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3.6.5: Gasbläschen - Biologie

3.6.5: Gasbläschen - Biologie


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LERNZIELE

  • Diskutieren Sie die Rolle eines Gasbläschens in Bezug auf das Überleben.

Gasbläschen sind spindelförmige Strukturen, die in einigen planktonischen Bakterien vorkommen und diesen Zellen Auftrieb verleihen, indem sie ihre Gesamtzelldichte verringern. Positiver Auftrieb ist erforderlich, um die Zellen im oberen Bereich der Wassersäule zu halten, damit sie weiterhin Photosynthese betreiben können. Sie bestehen aus einer Proteinhülle mit einer stark hydrophoben Innenfläche, die sie für Wasser undurchlässig macht (und verhindert, dass Wasserdampf im Inneren kondensiert), aber für die meisten Gase durchlässig ist. Da das Gasbläschen ein Hohlzylinder ist, kann es kollabieren, wenn der Umgebungsdruck zu groß wird.

Die natürliche Auslese hat die Struktur der Gasbläschen verfeinert, um ihre Knickfestigkeit zu maximieren, indem sie ein externes Verstärkungsprotein, GvpC, einbezieht, ähnlich dem grünen Faden in einem geflochtenen Schlauch. Es gibt einen einfachen Zusammenhang zwischen dem Durchmesser des Gasbläschens und dem Druck, bei dem es kollabiert – je breiter das Gasbläschen, desto schwächer wird es. Breitere Gasbläschen sind jedoch effizienter. Sie bieten mehr Auftrieb pro Proteineinheit als schmale Gasbläschen. Verschiedene Arten produzieren Gasbläschen mit unterschiedlichen Durchmessern, wodurch sie sich in unterschiedlichen Tiefen der Wassersäule besiedeln können (schnell wachsende, stark konkurrierende Arten mit breiten Gasbläschen in den obersten Schichten; langsam wachsende, dunkeladaptierte Arten mit starken schmalen Gasbläschen in die tieferen Schichten). Der Durchmesser des Gasbläschens wird auch dazu beitragen, zu bestimmen, welche Arten in verschiedenen Gewässern überleben. Tiefe Seen, die im Winter eine Vermischung erfahren, setzen die Zellen dem hydrostatischen Druck aus, der durch die volle Wassersäule erzeugt wird. Dadurch werden Arten mit schmaleren, stärkeren Gasbläschen ausgewählt.

Wichtige Punkte

  • Sie bestehen aus einer Proteinhülle mit einer stark hydrophoben Innenfläche, die sie für Wasser undurchlässig macht (und verhindert, dass Wasserdampf im Inneren kondensiert), aber für die meisten Gase durchlässig ist.
  • Die natürliche Auslese hat die Struktur des Gasbläschens fein abgestimmt, um seine Knickfestigkeit zu maximieren, einschließlich eines externen Verstärkungsproteins, GvpC, ähnlich dem grünen Faden in einem geflochtenen Schlauch.
  • Der Durchmesser des Gasbläschens wird auch dazu beitragen, zu bestimmen, welche Arten in verschiedenen Gewässern überleben.

3.6.5: Gasbläschen - Biologie

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Gasbläschen kommen vor allem in Wasserorganismen vor, da sie dazu dienen, den Auftrieb der Zelle zu modulieren und die Position der Zelle in der Wassersäule so zu verändern, dass sie für die Photosynthese optimal positioniert oder an Orte mit mehr oder weniger Sauerstoff bewegt werden kann. [1] Organismen, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche schweben könnten, konkurrieren mit anderen Aerobiern, die nicht in einer Wassersäule aufsteigen können, indem sie Sauerstoff in der obersten Schicht verbrauchen.

Darüber hinaus können Gasbläschen verwendet werden, um einen optimalen Salzgehalt aufrechtzuerhalten, indem der Organismus an bestimmten Stellen in einem geschichteten Gewässer positioniert wird, um einen osmotischen Schock zu verhindern. [2] Hohe Konzentrationen von gelösten Stoffen führen dazu, dass Wasser durch Osmose aus der Zelle gezogen wird, was zu einer Zelllyse führt. Die Fähigkeit zur Synthese von Gasvesikeln ist eine von vielen Strategien, die es halophilen Organismen ermöglichen, Umgebungen mit hohem Salzgehalt zu tolerieren.

