Information

Was ist der Zweck der „Keine DNA-Kontrolle“?

Was ist der Zweck der „Keine DNA-Kontrolle“?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Was ist der Zweck der „Keine DNA-Kontrolle“?

Vor kurzem habe ich ein forensisches DNA-Laborexperiment durchgeführt und kann die Verwendung von "Keine DNA-Kontrolle" immer noch nicht verstehen.


Keine DNA-Kontrollen (oder Wasserkontrolle, auch "keine Probenkontrolle") sind wichtig, um falsch positive Ergebnisse aufgrund von Kontamination auszuschließen.

Wenn Ihre Reagenzien/Pipetten/Ausrüstung, die Sie verwenden, sauber sind, gibt Ihnen diese Reaktion (ich nehme an bei der PCR) keine Bande. Wenn Sie eine Kontamination haben, zeigt sich dies dort, wo keine Band sein sollte und zeigt an, dass Sie ein Problem haben. In diesem Fall können Sie auch den anderen Ergebnissen nicht trauen.


Negativkontrolle in qRT-PCR - (13.01.2011)

Neu hier und neu für RT-PCR. Ich habe eine Frage zur Negativkontrolle.
Warum hat keine RT-Steuerung immer noch Ct-Wert? Ich benutze SYBR grün, wenn es keine ds-DNA gibt, sollte es sie nicht färben, warum hat der icycler noch Signal?
Was ist mit keinem Template-Control, weil ich kein Template-Control ausgeführt habe, ich weiß nicht, um welche Art von Ct-Daten es sich handelt?

warum ist meine basislinie nicht gerade, sie ist wie wellen, beeinflusst das meine schwellenlinie?

Keine RT-Kontrolle mit Signal weist darauf hin, dass sich in Ihrer RNA-Extraktion etwas DNA befindet. Eine No-Template-Kontrolle sollte Ihnen immer kein Signal geben - sie enthält außer Primern keine DNA. Wenn Sie ein Signal in dieser Steuerung haben, haben Sie irgendwo eine Kontamination.

Es gibt verschiedene Arten von Negativkontrollen, die Sie in der qPCR verwenden können.

Kontrolle ohne Schablone = keine DNA, cDNA oder RNA in Reaktion, Amplifikation kann auf eine Kontamination Ihrer Reagenzien (zB Mastermix, Primer) hinweisen, aber diese Negativkontrolle ist eigentlich dazu gedacht, die Bildung von Primerdimeren nachzuweisen. Wenn Sie eine Amplifikation erhalten, lassen Sie Ihre Probe auf einem Gel laufen, um zu sehen, ob das Primer-Dimer (muss neu gestaltet werden) oder ob Sie Ihr Ziel amplifizieren (z. B. Kontamination).

Bei einer RT-Negativkontrolle führen Sie bei Ihrer RNA-Probe keine reverse Transkriptionsreaktion durch = Amplifikation zeigt eine genomische DNA-Kontamination an. dh. Ihre RNA-Extraktion und -Isolierung lief nicht so gut. kann auch auf eine allgemeine Kontamination des Mastermixes usw. hinweisen.


sollte beachten, dass die Vermeidung von amp. in Ihren Negativkontrollen ist manchmal schwierig, wenn Sie am selben Tag oder zur gleichen Zeit häufig qPCR oder PCR durchgeführt haben. Arbeiten Sie außerhalb von Klonbereichen und reinigen Sie Ihren Labortisch und Ihre Ausrüstung gut, bevor Sie Reaktionen einrichten, um eine Kontamination zu minimieren. Sie können sogar Reaktionen in einer Haube einrichten, wenn Sie sehr wählerisch sein möchten. manchmal lasse ich eine Haube UV, um übrig gebliebene DNA zu brechen. Ct-Werte nach 35 oder 40 Zyklen ist wahrscheinlich nur eine Kontamination aus der Luft.

biotechgirl sagte am Freitag, den 14. Januar um 00:22:52 Uhr:

Es gibt verschiedene Arten von Negativkontrollen, die Sie in der qPCR verwenden können.

Kontrolle ohne Schablone = keine DNA, cDNA oder RNA in Reaktion, Amplifikation kann auf eine Kontamination Ihrer Reagenzien (zB Mastermix, Primer) hinweisen, aber diese Negativkontrolle ist eigentlich dazu gedacht, die Bildung von Primerdimeren nachzuweisen. Wenn Sie eine Amplifikation erhalten, lassen Sie Ihre Probe auf einem Gel laufen, um zu sehen, ob das Primer-Dimer (muss neu gestaltet werden) oder ob Sie Ihr Ziel amplifizieren (z. B. Kontamination).

Bei einer RT-Negativkontrolle führen Sie bei Ihrer RNA-Probe keine reverse Transkriptionsreaktion durch = die Amplifikation weist auf eine genomische DNA-Kontamination hin. dh. Ihre RNA-Extraktion und -Isolierung lief nicht so gut. kann auch auf eine allgemeine Kontamination des Mastermixes usw. hinweisen.


sollte beachten, dass die Vermeidung von amp. in Ihren Negativkontrollen ist manchmal schwierig, wenn Sie am selben Tag oder zur gleichen Zeit häufig qPCR oder PCR durchgeführt haben. Arbeiten Sie außerhalb von Klonbereichen und reinigen Sie Ihren Labortisch und Ihre Ausrüstung gut, bevor Sie Reaktionen einrichten, um eine Kontamination zu minimieren. Sie können sogar Reaktionen in einer Haube einrichten, wenn Sie sehr wählerisch sein möchten. manchmal trage ich eine Haube UV, um übrig gebliebene DNA abzubauen. Ct-Werte nach 35 oder 40 Zyklen ist wahrscheinlich nur eine Kontamination aus der Luft.

Eigentlich lasse ich die RT-PCR nur dreimal durch, aber jedes Mal, wenn die NO RT-Kontrollen mir einen Ct-Wert über dem Durchschnitt der Proben geben, aber nicht mehr als 32, ist das normal? Eine weitere Verwirrung besteht darin, dass es einen Datensatz gibt, bei dem der Ct-Wert der NO RT-Kontrolle 1 Zyklus kleiner als der der Probe oder fast gleich der Probe ist , dann führe ich RT-PCR aus)
Ein wenig mehr über mein Experiment, ich arbeite an der Genexpression auf Bakterien-RNA, ich verwende Gesamt-RNA, die mit Qiagen-Kits extrahiert wurde, und Dnase I (Promega) behandelt, um die DNA-Kontamination zu beseitigen, führe pcr und gel durch, um keine DNA-Kontamination zu bestätigen, und führe dann iCycler aus .
Ich hänge einige Dateien über das Ergebnis an.
Dankeschön
' href="http://www.protocol-online.org/forums/index.php?app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=2474" target="_blank">

Xiao Luo sagte am Freitag, 14. Januar, 16:58:10:

biotechgirl sagte am Freitag, den 14. Januar um 00:22:52 Uhr:

Es gibt verschiedene Arten von Negativkontrollen, die Sie in der qPCR verwenden können.

Kontrolle ohne Schablone = keine DNA, cDNA oder RNA in Reaktion, Amplifikation kann auf eine Kontamination Ihrer Reagenzien (z. B. Mastermix, Primer) hinweisen, aber diese Negativkontrolle ist eigentlich dazu gedacht, die Bildung von Primerdimeren nachzuweisen. Wenn Sie eine Amplifikation erhalten, lassen Sie Ihre Probe auf einem Gel laufen, um zu sehen, ob das Primer-Dimer (muss neu gestaltet werden) oder ob Sie Ihr Ziel amplifizieren (z. B. Kontamination).

