock-Proteinmodulatoren

Hitzeschockproteine ​​(Hsp) gehören in allen Lebensbereichen zu den hochkonservierten Proteinen. Obwohl diese Proteine ​​ursprünglich als zelluläre Reaktion auf Stress entdeckt wurden, sind sie auch an einer Vielzahl von zellulären Funktionen beteiligt, wie der Proteinrückfaltung, dem Proteintransport und der zellulären Signalübertragung. Eine große Anzahl potenzieller Hsp-Modulatoren befindet sich in klinischen Studien gegen verschiedene Erkrankungen des Menschen. Da die Zahl der Modulatoren, die auf Hsps abzielen, wächst, besteht die Notwendigkeit, ein umfassendes Wissensarchiv dieser weit verstreuten Ergebnisse zu entwickeln. Aus diesem Grund haben wir mit HSPMdb eine über das Internet zugängliche Datenbank entwickelt, die ein erstes manuell kuratiertes Repository für experimentell validierte Hsp-Modulatoren (Aktivatoren und Inhibitoren) ist. Die Daten wurden aus 176 Forschungsartikeln gesammelt und die aktuelle Version von HSPMdb enthält 10 223 Einträge von Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie die Aktivitäten von fünf Haupt-Hsps (Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60 und Hsp40) modulieren, die aus 15 verschiedenen Organismen (dh Mensch, Hefe) stammen , Bakterien, Viren, Mäuse, Ratten, Rinder, Schweine, Hunde, Hühner, Trypanosoma brucei und Plasmodium falciparum). HSPMdb bietet umfassende Informationen zu biologischen Aktivitäten sowie den chemischen Eigenschaften von Hsp-Modulatoren. Die biologischen Aktivitäten von Modulatoren werden als enzymatische Aktivität und zelluläre Aktivität dargestellt. Unter dem enzymatischen Aktivitätsfeld wurden Parameter wie IC50, EC50, DC50, Ki und KD bereitgestellt. Im Bereich der zellulären Aktivität wurden vollständige Informationen über die zellulären Aktivitäten (prozentuale Hemmung des Zellwachstums, EC50 und GI50), die Art der Zelllebensfähigkeitstests und die verwendete Zelllinie bereitgestellt. Eines der wichtigen Merkmale von HSPMdb besteht darin, dass es Benutzern ermöglicht, zu überprüfen, ob ihre interessierende Verbindung eine Ähnlichkeit mit den zuvor bekannten Hsp-Modulatoren aufweist oder nicht. Wir gehen davon aus, dass HSPMdb eine wertvolle Ressource für die breitere wissenschaftliche Gemeinschaft werden wird, die auf dem Gebiet der Chaperonbiologie und Proteinfehlfaltungskrankheiten arbeitet. HSPMdb ist unter http://bioinfo.imtech.res.in/bvs/hspmdb/index.php frei zugänglich.

© Der/die Autor(en) 2020. Veröffentlicht von Oxford University Press.

Figuren

Schematische Darstellung der Browserseite…

Schematische Darstellung der Browserseite von HSPMdb.

Gesamtzahl der Einträge in…

Gesamtzahl der Einträge in HSPMdb basierend auf der Herkunft von Hsps ( EIN…

Verschiedene Gerüste/Klassen von Modulatoren, die auf…

Verschiedene Gerüste/Klassen von Modulatoren gegen Hsp70 ( EIN ), Hsp90 ( B ),…


Erläuterung

Wenn Kliniker in der Literatur und in den Packungsbeilagen von Medikamenten noch nicht auf Kis gestoßen sind, werden sie wahrscheinlich in Zukunft darauf stoßen.1-3 Das Ki wird zum Teil wichtig, um klinisch relevante Arzneimittelinteraktionen vorherzusagen.1, 3 Einfach ausgedrückt haben die Hemmkonstante (Ki) und die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) eines Arzneimittels, von dem bekannt ist, dass es ein Cytochrom-P450-(CYP)-Enzym hemmt, mit der Konzentration zu tun, die erforderlich ist, um die Aktivität dieses Enzyms zu reduzieren um die Hälfte. Genauer gesagt spiegelt Ki die Bindungsaffinität wider und IC50 spiegelt mehr die funktionelle Stärke des Inhibitors wider, aber beide beeinflussen die Konzentration des vorhandenen Arzneimittels, um die Enzymaktivität zu hemmen. Zu beachten ist, dass bei Arzneimitteln, die nicht-kompetitive Inhibitoren von CYP-Enzymen sind, der Ki eines Arzneimittels im Wesentlichen der gleiche numerische Wert wie der numerische Wert der IC50 ist, während bei kompetitiver und nicht-kompetitiver Hemmung der Ki etwa halb so groß ist wie der von IC50.3 , je kleiner Ki, desto weniger Medikamente werden benötigt, um die Aktivität dieses Enzyms zu hemmen.