Gasvesikel sind wahrscheinlich einer der frühesten Motilitätsmechanismen unter mikroskopischen Organismen, da es sich um die am weitesten verbreitete Motilitätsform handelt, die im Genom von Prokaryonten konserviert ist, von denen sich einige vor etwa 3 Milliarden Jahren entwickelt haben. [3] [4] Modi der aktiven Motilität wie die Geißelbewegung erfordern einen Mechanismus, der chemische Energie in mechanische Energie umwandeln könnte, und ist daher viel komplexer und hätte sich später entwickelt. Auch die Funktionen der Gasvesikel sind zwischen den Arten weitgehend erhalten, obwohl die Regulationsweise unterschiedlich sein könnte, was auf die Bedeutung von Gasvesikeln als Motilitätsform hindeutet. In bestimmten Organismen wie Enterobakterien Serratia sp. Geißeln-basierte Motilität und Gasvesikelproduktion werden durch ein einzelnes RNA-bindendes Protein, RsmA, entgegengesetzt reguliert, was auf alternative Modi der Umweltanpassung hindeutet, die sich durch Regulierung der Entwicklung zwischen Motilität und Flotation zu verschiedenen Taxonen entwickelt hätten. [5]

Obwohl es Hinweise auf eine frühe Entwicklung von Gasvesikeln gibt, dient der Plasmidtransfer als alternative Erklärung für die weit verbreitete und konservierte Natur der Organelle. [4] Spaltung eines Plasmids in Halobacterium halobium führte zum Verlust der Fähigkeit zur Biosynthese von Gasvesikeln, was auf die Möglichkeit eines horizontalen Gentransfers hindeutet, der zu einer Übertragung der Fähigkeit zur Produktion von Gasvesikeln zwischen verschiedenen Bakterienstämmen führen könnte. [6]

D) Angepasst von Ramsay et al. (2011), mit freundlicher Genehmigung des Herausgebers.

Gasbläschen sind im Allgemeinen zitronenförmige oder zylindrische, hohle Proteinröhrchen mit konischen Kappen an beiden Enden. Die Vesikel variieren am stärksten in ihrem Durchmesser. Größere Vesikel können mehr Luft aufnehmen und weniger Protein verbrauchen, was sie in Bezug auf den Ressourcenverbrauch am wirtschaftlichsten macht. Je größer ein Vesikel ist, desto strukturell schwächer ist es jedoch unter Druck und desto weniger Druck ist erforderlich, bevor das Vesikel kollabieren würde. Organismen haben sich bei der Proteinnutzung als am effizientesten entwickelt und verwenden den größten maximalen Vesikeldurchmesser, der dem Druck standhält, dem der Organismus ausgesetzt sein könnte. Damit die natürliche Selektion betroffene Gasbläschen hat, muss der Durchmesser der Bläschen genetisch gesteuert werden. Obwohl Gene, die Gasvesikel kodieren, in vielen Haloarchae-Arten gefunden werden, produzieren sie nur wenige Arten. Das erste Haloarchaeal-Gasvesikel-Gen, GvpA, wurde aus Halobacterium sp. NRC-1. [7] 14 Gene sind an der Bildung von Gasbläschen in Haloarchae beteiligt. [8]

Das erste Gasvesikel-Gen, GvpA, wurde in Calothrix identifiziert. [9] Es gibt mindestens zwei Proteine, die das Gasvesikel eines Cyanobakteriums bilden: GvpA und GvpC. GvpA bildet Rippen und einen Großteil der Masse (bis zu 90%) der Hauptstruktur. GvpA ist stark hydrophob und kann eines der am stärksten hydrophoben bekannten Proteine ​​sein. GvpC ist hydrophil und trägt durch periodische Einschlüsse in die GvpA-Rippen zur Stabilisierung der Struktur bei. GvpC ist in der Lage, aus dem Vesikel ausgewaschen zu werden, was zu einer Abnahme der Vesikelstärke führt. Die Dicke der Vesikelwand kann von 1,8 bis 2,8 nm reichen. Die gerippte Struktur des Vesikels ist sowohl auf der Innen- als auch auf der Außenfläche mit einem Rippenabstand von 4–5 nm erkennbar. Vesikel können 100–1400 nm lang und 45–120 nm im Durchmesser sein.

Innerhalb einer Spezies sind die Gasbläschengrößen relativ einheitlich mit einer Standardabweichung von ±4%.