Bei einer RT-Negativkontrolle führen Sie bei Ihrer RNA-Probe keine reverse Transkriptionsreaktion durch = Amplifikation zeigt eine genomische DNA-Kontamination an. dh. Ihre RNA-Extraktion und -Isolierung lief nicht so gut. kann auch auf eine allgemeine Kontamination des Mastermixes usw. hinweisen.


sollte beachten, dass die Vermeidung von amp. in Ihren Negativkontrollen ist manchmal schwierig, wenn Sie am selben Tag oder zur gleichen Zeit häufig qPCR oder PCR durchgeführt haben. Arbeiten Sie außerhalb von Klonbereichen und reinigen Sie Ihren Labortisch und Ihre Ausrüstung gut, bevor Sie Reaktionen einrichten, um eine Kontamination zu minimieren. Sie können sogar Reaktionen in einer Haube einrichten, wenn Sie sehr wählerisch sein möchten. manchmal trage ich eine Haube UV, um übrig gebliebene DNA abzubauen. Ct-Werte nach 35 oder 40 Zyklen ist wahrscheinlich nur eine Kontamination aus der Luft.

Eigentlich lasse ich die RT-PCR nur dreimal durch, aber jedes Mal, wenn die NO RT-Kontrollen mir einen Ct-Wert über dem Durchschnitt der Proben geben, aber nicht mehr als 32, ist das normal? Eine weitere Verwirrung besteht darin, dass es einen Datensatz gibt, bei dem der Ct-Wert der NO RT-Kontrolle 1 Zyklus kleiner als der der Probe oder fast gleich der Probe ist , dann führe ich RT-PCR aus)
Ein wenig mehr über mein Experiment, ich arbeite an der Genexpression auf Bakterien-RNA, ich verwende Gesamt-RNA, die mit Qiagen-Kits extrahiert wurde, und Dnase I (Promega) behandelt, um die DNA-Kontamination zu beseitigen, führe pcr und gel durch, um keine DNA-Kontamination zu bestätigen, und führe dann iCycler aus .
Ich hänge einige Dateien über das Ergebnis an.
Dankeschön


Wenn es um qPCR geht, bin ich mir nicht sicher, ob die Durchführung eines Gels wirklich eine gültige Methode ist, um festzustellen, ob Ihre Probe frei von genomischer DNA ist. qPCR ist sehr empfindlich, viel mehr als das Ausführen eines Gels. Tatsächlich ist dies einer der Gründe, warum qPCR gegenüber anderen Methoden wie dem traditionellen Northern- oder Southern-Blotting verwendet wird. Nur weil Sie es auf dem Gel nicht sehen können, heißt es nicht, dass es nicht da ist.

qPCR ist theoretisch in der Lage, nur eine einzelne Kopie zu erkennen, während die Gelbildgebung im Allgemeinen mindestens 0,5 ug erfordert, um ausreichend zu erkennen.

Da Ihre Ct-Werte von Ihrer RT im Allgemeinen später als Ihre Proben sind, sieht es so aus, als ob Sie wahrscheinlich Kontaminationsprobleme haben. Entweder in Ihrer Probe, Ihrem Arbeitsbereich oder Ihren Reagenzien. Wenn Ihre RT ungefähr den gleichen Ct-Wert wie Ihre Probe hat, ist das Signal Ihrer Probe nicht gültig, da das gesamte Signal rein auf Kontamination zurückzuführen sein könnte. Ich schlage vor, einen weiteren qPCR-Lauf durchzuführen und drei Reaktionen einzurichten:

1. negative RT-Kontrolle
2. negative NTC-Kontrolle
3. Probe

Wenn Ihr NTC amplifiziert, lassen Sie das Produkt auf einem Gel laufen, um Primer-Dimer auszuschließen. Wenn Ihre Ct-Werte für NTC und RT ungefähr gleich sind, ist Ihre Probe wahrscheinlich nicht kontaminiert.

Eine andere Möglichkeit, die Probenqualität zu bestimmen, besteht darin, die Spezifikationsanalyse Ihrer extrahierten RNA zu verwenden. Sie wollen einen Abs260/Abs280 um 1,8. Ich habe Samples mit einem so niedrigen Verhältnis von 1,45 verwendet und hatte keine Probleme. Verhältnisse um 2,0 weisen auf andere Kontaminationsquellen hin. Wenn Sie auf dieses Problem stoßen, schlage ich vor, dass Sie sich in einigen der anderen Unterthemen dieses Forums umsehen, um Hilfe dazu zu erhalten.

Ersetzen Sie vielleicht alle Ihre Reagenzien, um dort eine Kontamination auszuschließen, und richten Sie Ihre Reaktion dann in einer biologischen Sicherheitswerkbank oder einer Laminar-Flow-Haube ein. Arbeiten Sie abseits von Bänken, die Klonen, Laufgele oder andere Arten von Experimenten beinhalten, die isolierte DNA verwenden. Ich stelle alle meine qPCR-Reaktionen in einem anderen Raum auf als andere Experimente.

Nebenfrage: Womit entsprechen die beiden Peaks in Ihrer Schmelzkurve? Die Probe vs. RT-Kontrolle? Wenn dies der Fall ist, haben Sie wahrscheinlich Probleme mit der Kontamination mit Primer-Dimer oder genomischer DNA.

biotechgirl sagte am Freitag, 14. Januar, 18:05:17:

Xiao Luo sagte am Freitag, 14. Januar, 16:58:10:

biotechgirl sagte am Freitag, den 14. Januar um 00:22:52 Uhr:

Es gibt verschiedene Arten von Negativkontrollen, die Sie in der qPCR verwenden können.

Kontrolle ohne Schablone = keine DNA, cDNA oder RNA in Reaktion, Amplifikation kann auf eine Kontamination Ihrer Reagenzien (zB Mastermix, Primer) hinweisen, aber diese Negativkontrolle ist eigentlich dazu gedacht, die Bildung von Primerdimeren nachzuweisen. Wenn Sie eine Amplifikation erhalten, lassen Sie Ihre Probe auf einem Gel laufen, um zu sehen, ob das Primer-Dimer (muss neu gestaltet werden) oder ob Sie Ihr Ziel amplifizieren (z. B. Kontamination).

Bei einer RT-Negativkontrolle führen Sie bei Ihrer RNA-Probe keine reverse Transkriptionsreaktion durch = die Amplifikation weist auf eine genomische DNA-Kontamination hin. dh. Ihre RNA-Extraktion und -Isolierung lief nicht so gut. kann auch auf eine allgemeine Kontamination des Mastermixes usw. hinweisen.


sollte beachten, dass die Vermeidung von amp. in Ihren Negativkontrollen ist manchmal schwierig, wenn Sie am selben Tag oder zur gleichen Zeit häufig qPCR oder PCR durchgeführt haben. Arbeiten Sie außerhalb von Klonbereichen und reinigen Sie Ihren Labortisch und Ihre Ausrüstung gut, bevor Sie Reaktionen einrichten, um eine Kontamination zu minimieren. Sie können sogar Reaktionen in einer Haube einrichten, wenn Sie sehr wählerisch sein möchten. manchmal trage ich eine Haube UV, um übrig gebliebene DNA abzubauen. Ct-Werte nach 35 oder 40 Zyklen ist wahrscheinlich nur eine Kontamination aus der Luft.

Eigentlich lasse ich die RT-PCR nur dreimal durch, aber jedes Mal, wenn die NO RT-Kontrollen mir einen Ct-Wert über dem Durchschnitt der Proben geben, aber nicht mehr als 32, ist das normal? Eine weitere Verwirrung besteht darin, dass es einen Datensatz gibt, bei dem der Ct-Wert der NO RT-Kontrolle 1 Zyklus kleiner als der der Probe oder fast gleich der Probe ist , dann führe ich RT-PCR aus)
Ein wenig mehr über mein Experiment, ich arbeite an der Genexpression auf Bakterien-RNA, ich verwende Gesamt-RNA, die mit Qiagen-Kits extrahiert wurde, und Dnase I (Promega) behandelt, um die DNA-Kontamination zu beseitigen, führe pcr und gel durch, um keine DNA-Kontamination zu bestätigen, und führe dann iCycler aus .
Ich hänge einige Dateien über das Ergebnis an.
Dankeschön


Wenn es um qPCR geht, bin ich mir nicht sicher, ob die Durchführung eines Gels wirklich eine gültige Methode ist, um festzustellen, ob Ihre Probe frei von genomischer DNA ist. qPCR ist sehr empfindlich, viel mehr als das Ausführen eines Gels. Tatsächlich ist dies einer der Gründe, warum qPCR gegenüber anderen Methoden wie dem traditionellen Northern- oder Southern-Blotting verwendet wird. Nur weil Sie es auf dem Gel nicht sehen können, heißt es nicht, dass es nicht da ist.

qPCR ist theoretisch in der Lage, nur eine einzelne Kopie zu erkennen, während die Gelbildgebung im Allgemeinen mindestens 0,5 ug erfordert, um ausreichend zu erkennen.

Da Ihre Ct-Werte von Ihrer RT im Allgemeinen später als Ihre Proben sind, sieht es so aus, als ob Sie wahrscheinlich Kontaminationsprobleme haben. Entweder in Ihrer Probe, Ihrem Arbeitsbereich oder Ihren Reagenzien. Wenn Ihre RT ungefähr den gleichen Ct-Wert wie Ihre Probe hat, ist das Signal Ihrer Probe nicht gültig, da das gesamte Signal rein auf Kontamination zurückzuführen sein könnte. Ich schlage vor, einen weiteren qPCR-Lauf durchzuführen und drei Reaktionen einzurichten:

1. negative RT-Kontrolle
2. negative NTC-Kontrolle
3. Probe

Wenn Ihr NTC amplifiziert, lassen Sie das Produkt auf einem Gel laufen, um Primer-Dimer auszuschließen. Wenn Ihre Ct-Werte für NTC und RT ungefähr gleich sind, ist Ihre Probe wahrscheinlich nicht kontaminiert.

Eine andere Möglichkeit, die Probenqualität zu bestimmen, besteht darin, die Spezifikationsanalyse Ihrer extrahierten RNA zu verwenden. Sie wollen einen Abs260/Abs280 um 1,8. Ich habe Samples mit einem so niedrigen Verhältnis von 1,45 verwendet und hatte keine Probleme. Verhältnisse um 2,0 weisen auf andere Kontaminationsquellen hin. Wenn Sie auf dieses Problem stoßen, schlage ich vor, dass Sie sich in einigen der anderen Unterthemen dieses Forums umsehen, um Hilfe dazu zu erhalten.

Ersetzen Sie vielleicht alle Ihre Reagenzien, um dort eine Kontamination auszuschließen, und richten Sie Ihre Reaktion dann in einer biologischen Sicherheitswerkbank oder einer Laminar-Flow-Haube ein. Arbeiten Sie abseits von Bänken, die Klonen, Laufgele oder andere Arten von Experimenten beinhalten, die isolierte DNA verwenden. Ich stelle alle meine qPCR-Reaktionen in einem anderen Raum auf als andere Experimente.

Nebenfrage: Womit entsprechen die beiden Peaks in Ihrer Schmelzkurve? Die Probe vs. RT-Kontrolle? Wenn dies der Fall ist, haben Sie wahrscheinlich Probleme mit der Kontamination mit Primer-Dimer oder genomischer DNA.

Die beiden Peaks sind das Referenzgen vs. Gen von Interesse, vielleicht werde ich, wie Sie sagten, versuchen, einen anderen Satz ohne RT-Kontrolle und ohne Template-Kontrolle laufen zu lassen, und auch meinen Arbeitsplatz an die Haube zu verlegen, um die DNA-Kontamination zu vermeiden.
Trotzdem, Ihre Antwort hilft mir sehr, ein neuer Typ in RT-PCR, ich arbeite immer noch an Lesematerialien, also hoffe, dass diese mir helfen können, es besser zu wissen, vielen Dank für Ihre Antwort, schön mit Ihnen zu sprechen. Ich hoffe, wir können mehr über RT-PCR kommunizieren.
Dankeschön


Dienstag, 1. März 2011

Aufnahmespezifität als Werkzeug für die Mikrobiomforschung

Tut mir leid, dass ich dich vernachlässige, Blog.

Rosie und ich fahren also in etwas mehr als einer Woche zum Human Microbiome Meeting hier in Vancouver. Das bedeutet, dass es zwei Poster zu machen gibt! AAccK! Wir werden bei dem Treffen etwas fehl am Platz sein, da wir hauptsächlich im Labor arbeiten, aber wir hoffen, mehr über die normale Umgebung von . zu erfahren H. Influenzae und vielleicht sogar Leute mit Zugang zu Schleim finden, die am bakteriellen genetischen Austausch interessiert sind.

In unseren Postern geht es also nicht direkt um das Mikrobiom, sondern auf einem über unser Experiment zur Genomik der natürlichen Transformation und das andere über die Aufnahmespezifitätsmessungen mittels Deep Sequencing. Als ich über die Zukunft der Aufnahme-Spezifitätsarbeit nachdachte, kam mir der Gedanke, dass wir das verwenden könnten H. Influenzae um zu filtern Hämophilus und andere Pasterellaceaen-Chromosomenfragmente aus einer Lungenschleim-DNA-Probe, zum Beispiel. Dies wäre zumindest eine gute Möglichkeit, die dort wahrscheinlichen Klumpen und Klumpen menschlicher DNA (zumindest das meiste) auszusortieren und ein Mikrobiom-Projekt vielleicht auf eine engere Gruppe zu konzentrieren. so viel Geld sparen.


Materialien

Reagenzien

Ceratopteris richardii Gametophyten und Sporophyten werden in Gewebekultur auf C-Farnnährstoff [10] 1% Agarmedium, pH 6,0, gezüchtet. Diese Medien können im Handel gekauft oder aus Stammlösungen hergestellt werden, wie in [11] beschrieben (Zusatzdatei 1). Es werden sterile Gewebekulturplatten mit einem Durchmesser von 90 mm verwendet, die 25 ml Medium pro Platte erfordern.

Kallus und regenerierende Sporophyten werden in Gewebekultur auf 1× Murashige und Skoog (MS) 2% Saccharose 0,7% Agarmedium, pH 5,8 (MS-Saccharose-Medium) gezüchtet. Es werden sterile Gewebekulturplatten mit 90 und 50 mm Durchmesser verwendet, die 25 bzw. 15 ml Medium pro Platte erfordern.

Sporophyten werden auf Erde (Blumenerde, z. B. Levingtons F3 Bodenmischung) bis zur Reife gezüchtet.

Callus wird durch Anwendung der Cytokinin (CK)-Analoga 6-Benzylaminopurin (BAP) oder Kinetin (KT) in MS-Saccharose-Medium in einer Endkonzentration von 5 μM erzeugt und aufrechterhalten. Die Selektion auf stabile Transformanten erfolgt durch Zugabe von Antibiotikum (Hygromycin B oder das Kanamycin-Analogon G-418) zu MS-Medium in der erforderlichen Konzentration (Tabelle  1 ). Vorräte von 5 mM BAP, 5 mM KT, 40 mg/ml Hygromycin B und 50 mg/ml G-418 können in entionisiertem sterilem Wasser zubereitet, durch einen 0,2 μm-Filter filtriert und auf unbestimmte Zeit gelagert werden �ଌ.

Tabelleਁ

Auswahlbedingungen für Antibiotika für C. richardii Transformation

AntibiotikumFür das Screening erforderliche Konzentration (μg/ml)
KallusGametophytSporophyt
Hygromycin B402020
G-418502020

Endkonzentrationen des Antibiotikums (wie angegeben), die in Wachstumsmedien für die erfolgreiche Identifizierung von transgenen Geweben aus Kallus-, Gametophyten- und Sporophytenpopulationen in Gewebekulturen erforderlich sind. Die Konzentrationen von Hygromycin B und G-418 wurden empirisch bestimmt ([9] Zusatzdatei 2).

Callus wird mit Wolframmikropartikeln (durchschnittlicher Durchmesser ≈ਁ.3 μm) beschossen, die mit 5 μg gereinigter Plasmid-DNA in einer Konzentration von 1 μg/μl markiert sind. Mikropartikel-Etikettierung erfordert steriles 50 % Glycerin, 2,5 M CaCl2 und 0,1 M Spermidin (jeweils sterilisiert durch einen 0,2 μm-Filter) und 70 und 100 % Ethanol (EtOH).

Ceratopteris richardii wird durch Sporen vermehrt, die im Handel und in verschiedenen Forschungslabors erhältlich sind. Dieses Protokoll ist für die Verwendung mit dem Hn-n-Stamm optimiert und wurde nicht an anderen Stämmen getestet.

Sporen werden vor der Verwendung mit einer Mischung aus Natriumhypochloritlösung (2% Chlor) und Tween-20 (0,1% v/v) sterilisiert.

Zellophanscheiben (90 mm Durchmesser) (AA Packaging Ltd., UK).

Filterpapier (90 mm Durchmesser).

Sterile Gewebekulturplatten mit 90 mm Durchmesser und 50 mm Durchmesser.

Sterile 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.

Allgemeine Reagenzien für die Gewebekultur z.B. 70% EtOH, Parafilm, Mikroporenband.

Ausrüstung

Wachstum von C. richardii erfordert eine kontinuierliche hohe Luftfeuchtigkeit und hohe Temperatur. Es wird empfohlen, Einrichtungen mit kontrollierter Umgebung zu verwenden, die in der Lage sind, eine konstante  ≈ꂅ % Luftfeuchtigkeit mit einem langen Tag (LD)-Wachstumsregime von 16 h hell/8 h dunkel, 28ଌ/28ଌ . aufrechtzuerhalten . Kontrollierte Feuchtigkeit ist für das Wachstum von Gametophyten, Kallus oder sich regenerierenden Sporophyten in Gewebekulturen nicht unbedingt erforderlich.

Biolistisches Partikelabgabesystem (z. B. Bio-Rad PDS-1000/He™) und zugehörige Reagenzien.

Klasse 1 Laminar-Flow-Gewebekulturschrank.

Sterile Pinzette. Während Uhrmacherzangen für die Übertragung und Manipulation von Sporophyten während der Gewebekultur empfohlen werden, werden Bajonettzangen empfohlen, um die sterile Übertragung von Kallusgewebe zu erleichtern.


Positiv- und Negativkontrollen für die Transformation - Welche Kontrollen sind zu verwenden (27. April 2006 )

Dies ist das erste Mal, dass ich eine Transformation durchführe, und ich bin verwirrt, welche Art von Steuerelementen ich verwenden soll. Jeder sagt mir immer wieder, dass es am besten ist, mehrere Kontrollen sowie eine positive und eine negative Kontrolle zu verwenden, aber ich bin mir nicht sicher, welche welche ist. Dies sind die vorgeschlagenen Steuerelemente:

1) Ungeschnittener Vektor allein
2) Schnittvektor allein
3) Schnittvektor + Ligase
4) Zellen allein ohne DNA (um sicherzustellen, dass meine kompetenten Zellen funktionieren, nehme ich an?)

Was ist also meine positive Kontrolle und welche meine negative (die Zellen allein?)? Was sollen diese anzeigen und was sollte ich auf meinen Platten sehen, wenn sie richtig funktionieren? Ich dachte, für die Kontrollen 1-3 auf der Liste sollten sie dasselbe zeigen, dh viel Wachstum. Was ist der Unterschied. Soll ich bei meiner Positivkontrolle und meinen Insert- und Vektorplatten ein ähnliches Wachstum sehen?

1) Nur ungeschnittener Vektor --> zeigt, ob die Transformation funktioniert. Wenn ja: viele Kolonien
2) Schneiden Sie den Vektor allein – > ohne Ligation sollten Sie keine Kolonien sehen. Wenn Sie sie sehen, wurde Ihr Vektor nicht vollständig geschnitten (ein bestimmter Prozentsatz).
3) Schnittvektor + Ligase --> nach der Ligation des geschnittenen Vektors (ohne Insert) sollten Sie Kolonien sehen. Dann funktioniert deine Liga im Prinzip.
4) Zellen allein ohne DNA (um sicher zu gehen, dass meine kompetenten Zellen funktionieren, nehme ich an?) --> Nein! Zellen allein wachsen nicht auf LB Amp, weil sie das Resistenzgen nicht nur auf ihnen haben der Vektor.

Ich würde sagen 2) und 4) sind neg. kontrolliert.

Kompetente Zellen können zirkuläre DNA aufnehmen. Transformiert man sie mit einem Plasmid, das ein Resistenzgen für Amp oder Kan oder Neo oder was auch immer enthält, dann können auf Platten mit Antibiotika nur die Zellen wachsen, die ein Plasmid aufgenommen haben.

Sie können 5) Plasmid schneiden + Insert schneiden --> ligieren und transformieren.
Mit Hilfe Ihrer Kontrollen können Sie Ihr Transformationsergebnis auswerten.

1) Nur ungeschnittener Vektor --> zeigt, ob die Transformation funktioniert. Wenn ja: viele Kolonien
2) Schneiden Sie den Vektor allein – > ohne Ligation sollten Sie keine Kolonien sehen. Wenn Sie sie sehen, wurde Ihr Vektor nicht vollständig geschnitten (ein bestimmter Prozentsatz).
3) Schnittvektor + Ligase --> nach der Ligation des geschnittenen Vektors (ohne Insert) sollten Sie Kolonien sehen. Dann funktioniert deine Liga im Prinzip.
4) Zellen allein ohne DNA (um sicherzustellen, dass meine kompetenten Zellen funktionieren, nehme ich an?) --> Nein! Zellen allein wachsen nicht auf LB Amp, weil sie das Resistenzgen nicht nur auf ihnen haben der Vektor.

Ich würde sagen 2) und 4) sind neg. kontrolliert.

Kompetente Zellen können zirkuläre DNA aufnehmen. Transformiert man sie mit einem Plasmid, das ein Resistenzgen für Amp oder Kan oder Neo oder was auch immer enthält, dann können auf Platten mit Antibiotika nur die Zellen wachsen, die ein Plasmid aufgenommen haben.

Sie können 5) Plasmid schneiden + Insert schneiden --> ligieren und transformieren.
Mit Hilfe Ihrer Kontrollen können Sie Ihr Transformationsergebnis auswerten.

Mein Chef sagt, 2) soll überprüfen, wie effizient meine Gelreinigung meines Vektors war, und den Hintergrund überprüfen? Was auch immer das heißt.

Hi
du hast recht. 2 ist eine Negativkontrolle, da sie nur angibt, wie viel ungeschnittener Vektor in Ihrem Präparat "vektorgereinigt" verbleibt.
Ich betrachte als die Wahrheit negative Kontrolle den Vektor allein + Ligation.
Nur Zellen sind für Ihre Zellen und für Ihre Küvette / LB auf Plasmidkontamination zu prüfen und auch auf Selektionseffizienz zu prüfen.


Dienstag, 17. August 2010

Messungen der direkten Aufnahmespezifität


So wurde ich ein wenig von unseren Plänen mit dem Genome BC-Teig abgelenkt, da ich noch mehr Sequenzierungsdaten habe! Umwerben! Ich werde später auf das Design unserer 92 Klone im Wert der Sequenzierung zurückkommen. Im Moment versuche ich, weitere Zuschüsse zu schreiben und unsere Erkenntnisse aus den neuen Sequenzdaten einzubeziehen.

Im Folgenden werde ich (versuchen) schnell zusammenzufassen, was ich mit meiner (sehr) vorläufigen Datenanalyse gefunden habe, und dann versuchen, das, worüber ich Schwierigkeiten habe, klar zu schreiben, zu beschreiben.

Vorweg: Es hat funktioniert! Meine Pläne sind ganz gut aufgegangen. ich habe

15 Millionen Single-End-Sequenz-Reads aus jedem der beiden DNA-Pools. Eines war aus dem Input 24% degeneriertes USS-enthaltendes Fragment. Das andere stammte von den periplasma-gereinigten DNA-Fragmenten. Das Experiment und sein Ergebnis wurden hier und hier beschrieben.

  1. Ich habe jede Lektüre ausgeschlossen, bei der die vier ersten und sechs letzten Basen nicht genau das waren, was sie sein sollten. (Diese sequenzierten Positionen sollten nicht entartet sein, sollten also keine Fehlpaarungen von der erwarteten Eingabesequenz aufweisen.) Dies schließt Lesevorgänge mit bekannten "schlechten" Basen aus und erzwingt die korrekte Ausrichtung. Die ungefilterten Daten enthielten eine Reihe von Reads, die eindeutig Insertionen oder Deletionen innerhalb der USS aufwiesen, wahrscheinlich aufgrund der Einschränkungen der ursprünglichen Oligosynthese.
  2. Ich habe alle Lesevorgänge ausgeschlossen, die Ns enthielten. Dies macht die Analyse etwas einfacher, insbesondere bei der Berechnung der Anzahl der Fehlpaarungen im degenerierten USS aus dem Konsens.

10 Millionen Lesevorgänge in jedem Datensatz. Das ist ein großer Verlust, und ich werde sicherlich versuchen, zu diesen Sequenzlesevorgängen zurückzukehren, aber im Moment ist das Weglassen ein anständiger Filter, der die Analyse vereinfacht (hauptsächlich durch Erzwingen einer "wahren" Ausrichtung).

Ich habe ein paar Greps zusammengeführt, um alle Sequenz-Reads zu ziehen, die meinen Kriterien entsprechen (die ersten vier Basen ATGC, die letzten sechs Basen GGTCGA und keine Ns). Von einem UNIX-Terminal:

Das ist es! (Eines Tages sollte ich wahrscheinlich etwas mit all den Qualitätswerten machen, aber im Moment ignoriere ich sie. Bei diesem Vorgang sind auch alle gelesenen IDs verloren gegangen.)

Ich stellte bald fest, dass bei der Analyse dieser neuen Dateien mein armer Computer-Foo sehr langsam laufende Skripte erstellt, also nahm ich die ersten 100.000 Lesevorgänge von jedem gefilterten Datensatz ab mit einem einfachen:

Erstellen einer Positionsgewichtungsmatrix:

Als nächstes berechnete ich die Frequenz jeder Basis an jeder Position für die beiden Datensätze (Erzeugung von zwei Positionsgewichtsmatrizen oder PWMs). Glücklicherweise habe ich zuvor ausgearbeitet, wie man die Eingangs-PWM verwendet, um die periplasma-gereinigte PWM hier und hier im Hintergrund zu korrigieren.

Ich habe die Daten mit Scan eingelesen. Ich habe normalerweise Dinge wie read.table oder read.csv verwendet, aber das Scannen sieht wie der richtige Weg für einen großen riesigen Vektor aus:

Hmmm. Wäre schön gewesen, diese Schleife zu vermeiden.

Aus den beiden Matrizen habe ich ein hintergrundkorrigiertes periplasmatisches Aufnahmespezifitätsmotiv erhalten, das wie folgt aussieht:
Dies schließt die festen Basen und eine andere anomale Basis zu Beginn des Lesens aus.
(Leider kann ich kein Weblogo oder andere Dinge verwenden, die schönere Logos machen, da keines eine positionsspezifische Basiskomposition unterstützt.)

Hey, schau dir das C an Position 7 an! Es ragt einfach heraus! Das muss ein besonders wichtiger Rückstand für die Aufnahme sein. Ein früherer Postdoc und Doktorand hatten beide die Aufnahmeeffizienz für Fragmente mit Punktmutationen in einem Konsensus-USS gemessen. Diese Daten bieten eine großartige unabhängige Validierung dieses grundlegenden Ergebnisses. So sehen diese Daten aus:
Es sieht so aus, als ob die beiden Ansätze vergleichbare Ergebnisse liefern. Fabelhaft!

Was können wir also noch aus diesem viel größeren Deep-Sequencing-Datensatz lernen? Ich bin sicher, alle möglichen Dinge. Im Moment habe ich nur die Anzahl der Nichtübereinstimmungen zwischen jedem der 100.000 gefilterten Sequenzlesevorgänge und dem Konsens-USS berechnet, auf dem das degenerierte Konstrukt basierte.

So sieht die Verteilung der Nichtübereinstimmungszahl für die beiden Datensätze aus:

Fantastisch! Verlagert, genau wie zuvor simuliert!

Zuerst versuchte ich eine Reihe von extrem mühsamen und langsamen Methoden, dies zu tun. Dann fand ich ein Paket namens "cba" mit einer Funktion namens "sdists", die Entfernungen mit Vektoren von Zeichenketten bearbeiten kann. (Der sdists-Schritt ist, wie ich die Computer ermordete, als ich versuchte, den vollständigen Datensatz zu verwenden.)

Ich denke, ich könnte es einfach in Stücken tun, damit der gesamte Datensatz RAM spart.

Wie auch immer, dieser Abstandsvektor wird als wichtiger Index für die Sequenzlesevorgänge für den nächsten Satz von Analysen dienen (die die Kovariation zwischen Positionen untersuchen und wie sich spezifische Fehlpaarungen auf das Motiv auswirken).

Okay, jetzt versuche ich, das, was mir schwer fällt, prägnant zu beschreiben. Diese Informationsgehaltsmessungen sind, wie im obigen Motiv, in Bits. Das ist "Informationsinhalt", kann aber auch als "Überraschung" gedacht werden. Deshalb hat das aus dem Genom abgeleitete USS-Motiv einen so viel höheren Informationsgehalt als das neue experimentell ermittelte Aufnahmemotiv. (Hier ist die genomische USS:)
Da die meisten Basen an einer bestimmten Position im degenerierten USS-Pool bereits die bevorzugte Konsensus-Base waren, wurde wenig "Überraschung" hervorgerufen, wenn die bevorzugte Base im periplasma-gereinigten Pool angereichert wurde. Als Maß in Bit. Deshalb ist der Maßstab zwischen den beiden Motiven so unterschiedlich.

Wie auch immer, das Problem tritt auf, wenn man über einige andere mögliche Experimente nachdenkt. Wenn zum Beispiel die Aufnahmespezifität teilweise modifiziert würde (wie wir denken, dass wir dies mit gentechnisch veränderten Stämmen erreichen können), würden die Positionen mit einer neuen Spezifität relativ zu den anderen äußerst informativ, wenn die normalen degenerierten Fragmente verwendet werden. Würde man jedoch auf Basis der veränderten Spezifität ein neues Konstrukt entwerfen, hätten diese Positionen gegenüber den anderen Basen keinen so erhöhten Informationsgehalt mehr.

Das ist eigentlich keine schlechte Sache – wir können es sogar ausnutzen – es ist nur schwer klar zu beschreiben. (Fortsetzung.)


Was ist der Zweck der „Keine DNA-Kontrolle“? - Biologie

Fremd-DNA kann auf verschiedene Weise in Zellen eingebracht werden. Wenn die fremde DNA in einer für den Wirt akzeptablen Form in die Zelle eingeführt wird, können Gene auf dieser DNA exprimiert und die DNA durch die Zellen vermehrt werden. In vielen Fällen geschieht dies durch Anheften der fremden DNA an ein DNA-Stück, das sich im Wirt replizieren kann. Für Bakterien und einige Eukaryotenarten stellen Plasmide oder Phagen geeignete Vektoren dar. Plasmide können nur relativ kleine DNA-Segmente (< 15 kb) tragen, aber Phagen- oder Cosmidvektoren können bis zu 50 kb tragen. Künstliche Hefe-Chromosomen (YAC) können verwendet werden, um sehr große fremde DNA-Fragmente (> 200 kb) in Hefe zu vermehren. Phagen- oder Viruspartikel stehen zur Verfügung, um DNA in fast jeden Zelltyp zu übertragen. In anderen Fällen kann fremde DNA ohne angehängten Vektor eingeführt werden und kann sich manchmal selbst in das Wirtschromosom integrieren, wo sie als Teil des Wirtsgenoms repliziert wird.

Der Gesamtprozess der Veränderung des Phänotyps eines Bakteriums durch die Einführung eines Plasmids wird als . bezeichnet Transformation (es gibt noch andere Prozesse, die auch Transformation genannt werden, mit denen wir uns aber nicht beschäftigen werden). Bakterien können durch verschiedene Techniken mit Plasmiden transformiert werden. Am einfachsten ist es, das Plasmid lediglich mit Bakterien zu inkubieren, deren Zellwand geschwächt ist. Die Behandlung der Bakterien mit Calcium oder Rubidium macht die Membran durch einen unbekannten Mechanismus durchlässig für DNA. Diese chemisch behandelten Zellen werden als . bezeichnet "kompetent" weil sie nun bereit sind, fremde DNA aufzunehmen. Es sind auch spezielle Stämme mit genetischen Veränderungen erhältlich, die die Bildung der Polysaccharidschicht einschränken, wodurch die Transformation dieser Zellen um 2 bis 3 Größenordnungen effizienter wird. Organische Lösungsmittel (DMSO) und Polyethylenglykol (PEG 8000) können in Transformationsverfahren verwendet werden. Diese Methoden haben möglicherweise eine etwas geringere Effizienz, sind jedoch schneller durchzuführen. Es werden auch weniger natürliche Verfahren zum Einbringen von DNA in Zellen verwendet. DNA, die an mikroskopische Partikel gebunden ist, kann physikalisch in Zellen "geschossen" werden (ballistische Transformation) oder lösliche DNA kann durch Sprengen von Löchern in die Zellmembran durch eine elektrische Hochspannungsentladung (Elektroporation) eindringen. Die Methode der Wahl hängt von der Art der Zelle und den verfügbaren Instrumenten ab.

In diesem Lab verwenden wir Elektroporation Bakterienzellen umzuwandeln. Bei der Elektroporation wird eine Suspension von Zellen und DNA einer elektrischen Hochspannungsentladung ausgesetzt, die Poren in der Zellmembran erzeugt. Diese Poren sind groß genug, um das Eindringen von DNA in die Zelle zu ermöglichen. Physiologisch gesehen kann die Zellmembran, die als Kondensator fungiert, keinen Strom durchlassen, außer durch Ionenkanäle, die die Membran einem elektrischen Hochspannungsfeld aussetzen, was zu einem vorübergehenden Zusammenbruch der Membranintegrität führt, und das Wiederverschließen der Löcher ist ein natürlicher Zerfallsprozess . Die Transformation mit dieser Methode ist sehr effizient (mehrere Größenordnungen größer als bei herkömmlichen chemischen Methoden).

  • Positive Kontrolle -- die Transformation kompetenter Zellen mit Plasmid-DNA (nicht verdaut) liefert ein Maß für die Effizienz der Transformation und dient als Standard für den Vergleich mit anderen Transformationen
  • Negativkontrollen
    • KEINE DNA -- Transformieren Sie kompetente Zellen ohne hinzugefügte DNA und plattieren Sie sie auf Selektionsmedien, wenn ein hoher Hintergrund ein Problem mit dem Antibiotikum in den Agarplatten anzeigt
    • Verdauungseffizienz – Transformieren kompetenter Zellen mit verdauter Plasmid-DNA/NO-Ligase-Behandlung bei hohem Hintergrund kann darauf hindeuten, dass die Verdauung nicht vollständig war
    • Vector recircularization -- transform competent cells with digested vector DNA that was treated with alkaline phosphatase before adding ligase (NO insert is present) if high background, may indicate that the dephosphorylation reaction was incomplete
      Verweise:
  • Andreason, G.L. and G.A. Evans. (1989) Optimization of electroporation for transfection of mammalian cell lines. Anal. Biochem. 180 (2): 269.
  • Chung, C.T. and R.H. Miller. (1988) A rapid and convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells. Nukl. Acid. Res. 16: 3580.
  • Cohen, S.N., A.C.Y. Chang, and L. Hsu. (1972) Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proz. Nat. Acad. Sci., USA 69: 21102114.
  • Cohen, S.N., A.C.Y. Chang, H.W. Boyer, and R.B. Helling. (1973) Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proz. Nat. Acad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 70: 3240-3244.
  • Knutson, J.C. and D. Yee. (1987) Electroporation: parameters affecting transfer of DNA into mammalian cells. Anal. Biochem. 164 (1): 44.
  • Potter, H., L. Weir, and P. Leder. (1984) Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proz. Nat. Acad. Wissenschaft 81: 7161.
  • Sugar, I.P. and E. Neumann. (1984) Stochastic model for electric field-induced membrane pores: Electroporation. Biophys. Chem. 19 (3): 211.
  • Tsong, T.Y. (1991) Electroporation of cell membranes. Biophys. J. 60: 297-306.
  • Weaver, J.C. (1993) Electroporation: A general phenomenon for manipulating cells and tissues. J. Zelle. Biochem. 51: 426-435.
  • Growth and Check of Bacterial Strains

    Bacteria can be propagated on liquid or solid media. The use of liquid allows large quantities of bacteria to be harvested but does not permit easy selection or determination of phenotype of single cells. The technique of "streaking" cells onto a solid media provides simple isolation of colonies arising from single cells. Colonies selected for the desired phenotype are then used to inoculate liquid broth. A single colony inoculum is preferred because bacteria can undergo many types of mutations naturally. The instability of some of the mutations, especially transposons and phages, can allow some cells to lose characteristics important to the selection scheme and may complicate the analysis. It is always wise to check the parent strain for proper phenotype that reflects the genotype and then use "picks" from single colonies to start liquid cultures.

    The phenotype of drug resistance is fairly easily diagnosed. The desired insert is likely to be present if the cells can grow on antibiotic plates.

    Strain Descriptors

    Strains are described by six indicators.

    1. Individual genes - The listing of a genetic locus or operon functionality associated with the genome of the strain denotes a Mangel of the identified activity unless a "+" accompanies the description. Each locus is described by a three letter code and may contain more than one gene (e.g. lac indicates lactose utilization and encompasses an operator region and three catalytic enzymes). A capital letter following the code specifies the individual gene, as in the case of lac Z, which indicates that the mutation occurs in the b -galactosidase gene. The addition of a number specifies the allele involved. For emphasis of a wild-type gene or locus containing no mutation a superscript of "+" may be placed after the identification (e.g. lac + denotes a fully functional lac operon). An example of a complete strain description is: MC4100 - F- ara D139 d ( arg F- lac )U169 rps L150 rel A1 flb B3501 deo C1 pts F25 rbs R. Each mutant locus listed is nicht functional and the deficiency causes the phenotype described in the description list.
      Notiz: The following descriptions frequently cause confusion because they are NOT locus descriptions:
      Drug resistance is indicated by the presence of a two or three letter code and sometimes a superscript "r" for resistance and "s" for sensitive (e.g., kanamycin, Km r )>
      F' [ present and functional genes ] - loci descriptions listed in square brackets after episome or plasmid designations are present and functional.
    2. Deletions are indicated by the D symbol and the deleted genes or loci are given in parenthesis. As in the MC4100 description above, the deletion occurs from arg F to the lac gene and the particular allele of this mutation is U169.
    3. Fusions are denoted in a similar manner as deletions but the f symbol is used. A " ' " indicates the fusion product is an incomplete gene. The position of the mark preceding the code indicates a portion of the 5' end is missing and a post code mark indicates a 3' deletion.
    4. Insertions are identified by what is inserted and where. A double colon, " :: ," separates the position of insertion from the insert. This is demonstrated in the description of GNB824 by the denotation hns -24::Tn10 (Tc r ). The transposon, Tn10 containing tetracycline resistance gene, is located in the hns locus. This particular insert is designated 24, but this number does not denote the position within the gene. It is an allele number to distinguish it from other insertions. If the insertion point is in an unknown gene the first letter is z followed by a two letter code giving the minute location on the chromosome ( a-j for increments of 10 minutes followed by a-j for minute interval, e.g., zfi=69 minutes).
    5. Plasmids or lysogenic phages present in the strain are at the end of the genotype in brackets.
    6. Fertility status is assumed to be F- unless indicated. F+ or Hfr strains are designated at the start of the description. F' status is listed at the end of the description and any functional loci or genes contained on the F factor are given in square brackets.

    Consult the photocopy provided of a description of specific genetic loci. It is very important to maintain a complete description of the strains used in experiments and to confirm the phenotype.

    You will be using these cells for transformations of BioBricks:

    • *Tet sensitive (TetS) strains:
      • GNB8385K - MC4100 cad ::Mu dl 1734 (Kmr lac ) = kanamycin (Kan) resistant/tetracycline (Tet) sensitive
        (MC4100 - F- ara D139 d( arg F- lac )U169 rps L150 rel A1 flb B3501 deo C1 pts F25 rbs R)
      • GNB824 - GNB8385K hns -24::Tn10 (Tcr) = Kan and Tet resistant

      GNB8385K and GNB824 strains were developed in the laboratory of George N. Bennett, Ph.D., Rice University:
      Tet sensitive ( TetS ) strain GNB8385K was derived from E. coli MC4100: Mu transposon containing beta-galactosidase and kanamycin resistance was inserted into the arginine decarboxylase (adi) or lysine decarboxylase (cad) genes (reporter gene is expressed when bacteria are grown in acidic media = white at neutral pH red at acidic on MacConkey agar).

      Tet resistant ( TetR ) strain GNB824 was derived from strain GNB8385K: Tn10(Tcr) randomly inserted and strains were screened for loss of regulation of the decarboxylase loci (reporter gene is expressed under both neutral and acidic conditions = red colonies on MacConkey agar).


      ERGEBNISSE

      Presurvey Responses

      The presurvey asked students to report their level of understanding about directionality, primers, PCR, and positive and negative controls. Approximately 65–70% of students reported they were unsure of these topics, whereas 30–35% of students felt they understood the topic. The topic of directionality was more specifically evaluated on the presurvey when students were asked to write the reverse complement of a DNA sequence. Although 12% of students responded correctly, 88% of students could not successfully write the reverse complement. We used the data from the presurvey as a baseline of students' prior knowledge.

      Learning Goals

      Exercises were designed to target the learning goals established for the unit (Table 1 and Figure 1). Each exercise was evaluated with its own rubric containing three to four questions, each aligned with appropriate broad and specific goals, and scored on a trilevel scale, with three describing the highest level of comprehension (available online). Data are presented as the percentage of students who achieved a level one, two, or three of understanding. Datum gathered for each specific goal across multiple exercises was averaged to give an overview of how well students achieved the learning goals (Figure 2). For example, specific goal two (Table 1) was assessed by one question from the PCR Exercise and two questions from the Gel Analysis Exercise. All three questions examined how well students could make troubleshooting inferences. Seventy percent of students attained a level three, 25% a level two, and 5% a level one for this learning goal. For specific goals one through six, the majority of students attained a level three of understanding, thereby demonstrating comprehension of the steps of PCR and gel electrophoresis, interpretation of PCR results using controls and DNA size standards, design of quality primers, and troubleshooting experimental results (Figure 2A).

      Figure 2. Student achievements on specific goals. Over the course of the teachable unit, students completed four exercises and a final project all designed to meet seven specific goals (Table 1). All specific goals corresponded to at least two independent questions on one or several exercises. Student understanding for each question was ranked according to two rubrics. Exercises were scored on a three-level scale (A), and the final project was scored on a five-level scale (B). All responses were compiled for each specific goal and are presented as a percentage of total responses (n = 97). Goals: 1, drawing the steps of PCR 2, troubleshooting inferences 3, gel electrophoresis 4, using a DNA ladder 5, positive and negative controls 6, designing primers and 7, GMO case-based presentations.

      Assessment of specific goal seven was based on final group presentations and was scored on a separate five-level rubric, levels zero through four (available online Figure 2B). Students were asked to synthesize the information contained in all of the other exercises to formulate a logical argument based on class data for or against the presence of GMOs in a particular granola bar. The data were used as evidence for their argument in a mock trial regarding false advertisement and GMOs. The majority of students, 65%, obtained a level three or four, indicating a clear, logical, and complete interpretation of the results (Figure 2B).

      An Example Assessment: Gel Analysis Exercise

      Figure 3 highlights data from the Gel Analysis Exercise as an example of how each exercise was evaluated. Similar datum from each of the five exercises was compiled for each specific learning goal to create Figure 2. To assess individual exercises, an evaluative rubric was designed with specific questions that aligned with the broad and specific learning goals. The Gel Analysis Exercise (Supplemental Material D) asked students to identify suspects based on PCR fingerprinting results. Students used a DNA ladder and positive and negative controls to identify cross-reacting bands and appropriately eliminate suspects. Four questions were used to evaluate student learning gains on the exercise, which covered specific goals two, three, four, and five (Table 1 and Figure 1).

      Figure 3. Levels of student understanding for a representative exercise. On the Gel Analysis Exercise, students were asked to analyze a gel to eliminate possible suspects from a crime. Students needed to determine the presence or absence of a band and the size of a band accurately to make their conclusions. Students' responses were evaluated for the following questions. Question 1, how well can the student analyze the results of the gel to identify cross-reacting bands and make appropriate conclusions? Question 2, how well does the student identify and design the next important experiment to test? Question 3, how well does the student understand how DNA migrates in a gel and how to use the ladder to determine fragment sizes? Question 4, how well does the student understand the importance of positive and negative controls? Student understanding was ranked on a three-level scale, with a level three describing the most complete answer, using a rubric. All responses are presented as a percentage of total responses (n = 97).

      The first question asked how well the students could identify cross-reacting bands using positive and negative controls. Eighty percent of students correctly eliminated suspects (level three), whereas 19% could identify appropriate suspects to eliminate but misinterpreted the negative water control, which led them to errantly dismiss one suspect (level two). Question two assessed how well students were able to design the next logical experiment, which in this case was to retest a suspect because of lack of a cross-reacting band. Level three required students to identify which suspect to test and the appropriate controls to use (water and DNA standards that contain or lack the gene fragment). Sixty-three percent of students completed this successfully, whereas 31% could identify the suspect but did not include the appropriate controls (level two). Question three evaluated how well each student could interpret gel results using a DNA ladder. Ninety-six percent of students could determine the appropriate size of the bands based on the ladder, but only half of those students could state how size influenced their decision to eliminate suspects. The last question assessed student understanding of positive and negative controls and how they influenced the student's conclusions about suspects. The majority of students, 79%, were able to identify positive and negative controls (levels two and three) however, only 20% could convey how the controls affected their decisions (level three). For example, some students could recognize a negative control but could not explain the importance of the presence of a cross reacting band in that control, which can be used as an internal control for a successful reaction.

      Knowledge Retention

      Students were surveyed 5 mo after completion of the unit to assess retention of knowledge gained during the unit (Figure 4). Retention questions were directly paired with three rubric questions used to assess the exercises. Question one addressed amplification of a specific DNA sequence using PCR and was paired with the same rubric question from the PCR Exercise. During the GMO unit, 78% of students attained a level three of understanding and 18% attained a level two of understanding. Five months later, 47% percent of students achieved a level three, whereas 39% attained a level two. According to students' responses, those who achieved a level one or two understood how PCR amplified DNA but still had misconceptions about the specificity of primers.

      Figure 4. Knowledge retention. Students were tested for knowledge retention on three topics covered during the teachable unit (columns: TU) and 5 mo after completion of the teachable unit (columns: Ret). Question 1 (Amplification). How well can the student explain why PCR is an appropriate technique for amplification of DNA? Question 2 (Reverse Primer). How well does the student understand the proper orientation/design of the reverse primer? Question 3 (± Controls). How well does the student understand the importance of positive and negative controls? Student understanding was ranked on a three-level scale, with a level three describing the most complete answer, using a rubric. All responses are presented as a percentage of total responses (n = 97).

      The second retention question required students to design a reverse primer with proper orientation similar to the Primer Design Exercise. During the unit, a great majority of students, 85%, clearly understood how to design a reverse primer that was antiparallel to the sequence of interest and written in the 5′to 3′ direction, in accordance with standard notation. Although 37% of students were able to design a correct reverse primer 5 mo later (level three), 42% mistakenly designed a forward primer, indicating confusion about the directionality of DNA replication or standard notation (level one). The remaining 21% of students designed a primer that was either a complementary sequence or had reverse directionality, but not both (level two).

      Question three examined how well students understood positive and negative controls as first evaluated on the Gel Analysis Exercise. During the unit, 59 and 20% of students reached levels two and level three, respectively, indicating the majority of students could identify positive and negative controls and use them to interpret results from the lab. Sixty-six percent of students were able to define positive and negative controls correctly on the retention survey (level three). The percentage of students with a level one of understanding decreased from 21 to 5% after 5 mo.

      Students' Perceptions of New Materials

      On the postsurvey, students were asked about the usefulness of the materials and activities within the exercises in contributing to their understanding of various concepts related to PCR and gel electrophoresis. For each exercise, students selected whether the exercise was of no contribution, some contribution and/or clarified a misconception, or a great contribution to their understanding (Figure 5). A large majority of students responded that all exercises contributed in some way to their understanding (>80% for each exercise). Students felt the animations and primer design exercise were most helpful, with greater than 60% reporting that these exercises were of great help.

      Figure 5. Students' perceptions of the utility of instructional materials. In a postsurvey, students were asked how useful the new materials were in understanding PCR and gel electrophoresis. Each column pertains to the exercises explained in the Teachable Unit Design section. ■, no contribution to student understanding □, some contribution to understanding and/or clarified a misconception and , a great contribution to student understanding. All responses are presented as a percentage of total responses (n = 97).


      No DNA Control

      Verknüpfung

      Hi blog! Long time, no update…

      On Thursday, I submitted 91 genomic DNA samples to our local genome centre (center for you American reader). They’ll be sheared up, converted into indexed (barcoded) libraries, and sequenced on an Illumina GA2 over 4 “lanes”. Wütend! That should have been easier.

      I won’t get the data until probably around February, so with that out-of-the-way for now, I’d best get my act together. But before that, here’s what this first round of sequencing for our Genome BC grant is about:

      We want to get a basic genetic picture of what happens when we do our standard transformation experiments we lack simple rules of genetic transmission by natural transformation. How many DNA fragments do competent cells add to their chromosomes by homologous recombination? How long are the segments? How does genetic divergence affect transformation?

      Verknüpfung

      Haemophilus influenzae KW20 cells can be made naturally competent by starvation of log-phase cells in M-IV media. A fraction of the cells in the culture becomes competent, able to take up added DNA fragments into their cytosol (in H. influenzae, uptake is biased to fragments containing USS, abundant motifs in H. influenzae chromosomes). Taken up DNA fragments can recombine with the cells’ chromosomes, if sufficient sequence identity between the fragment and part of the chromsome allows it.

      We added genomic DNA from an antibiotic-resistant derivative of a divergent clinical isolate NP (86-028NP NovR NalR) to competent KW20 cultures in three separate experiments. In each case, we isolated antibiotic-resistant and –sensitive clones, grew these up in overnight cultures, saved frozen stocks, and extracted genomic DNA from the rest of the cultures for sequencing.

      In these experiment, we are not getting a particularly “natural” view of natural transformation, since the donor DNA we’re using is purified chromosomal DNA from a single divergent isolate. Since we know effectively nothing about the actual DNA in the natural environment of naturally competent H. influenzae—its source, size-distribution, or associated muck—this seems like a good place to start. We know the genome sequence of the donor and can use the genetic differences between donor and recipient to identify transforming DNA segments.

      Based on our preliminary work, we think that these transformed clones will contain long(ish) segments from NP, replacing segments of the KW20 chromosome. We’re using multiplexed Illumina GA2 paired-end sequencing to identify recombinant segments in a large set of clones from these three experiments. We won’t get perfect genome sequences out the other end instead we expect a median read depth of

      60 per clone, enough to probably capture the vast majority of diagnostic polymorphisms in each clone. Then we’ll look at the distribution of recombinant segments across the independent transformants. That’ll be the Science part.

      Here’s what the 91 samples were:

      Selected set: 72
      Because we estimate that only about 10% of the cells in each culture was actually competent, we selected for either novobiocin or nalidixic acid resistant clones (3x12 of each) to ensure that the clone was derived from a competent cell. To allow for selection for transformed cells, the NP donor DNA was purified from a clone made NovR and NalR by PCR-mediated transformation. This means that for a given selected clone, a recombinant segment is always predicted that spans the appropriate locus. At the two selected loci, we will be able to ask about “LD decay” away from the selected positions. We also expect a large number Independent recombinant segments in these clones these will provide basic information about the distribution, size, and breakpoints of recombination tracts in natural transformants.

      Unselected set: 8 pools of 2
      While we estimate percent-competence by evaluating the “congression” (unexpectedly high co-transformation) of “unlinked” markers (not on the same DNA fragment), this calculation relies on an assumption about competent cultures, namely that cells come in only two flavors: either non-competent, unable to take up DNA, or competent, able to take up several long fragments of DNA. It could also be that “congression” arises from a more quantitative distribution of states, where cells are more or less competent i.e. able to take up and recombine a variable number of fragments.
      For the most part, the use of “congression” to evaluate the overall competence of a culture is probably valid, but in terms of generalizing from the above large set of selected transformants, we’d like to know how well this assumption holds true. Because we expect that most unselected clones will look just like the recipient KW20 chromosome, we pooled 16 unselected clones into pairs and include these pools as 8 of our submitted samples. Since we predict that only 10% of cells in the cultures was competent, our null hypothesis is that 1-3 clones will look like selected clones (i.e. a handful of independent recombination tracts) and the rest will look just like KW20. We may, however, find that many more clones show evidence of transformation, but containing only one or only very short recombination tracts.

      Selected late-log set: 8
      Similarly, we also included 8 NovR clones selected from a late-log transformation. Cultures of cells in late-log are considerably less competent than MIV cultures (

      1-2 orders of magnitude), and Rosie showed me some old data in her notebook suggesting that this could roughly be accounted for by percent-competence. The suggestion is that the low transformation frequency of late-log cultures vs MIV cultures is only because fewer cells are competent, rather than late-log competent cells being less transformable. Sequencing a handful of transformants from a late-log culture will help sort this out, in a similar fashion as sequencing unselected clones from MIV cultures.

      Controls: 3
      We included both the donor and recipient genomes as samples while we’ve already obtained ridiculous coverage of these samples, including them here acts as an internal “coverage control”. We also threw in some MAP7 DNA, which is a KW20-derivative with a bunch of antibiotic-resistances. While it’s going to look almost like KW20, we use it on a practically daily basis, so it’d be nice to see its sequence.

      So that’s the set of 91 clones we’re having sequenced with our first round of Genome BC cash. I’m keeping my fingers crossed that the data is good and abundant and reveals new things… (continued. )


      Danksagung

      The authors thank Betsy Hutchison and Rebecca Huss for critical reading of the manuscript, and Janice Lovett for helpful discussions. They thank Tom Reho for technical support. They also thank the students for providing feedback for the laboratory. The development of the laboratory was supported by the SUNY Geneseo Provost's Office.

      Additional Supporting Information may be found in the online version of this article.

      Supporting Information Figure 1

      Supporting Information Figure 2

      Supporting Information Figure 3

      Bitte beachten Sie: Der Herausgeber ist nicht verantwortlich für den Inhalt oder die Funktionalität der von den Autoren bereitgestellten unterstützenden Informationen. Alle Anfragen (außer fehlenden Inhalten) sollten an den entsprechenden Autor des Artikels gerichtet werden.


      Schau das Video: ПЕРЕВОЖУ РЕАКЦИЮ ИНОСТРАНЦЕВTara Simon Studios: ДИМАШ- SOSПЕРВАЯ РЕАКЦИЯ (Dezember 2022).