Wenn ein Ki viel höher ist als die maximalen Plasmakonzentrationen des Arzneimittels, denen ein Patient bei einer typischen Dosierung ausgesetzt ist, dann ist es unwahrscheinlich, dass dieses Arzneimittel die Aktivität dieses Enzyms hemmt. Dieser Effekt kann sich auch im [I]/Ki-Verhältnis widerspiegeln.1 Ein klinisch relevantes Beispiel dafür ist die Bewertung des Ki für Protonenpumpenhemmer (PPIs) auf das Cytochrom P-450 (CYP) 3A4-Enzym.4 In diesem Beispielsweise sind die Kis für die meisten PPIs (42 bis 51 mM) signifikant höher als ihre jeweiligen maximalen Konzentrationen (1 bis 5,2 mM) bei Patienten, die entweder stark metabolisieren oder schlecht metabolisieren von 2C219.4-9 Weil die Kis für PPIs so hoch sind viel höher als die bei typischer Dosierung beobachteten maximalen Wirkstoffkonzentrationen, hemmen die meisten PPIs wahrscheinlich die Aktivität von CYP3A4 nicht.

Es ist auch wichtig, bei der Interpretation oder Überprüfung des Ki für ein bestimmtes Medikament zu erkennen, dass einige Faktoren bekanntermaßen den aus einer Studie erhaltenen Wert beeinflussen. Zu diesen Faktoren gehören die Spezifität des Substrats, die Bindungskomponenten im Inkubationssystem und jegliche Substrat- oder Inhibitor-Verarmung.1 In Bezug auf das Inkubationssystem kann der Ki je nach verwendetem biologischen System schwanken, was zu einem Bereich für Ki führt. 4,10

Daher ist die Verwendung des Ki hilfreich, um die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass ein bestimmtes Medikament ein bestimmtes Enzym hemmt und zu einer klinisch relevanten Arzneimittelwechselwirkung mit einem Substrat für das Enzym führt. In vielen Fällen ist die Bewertung des Ki in Bezug auf die Konzentration des im Körper vorhandenen Inhibitors bereits erfolgt und wird als Grundlage für Programme oder bestimmte Arzneimittelinformationsquellen verwendet, um ein bestimmtes Medikament als Inhibitor zu melden oder nicht. Ebenso wichtig ist es für Kliniker zu erkennen, dass alle Medikamente je nach ihrer Markteinführung vollständig evaluiert wurden oder nicht. In solchen Fällen oder Situationen müssen Kliniker möglicherweise auf diese Bewertungsmethode zurückgreifen, wenn sie versuchen, die Wahrscheinlichkeit einer Arzneimittelwechselwirkung zwischen gleichzeitig verabreichten Medikamenten zu erkennen.


Ligandenbindungsassays: IC50, EC50 und Kd - Biologie

Hintergrund Eine wichtige Barriere für eine wirksame Immuntherapie bei Krebs ist die immunsuppressive Tumor-Mikroumgebung (TME), die durch infiltrierende regulatorische T-Zellen (Tregs) und myeloische Suppressorzellen (MDSC) gekennzeichnet ist. Während die Erschöpfung immunsuppressiver Zellen eine vielversprechende Strategie für die Krebsimmuntherapie ist, sind aktuelle Ansätze aufgrund fehlender Spezifität und Sicherheitsbedenken ineffektiv. Der Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (TNFR2) entwickelt sich als neues, selektives Ziel zur Überwindung der Immunsuppression bei TME. Die TNFR2-Expression ist im Allgemeinen auf stark immunsuppressive Zellpopulationen in der TME beschränkt und der TNFR2-TNF-α-Weg spielt eine wichtige Rolle bei der Erzeugung und dem Überleben dieser Zellen. TNFR2 ist auch ein Onkogen, das bei bestimmten Tumoren hochreguliert ist und das Überleben von Tumorzellen verbessern kann. Somit ist das Targeting von TNFR2 ein vielversprechender therapeutischer Ansatz mit mehreren potentiellen Wirkmechanismen.

Methoden Mit APXiMAB™, der proprietären monoklonalen Kaninchen-Antikörpertechnologie von Apexigen, wurde ein vielfältiges Panel von Antikörpern gegen TNFR2 erstellt. Eine solide Bewertung von über 100 Antikörperkandidaten für TNFR2-Bindung, TNF-α-Blockade und funktionelle Assays ergab APX601, einen humanisierten IgG1-Antikörper, als den führenden therapeutischen Kandidaten. Die Fähigkeit von APX601, die Immunsuppression umzukehren, wurde in Treg- und MDSC-Suppressionsassays untersucht. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit von APX601 zur Depletion von TNFR2-exprimierenden Treg- und Tumorzellen sowohl in vitro als auch in vivo unter Verwendung des Maus-Colo205-Xenograft-Modells untersucht.

Ergebnisse APX601 bindet spezifisch an humanes TNFR2 mit hoher Affinität (Kd = 47 pM) und erkennt ein einzigartiges Epitop in der CRD1-Domäne von TNFR2. APX601 ist ein potenter Antagonist, der die TNFR2-TNF-α-Interaktion in zellbasierten Ligandenbindungsassays blockiert (IC50 = 0,149 nM). APX601 ist in der Lage, die Immunsuppression über zwei Mechanismen umzukehren: 1) signifikante Blockade der immunsuppressiven Funktionen von Tregs und MDSCs durch Hemmung der Bindung von TNFR2 an seinen Liganden TNF-α und 2) Depletion von TNFR2-exprimierenden Tregs, MDSC und Tumorzellen über Antikörper-abhängige Zellzytotoxizität (ADCC) (EC50 = 1,14 nM) und ADCP (EC50 = 0,71 nM) Effektorfunktionen.

Schlussfolgerungen APX601 ist ein potenter TNFR2-Antagonist-Antikörper, der die Immunsuppression umkehrt, indem er auf TNFR2-exprimierende Treg und MDSC abzielt und das Abtöten von Tumorzellen induziert. Unsere Daten unterstützen die Weiterentwicklung von APX601, einem vielversprechenden immuntherapeutischen Antikörper mit mehreren potentiellen Wirkmechanismen, zur Behandlung einer Vielzahl solider Tumoren.

Ethik-Zulassung Gesunde menschliche Blutproben wurden vom Stanford Blood Center (Palo Alto, CA) von einwilligenden Spendern nach einem genehmigten Protokoll erhalten.


  • Entfernen Sie alle Leerzeichen aus Katalognummern. Anstatt beispielsweise nach "AZ 12345" zu suchen, versuchen Sie, nach "AZ12345" zu suchen.
  • Wir empfehlen, weniger Wörter zu verwenden. Anstatt beispielsweise nach "Countess Automated Cell Counter" zu suchen, suchen Sie nach "Countess".
  • Wir empfehlen die Verwendung breiterer oder allgemeiner Begriffe. Sie können Ihre Suche verfeinern, indem Sie Filter wie Produktkategorie, Anwendung, Marke und mehr verwenden.
  • Überprüfen Sie die Rechtschreibung der Suchbegriffe erneut oder verwenden Sie die automatische Vorschlagsfunktion im Suchfeld.

Detaillierte Suchtipps

Um eine Suche durchzuführen, geben Sie einige beschreibende Wörter, eine Katalognummer oder einen Produktnamen ein. Die Suche gibt alle Dokumente oder Webseiten zurück, die eines der Wörter aus Ihrer Abfrage enthalten. Sie können Ihre Suche verfeinern oder eingrenzen, indem Sie Wörter von Ihrer Suchanfrage abziehen oder in der oberen oder linken Spalte filtern.