D) Adaptiert von Pfeifer (2012) und (E) von Shapiro et al. (2014), mit freundlicher Genehmigung des Herausgebers.

Es scheint, dass Gasbläschen ihre Existenz als kleine bikonische (zwei Kegel mit miteinander verbundenen flachen Basen) Strukturen beginnen, die sich auf den spezifischen Durchmesser vergrößern, dann wachsen und ihre Länge ausdehnen. Es ist nicht genau bekannt, was den Durchmesser steuert, aber es könnte ein Molekül sein, das GvpA stört oder die Form von GvpA kann sich ändern.

Die Bildung von Gasvesikeln wird durch zwei Gvp-Proteine ​​reguliert: GvpD, das die Expression von GvpA- und GvpC-Proteinen unterdrückt, und GvpE, das die Expression induziert. [10] Extrazelluläre Umweltfaktoren beeinflussen auch die Vesikelbildung, entweder durch Regulierung der Gvp-Proteinproduktion oder durch direkte Störung der Vesikelstruktur. [8] [11]

Lichtintensität Bearbeiten

Es wurde festgestellt, dass die Lichtintensität die Produktion und Aufrechterhaltung von Gasbläschen zwischen verschiedenen Bakterien und Archaeen unterschiedlich beeinflusst. Zum Anabaena flos-aquae, höhere Lichtintensitäten führen zu einem Vesikelkollaps aufgrund eines Anstiegs des Turgordrucks und einer stärkeren Ansammlung von Photosyntheseprodukten. Bei Cyanobakterien nimmt die Vesikelproduktion bei hoher Lichtintensität ab, da die Bakterienoberfläche UV-Strahlung ausgesetzt wird, die das Bakteriengenom schädigen kann. [11]

Kohlenhydrate Bearbeiten

Ansammlung von Glukose, Maltose oder Saccharose in Haloferax mediterranei und Haloferax vulkanii Es wurde festgestellt, dass sie die Expression von GvpA-Proteinen und damit eine Abnahme der Gasvesikelproduktion hemmen. Dies geschah jedoch nur in der frühen exponentiellen Wachstumsphase der Zelle. Die Vesikelbildung könnte auch bei abnehmenden extrazellulären Glucosekonzentrationen induziert werden. [12]

Sauerstoff Bearbeiten

Es wurde festgestellt, dass Sauerstoffmangel die Bildung von Gasbläschen in halophilen Archaeen negativ beeinflusst. Halobacterium salinarum produzieren aufgrund der reduzierten Synthese von mRNA-Transkripten, die für Gvp-Proteine ​​kodieren, unter anaeroben Bedingungen wenig oder keine Vesikel. H. mediterranei und H. vulkanii produzieren keine Vesikel unter anoxischen Bedingungen aufgrund einer Abnahme der synthetisierten Transkripte, die für GvpA kodieren, und verkürzter Transkripte, die GvpD exprimieren. [12]

PH-Wert Bearbeiten

Es wurde festgestellt, dass erhöhte extrazelluläre pH-Werte die Vesikelbildung bei Microcytis-Spezies erhöhen. Bei erhöhtem pH-Wert sind Werte von gvpA und gvpC Transkripte nehmen zu, was eine stärkere Exposition gegenüber Ribosomen für die Expression ermöglicht und zu einer Hochregulierung von Gvp-Proteinen führt. Dies kann auf eine stärkere Transkription dieser Gene, einen verringerten Zerfall der synthetisierten Transkripte oder die höhere Stabilität der mRNA zurückgeführt werden. [13]

Ultraschallbestrahlung Bearbeiten

Es wurde festgestellt, dass Ultraschallbestrahlung bei bestimmten Frequenzen Gasbläschen in Cyanobakterien kollabiert Spirulina platensis, damit sie nicht blühen. [14]

Quorum Sensing Bearbeiten

In Enterobakterium Serratia sp. Stamm ATCC39006, Gasbläschen werden nur produziert, wenn eine ausreichende Konzentration eines Signalmoleküls, N-Acylhomoserinlacton, vorhanden ist. In diesem Fall wirkt das Quorum-Sensing-Molekül N-Acylhomoserinlacton als Morphogen, das die Organellenentwicklung initiiert. [5] Dies ist für den Organismus von Vorteil, da Ressourcen für die Gasvesikelproduktion nur genutzt werden, wenn eine Sauerstofflimitierung durch eine Zunahme der Bakterienpopulation vorliegt.

Gasvesikel-Gen gvpC von Halobacterium sp. wird als Verabreichungssystem für Impfstoffstudien verwendet.

Mehrere Eigenschaften des vom Gasvesikel-Gen kodierten Proteins gvpC ermöglichen die Verwendung als Träger und Adjuvans für Antigene: Es ist stabil, resistent gegen biologischen Abbau, toleriert relativ hohe Temperaturen (bis 50 °C) und ist für den Menschen nicht pathogen. [15] Mehrere Antigene verschiedener humanpathogener Erreger wurden in die gvpC-Gen zur Herstellung von Untereinheiten-Impfstoffen mit lang anhaltenden immunologischen Reaktionen. [16]

Verschiedene genomische Segmente, die für mehrere kodieren Chlamydia trachomatis Die Proteine ​​des Krankheitserregers, einschließlich MOMP, OmcB und PompD, sind mit dem gvpC-Gen von Halobakterien. In vitro Bewertungen von Zellen zeigen die Expression der Chlamydia-Gene auf Zelloberflächen durch bildgebende Verfahren und zeigen charakteristische immunologische Reaktionen wie TLRs-Aktivitäten und entzündungsfördernde Zytokinproduktion. [17] Das Gasvesikel-Gen kann als Transportvehikel genutzt werden, um einen potenziellen Impfstoff gegen Chlamydien zu generieren. Zu den Einschränkungen dieser Methode gehört die Notwendigkeit, den Schaden des GvpC-Proteins selbst zu minimieren und gleichzeitig so viel des Impfstoff-Zielgens in die gvpC-Gensegment. [17]

Ein ähnliches Experiment verwendet das gleiche Gasvesikel-Gen und Salmonella enterica das sekretierte Inosinphosphat-Effektorprotein SopB4 und SopB5 des Krankheitserregers, um einen potentiellen Impfstoffvektor zu erzeugen. Immunisierte Mäuse sezernieren proinflammatorische Zytokine IFN-γ, IL-2 und IL-9. Antikörper-IgG wird ebenfalls nachgewiesen. Nach einer Infektionsprovokation wurden in den entnommenen Organen wie Milz und Leber keine oder signifikant weniger Bakterien gefunden. Potenzielle Impfstoffe, die Gasvesikel als Antigen-Display verwenden, können als alternativer Verabreichungsweg über die Schleimhaut verabreicht werden, wodurch ihre Zugänglichkeit für mehr Menschen erhöht und ein breiteres Spektrum an Immunreaktionen im Körper ausgelöst wird. [fünfzehn]

Gasbläschen haben mehrere physikalische Eigenschaften, die sie auf verschiedenen medizinischen Bildgebungsmodalitäten sichtbar machen. [18] Die Fähigkeit von Gasbläschen, Licht zu streuen, wird seit Jahrzehnten zur Abschätzung ihrer Konzentration und zur Messung ihres Kollapsdrucks verwendet. Der optische Kontrast von Gasvesikeln ermöglicht es ihnen auch, als Kontrastmittel in der optischen Kohärenztomographie mit Anwendungen in der Augenheilkunde zu dienen. [19] Der Unterschied in der akustischen Impedanz zwischen dem Gas in ihren Kernen und der umgebenden Flüssigkeit verleiht den Gasvesikeln einen robusten akustischen Kontrast. [20] Darüber hinaus erzeugt die Fähigkeit einiger Gasbläschenhüllen, sich zu wölben, harmonische Ultraschallechos, die das Kontrast-Gewebe-Verhältnis verbessern. [21] Schließlich können Gasvesikel als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRT) verwendet werden, basierend auf dem Unterschied zwischen der magnetischen Suszeptibilität von Luft und Wasser. [22] Die Fähigkeit, Gasbläschen unter Verwendung von Druckwellen nicht-invasiv zu kollabieren, bietet einen Mechanismus, um ihr Signal zu löschen und ihren Kontrast zu verbessern. Das Subtrahieren der Bilder vor und nach dem akustischen Kollaps kann Hintergrundsignale eliminieren, was die Erkennung von Gasbläschen verbessert.

Die heterologe Expression von Gasvesikeln in Bakterien- [23] und Säugerzellen [24] ermöglichte ihre Verwendung als erste Familie akustischer Reportergene. [25] Während fluoreszierende Reportergene wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) in der Biologie weit verbreitet waren, in vivo Anwendungen sind durch die Eindringtiefe des Lichts in das Gewebe begrenzt, typischerweise einige mm. Lumineszenz kann tiefer im Gewebe nachgewiesen werden, hat aber eine geringe räumliche Auflösung. Akustische Reportergene bieten eine räumliche Auflösung im Submillimeterbereich und eine Eindringtiefe von mehreren Zentimetern in vivo Untersuchung biologischer Prozesse tief im Gewebe.


Messung der Abmessungen von Gasbläschen durch Elektronenmikroskopie

Grant J. Jensen, Abteilung für Biologie und Bioingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Abteilung für Chemie und Chemieingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Abteilung für Chemie und Chemieingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornien, USA

Grant J. Jensen, Abteilung für Biologie und Bioingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Abteilung für Chemie und Chemieingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Abteilung für Chemie und Chemieingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornien, USA

Abteilung für Chemie und Chemieingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornien, USA

Abteilung für Biologie und Bioingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornien, USA

Abteilung für Biologie und Bioingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornien, USA

Beckman Institute, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornien, USA

Abteilung für Biologie und Bioingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornien, USA

Abteilung für Chemie und Chemieingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornien, USA

Abteilung für Biologie und Bioingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornien, USA

Department of Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, Provo, Utah, USA

Grant J. Jensen, Abteilung für Biologie und Bioingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Abteilung für Chemie und Chemieingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Abteilung für Chemie und Chemieingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornien, USA

Grant J. Jensen, Abteilung für Biologie und Bioingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Abteilung für Chemie und Chemieingenieurwesen, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Informationen zur Finanzierung: Caltech Center for Environmental Microbial Interactions Heritage Medical Research Institute National Institutes of Health, Stipendien-/Preisnummern: R01-EB018975, R35-GM122588 Packard Fellowship for Science and Engineering Pew Scholarship in the Biomedical Sciences

Abstrakt

Gasvesikel (GVs) sind zylindrische oder spindelförmige Proteinnanostrukturen, die mit Luft gefüllt sind und von verschiedenen Cyanobakterien, heterotrophen Bakterien und Archaeen zur Flotation verwendet werden. In letzter Zeit haben GVs aufgrund ihrer Fähigkeit, als Bildgebungsmittel und Aktuatoren für Ultraschall, Magnetresonanz und verschiedene optische Techniken zu dienen, Interesse an biotechnologischen Anwendungen gewonnen. Der Durchmesser von GVs ist ein entscheidender Parameter, der zu ihrer mechanischen Stabilität, Auftriebsfunktion und Evolution in Wirtszellen sowie zu ihren Eigenschaften bei bildgebenden Anwendungen beiträgt. Trotz ihrer Bedeutung unterscheiden sich die gemeldeten Durchmesser für die gleichen GV-Typen je nach der für ihre Bewertung verwendeten Methode. Hier liefern wir eine Erklärung für diese Diskrepanzen und verwenden elektronenmikroskopische (EM) Techniken, um den Durchmesser der am häufigsten untersuchten Arten von GVs genau abzuschätzen. Wir zeigen, dass während der Lufttrocknung auf dem EM-Gitter die GVs abflachen, was zu a

1,5-fache Vergrößerung ihres scheinbaren Durchmessers. Wir zeigen, dass der Durchmesser von GVs durch direkte Messungen von Kryo-EM-Proben genau bestimmt werden kann oder alternativ indirekt von Breiten von flach kollabierten und negativ gefärbten GVs abgeleitet werden kann. Unsere Ergebnisse helfen, die Inkonsistenz in zuvor gemeldeten Daten zu erklären und bieten genaue Methoden zur Messung der GV-Dimensionen.


Ergebnisse

Zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen wurden zwei verschiedene Methoden angewendet. Der erste Ansatz waren Pull-Down-Experimente unter Verwendung der Cellulose-bindenden Domäne als Tag, der zweite Ansatz war Split-GFP, um Interaktionspartner zu identifizieren in vivo.

Pulldown-Experimente unter Verwendung der Cellulose-Bindungsdomäne

Mutmaßliche Interaktionen der akzessorischen Proteine ​​GvpF bis GvpM wurden durch Pull-Down-Experimente unter Verwendung der Cellulose-Bindungsdomäne CBD untersucht, die es markierten Proteinen ermöglicht, Cellulose bei hohen Salzkonzentrationen (2𠄳 M KCl) zu binden (Ortenberg und Mevarech, 2000 Irihimovitch und Eichler , 2003 Schlesner et al., 2012). CBD wurde an den N- oder C-Terminus jedes akzessorischen Gvp unter Verwendung des Vektorplasmids pCBD (ergänzende Figur 1) fusioniert. Das resultierende CBDX oder XCBD Konstrukte (X = jedes akzessorische GvpF bis GvpM) wurden zur Transformation verwendet Haloferax vulkanii WR340. Um zu testen, ob die CBD-Fusionsproteine ​​tatsächlich in 2 M KCl gereinigt werden können, wurden Lysate der jeweiligen CBDX-Transformanten wurden mit Cellulose gemischt, um das CBD-markierte Gvp zu binden, und die Elutionsfraktionen wurden durch SDS-PAGE sowie Western-Analyse unter Verwendung von Antiseren untersucht, die gegen die verschiedenen Gvp-Proteine ​​erzeugt wurden (ergänzende Abbildung 2). Mit Ausnahme von GvpJ und GvpM wurde das akzessorische Gvp in angemessenen Mengen isoliert (Tabelle 1) und in den mit Coomassie gefärbten Gelen gut sichtbar (ergänzende Abbildung 2). GvpJ und GvpM wurden in viel geringeren Mengen erhalten, vermutlich aufgrund ihrer hydrophoben Natur und ihrer Neigung zur Aggregation. Aggregate von GvpJ und GvpM können in der festen Fraktion der Zellextrakte vorhanden sein und die Zugabe der Detergenzien DDM (n-Dodecyl-β-D-maltoside) oder OGP (Octyl-β-D-glucopyranosid) zum Lysat und Waschpuffer verbesserte die Anwesenheit dieser Proteine ​​in der löslichen Fraktion leicht (Tabelle 1). Alle akzessorischen Gvp-Proteine, einschließlich GvpJ und GvpM, waren durch Western-Analyse nachweisbar (ergänzende Abbildung 2). Bei GvpJ ist immer ein Abstrich größerer Banden nachweisbar, was auf seine Aggregationsfähigkeit hinweist (Ergänzende Abbildung 2). Somit ist jeder der CBDGvp-Proteine ​​wurden ausgewählt und konnten gereinigt werden. Um sicherzustellen, dass das unmarkierte Gvp weder mit der Cellulosematrix noch mit CBD interagiert, wurden Transformanten hergestellt, die die Plasmide pCBD (ohne gvp) und pX ex (gvpX-pJAS35 drückt irgendein aus gvp ohne cbd Verschmelzung). Keines der getesteten Gvp-Proteine ​​war in der jeweiligen Elutionsfraktion nachweisbar, was zeigt, dass keines von ihnen an Cellulose oder an CBD selbst band (Daten nicht gezeigt).

Tabelle 1. Betrag von CBDGvp gewonnen aus einer 400 ml Kultur durch CBD.

Die CBD-markierten Gvp-Proteine ​​wurden als Köder verwendet und auf die Selektion eines mutmaßlichen Gvp-Interaktionspartners getestet, der in derselben Zelle produziert wurde. Das erste getestete Proteinpaar war GvpL/GvpM, wo eine Interaktion mit His-markierten Gvp-Proteinen nachgewiesen wurde. GvpL oder GvpM trugen CBD fusioniert an den N- oder C-Terminus (CBDNSCBD oder CBDM, MCBD) und die Kombinationen CBDL/M, LCBD/M, CBDM/L und MCBD/L wurden analysiert. Lysate der CBDL/M und LCBD/M-Transformanten wurden auf die Anwesenheit von GvpM getestet und Monomere und Dimere dieses Proteins wurden durch Western-Analyse identifiziert (ergänzende Abbildung 3). Außerdem war GvpL in den Elutionsfraktionen der CBDM/L und MCBD/L-Transformanten, die anzeigen, dass GvpL GvpM bindet (ergänzende Abbildung 3). Diese Ergebnisse bestätigten die GvpL/GvpM-Wechselwirkung, die bereits bei Verwendung der entsprechenden His-markierten Gvp-Proteine ​​und einer Ni-NTA-Matrix für die Affinitätschromatographie beobachtet wurde (Tavlaridou et al., 2014).

Ähnliche Pull-Down-Experimente mit CBD wurden mit allen anderen akzessorischen Gvp-Proteinen durchgeführt. Die jeweiligen Hfx. vulkanii Transformanten trugen immer zwei Konstrukte, eines für das Köderprotein (CBDX) und eine für die Beute GvpY (mit X, Y = F, G, H, I, J, K, L oder M). Beide Leserahmen, die Köder und Beute kodieren, wurden unter Pfdx Promotorkontrolle, um eine ähnlich hohe Expression sicherzustellen. Nicht alle möglichen Interaktionen wurden auf beide Arten durchgeführt (CBDX+Y und CBDY+X), da bereits mit einem Proteinpaar Proteininteraktionen gefunden wurden. Die Ergebnisse dieser Studien sind in Abbildung 1 dargestellt und in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Western-Blots in Abbildung 1 sind nach dem zum Nachweis des Beuteproteins verwendeten Antiserum angeordnet. Verwenden von CBDX zur Auswahl von GvpM ergab monomeres GvpM mit CBDH, und Monomere sowie Dimere mit CBDF, CBDG, CBDJ, CBDK, und CBDL (Abbildung 1). Dimere und Multimere von GvpM wurden beobachtet mit CBDIch (Abbildung 1). Daher wurde GvpM in all diesen Fällen abgezogen. GvpL wurde ausgewählt von CBDF, aber die Ergebnisse mit CBDH oder CBDIch war zweideutig (Abbildung 1). Wenn jedoch CBDL wurde als Köder verwendet, GvpM, GvpK, GvpJ oder GvpG wurden wiederum ausgewählt, was darauf hindeutet, dass alle diese akzessorischen Gvp GvpL banden. Außerdem interagierte GvpK mit jedem der zusätzlichen Gvp, da CBDF durch CBDJ und CBDL hat GvpK heruntergezogen und CBDK hat GvpM wiederhergestellt. Monomere von GvpJ wurden ausgewählt von CBDX, aber es wurde ein Abstrich mit zusätzlichen GvpJ-Multimeren gefunden mit CBDF, CBDH, CBDICH, CBDL, oder CBDM (Abbildung 1). GvpI wurde nur als Köder verwendet und CBDIch habe eines der zusätzlichen Gvp-Proteine ​​heruntergezogen. Es ist interessant zu bemerken, dass CBDIch habe oft die Bildung größerer Oligomere induziert, insbesondere mit GvpM, GvpK oder GvpJ als Beute. GvpH wurde ausgewählt von CBDZum CBDIch und CBDH zog GvpG, GvpJ, GvpK, GvpL oder GvpM herunter (Abbildung 1 und Tabelle 2). GvpG-Monomere und -Dimere wurden ausgewählt von CBDF, während CBDH, CBDIch und CBDL wählte das Dimer von GvpG (und zusätzliche Multimere im Fall von CBDIch) (Abbildung 1). Schon seit CBDG-gebundenes GvpM, GvpK und GvpJ zeigten diese Ergebnisse, dass GvpG mit allen akzessorischen Proteinen wechselwirken kann. Ähnliche Ergebnisse wurden mit GvpF erzielt, da GvpF durch CBDIch und CBDF zog GvpG, GvpH und GvpJ durch GvpM herunter (Abbildung 1 und Tabelle 2). Insgesamt implizierten die Ergebnisse dieser Pull-Down-Experimente, dass jedes akzessorische Gvp mehrere Interaktionspartner hatte und legten nahe, dass diese Proteine ​​einen größeren Komplex bilden könnten.

Abbildung 1. Western-Analysen der Pull-Down-Assays mit CBDX. Der Köder CBDX und das Beuteprotein Y (X, Y = jedes GvpF bis GvpM Protein) wurden in derselben synthetisiert Hfx. vulkanii Zelle. Beide sind oben auf den Blots markiert. Es ist nur die Elutionsfraktion der Cellulosematrix gezeigt. Jeweils 15 μL der Elutionsfraktion wurden per SDS-PAGE aufgetrennt, die Proteine ​​auf eine PVDF-Membran transferiert und mit dem jeweils darunter angegebenen Antiserum (㬟 bis αM) inkubiert. Die mutmaßlichen Interaktionspartner wurden mit dem Fluorophor-markierten Sekundärantikörper IRDye 800 CW (Licor) sichtbar gemacht. Die Blots werden invertiert nach schwarz-weiß und nach dem jeweils verwendeten Antiserum angeordnet. Pfeile markieren das erwartete Gvp-Monomer und -Dimer. Die Zahlen auf der linken Seite sind Größenmarkierungen in kDa.

Tabelle 2. Zusammenfassung der Pulldown-Experimente mit CBDGvp.

Zubehör Gvp Proteine ​​Ausgewählt von CBDm

Um zu untersuchen, ob GvpM alle zusätzlichen Gvp gleichzeitig auswählen konnte, Hfx. vulkanii Transformanten wurden hergestellt mit CBDM und zusätzlich das Plasmid pF-L ex exprimierend gvpFGHIJKL unter den starken Pfdx Promoter-Kontrolle. Die Interaktionspartner von CBDM wurden durch Pull-Down-Experimente aus dem Lysat dieser Transformante ausgewählt, und Proben wurden durch Western-Analysen unter Verwendung der verschiedenen Antiseren getestet (Fig. 2). Alle zusätzlichen GvP wurden identifiziert, was darauf hindeutet, dass CBDM hat sie alle angezogen. Es wurde jeweils das jeweilige monomere Gvp nachgewiesen. Im Fall von GvpG waren neben dem erwarteten 10-kDa-GvpG-Protein zwei 30�-kDa-Banden sichtbar, und GvpJ und GvpK bildeten ebenfalls Multimere (Abbildung 2). Das Monomer der CBDM-Köderprotein wurde ebenfalls nachgewiesen (Abbildung 2). Gesamt, CBDM konnte GvpF durch GvpL herunterziehen. Es ist möglich, dass jedes dieser Gvp-Proteine ​​unabhängig an CBDM, aber es ist auch möglich, dass einige oder alle von ihnen einen Komplex bilden, der an GvpM bindet.

Figur 2. Westliche Analysen von Proteinen ausgewählt von CBDMindest CBDM/pF-L ex-Transformanten. Jeweils 15 μL der Elutionsfraktion wurden per SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und mit dem jeweils darunter markierten Antiserum (㬟 bis αM) inkubiert. Die Reaktionen werden mit dem Fluorophor-markierten Sekundärantikörper IRDye 800 CW (Licor) sichtbar gemacht. Pfeile markieren das erwartete detektierte Gvp-Monomer. Die Blots wurden schwarz-weiß invertiert. Zahlen auf der linken Seite sind Größenmarkierungen in kDa.

Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Split-GFP . untersucht

Paarweise Wechselwirkungen der akzessorischen Gvp-Proteine ​​wurden in Hfx. vulkane in vivo nach der Split-GFP-Methode. Jeder gvp Leserahmen wurde durch PCR amplifiziert und in die vier Vektorplasmide inseriert, um die zu fusionieren ngfp- oder cgfp Leserahmen zum 5′ oder 3′ Terminus von jedem gvp (Winteret al., 2018). Die N- und C-terminalen GFP-Fragmente NGFP und CGFP leiten sich vom salzadaptierten, grün fluoreszierenden Protein mGFP2 ab (Born und Pfeifer, 2019). Ein fluoreszierendes GFP wird nur gebildet, wenn die beiden Fusionspartner interagieren und keine sterische Hinderung auftritt. Der Leserahmen jedes Fusionsproteins wird unter dem Pfdx Promotorkontrolle, um ähnlich große Mengen dieser Proteine ​​zu erhalten. Die vier N/CGFP-Fusionen wurden bezeichnet als nX, oder CX für die N-terminale Fusion und XC oder Xn für die C-terminale Fusion mit Gvp (mit X = entsprechendes akzessorisches Gvp C = CGFP N = NGFP). Getestet wurden die acht Kombinationen eines Proteinpaares in Hfx. vulkanii Transformanten und die Fluoreszenz wurde in willkürlichen lichtabsorbierenden Einheiten pro mm 2 gemessen. Die für jedes Interaktionspaar berechnete höchste relative Fluoreszenz (RF-Werte) ist in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt, und die ursprünglichen Daten, die in LAU/mm 2 erhalten wurden, sind in der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt. Eine Zusammenfassung dieser Daten ist in Abbildung 3 dargestellt.

Figur 3. