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Labor 5: Direkte Färbung und indirekte Färbung – Biologie

Labor 5: Direkte Färbung und indirekte Färbung – Biologie


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A. EINFÜHRUNG IN DAS FÄRBEN

DISKUSSION

In unserem Labor kann die Bakterienmorphologie (Form und Struktur) auf zwei Arten untersucht werden:

  • durch Beobachtung lebender, ungefärbter Organismen (Nassfassung) oder
  • durch Beobachten abgetöteter gefärbter Organismen.

Da Bakterien fast farblos sind und daher wenig Kontrast zu der Brühe, in der sie suspendiert sind, aufweisen, sind sie ungefärbt schwer zu beobachten. Das Färben von Mikroorganismen ermöglicht:

  • sehen einen größeren Kontrast zwischen dem Organismus und dem Hintergrund,
  • verschiedene morphologische Typen unterscheiden (nach Form, Anordnung, Grammreaktion usw.),
  • bestimmte Strukturen beobachten (Geißeln, Kapseln, Endosporen usw.).

Bevor Sie Bakterien anfärben, müssen Sie zuerst verstehen, wie man "fixieren" Sie die Organismen auf dem Objektträger. Wenn das Präparat nicht fixiert ist, werden die Organismen während der Färbung vom Objektträger abgewaschen. Eine einfache Methode ist die Lufttrocknung und Hitzefixierung. Die Organismen werden hitzefixiert, indem ein luftgetrockneter Abstrich der Organismen durch die Flamme eines Gasbrenners geleitet oder vor die Öffnung einer Mikroverbrennungsanlage gehalten wird. Die Hitze koaguliert die Proteine ​​der Organismen, wodurch die Bakterien am Objektträger haften bleiben.

Die Verfahren zur Hitzefixierung ist wie folgt:

1. Wenn die Kultur aus einem Agarmedium:

A. Verwendung der Tropfflasche von deionisiertes Wasser in Ihrem Färbeständer gefunden, Platz 1/2 eines normal großen Tropfens Wasser auf einem sauberen Objektträger, indem Sie mit der Pipette den Objektträger berühren (siehe Abb. 2). Verwenden Sie alternativ Ihre sterilisierte Impföse, um einen Tropfen entionisiertes Wasser auf den Objektträger zu geben.

B. Entfernen Sie mit Ihrer sterilen Impföse aseptisch geringe Menge der Kultur von der Agaroberfläche und 2 - 3 mal sanft berühren zum Wassertropfen bis das Wasser wird sichtbar trüb (siehe Abb. 3).

C. Verbrennen Sie die verbleibenden Bakterien auf der Impföse. Wenn dem Wasser zu viel Kultur zugesetzt wird, sehen Sie keine gefärbten einzelnen Bakterien.

D. Nachdem die Impföse abgekühlt ist, Verteilen Sie die Suspension auf etwa der Hälfte des Objektträgers einen dünnen Film zu bilden (siehe Abb. 4).

e. Lassen Sie diese dünne Aufhängung komplett lufttrocknen (siehe Abb. 5). Der Ausstrich muss vollständig trocken sein, bevor der Objektträger hitzefixiert wird!

F. Um die Bakterien auf dem Objektträger zu fixieren, Nehmen Sie den luftgetrockneten Objektträger mit einer Deckglaszange auf und halten Sie den Boden des Objektträgers gegenüber dem Ausstrich in der Nähe der Öffnung des Mikroverbrennungsofens für 10 Sekunden (siehe Abb. 6) wie von Ihrem Ausbilder demonstriert. Wenn der Objektträger nicht ausreichend erhitzt wird, werden alle Bakterien abgewaschen. Bei Überhitzung kann die strukturelle Integrität der Bakterien beschädigt werden.

2. Wenn der Organismus aus a . entnommen wird Brühe Kultur:

A. Mit einem Sharpie, Zeichne einen Kreis um die Größe eines Nickels auf der Unterseite Ihres Objektträgers (siehe Abb. 10)

B. Drehen Sie die Folie um. Platzieren Sie mit Ihrer sterilen Impföse 2 oder 3 Ösen der Kultur aseptisch innerhalb dieses Kreises auf der oben des Schlittens (siehe Abb. 11). Kein Wasser verwenden.

C. Mit der Impföse verteilen Sie die Suspension über die durch den Kreis abgegrenzte Fläche einen dünnen Film zu bilden.

D. Lassen Sie diese dünne Aufhängung komplett lufttrocknen.

e.Um die Bakterien auf dem Objektträger durch Hitze zu fixieren, Nehmen Sie den luftgetrockneten Objektträger mit einer Deckglaszange auf und halten Sie den Boden des Objektträgers gegenüber dem Ausstrich in der Nähe der Öffnung des Mikroverbrennungsofens für 10 Sekunden (siehe Abb. Bei Überhitzung kann die strukturelle Integrität der Bakterien beschädigt werden.

Um zu verstehen, wie das Färben funktioniert, ist es hilfreich, ein wenig über die physikalische und chemische Natur von Flecken zu wissen. Bei Flecken handelt es sich im Allgemeinen um Salze, bei denen eines der Ionen gefärbt ist. (Ein Salz ist eine Verbindung, die aus einem positiv geladenen Ion und einem negativ geladenen Ion besteht.) Zum Beispiel ist der Farbstoff Methylenblau eigentlich das Salz Methylenblauchlorid, das in Wasser in ein positiv geladenes Methylenblau-Ion mit blauer Farbe dissoziiert und ein negativ geladenes Chloridion, das farblos ist.

Farbstoffe oder Flecken können in zwei Gruppen eingeteilt werden: basisch und sauer. Befindet sich der Farbanteil des Farbstoffs im positives Ion, wie im obigen Fall heißt es a basischer Farbstoff (Beispiele: Methylenblau, Kristallviolett, Safranin). Wenn der Farbanteil im negativ geladenes Ion, es heißt an saurer Farbstoff (Beispiele: Nigrosin, Kongorot).

Aufgrund seiner chemischen Natur, das Zytoplasma aller Bakterienzellen ist leicht negativ geladen beim Wachsen in einem Medium mit nahezu neutralem pH-Wert. Daher wird bei Verwendung von a basischer Farbstoff, verbindet sich der positiv geladene Farbanteil der Färbung mit dem negativ geladenen bakteriellen Zytoplasma (entgegengesetzte Ladungen ziehen sich an) und der Organismus wird direkt gebeizt (siehe Abb. 1). Ein saurer Farbstoff, reagiert aufgrund seiner chemischen Natur unterschiedlich. Da sich der Farbanteil des Farbstoffs auf dem negativen Ion befindet, verbindet er sich nicht leicht mit dem negativ geladenen bakteriellen Zytoplasma (wie Ladungen abstoßen). Stattdessen bildet es a Ablagerung um den Organismus, wodurch der Organismus selbst farblos bleibt (siehe Abb. Da der Organismus indirekt gesehen wird, nennt man diese Art der Färbung indirekt oder Negativ, und wird verwendet, um eine genauere Ansicht der Bakteriengröße, -formen und -anordnungen zu erhalten.

Im heutigen Labor werden wir verschiedene Mikroorganismen sowohl direkt als auch indirekt anfärben.

B. DIREKTE FARBE MIT EINER BASISFARBE

Bei der Direktfärbung verbindet sich der positiv geladene Farbanteil des basischen Farbstoffs mit dem negativ geladenen Bakterium und der Organismus wird direkt gefärbt.

ORGANISMEN

Deine Reinkulturen von Staphylococcus epidermidis (Kokken mit Staphylokokken-Anordnung) oder Micrococcus luteus (Kokken mit Tetrade oder Sarcina-Anordnung) und Escherichia coli (kleiner Bazillus) oder Enterobacter aerogenes (kleiner Bazillus) aus Labor 3.

VERFAHREN (individuell zu erledigen)

1. Escherichia coli oder Enterobacter aerogenes

A. Hitze-fixieren Sie einen Abstrich von entweder Escherichia coli oder Enterobacter aerogenes wie folgt:

1. Verwenden Sie alternativ Ihre sterilisierte Impföse, um einen Tropfen entionisiertes Wasser auf den Objektträger zu geben.

2. 3).

3. Wenn dem Wasser zu viel Kultur zugesetzt wird, sehen Sie keine gefärbten einzelnen Bakterien.

4. 4).

5. Der Ausstrich muss vollständig trocken sein, bevor der Objektträger hitzefixiert wird!

6. Bei Überhitzung kann die strukturelle Integrität der Bakterien beschädigt werden.

B. Legen Sie den Objektträger auf ein Färbetablett und bedecken Sie den gesamten Film mit Safranin (siehe Abb. 7A). Fleck für eine Minute.

C. Heben Sie den Objektträger an einem Ende an und halten Sie ihn schräg über die Färbeschale. Verwenden Sie die Waschflasche auf der Tischplatte vorsichtig überschüssiges Safranin abwaschen vom Schlitten (siehe Abb. 7B). Waschen Sie auch alle Flecken ab, die auf die Unterseite auch der Folie.

D. Verwenden Sie ein Löschpapier, um tupfen Sie die Folie trocken (siehe Abb. 8). Beobachten Sie mit Ölimmersionsmikroskopie.

2. Micrococcus luteus oder Staphylococcus epidermidis

A. Hitze-fixieren Sie einen Abstrich von entweder Micrococcus luteus oder Staphylococcus epidermidiswie folgt:

1. Fleck mit Kristallviolett zum eine Minute.

C. Überschüssiges Kristallviolett mit Wasser abwaschen.

D. Trocken tupfen und mit Ölimmersionsmikroskopie beobachten.

3. Bereiten Sie einen dritten Objektträger der normalen Flora und Zellen Ihres Mundes wie folgt vor:

A. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um die Innenseite Ihres Mundes und Ihr Zahnfleisch kräftig abzukratzen.

B. Reiben Sie den Tupfer über den Objektträger (kein Wasser verwenden), luftgetrocknet, und Hitzefix.

C. Fleck mit Kristallviolett zum 30 Sekunden.

D. Überschüssiges Kristallviolett mit Wasser abwaschen.

e. Trocken tupfen und beobachten. Finden Sie Epithelzellen mit Ihrem 10X-Objektiv, zentrieren Sie sie im Feld und wechseln Sie zur Ölimmersion, um Ihre normalen Bakterienflora auf und um Ihre Epithelzellen zu beobachten.

4. Achten Sie darauf, dass Sie die verbrauchte Farbe in Ihrer Färbeschale vorsichtig in den Farbabfall-Sammelbehälter gießen. nicht die Spüle runter.

C. INDIREKTER FLECK MIT EINEM SAUEREN FARBSTOFF Bei der Negativfärbung wird der negativ geladene Farbanteil des sauren Farbstoffs von der negativ geladenen Bakterienzelle abgestoßen. Dadurch wird der Hintergrund gefärbt und die Zelle bleibt farblos.

ORGANISMUS

Nutze die Reinkultur von Micrococcus luteus bereitgestellt.

VERFAHREN (individuell zu erledigen)

1. Platziere a kleiner Tropfen Nigrosin zu einem Ende eines sauberen Objektträgers.

2. Fügen Sie mit Ihrer sterilen Impföse aseptisch eine kleine Menge . hinzu Micrococcus luteus zum Farbstoff und mischen Sie vorsichtig mit der Schlaufe.

3. Mit dem Rand eines anderen Objektträgers die Mischung mit unterschiedlichem Druck über den Objektträger verteilen, so dass sich abwechselnd helle und dunkle Bereiche (siehe Abb. 9). Stellen Sie sicher, dass der Farbstoff ist nicht zu dick oder du wirst die Bakterien nicht sehen!

4. Lassen Sie die Folie vollständig an der Luft trocknen auf der Folie. Nicht hitzefixieren und den Farbstoff nicht abwaschen.

5. Achten Sie darauf, dass Sie die verbrauchte Farbe in Ihrer Färbeschale vorsichtig in den Farbabfall-Sammelbehälter gießen. nicht die Spüle runter.

6. Beobachten Sie mit Ölimmersionsmikroskopie. Suchen Sie einen Bereich, der weder zu viel noch zu wenig Farbstoff enthält (ein Bereich, der helles Lila wo das Licht durch die Folie kommt). Wenn der Farbstoff zu dick ist, wird nicht genügend Licht durchgelassen; Wenn der Farbstoff zu dünn ist, ist der Hintergrund für einen ausreichenden Kontrast zu hell.

ERGEBNISSE

Machen Sie Zeichnungen von Ihren drei direkten Farbpräparationen und Ihrer indirekten Farbpräparation.


Tech-Tipp: Kombinierte direkte und indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von Primärantikörpern aus demselben Wirt

Immunfluoreszenz kann auf zwei Arten durchgeführt werden, durch direkten oder indirekten Nachweis. Direkte Immunfluoreszenz verwendet einen Fluorophor-konjugierten Antikörper, um das Zielprotein zu färben. Indirekte Immunfluoreszenz beinhaltet zuerst die Bindung des primären Antikörpers an das Ziel und dann den Nachweis des primären Antikörpers unter Verwendung eines konjugierten sekundären Antikörpers. Die indirekte Immunfluoreszenz bietet den Vorteil einer höheren Sensitivität. Jedes konjugierte Antikörpermolekül trägt normalerweise 4-6 Fluoreszenzfarbstoffe. Bei direkter Immunfluoreszenz mit monoklonalen Antikörpern kann nur ein Antikörper an sein Zielantigen auf dem Protein binden und es mit 4-6 Farbstoffmolekülen markieren. Bei der indirekten Immunfluoreszenz binden mehrere sekundäre Antikörper an jeden primären Antikörper, wodurch die Anzahl der mit dem Zielprotein assoziierten Farbstoffe stark erhöht wird. Die direkte Immunfluoreszenz bietet jedoch den Vorteil, eine Probe gleichzeitig mit mehreren Primärantikörpern derselben Wirtsspezies anfärben zu können.

Sekundärantikörper erkennen immer noch einen farbstoffkonjugierten Primärantikörper, daher kann ein direkt markierter Antikörper nicht in einem einzigen Färbeschritt mit einem unkonjugierten Primärantikörper derselben Spezies kombiniert werden, da der markierte Sekundärantikörper sowohl die markierten als auch die unmarkierten Primärantikörper erkennt. Die Färbung kann jedoch sequentiell durchgeführt werden, um einen indirekten Nachweis des ersten Primärantikörpers unter Verwendung eines Sekundärantikörpers zu ermöglichen, gefolgt von einer Färbung mit einem direkt markierten Primärantikörper derselben Spezies, ohne Kreuzreaktivität mit dem Sekundärantikörper. Das folgende Protokoll liefert ein Beispiel für die sequentielle Färbung mit zwei unkonjugierten Primärantikörpern aus Kaninchen- und Mauswirten, gefolgt von einem direkt markierten Mausprimärantikörper. Es kann für andere Kombinationen von primären Antikörper-Wirtsspezies angepasst werden.

Protokoll für kombinierte direkte und indirekte Immunfluoreszenz

1. Führen Sie die Fixierung, Permeabilisierung und Blockierung Ihrer Proben gemäß dem bevorzugten Protokoll für Ihre Primärantikörper durch.

Notiz: Weitere Informationen zur Fixierung, Permeabilisierung und Blockierung finden Sie in unseren Protokollen für die antikörperbasierte Detektion.

2. Proben mit unmarkierten Maus- und Kaninchen-Primärantikörpern, verdünnt in Blockierungspuffer, in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.

3. Spülen Sie die Proben dreimal mit PBS und führen Sie dann 3 x 5-minütige Waschvorgänge mit PBS durch.

4. Inkubieren Sie die Proben mit fluoreszierenden Anti-Maus- und Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern, verdünnt in Blockierungspuffer, 30 Minuten bis 2 Stunden lang bei Raumtemperatur und lichtgeschützt. Typischerweise werden fluoreszierende sekundäre Konjugate in einer Endkonzentration von 1-2 ug/ml verwendet.

Notiz: Achten Sie darauf, für alle Antikörper-Wirtsspezies stark kreuzadsorbierte Sekundärantikörper mit minimaler Kreuzreaktivität zu verwenden. Stellen Sie beim Färben von menschlichen oder tierischen Gewebeschnitten, die endogene Immunglobuline enthalten können, sicher, dass die sekundären Antikörper auch eine minimale Kreuzreaktivität mit dem Gewebe selbst aufweisen.

5. Proben dreimal mit PBS spülen, dann 3 x 5 Minuten lang mit PBS lichtgeschützt waschen.

6. Proben mit direkt markiertem Maus-Primärantikörper, verdünnt in Blockierungspuffer, 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. In diesem Schritt können nukleäre Gegenfärbungen oder markiertes Phalloidin eingeschlossen werden.

Notiz: Möglicherweise müssen Sie eine höhere Konzentration des direkt markierten Primärantikörpers verwenden als für die indirekte Immunfluoreszenz.

7. Die Proben dreimal mit PBS spülen, dann 3 x 5 Minuten lang mit PBS lichtgeschützt waschen.

8. Montieren Sie die Proben in ein Antifade-Eindeckmedium und ein Bild.


Beispieldaten

Kombinierte direkte und indirekte Immunfluoreszenzfärbung von Ratten-Retina-Kryosektion mit Maus-Anti-Neurofilament H und CF™568 Ziegen-Anti-Maus (min x Ratte) (neuronale Prozesse, rot), Kaninchen-Anti-GFAP und CF™488A Ziegen-Anti-Kaninchen, hoch kreuzadsorbiert (Gliazellen, grün), gefolgt von CF™640R Mix-n-Stain™ markiertem Maus-Anti-ZO1 (tight Junctions, magenta). Eingebettet in Everbrite™ Eindeckmedium mit DAPI (Kerne, blau). Kombinierte direkte und indirekte Immunfluoreszenzfärbung von Rattenhoden mit Maus-Antitubulin und CF™488A Ziegen-Anti-Maus (min x Ratte) (Mikrotubuli, grün), gefolgt von CF™555 Mix-n-Stain-markiertem Maus-Anti-ZO1 (tight Verbindungen, rot) und CF™640R Phalloidin (Aktinfilamente, cyan).

Verwandte Produkte

Biotium bietet eine große Auswahl an hochgradig kreuzadsorbierten Sekundärantikörpern, die mit unseren hellen und photostabilen CF™-Farbstoffen konjugiert sind. Wir bieten auch mehr als 1000 Primärantikörper an, die in gereinigtem Format oder mit Ihrer Wahl von 13 CF™-Farbstoffen erhältlich sind. Darüber hinaus bieten Ihnen unsere Mix-n-Stain™-Antikörper-Kits eine schnelle und einfache Möglichkeit, Ihren eigenen Primärantikörper mit einer großen Auswahl an CF™-Farbstoffen zu konjugieren. Sehen Sie sich auch unsere Zubehörprodukte für Immunfluoreszenz an, darunter TrueBlack™ Lipofuscin Autofluorescence Quencher, EverBrite™ Antifade-Eindeckmedien und CoverGrip™ Coverslip Sealant.


Direkte vs indirekte Immunfluoreszenz

​​Immunfluoreszenz-(IF)- oder Zell-Imaging-Techniken basieren auf der Verwendung von Antikörper ein spezifisches Zielantigen mit einem Fluoreszenzfarbstoff (auch Fluorophore oder Fluorochrome genannt) wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) zu markieren. Bei IF werden üblicherweise Antikörper verwendet, die chemisch an Fluorophore konjugiert sind.

​ Das Fluorophor ermöglicht die Visualisierung der Zielverteilung in der Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop (zB Epifluoreszenz- und Konfokalmikroskop). Je nachdem, ob der Fluorophor an den Primär- oder den Sekundärantikörper konjugiert ist, unterscheiden wir zwei IF-Methoden:

  • Direct IF verwendet einen einzelnen Antikörper, der gegen das interessierende Ziel gerichtet ist. Die primärer Antikörper wird direkt an ein Fluorophor konjugiert.
  • Indirekter IF verwendet zwei Antikörper. Die primärer Antikörper unkonjugiert ist und ein fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper, der gegen den Primärantikörper gerichtet ist, zum Nachweis verwendet wird.

Das folgende Diagramm stellt sowohl direkte als auch indirekte Methoden dar.

Beide Methoden haben ihre Vor- und Nachteile, wie in der folgenden Tabelle dargestellt.

Protokolle für direkte IF sind normalerweise kürzer, da sie nur einen Markierungsschritt erfordern.

Direkte und indirekte Verfahren sind nicht auf Immunfluoreszenz beschränkt. Sie sind auch für andere Techniken relevant, die auf der Verwendung von Fluorophor-konjugierten Antikörpern beruhen, wie Durchflusszytometrie, ELISA, Western Blot und Immunhistochemie.

Der Nachweis von Proteinen mit geringer Häufigkeit kann selbst mit indirekten Methoden manchmal eine Herausforderung darstellen. Biotinylierte Antikörper bieten eine zusätzliche Schicht für eine erhöhte Signalverstärkung. Erfahren Sie hier mehr über die Funktionsweise von Methoden, die auf der Verwendung von Biotin-konjugierten Antikörpern basieren.


Negatives Färbeverfahren

  1. Nehmen Sie einen sauberen, fettfreien und trockenen Objektträger.
  2. Gib einen minimalen Tropfen nigrosin mit einer Pipette zu einem Ende des Objektträgers.
  3. Dann nimm die Inokulum von den Kulturplatten oder Schrägkultur über eine sterilisierte Impföse entnehmen und mit einem Tropfen Nigrosin mischen.
  4. Danach eine weitere saubere, fettfreie und trockener Objektträger und legen Sie das eine Ende zur Mitte hin.
  5. Dann, Schieflage schieben Sie das Glas über den Farbstoff, der den Testorganismus enthält, indem Sie einen spitzen Winkel bilden.
  6. Ziehen Sie den geneigten Objektträger leicht, bis er den Tropfen des Kulturorganismus berührt, und ziehen über den Rand des Objektträgers, um ein gleichmäßiges, breites und dünner Bakterienabstrich.
  7. Lassen Sie den Objektträger luftgetrocknet (nicht erhitzen).
  8. Zuletzt einen Tropfen Ölimmersion und beobachten Sie den Objektträger unter dem Mikroskop auf das Auftreten einer farblosen Bakterienzelle mit grauem Hintergrund.


Vorteile

  • Durch Negativfärbung sind klare ungefärbte Zellen vor dem schwarz gefärbten Hintergrund leicht zu erkennen.
  • Ein negatives Färbeverfahren beinhaltet nicht die Hitzefixierung der Probe. Als Ergebnis verformt sich die Zelle nicht durch die Hitze.
  • Es kann auch wärmeempfindliche Mikroorganismen wie Spirochäten, Hefen usw.
  • Die Negativ-Färbetechnik ermöglicht auch die Untersuchung einer transparenten Kapsel um die Zellwand verschiedener Mikroorganismen wie Cryptococcus neoformans.
  • Es ist eine ziemlich einfache und schnelle Methode, bei der nur eine einzige saure Beize verwendet wird.

Nachteile

  • Negative Färbung liefert nicht viele Informationen über die Zelle eher als die Zellgröße, -form und -anordnung.
  • Mit dieser Technik können wir keinen bestimmten Stamm oder eine Art von Organismus untersuchen.

Abschluss

Daher können wir schlussfolgern, dass eine negative Färbetechnik eine einfache Methode ist, um den Mikroorganismus mit einer einzigen sauren Färbung zu untersuchen. Negative Färbung führt zu einer ungefärbten oder klaren Probe mit dunklem Hintergrund.

Zwischen dem negativ geladenen Farbstoff und der Probe tritt eine Abstoßung auf, woraufhin wir Zellen unterschiedlicher Form und Größe beobachten können ungefärbte Umrisse gegen a fleckiger Hintergrund.


Labor 5: Plattwurm und kleinere Lophotrochozoen

Stamm Rotifera: Rädertierchen
Stamm Acanthocephala: stachelige Würmer
Stamm Ectoprocta (Bryozoa) &ndash &ldquomoss Tiere&rdquo (Bugula, Plumatella)
Stamm Brachiopoda &ndash &ldquolampshells&rdquo (Lingula, Terebratella)

Phylum Ab diesem Zeitpunkt haben alle auf der Zoo Lab-Website behandelten Tiere eine primäre bilaterale Symmetrie und sind triploblastisch, d. Während die radiale Symmetrie gut für sitzende oder sich langsam bewegende Formen geeignet sein kann, benötigen Tiere, die aktiv auf der Suche nach Nahrung, Unterschlupf und Partner sind, einen neuen Körperplan. Bilaterale Symmetrie in Verbindung mit Cephalisation löst diese Probleme. Das vordere Ende bewegt sich nach vorne und das hintere folgt. Die dorsale Seite wird nach oben und die ventrale Seite nach unten gehalten und ist normalerweise auf die Fortbewegung spezialisiert.

Der bilaterale Grad der Metazoen wird weiter in zwei Hauptabteilungen unterteilt: die Protostome und Deuterostomen, die aufgrund einer Reihe embryologischer Unterschiede getrennt werden. Beweise aus der Sequenzanalyse des ribosomalen Gens mit kleiner Untereinheit deuten darauf hin, dass sich die Protostome einige Zeit nach der Divergenz der Vorfahren von Deuterostomen und Protostomen während des Kambriums in zwei große Gruppen (Superphyla) aufspalten, die Ecdysozoa und Lophotrochozoa. In diesem Labor werden wir einen Acoelomat-Lophotrochozoen-Stamm und mehrere kleinere Pseudocoelomat- und Eucoelomat-Lophotrochozoen-Stamm untersuchen.

Der Stamm Platyhelminthes enthält über 20.000 freilebende und parasitische Arten von acoelomaten Tieren, die Plattwürmer genannt werden. Bei Plattwürmern ist der Körper dorsoventral abgeflacht, wobei sich Mund und Genitalporen normalerweise in ventraler Position befinden. Der Raum zwischen Darm und Außenseite ist mit mesodermalen Muskelfasern und undifferenziertem Parenchym gefüllt. Obwohl flüssigkeitsgefüllte Räume im Parenchym als hydrostatisches Skelett zur Unterstützung und zum inneren Transport dienen, fehlt den Tieren eine Körperhöhle, weshalb sie als Acoelomat bezeichnet werden. Die meisten freilebenden Plattwürmer haben ein Verdauungssystem vom gastrovaskulären Typ (ein Mund ist vorhanden, aber kein Anus), während parasitäre Formen im Allgemeinen kein Verdauungssystem haben.

Plattwürmer haben ein zentralisiertes Nervensystem, das aus einem Paar Hirnganglien und Längsnervensträngen besteht, die mit Quernerven verbunden sind. Das Ausscheidungssystem (in einigen Formen nicht vorhanden) besteht aus zwei seitlichen Kanälen mit Protonephridien, die Flammenzellen tragen. Obwohl viele Plattwürmer freilebend sind, enthält der Stamm auch einige sehr wichtige parasitäre Arten.

In Bezug auf die Fortpflanzung können sich Plattwürmer sexuell oder ungeschlechtlich fortpflanzen. Die meisten Arten sind einhäusig, praktizieren jedoch Kreuzbefruchtung. Viele Süßwasser-Turbellarien können sich ungeschlechtlich durch Spaltung vermehren, bei der sich das Tier einfach in zwei Hälften teilt, von denen jede die andere Hälfte regeneriert. Bei einigen Turbellarien (wie bei den meisten anderen Tieren) enthält das Eigelb, das die Nahrung für den sich entwickelnden Embryo liefert, in der Eizelle selbst einen Zustand, der als Endolecithal bezeichnet wird. Bei den Monogeneanern, Trematoden und Cestoden (sowie bei einigen Turbellarien) wird das Eigelb von Zellen beigesteuert, die aus Organen, den sogenannten Dotterdrüsen, freigesetzt werden, und die Eier werden daher als Ektolecital bezeichnet. Die Entwicklung kann direkt oder indirekt erfolgen.

Die Klasse Turbellaria enthält meist freilebende Formen mit einer Größe von wenigen mm bis 50 cm. Die meisten Arten sind Bodenbewohner in Meeres- und Süßwasserumgebungen, die über Felsen, Sand oder Vegetation kriechen. Kleinere Formen können mit ventralen Zilien schwimmen, aber häufiger bewegen sie sich, indem sie eine Schleimschicht ablegen, die die Adhäsion unterstützt und den Zilien hilft, Traktion zu gewinnen. Größere Formen verwenden starke Muskelkontraktionen zum Krabbeln oder Schwimmen. Einzigartig bei Turbellarien sind stäbchenförmige Rhabditen, die in den ventralen Epidermiszellen der Körperoberfläche vorkommen. Diese Rhabditen scheiden Schleim aus, der den Körper des Tieres bedeckt, möglicherweise zum Schutz vor Fressfeinden oder um das Austrocknen zu verhindern.

In Bezug auf die Ernährung sind die meisten Turbellarien Raubtiere und Aasfresser. Epidermale Schleimsekrete fangen Beutetiere ein und töten sie. Ein muskulöser Pharynx, der durch den ventralen Mund umgestülpt wird, wird verwendet, um Verdauungsenzyme in die Beute abzusondern, die dann in den verzweigten Darm gesaugt wird, der eine gastrovaskuläre Höhle bildet. Neben einem einfachen Nervensystem haben Turbellarien lichtempfindliche Augenflecken, die Ocelli genannt werden, die dem Tier helfen, die Lichtrichtung zu orientieren. Berührungs- und chemische Rezeptoren in einigen Formen wie dem im Labor zu sehenden Planarien sind in seitlichen Projektionen des Kopfes konzentriert, die als Ohrmuscheln bezeichnet werden und wie Ohrläppchen aussehen. Die Fortpflanzung bei Turbellarien kann asexuell durch Spaltung oder sexuell erfolgen. Alle Formen sind einhäusig, praktizieren jedoch Kreuzbefruchtung. Planarien sind auch für ihre enorme Regenerationskraft bekannt, und aus einer in drei Teile geschnittenen Planarie werden drei neue, vollständige Individuen entstehen!

Die Klasse Monogenea enthält Tiere, die als monogenetische Egel bezeichnet werden. Obwohl die meisten Arten Ektoparasiten auf der Haut oder Kiemen von Fischen sind, gibt es einige Formen in den Blasen von Fröschen und sogar eine, die im Auge eines Nilpferdes lebt! Der Lebenszyklus eines monogenetischen Egels ist direkt mit einem einzigen Wirt. Da sie sowohl für die Fortpflanzung als auch für die Übertragung von einem einzigen Wirt abhängen müssen, haben monogenetische Egel Mechanismen entwickelt, die normalerweise sicherstellen, dass die Parasiten das Leben ihrer Wirte nicht gefährden, aber unter beengten Bedingungen (wie Fischbrutereien) können sie ernsthafte, schädigenden Befall.

Die Klasse Trematoda enthält etwa 8.000 Arten von blattähnlichen Tieren, die als digenetische Egel bezeichnet werden. Die Adulten sind Endoparasiten an Wirbeltieren, aber viele Wirbellose dienen als Zwischenwirte und viele Arten von medizinischer und wirtschaftlicher Bedeutung! Die Entwicklung ist indirekt, nicht nur Erwachsene, sondern auch Larven vermehren sich und alle Arten haben mindestens zwei Wirte, einen für die Übertragung und den anderen für die Fortpflanzung. Die überwiegende Mehrheit der Egel besitzt zwei große Saugnäpfe, die zur Befestigung verwendet werden, einen vorderen, der als oraler Sauger bezeichnet wird, der den Mund umgibt, und einen hinteren, der als ventraler Sauger oder Acetabulum bezeichnet wird.

Bei Trematoden führt ein Ei zur Produktion vieler Nachkommen! Eier werden typischerweise über den Urin oder Kot des Endwirts in Wasser abgelegt. Wenn sie Süßwasser erreichen, öffnet sich das Ei und eine freischwimmende Larve namens Miracidium schwimmt heraus. Das Miracidium schwimmt dann herum, bis es einen geeigneten Zwischenwirt findet, bei dem es sich normalerweise um eine Wasserschnecke handelt, von der es chemisch angezogen wird. Wenn das Miracidium eine Schnecke findet, dringt es in diese ein, verliert seine Flimmerhärchen und entwickelt sich zu einer Sporozyste, die ungeschlechtlich entweder mehr Sporozysten oder eine Reihe von Redien produziert, die auch ungeschlechtlich entweder mehr Redien oder schwanzförmige Formen, die Cercarien genannt werden, produzieren. Die Zerkarien schlüpfen aus der Schnecke, schwimmen umher und dringen in einen zweiten Zwischenwirt ein, den letzten (endgültigen) Wirt oder Enzyst auf der Vegetation (im Fall des Schafleberegels), wo sie in Metazerkarien umgewandelt werden, die juvenile Egel des Erwachsenen sind wächst aus den Metazerkarien, wenn es vom Endwirt gefressen wird.

Trematodeninfektion beim Menschen

Menschen können auf verschiedene Weise mit einer Reihe von schweren Trematoden infiziert werden. Beim Orientalischen Leberegel (Clonorchis sinensis) erfolgt die Ansteckung durch den Verzehr von rohem oder schlecht gekochtem Fisch (der als zweiter Zwischenwirt des Parasiten dient), der die Metazerkarien der Trematoden enthält.

Bei Blutegeln (Schistosoma) kann es zu einer Infektion kommen, wenn sich Schweifzerkarien durch die freiliegende Haut von Personen graben, die in Gewässern mit Zerkarien (wie asiatischen Reisfeldern) baden oder arbeiten. Schistosomiasis ist eine chronische Erkrankung, die innere Organe schädigen und bei Kindern das Wachstum und die kognitive Entwicklung beeinträchtigen kann. Die Harnform der Bilharziose ist mit einem erhöhten Risiko für Blasenkrebs bei Erwachsenen verbunden und die Krankheit ist nach Malaria die sozioökonomisch verheerendste parasitäre Erkrankung!

Der Schafleberegel (Fasciola hepatica) ist ein häufiger Parasit von Schafen und Rindern, die sich durch den Verzehr von Wasserpflanzen mit eingekapselten Metazerkarien (juvenile Egel) infizieren. Der Mensch kann sich den Parasiten durch den Verzehr von roher Brunnenkresse (die natürlich an den Rändern von Seen und Teichen wächst und in vielen Ländern Asiens und Europas kultiviert wird) mit den Metazerkarien des Egels erwerben.

Der Lungenegel (Paragonimus westermani) ist ein potenziell gefährlicher Parasit, der in Asien und Südamerika vorkommt und bei menschlichen Wirten zum Tod führen kann. Ihre Eier werden aus der Lunge ihres Wirts ausgehustet, geschluckt und mit dem Kot ausgeschieden. Der Mensch kann sich durch den Verzehr von rohen oder schlecht gekochten Süßwasserkrabben (dem zweiten Zwischenwirt des Parasiten), die die Metazerkarien des Egels enthalten, infizieren.

Die Klasse Cestoda enthält etwa 4.000 Arten von Bandwürmern, die alle stark modifizierte Endoparasiten sind, die in fast allen bekannten Wirbeltierarten leben. Der lange, abgeflachte Körper eines Bandwurms (der als Strobila bezeichnet wird) ist in Segmente unterteilt, die als Proglottiden bezeichnet werden. Die meisten Formen haben am vorderen Ende ein Organ namens Skolex mit Saugnäpfen, Haken usw., die an der Darmwand befestigt sind und verhindern, dass sie weggefegt werden.

Bandwürmer haben kein Verdauungssystem und ernähren sich, indem sie Nährstoffe direkt vom Wirt aufnehmen. Die gesamte Körperoberfläche ist mit winzigen Vorsprüngen, den sogenannten Mikrotrichen, bedeckt, die die absorbierende Oberfläche des Bandwurms stark erhöhen. Bandwürmer sezernieren auch Substanzen, die die Verdauungsenzyme ihres Wirts hemmen und den pH-Wert um sie herum auf ein Niveau senken, das sie, aber nicht die Verdauungsenzyme ihres Wirts, funktionieren können. Bei Bandwürmern wird ein Großteil der Strobila der Fortpflanzung überlassen. Jede Proglottide ist einhäusig, und Kreuzbefruchtung oder sogar Selbstbefruchtung ist üblich. Proglottiden können mit bis zu 100.000 Eiern gefüllt werden!

Mit wenigen Ausnahmen benötigen alle Cestoden mindestens zwei Wirte, und der Adulte ist der Parasit im Verdauungstrakt von Wirbeltieren. Häufig ist einer der Zwischenwirte ein Wirbelloses (meistens ein Arthropode wie ein Floh, eine Laus oder ein Ruderfußkrebs), das vom Endwirt gefressen wird. Die Eier in den Proglottiden werden täglich mit dem Kot in den Boden abgegeben, wo sie längere Zeit ruhen können. Manchmal kriechen die eiertragenden Proglottiden von selbst aus dem Anus und können auf einem infizierten Hund, einer Katze oder einem Kind oder auf infizierter Kleidung und Bettwäsche herumgezappelt werden. Sobald die Eier freigesetzt werden, müssen sie von einem Zwischenwirt aufgenommen werden, um zu hakenförmigen Larven, sogenannten Onkosphären, zu schlüpfen, die sich durch die Darmwand bohren und vom Kreislaufsystem aufgenommen werden, wo sie zu Skelettmuskeln, Herz oder sogar anderen transportiert werden Organ, wo sie sich als Zystizerken (Blasenwürmer) einhüllen. Jeder Zystizerkus ist im Wesentlichen ein Inside-Out-Skolex, das sich umstülpt, nachdem das infizierte Gewebe (sog. Der Skolex heftet sich dann mit Saugnäpfen und/oder Haken an der Darmschleimhaut an.

Bandwurminfektion beim Menschen

Menschen können sich mit Bandwürmern infizieren, indem sie schlecht gekochtes Fleisch essen, das die Zystizerken des Bandwurms enthält. Die wichtigsten Bandwürmer, die den Menschen infizieren, sind der Rinderbandwurm (Taenia saginata) und der Schweinebandwurm (Taenia solium).

Eine andere Cestodenart, die den Menschen infizieren kann, ist der breite Fischbandwurm (Diphyllobothrium latum), der bei Fischen der Großen Seen häufig vorkommt. Auch hier erfolgt die Infektion durch die Einnahme von Cystizerken in rohem oder schlecht gekochtem Fisch. In den meisten Fällen fügen Bandwürmer im Darm ihren menschlichen Wirten keinen großen Schaden zu, aber gelegentlich wandern sie in andere Organe wie die Augen oder sogar das Gehirn ab, wo sie schwere neurologische Probleme und sogar den Tod durch zerebrale Zystizerkose verursachen können!

Der Hundebandwurm (Diplydium caninum) kommt bei Hunden häufig vor, kann aber von Menschen (normalerweise Kindern) aufgenommen werden, die infizierte Flöhe aufnehmen, die als Zwischenwirte des Parasiten dienen.

Im Gegensatz zu radiären und acoelomaten Stämmen, bei denen der Raum zwischen der Körperwand und dem Verdauungstrakt mit Mesoglea oder mit solidem mesenchymalem Parenchym gefüllt ist, haben die verbleibenden bilateralen Tiere, die auf der Zoo Lab-Website behandelt werden, eine Körperhöhle, in der sich innere Organe befinden. Bei den Pseudocoelomaten bleibt das embryonale Blastocoel als Körperhöhle bestehen. Da es nicht mit mesodermalem Peritoneum (der Auskleidung des Zöloms) ausgekleidet ist, wird es als "falsche Höhle" oder Pseudocoel bezeichnet.

Der Stamm Acanthocephala enthält etwa 1.000 Arten von parasitären Tieren, die Stachelkopfwürmer genannt werden, die alle Endoparasiten im Darmtrakt von Wirbeltieren (insbesondere Fischen) sind. Zwei Wirte sind erforderlich, um den Lebenszyklus abzuschließen, und die Jungtiere sind Parasiten von Krebstieren und Insekten. Die meisten Arten sind recht klein (weniger als 40 mm). Stachelköpfige Würmer haben eine umkehrbare Rüssel mit zurückgebogenen Stacheln bedeckt, die eine Befestigung im Darm des Wirts bieten. Eier passieren den Wirt und werden von bestimmten Insekten oder Krebstieren gefressen, wo sie schlüpfen und mehrere Entwicklungsstadien durchlaufen. Wird der Zwischenwirt von einem Vogel, Säugetier oder Fisch gefressen, heftet sich die darin befindliche Larve mit ihrem stacheligen Rüssel an die Darmwand.

Der Phylum Rotifera enthält etwa 1.800 Arten von mikroskopisch kleinen Tieren, die als Rädertierchen bezeichnet werden und eine vordere Zilienkrone tragen, die wie ein sich drehendes Rad aussehen. Obwohl kosmopolitisch (weit verbreitet), sind die meisten nur in Süßwasserumgebungen zu finden. Der allgemeine Körperplan eines Rädertierchens ist in drei Bereiche unterteilt: ein Kopf, der ein bewimpertes Organ trägt, das als Korona (Radorgan) bezeichnet wird und Strömungen erzeugt, die kleine planktonische Formen in den Mund ziehen, der sich in einen muskulösen Pharynx namens Mastax öffnet . Der Mastax ist mit komplizierten Kiefern ausgestattet, die aus sieben harten Stücken bestehen, die als Trophi bezeichnet werden und zum Greifen und Kauen der Beute verwendet werden. Der Rumpf enthält die viszeralen Organe, und der Fuß (sofern vorhanden) ist segmentiert und in Gelenke umringt, die sich verkürzen oder teleskopieren können. Pedaldrüsen am Fuß scheiden eine klebrige Substanz aus, die das Tier am Substrat verankert oder es mit egelähnlichen Bewegungen mitkriechen lässt.

Ab diesem Zeitpunkt sind alle Tiere, die auf der Zoo Lab-Website untersucht werden, eucoelomat, dh sie haben ein echtes Zölom (Körperhöhle), das mit einer dünnen Schicht mesodermalen Gewebes, dem Peritoneum, ausgekleidet ist. Hinweis: Die Entwicklung des Zöloms muss als einer der wichtigsten Schritte in der Evolution größerer und komplexerer Formen angesehen werden, da es viel Platz für Organe bietet, die durch dünne Membranen, die Mesenterien genannt werden, an Ort und Stelle gehalten werden können!

Der Stamm Ectoprocta (auch Bryozoa genannt) enthält etwa 4.000 Arten kleiner kolonialer Formen, die als Moostiere bezeichnet werden und in flachen Süßwasser- und Meeresumgebungen vorkommen. Obwohl Bryozoen auch im Fossilienbestand gut vertreten sind, sind sie heute auch recht häufig. Moderne Meeresformen nutzen alle Arten von festen Substraten, einschließlich Muscheln, Felsen, Meereshölzer und Schiffsböden. Tatsächlich sind die Ektoprokte wie Seepocken eine der wichtigsten Gruppen von Fouling-Organismen, die regelmäßig von Schiffs- und Bootsrümpfen entfernt werden müssen. Jedes Mitglied einer Kolonie lebt in einer winzigen Kammer, die als Zoecium („Tierhaus&rdquo) bezeichnet wird und von ihrer Epidermis abgesondert wird.

Jedes Individuum (Zooid) besteht aus einem Futterteil und einem gehäusebildenden Teil. Das Zoecium kann gallertartig, chitinhaltig oder kalkhaltig sein, und manchmal ist es mit Sandkörnern imprägniert. Der Fütterungsteil des Tieres enthält das Lophophor (ein Füttergerät mit Flimmerhärchen, das auch für den Gasaustausch verwendet werden kann), den Verdauungstrakt, die Muskeln und das Nervensystem. Jedes Individuum lebt eine Art „Kleine-in-der-Kiste“-Existenz, taucht auf, um sich zu ernähren, und zieht sich dann schnell in seine Schutzkammer zurück, die oft mit einer winzigen Falltür (Operculum) verschlossen ist.

Der Stamm Brachiopoda (&ldquoarm foots&rdquo) enthält Tiere, die als Lampenschalen bekannt sind. Dies ist eine alte Gruppe, die im Fossilienbestand gut vertreten ist (mit etwa 30.000 beschriebenen Arten), aber nur etwa 300 lebenden Arten. Brachiopoden ähneln Muscheln, aber im Gegensatz zu Muscheln haben sie Schalen, die sich eher auf der ventralen und dorsalen Seite als auf der linken und rechten Seite befinden.

Brachiopoden werden in zwei Klassen eingeteilt, je nachdem, ob sie Schalen haben, die durch ein Scharnier mit ineinandergreifendem &ldquoteeth&rdquo verbunden sind, oder mit Schalen von ungleicher Größe. Brachiopoden in der letzteren Gruppe werden Lampenschalen genannt, weil die größere Ventralklappe einer römischen Öllampe ähnelt. Einige Brachiopoden heften sich mit einem Stiel an der Ventralklappe an das Substrat an, während andere die Ventralklappe nur an das Substrat zementieren (wie eine Auster) oder sich in das Sediment eingraben. Wie Bryozoen haben auch Brachiopoden einen Lophophor, der den Mund umgibt, der zur Nahrungsaufnahme und zum Gasaustausch verwendet wird.

Labor-5 01

Dieser Objektträger enthält zwei Exemplare des freilebenden turbellaren Plattwurms Planaria. Eine Probe wurde gefärbt, während die andere mit Ruß injiziert wurde, um die Ausdehnung der blinden Magen-Darm-Höhle zu zeigen, die in drei vielverzweigte Stämme (einen vorderen und zwei hinteren) unterteilt ist. Ohne Anus muss die Nahrung zuerst durch den Mund in die Magen-Gefäß-Höhle gelangen, wo sie verdaut wird, wonach Abfallprodukte durch dieselbe Öffnung austreten. Beachten Sie den großen, umstülpbaren Rachen in jedem Planarien, der zum Füttern verwendet wird. Im Kopfbereich befinden sich seitliche Fortsätze, die als Ohrmuscheln bezeichnet werden (bei den gezeigten Präparaten nicht gut entwickelt), die Berührungs- und chemische Rezeptoren sowie lichtempfindliche Ocellen (Augenflecken) enthalten.

Labor-5 02

  1. Mundhöhle
  2. Gastrodermis
  3. Gastrovaskuläre Höhle
  4. Epidermis
  5. Rachen
  6. Parenchym

Diese Folie enthält einen Querschnitt durch die pharyngeale (mittlere) Region des freilebenden Plattwurms Planaria. Beachten Sie den großen muskulären Pharynx, der in einem Raum liegt, der als Mundhöhle bezeichnet wird. Während der Nahrungsaufnahme kann der Rachen durch das Maul gestülpt und zum Aufsaugen von Flüssigkeiten und Weichteilen von gefangenen Beutetieren verwendet werden. Zwei Äste der ausgedehnten gastrovaskulären Höhle sind ebenfalls zu sehen. Dieser Hohlraum ist mit großen, vakuolisierten Zellen ausgekleidet, die die Gastrodermis umfassen. Auf der Außenseite des Plattwurms befindet sich eine bewimperte Epidermis, die viele Drüsenzellen sowie dunkel färbende stäbchenförmige Körper, sogenannte Rhabditen, enthält, die ihren Inhalt abgeben können, um eine schützende Schleimschicht um den Körper zu bilden. In Ermangelung einer Körperhöhle ist der Raum zwischen Darm und Epidermis bei diesen Acoelomaten mit einem Geflecht aus mesodermalem Parenchym sowie zirkulär, längs und schräg verlaufenden Muskelfasern ausgefüllt.

Labor-5 03

  1. Gastrovaskuläre Höhle
  2. Gastrodermis
  3. Parenchym
  4. Rhabditen auf der Epidermis

Labor-5 04

Dieses Dia zeigt ein gefärbtes ganzes Tier des Orientalischen Leberegels (Clonorchis sinensis), einem wichtigen Trematodenparasiten des Menschen in vielen Regionen Asiens, insbesondere in China, Südostasien und Japan. Menschen infizieren sich durch den Verzehr von rohem oder schlecht gekochtem Fisch, der die eingekapselten Metazerkarien enthält. Nach der Einnahme lösen sich diese Zysten im Darm auf und setzen die jungen Egel frei, die dann in den Gallengang und die Leber wandern.

Vorderer Abschnitt

Labor-5 05

  1. Mund- und Mundsauger
  2. Rachen
  3. Speiseröhre
  4. Intestinaler Blinddarm
  5. Genitalporen
  6. Ventraler Saugnapf (Azetabulum)

Mittelteil

Labor-5 06

  1. Uterus
  2. Darmzeca
  3. Dotterdrüsen
  4. Dotterkanal
  5. Eierstock
  6. Samenaufnahme
  7. Hoden
  8. Ausscheidungsblase

Seitenzahnbereich

Labor-5 07

Labor-5 08

Diese Folie zeigt die Redia-Larve eines Trematodenparasiten. Dieses Larvenstadium entwickelt sich normalerweise im Gewebe einer Wasserschnecke. Die Redia enthält Gruppen von Zellen, die "Keimkugeln" genannt werden, die sich schließlich zu den mit Schwanz versehenen Cercaria-Larven entwickeln, die aus der Schnecke hervorgehen und einen zweiten Zwischenwirt oder eine Enzyst auf der Vegetation durchdringen, um eine Metazerkarie zu werden.

Labor-5 09

Diese Folie zeigt die Schwanz-Cercaria-Larve eines Trematoden-Parasiten. Dieses Larvenstadium, das sich normalerweise im Gewebe einer Wasserschnecke entwickelt, wird aus ihrem Zwischenwirt austreten und einen zweiten Zwischenwirt oder eine Enzyste auf der Vegetation durchdringen, um eine Metazerkarie zu werden.

Labor-5 10

Dieser Objektträger enthält gefärbte Schnitte des Hundebandwurms Diplydium caninum aus vier verschiedenen Regionen. Der vorderste Teil enthält den Skolex, ein spezialisiertes Befestigungsorgan, das oft Haken und/oder Saugnäpfe enthält. Der Rest des Körpers ist in eine lineare Reihe von Segmenten unterteilt, die Proglottiden genannt werden, von denen jedes einen vollständigen Satz von Fortpflanzungsorganen enthält. Die jüngsten Proglottiden im ersten Teil der Strobila (Körper) des Bandwurms sind unreif, während die in der Mitte reif sind. Die ältesten terminalen Proglottiden sind trächtig, das heißt, sie sind mit Eiern gefüllt. Hunde und Katzen können sich durch den Verzehr von adulten Flöhen (den Zwischenwirten), die Zystizerkoidenlarven enthalten, infizieren.

Skolex (Nahaufnahme)

Lab-5 11

Lab-5 12

  1. Hoden
  2. Samenleiter
  3. Vagina
  4. Eierstock
  5. Dotterdrüse
  6. Genitalporen

Diese Folie zeigt eine reife Proglottide des Hundebandwurms Diplydium caninum. Beachten Sie, dass es zwei vollständige Sätze von männlichen und weiblichen Fortpflanzungsstrukturen gibt, die Hoden, Samenleiter (der Plural von Samenleiter), Eierstöcke, Dotterdrüsen, Vaginas und Genitalporen umfassen. Hunde und Katzen infizieren sich durch den Verzehr von adulten Flöhen (den Zwischenwirten), die Cysticercoid-Larven enthalten.

Lab-5 13

  1. Ausscheidungskanal
  2. Hoden
  3. Uterus
  4. Genitalporen
  5. Samenleiter
  6. Vagina
  7. Eierstöcke
  8. Dotterdrüsen

Diese Folie zeigt eine reife Proglottide des Bandwurms Taenia pisiformis, einer Art, die häufig im Dünndarm von Hunden und Katzen vorkommt. Beachten Sie, dass jedes Segment einen vollständigen Satz von Fortpflanzungsstrukturen enthält, einschließlich Hoden, Samenleiter (Samengang), Eierstock, Dotterdrüse, Vagina und Genitalporen.

Labor-5 14

Diese Folie zeigt einen Skolex aus der vordersten Region des Bandwurms Taenia pisiformis. Beachten Sie die Reihe von Haken an einem erhöhten Teil des Skolex, der als Rostellum bezeichnet wird, sowie die vier seitlichen Saugnäpfe. Diese Haken und Saugnäpfe ermöglichen es dem Bandwurm, an der Darmwand seines Wirts zu bleiben.

Haken am Rostellum

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Dieses Dia zeigt eine vergrößerte Ansicht der erhabenen Spitze des Skolex (Rostellum) des Hunde- und Katzenbandwurms Taenia pisiformis. Beachten Sie die beeindruckende Anzahl von Haken, die der Bandwurm verwendet, um sich am Darmtrakt seines Wirts festzuhalten.

Labor-5 16

Diese Folie zeigt die Cysticercus-Larve des Bandwurms Taenia pisiformis. Beachten Sie den eingestülpten Skolex am rechten Ende dieses "Blasenwurms". Nachdem infiziertes Gewebe des Zwischenwirts vom Endwirt gefressen wurde, stülpt sich die Skolekse um und heftet sich mit Haken und Saugnäpfen an die Darmschleimhaut.

Lab-5 17

Diese Folie zeigt ein gefärbtes Exemplar eines erwachsenen stachelköpfigen Wurms, der zum Phylum Acanthocephala gehört. Obwohl Infektionen beim Menschen registriert wurden, parasitieren erwachsene Würmer normalerweise den Verdauungstrakt von Fischen, Vögeln und Haus- und Wildsäugetieren. Die Larven der Stachelkopfwürmer entwickeln sich in verschiedenen Krebs- oder Insektenarten. Beachten Sie den umgestülpten Rüssel mit zahlreichen zurückgebogenen Dornen, die dem Organismus seinen Namen geben. Diese Stacheln (die es den Würmern ermöglichen, am Verdauungstrakt zu bleiben) können eine massive und manchmal schmerzhafte Zerstörung der Darmschleimhaut verursachen.

Akanthocephaler Rüssel (Nahaufnahme)

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Dieses Dia zeigt zwei gefärbte Rädertierchen. Diese pseudocoelomate Tiere haben ihren Namen von einer markanten Flimmerkrone (Corona), die beim Schlagen den Eindruck eines rotierenden Rades erweckt. Die Bewegung dieser Flimmerhärchen erzeugt Wasserströme, die Nahrungsbestandteile in den Mund des Organismus ziehen. Im Inneren wird die Nahrung gekaut und in einem muskulösen Teil des Rachens, dem Mastax genannt, der mit kleinen harten Kiefern namens Trophi ausgestattet ist, zermahlen. Obwohl es einige Meeresarten gibt, kommen die meisten Rädertierchen in Süßwasserhabitaten auf der ganzen Welt vor.

Fotos von lebenden Rädertieren

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Diese Mikroskopaufnahme zeigt zwei lebende Exemplare der Rotifere Philodina. Beachten Sie die seitliche Ausdehnung der Körperwand im Kopfbereich der Probe rechts (durch den roten Pfeil gekennzeichnet). Diese Struktur (die als Antenne bezeichnet wird) enthält viele winzige sensorische Borsten. Auf dem linken Präparat ist die Korona ("Radorgan") mit zwei großen Flimmerscheiben und dem Fuß mit seinen beiden Zehen (die Sporen, auf die der blaue Pfeil zeigt) zu sehen. Pedaldrüsen (die sich durch Kanäle an den Zehenspitzen öffnen) produzieren einen Klebstoff, der zur vorübergehenden Befestigung am Untergrund dient.

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Diese Mikroskopaufnahme zeigt eine vergrößerte Ansicht des Süßwasser-Rädertierchens Philodina. Beachten Sie die auffällige Korona (Radorgan) mit ihren Flimmerhärchen und den zentral angeordneten Mastax (auf den der rote Pfeil zeigt), ein muskulöser Teil des Rachens, der mit Chitinkiefern (Trophi) ausgestattet ist, die aufgenommene Nahrung zermahlen und zerkleinern.

Labor-5 22

Dieses Mikroskopbild zeigt eine andere Art von Rädertierchen der Gattung Monostyla. Diese häufige Süßwasserart hat eine starre, chitinähnliche Hülle, die als Lorica bezeichnet wird.

Labor-5 23

Diese Folie zeigt mehrere Zooide des Süßwasserektoprokts Plumatella. Beachten Sie die auffälligen Lophophoren. Diese Fütterungsvorrichtungen bestehen aus Massen von Flimmertentakeln, die auf Kämmen getragen werden, die den Mund umgeben. Neben der Fortpflanzung durch Knospung vermehren sich Süßwasserbryozoen ungeschlechtlich mit Hilfe spezieller resistenter Körper, die Statoblasten genannt werden (auf dieser Folie nicht sichtbar). Diese dunklen, scheibenförmigen Strukturen (ähnlich den Gemmules von Süßwasserschwämmen) werden im Sommer und Herbst produziert und können ruhen, bis sich die Umweltbedingungen im Frühjahr verbessern.

Labor-5 24

Diese Folie zeigt einen Teil einer sich verzweigenden Kolonie des marinen Bryozoen (Ektoprokt) Bugula. Die Verzweigung innerhalb der Kolonie wird durch wiederholtes asexuelles Knospen von Individuen erzeugt, die als Zooide bezeichnet werden. Beachten Sie die Tentakel der Lophophoren (mit Flimmerhärchen versehene Nahrungsgeräte, die den Mund umgeben und auch zum Gasaustausch verwendet werden können). Wie viele koloniale Nesseltiere sind Ektoproktkolonien polymorph, wobei die meisten Zooide als Nahrungsindividuen fungieren. Abwehrzooide, Avicularien genannt, schützen die Kolonie vor kleinen Organismen, einschließlich sich ansiedelnder Larven und kriechenden röhrenbildenden Polychaetenwürmern und Arthropoden. Jedes Avicularium ähnelt einem Vogelkopf mit kräftiger Muskulatur und einer scharfen schnabelartigen Struktur (Rostrum), die verwendet wird, um die Gliedmaßen eindringender Organismen zu ergreifen.

Avicularium (Nahaufnahme)

Labor-5 25

Diese Folie zeigt eine vergrößerte Ansicht eines Aviculariums des marinen kolonialen Bryozoen Bugula. Beachten Sie den Unterkiefer, den vogelähnlichen Schnabel (der als Podest bezeichnet wird) und die Muskulatur. Avicularia schützen die Kolonie vor kleinen Organismen, einschließlich sich ansiedelnder Larven und kriechenden röhrenbildenden Polychaetenwürmern und Arthropoden.

Labor-5 26

Dies ist ein Dia eines monogenetischen Egels, der aus den Kiemen eines atlantischen Stachelrochens entnommen wurde. Im Gegensatz zu den digenetischen Trematoden haben monogenetische Arten einen direkten Lebenszyklus, in dem sich Flimmerlarven, die Oncomiracidien genannt werden, auf oder in einem einzigen Wirt entwickeln. Obwohl einige Arten in der Harnblase von Fröschen und Schildkröten vorkommen, haften die meisten dieser Egel an den Kiemen und äußeren Oberflächen von Fischen mittels eines hinteren Befestigungsorgans namens Opisthaptor, das mit Haken ausgestattet ist.

Lab-5 27

Dieses Objektträger zeigt ein gefärbtes ganzes Tier des Schafleberegels (Fasciola hepatica). Diese große Trematode ist ein häufiger Parasit von Schafen und Rindern, die sich durch den Verzehr von Wasserpflanzen infizieren, die die eingekapselten Metazerkarien (juvenile Egel) enthalten. Nach der Einnahme werden die Zystenwände verdaut und die Larven graben sich durch die Darmwand in die Körperhöhle und schließlich in die Leber.

Lab-5 28

Diese Folie zeigt ein erwachsenes Exemplar des Lungenegels Paragonimus westermani. In Ostasien, im Südwestpazifik und in einigen Teilen Südamerikas gefunden, parasitiert der Egel eine Reihe von wilden Fleischfressern, Schweinen, Nagetieren und Menschen. Eine Infektion mit Lungenegeln verursacht Atemwegssymptome, mit Atembeschwerden und chronischem Husten, und Todesfälle sind häufig! Menschen infizieren sich mit Lungenegeln, indem sie rohe oder schlecht gekochte Süßwasserkrabben essen, die die Fluke metacercariae enthalten.

Lab-5 29

Diese Folie zeigt ein Paar erwachsener Blutegel bei der Kopulation. Blutegel unterscheiden sich von den meisten anderen Egeln dadurch, dass sie zweihäusig sind (d. h. verschiedene Geschlechter haben). Männchen sind größer und haben eine große, ventrale Rinne, die als gynäkophorer Kanal hinter dem ventralen Saugnapf bezeichnet wird und das kleinere (dunkler gefärbte) Weibchen während der kontinuierlichen Kopulation hält. Schistosoma mansoni ist eine der drei Arten von Blutegeln, die für die Krankheit beim Menschen namens Bilharziose verantwortlich sind. Menschen infizieren sich, wenn sich die schwanzförmigen Cercaria-Larven (die aus Süßwasserschnecken entkommen, die als Zwischenwirte dienen) in die exponierte Haut von Personen eingraben, die in solchen Lebensräumen baden, schwimmen oder arbeiten.

Lab-5 35

Dieses Modell enthält mehrere Ansichten eines freilebenden turbellaren Plattwurms. Das linke Bild zeigt das Nervensystem (weiß lackiert), das aus einem Paar Hirnganglien mit zwei ventralen Nervensträngen besteht, die durch eine Reihe von Quernerven, Kommissuren genannt, verbunden sind und ihm ein leiterähnliches Aussehen verleihen. Andere sensorische Strukturen umfassen einfache, lichtempfindliche Augen (Ocellen) und chemische Rezeptoren, die in seitlichen Projektionen des Kopfes konzentriert sind, die als Ohrmuscheln bezeichnet werden (weil sie wie Ohrläppchen aussehen). Obwohl die Fortpflanzung bei Planarien ungeschlechtlich durch Spaltung erfolgen kann, sind alle Formen einhäusig mit männlichen und weiblichen Fortpflanzungsorganen. Einige Merkmale des Fortpflanzungssystems (in Blau und Gelb dargestellt) sind auch auf dem linken Modell zu sehen.

Das rechte Modell zeigt die vielen verzweigten gastrovaskulären Höhlen (in rot dargestellt), die durch eine einzelne ventrale Öffnung am Ende eines muskulösen, umstülpbaren Pharynx austreten (bei beiden Modellen sowie auf der kleinen oberen Planarie in gebrochenem Weiß dargestellt).
Modell). Auf dem Modell ist auch ein Teil des Ausscheidungs-/Osmoregulationssystems (in Grün dargestellt) zu sehen, das aus Protonephridien besteht, die einige Abfälle sammeln und absondern sowie überschüssiges Wasser, das durch Osmose in Süßwasserformen gelangt. Protonephridien bestehen aus Ausscheidungskanälchen, die innen verschlossen sind und sich nach außen durch eine Reihe von Sammelrohren öffnen, die zu einer hinteren Öffnung führen, die als Nephridiopore bezeichnet wird. Die inneren Enden jedes dieser Röhrchen enden in sogenannten Flammenzellen (von denen eine auf dem kleinen, unteren Modell abgebildet ist), die Zilienbüschel aufweisen, die wie eine Kerzenflamme flackern. Das Schlagen dieser Flimmerhärchen zieht Wasser durch einen netzartigen Becher, wodurch ein Filtrat aus Wasser und kleinen Molekülen entsteht.

Vordere Abschnitte

Lab-5 36

  1. Hirnganglion
  2. Ventrales Nervenstrang
  3. Ocellus
  4. Ohrmuscheln
  5. Hoden
  6. Eierstock
  7. Eileiter
  8. Kreisförmige Muskelschicht
  9. Längsmuskelschicht

Hintere Abschnitte

Lab-5 37

  1. Gastrovaskuläre Höhle
  2. Rachen
  3. Ausscheidungssystem
  4. Ventrales Nervenstrang
  5. Hoden
  6. Samenblase
  7. Eileiter
  8. Parenchym

Flammenzelle Nahaufnahme

Labor-5 38

Lab-5 30

Dieses Bild zeigt ein Modell des Orientalischen Leberegels (Clonorchis sinensis), einem wichtigen Trematodenparasiten des Menschen in vielen Regionen Asiens. Menschen infizieren sich durch den Verzehr von rohem oder untergegartem Fisch, der die eingekapselten Metazerkarien enthält. Nach der Einnahme lösen sich diese Zysten im Darm auf und setzen die jungen Egel frei, die dann in den Gallengang und die Leber wandern. Für Nahaufnahmen von markierten Strukturen, die in verschiedenen Abschnitten des Leberegels gefunden wurden, klicken Sie auf die unten stehenden Links.

Dorsal-Anterior

Lab-5 32

1. Pharynx 2. Hirnganglien 3. Blinddarm 4. Samenbläschen 5. Uterus

Ventral-Anterior

Labor-5 31

1. Mund 2. Saugnapf 3. Ösophagus 4. Blinddarm 5. Ventraler Saugnapf 6. Genitalporen 7. Uterus 8. Dotterdrüsen

Dorsal-Posterior

Lab-5 34

1. Samenbläschen 2. Uterus 3. Blinddarm 4. Samengefäß 5. Ausscheidungsblase 6. Ausscheidungsport 7. Dottergänge 8. Mehlis-Drüse

Ventral-Posterior

Labor-5 33

1. Uterus 2. Dotterdrüsen 3. Mehlis-Drüse 4. Eierstock 5. Samengefäß 6. Hoden 7. Ausscheidungsblase 8. Blinddarm


Definition der einfachen Färbung

Die einfache Färbung ist als eine der gewöhnlichen und dennoch populären Methoden definiert, die verwendet wird, um die Bakteriengröße, -form und -anordnung aufzuklären, um die verschiedenen Bakteriengruppen zu unterscheiden. Es färbt die Bakterienzelle gleichmäßig und erhöht damit die Sichtbarkeit eines Organismus. Ein Begriff einfache Färbung, der manchmal mit Begriffen wie Direkt-, Positiv- oder Monochromfärbung austauschbar ist. Lassen Sie uns nun verstehen, warum einfache Färbung mit solchen alternativen Namen bezeichnet wird.

  • Direktfärbung: Weil es eine direkte Methode ist, die die Bakterienzelle direkt mit einem farblosen Hintergrund färbt.
  • Positivfärbung: Weil es positiv geladene basische Farbstoffe verwendet, die sich an die negativ geladene Bakterienzelle binden.
  • Monochrome Färbung: Weil es der Probe einen Kontrast verleiht, indem nur eine einzige Färbung verwendet wird.

Einfache Flecken

Einfache Flecken können definiert werden als basische Farbstoffe, das sind die alkoholischen oder wässrigen Lösungen (auf 1-2% verdünnt). Diese können sich leicht lösen OH – und akzeptiert H + Ion, wodurch die einfachen Flecken positiv geladen werden. Wie die einfachen Flecken sind positiv geladen, sie werden gewöhnlich als positive oder kationische Farbstoffe bezeichnet.

Es wird häufig verwendet, um die meisten Bakterien zu färben. Da der einfache Farbstoff eine positive Ladung trägt, haftet er fest an einer negativen Bakterienzelle und färbt den Organismus, indem er einen farblosen Hintergrund hinterlässt. Beispiele von einfachen Flecken sind Safranin, Methylenblau, Kristallviolett usw.

Die Grundflecken haben unterschiedliche Belichtungszeit um die Bakterienzelle zu durchdringen und zu färben.

Grundlegende FleckenEinwirkzeit zum Anfärben der Bakterien
Methylenblau1-2 Minuten
Kristallviolett20-60 Sekunden
Carbol Fuschin15-30 Sekunden
Safranin30-60 Sekunden

Prinzip

Sein Prinzip basiert auf der Herstellung von a markiert Kontrast zwischen den Organismus und seine Umgebung mit basischer Beize. Ein basischer Farbstoff besteht aus einem positiven Chromophor, der sich stark von den negativen Zellbestandteilen und geladenen Molekülen wie Nukleinsäuren und Proteinen anzieht. So führt eine einfache Färbetechnik zu einer farbigen Bakterienzelle vor einem farblosen Hintergrund.

Verfahren der einfachen Färbung

Es umfasst die folgenden drei Schritte:


Abstrichvorbereitung

Bakterieller Abstrich erscheint als dünner Film einer Bakterienkultur. Für die Abstrichvorbereitung müssen wir folgende Schritte durchführen:

  1. Nehmen Sie einen sauberen, fettfreien Objektträger.
  2. Geben Sie einen Tropfen destilliertes Wasser in die Mitte des Objektträgers.
  3. Fügen Sie dann Inokulum aus der Bakterienkultur mit sterilisierter Impföse auf dem Glasobjektträger hinzu.
  4. Mischen Sie anschließend das Inokulum mit einem Tropfen destilliertem Wasser, um einen dünnen Film zu bilden, indem Sie die Impföse gleichmäßig drehen, bis sich ein dünner Bakterienfilm gebildet hat.


Wärmefixierung

Bewegen Sie nach der Vorbereitung des Abstrichs die vorbereiteten Objektträger mindestens dreimal über die Flamme des Bunsenbrenners. Lassen Sie den Objektträger dann an der Luft trocknen. Es gibt viele Gründe, eine Wärmefixierung durchzuführen, und sie kann nicht übersprungen werden, weil:

  • Die Wärmefixierung hilft bei der Fixierung einer Probe auf dem Glasobjektträger.
  • Die Wärmefixierung hilft dem Fleck, den Ausstrich zu durchdringen.


Färbung von Bakterien

Es ist der letzte und wichtigste Schritt, bei dem man die morphologischen Eigenschaften der Bakterien durch mikroskopische Untersuchung identifizieren kann, sobald die Zellen gefärbt sind. Diese Phase umfasst die folgenden Schritte, die wie folgt lauten:

  1. Fügen Sie dem hitzefixierten Abstrich Fleck hinzu.
  2. Lassen Sie den Farbstoff mindestens 1 Minute stehen, damit er zwischen die Zellen eindringen kann.
  3. Waschen Sie den Objektträger sorgfältig ab.
  4. Objektträger mit saugfähigem Papier trocken tupfen (Objektträger nicht abwischen).
  5. Untersuchen Sie den Objektträger unter dem Mikroskop von niedriger bis hoher Leistung, um eine vergrößerte Ansicht der Probe zu erhalten. Man kann auch einen Tropfen Öl über den gefärbten Bereich des Glasobjektträgers auftragen, um ihn unter einem 100X-Objektiv zu beobachten.


Video

Vorteile

  • Einfache Färbung ist ein sehr einfach durchzuführende Methode, die den Organismus mit einem einzigen Reagenz färbt.
  • Es ist ein schnell Methode, die die Aufführungszeit um nur 3-5 Minuten verkürzt.
  • Einfaches Anfärben hilft, die Bakterienform, -größe und -anordnung zu untersuchen oder aufzuklären.
  • Es hilft uns auch, die Bakterienzellen von den nicht lebenden Strukturen zu unterscheiden.
  • Einfaches Färben kann in der nützlich sein vorbereitende Studie der morphologischen Eigenschaften der Bakterien.

Nachteile

  • Es gibt nicht viele Informationen über die Zelle, abgesehen von den morphologischen Eigenschaften der Bakterien.
  • Durch einfaches Färben können wir einen bestimmten Organismus nicht klassifizieren.

Abschluss

Daraus können wir schließen, dass eine einfache Färbemethode der einfachste Weg ist, das mikroskopische Objekt zu färben, da eine einzige Grundfärbung verwendet wird. Die Ergebnisse der einfachen Färbung richten sich nach der Art der verwendeten Grundfärbung.

Die Farbe eines Flecks entscheidet über die Farbe einer Probe, die identifiziert werden muss. Wenn die Bakterien zum Beispiel die Safraninfarbe behalten, erscheinen sie rosarot, und dasselbe gilt für die anderen Flecken.

Bei der einfachen Färbung besteht eine Anziehungskraft zwischen der positiven Färbung und der negativen Bakterienzelle, was zur Beobachtung von farbige Bakterien mit einem heller Hintergrund.


Beobachtungen an lebenden Bakterien

Manchmal werden die Testergebnisse beeinträchtigt, weil ein kontaminierender Organismus im Medium anstelle des beabsichtigten Bakterienisolats wächst. Für eine schnelle Überprüfung, ob die Zellmorphologie mit der Kultur übereinstimmt, aus der das Inokulum entnommen wurde, kann eine nasse Halterung hergestellt und im Dunkelfeld und/oder Phasenkontrast untersucht werden. Falls vorhanden, sind Endosporen oft im Phasenkontrast zu erkennen, wodurch eine Sporenfärbung vermieden werden kann.

Sehr oft erfordert die Identifizierung eines unbekannten Organismus die Kenntnis seiner Motilität, dh seiner Fähigkeit zur Translationsbewegung. Die Ergebnisse von Motilitätsagar-Inkubationen können schwierig zu interpretieren sein, insbesondere bei aeroben Bakterien, die nicht tief in den Agar hineinwachsen. Eine gute schnelle Überprüfung der Beweglichkeit ist die Untersuchung einer sehr jungen Kultur mit der Methode des hängenden Tropfens. Eine junge Kultur wäre eine Bouillonkultur, die in der Nacht zuvor beimpft wurde, oder eine Bouillonkultur, die morgens etwa 10fach verdünnt, inkubiert und nachmittags untersucht wurde. Eine Kultur mit hängenden Tropfen wird hergestellt, indem ein sehr kleiner Tropfen Medium auf ein Deckglas gegeben wird und das Deckglas dann über einem Vertiefungsobjektträger umgedreht wird, so dass der Boden des Tropfens nicht mit dem Objektträger selbst in Kontakt kommt. Vaseline kann bei Bedarf verwendet werden, um eine dichte Kammer zu bilden.

Hängende Tropfen können mit allen Objektiven untersucht werden. Um jedoch in die Tiefe des Tropfens schauen zu können, kann die Grenze 100x betragen. Der gebogene Muldenschieber verzerrt die Effekte des Phasenkontrasts, aber das Dunkelfeld kann funktionieren und reicht aus, um Bewegungen zu erkennen. Alle lebenden Bakterien bewegen sich durch Brownsche (molekulare) Bewegung mit einer Schwingungsrate, die umgekehrt proportional zur Größe der Zelle ist. Die schnelle Brownsche Bewegung ist ein häufiges Merkmal nicht beweglicher Kokken wie Staphylococcus, Streptococcus oder Micrococcus. Einige Bakterien sind jedoch begeißelt und zeigen auch eine Translationsbewegung. Wirklich bewegliche Organismen werden über das Mikroskopfeld rasen. Suchen Sie nach eindeutiger Richtungsbewegung, Taumeln und Bewegung gegen Strömungen.


Verfahren

    Erhalten Sie eine gleichmäßige Zellsuspension: Befolgen Sie das Typsinisierungs-/Trypsin-Neutralisierungsprotokoll für den spezifischen Zelltyp. Legen Sie die Zellsuspension in ein konisches Zentrifugenröhrchen geeigneter Größe. Um eine genaue Zellzählung zu erhalten, ist eine einheitliche Suspension mit Einzelzellen erforderlich. Die Zellsuspension im Röhrchen 5-7 mal mit einer Pipette mit kleiner Bohrung (5 ml oder 10 ml Pipette) auf und ab pipettieren. Für durch Kryokonservierung aufgetaute Zellen (in 1 ml Kryokonservierungsmedium) 7-10 mal mit einer 1 ml Pipette auf- und abpipettieren.

Für eine genaue Bestimmung sollte die Gesamtzahl der Zellen über einem 1 mm 2 zwischen 15 und 50 liegen. Wenn die Anzahl der Zellen pro 1 mm 2 50 überschreitet, verdünnen Sie die Probe und zählen Sie erneut. Wenn die Anzahl der Zellen pro 1 mm 2 weniger als 15 beträgt, verwenden Sie eine weniger verdünnte Probe. Wenn keine weniger verdünnten Proben verfügbar sind, zählen Sie die Zellen auf beiden Seiten des Hämozytometers (8 x 1 mm 2 Bereiche).

Führen Sie eine separate Zählung von lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen. Wenn mehr als 25 % der Zellen nicht lebensfähig sind, wird die Kultur nicht auf der geeigneten Medienmenge gehalten. Die Kultur erneut inkubieren und das Medienvolumen entsprechend der Konfluenz der Zellen und dem Aussehen der Medien anpassen. Fügen Sie Zellen oben und links ein, die die Mittellinie berühren. Die Zellen, die die Mittellinie unten und rechts berühren, werden nicht gezählt.

ich. Trypanblau ist die "Vitalfärbung", die von lebenden Zellen ausgeschlossen ist.
ii. Lebende Zellen erscheinen unter Phasenkontrast farblos und hell (refraktil).
iii. Tote Zellen färben sich blau und sind nicht brechend.

  • % Zelllebensfähigkeit = [Gesamtzahl lebensfähiger Zellen (ungefärbt) / Gesamtzahl Zellen (lebensfähig + tot)] x 100.
  • Lebensfähige Zellen/ml = Durchschnittliche Anzahl lebensfähiger Zellen pro Quadrat x Verdünnungsfaktor x 10 4 /
  • Durchschnittliche Anzahl lebensfähiger Zellen pro Quadrat = Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen in 4 Quadraten / 4.
  • Verdünnungsfaktor = Gesamtvolumen (Probenvolumen + Volumen der Verdünnungsflüssigkeit) / Probenvolumen.
  • Gesamte lebensfähige Zellen/Probe = lebensfähige Zellen/ml x Das ursprüngliche Flüssigkeitsvolumen, aus dem die Zellprobe entnommen wurde.
  • Benötigtes Medienvolumen = (Anzahl der benötigten Zellen/Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen) x 1000.

Immunhistochemische Methoden

Die enzymatische Methode für die Immunhistochemie verwendet Reagenzien wie Calciumchlorid, Natriumhydroxid, Salzsäurelösungen, Xylol zum Entparaffinieren und Methanol. Die Immunhistochemie verwendet unterschiedliche Färbeverfahren wie einstufige direkte Methode, ABC-Methode, zweistufige indirekte Methode und Tyramid-Signalverstärkung.

Direkte Methode

Das direkte Verfahren ist ein einstufiges Färbeverfahren und beinhaltet einen markierten Antikörper (d. h. FITC-konjugiertes Antiserum), der direkt mit dem Antigen in Gewebeschnitten reagiert. Diese Technik verwendet nur einen Antikörper und das Verfahren ist kurz und schnell. Sie ist jedoch aufgrund der geringen Signalverstärkung unempfindlich und wird seit Einführung der indirekten Methode nur noch selten verwendet.

Indirekte Methode

Die indirekte Methode beinhaltet einen unmarkierten Primärantikörper (erste Schicht), der mit Gewebeantigen reagiert, und ein markierter Sekundärantikörper (zweite Schicht) reagiert mit dem Primärantikörper (Hinweis: Der Sekundärantikörper muss gegen das IgG der Tierart gerichtet sein, in der der Primärantikörper wurde angehoben). Dieses Verfahren ist aufgrund der Signalverstärkung durch mehrere sekundäre Antikörperreaktionen mit unterschiedlichen antigenen Stellen auf dem primären Antikörper empfindlicher. Darüber hinaus ist es auch wirtschaftlich, da ein markierter Zweitschicht-Antikörper mit vielen Erstschicht-Antikörpern (von derselben Tierart gezüchtet) gegen verschiedene Antigene verwendet werden kann. Der Antikörper der zweiten Schicht kann mit einem Fluoreszenzfarbstoff wie FITC, Rhodamin oder Texasrot markiert werden, und dies wird als indirekte Immunfluoreszenzmethode bezeichnet. Der Antikörper der zweiten Schicht kann mit einem Enzym wie Peroxidase, alkalischer Phosphatase oder Glucoseoxidase markiert werden, und dies wird als indirektes Immunenzymverfahren bezeichnet.

PAP-Methode

(Peroxidase-Anti-Peroxidase-Methode): Die PAP-Methode ist eine Weiterentwicklung der indirekten Technik und beinhaltet eine dritte Schicht, einen Kaninchen-Antikörper gegen Peroxidase, gekoppelt mit Peroxidase, um einen sehr stabilen Peroxidase-Anti-Peroxidase-Komplex herzustellen. Der Komplex, bestehend aus Kaninchen-Gaba-Globulin und Peroxidase, wirkt als Antigen der dritten Schicht und wird an das unkonjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Gaba-Globulin der zweiten Schicht gebunden. Die Sensitivität ist etwa 100- bis 1000-fach höher, da das Peroxidase-Molekül nicht chemisch an das Anti-IgG konjugiert, sondern immunologisch gebunden ist und nichts von seiner Enzymaktivität verliert. Es ermöglicht auch eine viel höhere Verdünnung des primären Antikörpers, wodurch viele der unerwünschten Antikörper eliminiert und unspezifische Hintergrundfärbungen reduziert werden.

Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Methode

Die ABC-Methode ist die Standard-IHC-Methode und eine der weit verbreiteten Techniken für die immunhistochemische Färbung. Avidin, ein großes Glykoprotein, kann mit Peroxidase oder Fluorescein markiert werden und hat eine sehr hohe Affinität zu Biotin. Biotin, ein Vitamin mit niedrigem Molekulargewicht, kann mit einer Vielzahl von biologischen Molekülen wie Antikörpern konjugiert werden. Die Technik umfasst drei Schichten. Die erste Schicht ist unmarkierter primärer Antikörper. Die zweite Schicht ist biotinylierter sekundärer Antikörper. Die dritte Schicht ist ein Komplex aus Avidin-Biotin-Peroxidase. Die Peroxidase wird dann vom DAB oder einem anderen Substrat entwickelt, um verschiedene kolorimetrische Endprodukte zu erzeugen.

Markierte StreptAvidin Biotin (LSAB) Methode

Streptavidin, abgeleitet von Streptococcus avidini, ist eine neuere Innovation zur Substitution von Avidin. Das Streptavidin-Molekül ist im Vergleich zu tierischem Gewebe ungeladen, im Gegensatz zu Avidin, das einen isoelektrischen Punkt von 10 hat, und daher wird die elektrostatische Bindung an das Gewebe eliminiert. Darüber hinaus enthält Streptavidin keine Kohlenhydratgruppen, die an Gewebelektine binden könnten, was zu einer gewissen Hintergrundfärbung führt. LSAB ist technisch der Standard-ABC-Methode ähnlich. Die erste Schicht ist unmarkierter primärer Antikörper. Die zweite Schicht ist biotinylierter sekundärer Antikörper. Die dritte Schicht besteht aus Enzym-Streptavidin-Konjugaten (HRP-Streptavidin oder AP-Streptavidin), um den Komplex aus Avidin-Biotin-Peroxidase zu ersetzen. Das Enzym wird dann durch Auftragen der Substratchromogenlösungen sichtbar gemacht, um verschiedene kolorimetrische Endprodukte herzustellen. Die dritte Schicht kann auch ein fluoreszierender Farbstoff-Streptavidin wie FITC-Streptavidin sein, wenn eine Fluoreszenzmarkierung bevorzugt wird. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht legt nahe, dass die LSAB-Methode etwa 5- bis 10-mal empfindlicher ist als die Standard-ABC-Methode.


Richtlinien für die indirekte Färbung in der Durchflusszytometrie mit sekundären Nachweisreagenzien

Abb. 2. Färbestrategien. Illustration der verschiedenen Arten von Färbeprotokollen, die möglicherweise verwendet werden müssen, um eine erfolgreiche indirekte und direkte Färbung in der Durchflusszytometrie zu erzielen.

1. Einfache Einzel-Primär-Antikörper-Färbung

Beim Färben von Proben mit einem direkt konjugierten primären Antikörper ist die Probe nach der ersten Inkubation und einigen einfachen Waschvorgängen bereit für die Aufnahme (Abbildung 2A). Die indirekte Färbung mit einem unkonjugierten Primärantikörper, der mit einem Sekundärantikörper nachgewiesen wird, erfordert zusätzliche Schritte: Inkubieren mit dem Primärantikörper, Waschen und dann Inkubieren mit dem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper, der Ihren Primärantikörper erkennt. Nach weiteren Waschungen ist die Probe bereit für die Aufnahme (Abbildung 2B).

Wenn Sie jedoch eine Kombination aus konjugierten und unkonjugierten Primärantikörpern haben, die Sekundärantikörper in Ihrem Panel benötigen, kann die Färbung komplizierter sein. Um unspezifische Bindungen zu vermeiden, müssen zusätzlich zu den üblichen durchflusszytometrischen Kontrollen Färbeprotokolle, Blockierungs- und Waschschritte sowie Antikörperauswahlen berücksichtigt werden.

2. Kombination von konjugierten und unkonjugierten Antikörpern

Ein häufiges Problem bei der Kombination von unkonjugierten und konjugierten Antikörpern ist der unangemessene Nachweis der konjugierten primären Antikörper/Antikörper durch den sekundären Antikörper, was zu falsch positiven Ergebnissen führt. Dieses Problem wird in einem Video veranschaulicht, das praktisch demonstriert, wie die Verwendung von Bio-Rad&rsquos Maus-IgG-Isotyp-spezifischen Sekundärantikörpern Ergebnisse liefern kann, denen Sie beim Imaging-Multiplexing vertrauen können, ohne das Risiko falsch positiver Ergebnisse und in nur zwei einfachen Schritten. Um dieses Problem zu vermeiden, ist es notwendig, zwischen den unkonjugierten und konjugierten Primärantikörpern anhand von Spezies, Klasse oder Isotyp unterscheiden zu können. Die primären Antikörper können zusammen inkubiert, gewaschen und dann mit sekundären Antikörpern markiert werden, die nur die Spezies, Klasse oder den Isotyp der unkonjugierten primären Antikörper erkennen (Abbildung 2C). Um Ihre Färbung zu optimieren, sollten idealerweise sowohl die primären als auch die sekundären Antikörper titriert werden, um einen minimalen Hintergrund mit einem maximalen spezifischen Signal sicherzustellen. Es wird außerdem empfohlen, eine Kontrolle nur mit sekundärem Antikörper und eine Kontrolle mit allen Antikörpern außer dem unmarkierten primären Antikörper einzufügen, um auf unspezifische Färbung zu prüfen. Um Hilfe beim Färben zu erhalten, sehen Sie sich unsere detaillierten Färbeprotokolle an.

3. Blockieren und Waschen

Die Inkubation mit einem geeigneten Serum vor der Zugabe von Primärantikörpern kann den Hintergrund reduzieren, indem Fc-Rezeptoren blockiert werden. Dieser sollte von der gleichen Spezies wie der zu analysierende Zelltyp sein, niemals von der gleichen Spezies wie der Wirt des primären Antikörpers, da der sekundäre Antikörper das blockierende Serum UND den primären Antikörper erkennt. Wenn Sie Rinderserumalbumin verwenden, kann es mit Rinder-IgG kontaminiert sein, das mit eng verwandten Arten wie Ziegen und Schafen kreuzreagieren kann. Beziehen Sie geeignete Waschschritte ein, um überschüssige primäre und sekundäre Antikörper zu entfernen. Intrazelluläre Färbeprotokolle können mehr und längere Waschschritte erfordern, um den gesamten Antikörperüberschuss zu entfernen. Darüber hinaus kann die Wahl des Permeabilisierungs- und Waschpuffers die Färbung beeinflussen und sollte für Ihr Experiment optimiert werden.

4. Antikörperauswahl

Die Antikörperauswahl für Ihre primären und sekundären Antikörper beeinflusst Ihr experimentelles Design. Unerwünschte Spezies-Kreuzreaktivität kann durch Verwendung kreuzadsorbierter oder isotypspezifischer sekundärer Antikörper entfernt werden. Dadurch wird sichergestellt, dass das Signal des sekundären Antikörpers spezifisch für das primäre Ziel ist. Wenn Sie Immungewebe färben, das viele Fc-Rezeptoren enthält, sollten Sie zusätzlich zur Blockierung mit Serum ein F(ab)-Fragment als sekundären Antikörper in Betracht ziehen, um die unspezifische Bindung zu reduzieren. Wenn beim Multiplexen keine Primärantikörper von verschiedenen Spezies erzeugt wurden, können verschiedene Immunglobulinklassen verfügbar sein, zum Beispiel IgG und IgM, was die Verwendung von klassenspezifischen Sekundärantikörpern derselben Spezies ermöglicht. Viele monoklonale Primärantikörper sind Maus- oder Ratten-IgG1, IgG2a oder IgG2b. Isotypspezifische Sekundärantikörper ermöglichen das Multiplexen von gereinigten Antikörpern derselben Spezies. Möglicherweise können Sie Ihre Färbeoptionen durch Mischen und Anpassen dieser Methoden erweitern, stellen Sie jedoch immer sicher, dass Ihre sekundären Antikörper nicht mehrere Ziele erkennen und die richtigen Kontrollen durchgeführt werden.

5. Entschädigung

Wenn Sie markierte Sekundärantikörper in einem mehrfarbigen Panel verwenden, sollten Sie dennoch die korrekte Kompensationskontrolle für das Sekundärfluorophor durchführen. Am einfachsten ist es, die Einzelfärbungskompensationskontrolle mit dem unkonjugierten Primärantikörper und dem dazugehörigen Sekundärantikörper durchzuführen. Erweist sich dies als problematisch, beispielsweise aufgrund geringer Expression, können Kompensationsperlen eingesetzt werden. Abhängig von der Antikörperbindungsfähigkeit der Beads kann es möglich sein, diese direkt mit dem sekundären Antikörper oder mit den primären plus sekundären Antikörpern zu verwenden. Eine dritte Möglichkeit besteht darin, eine Kompensation unter Verwendung eines primären Antikörpers durchzuführen, der direkt an denselben Fluorophor konjugiert ist, der für den sekundären Antikörper verwendet wird. Die Verwendung von Tandem-Fluorophoren bei dieser Methode sollte jedoch aufgrund der inhärenten Unterschiede zwischen den Tandem-Fluorophor-Chargen mit äußerster Vorsicht erfolgen.

6. Streptavidin als Sekundärreagenz

Manchmal ist nur ein biotinylierter Primärantikörper verfügbar, in diesem Fall wird die Verwendung von fluoreszenzmarkiertem Streptavidin mit einem solchen Antikörper es für die Durchflusszytometrie geeignet machen, ohne dass Sekundärantikörper benötigt werden. Diese Option macht die Kreuzreaktivität von Sekundärantikörpern mit anderen Primärantikörpern überflüssig und kann die Co-Färbungsoptionen erweitern. Es ist jedoch weiterhin erforderlich, die korrekten Negativ- und Kompensationskontrollen durchzuführen.

7. Allgemeine Ablaufsteuerung/Tipps

Für die Durchflusszytometrie sind spezifische Kontrollen erforderlich, z. B. ungefärbte, Isotyp-, Lebensfähigkeits-, Kompensations- und FMO-Kontrollen. Der Aufbau mehrfarbiger Panels kann knifflig sein und die Einhaltung der Richtlinien zur Instrumenten- und Fluorophorauswahl ist bei der indirekten Färbung ebenso wichtig. Zusätzlich zu diesen Standardkontrollen und Richtlinien für die Durchflusszytometrie kann die Verwendung von Sekundärantikörpern zusätzliche Kontrollen und eine Optimierung sowohl der Antikörper als auch des Färbeprotokolls erfordern. Die unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers kann durch Färben mit dem sekundären Antikörper ohne den spezifischen primären Antikörper, entweder allein oder in Kombination mit primären Antikörpern, die nicht das beabsichtigte Ziel darstellen, bestimmt werden. Alternativ kann ein primärer Antikörper verwendet werden, an den der sekundäre Antikörper bindet und der in Ihrer Probe als negativ bekannt ist. Dadurch erhalten Sie eine Vorstellung von der Bindung sowohl an die Probe als auch an andere Antikörper im Panel, sodass Sie die unspezifische Hintergrundfärbung beurteilen können.

Weitere Informationen zu Sekundärantikörpern und deren Verwendung in verschiedenen Anwendungen finden Sie auf unserer speziellen Sekundärantikörper-Webseite.


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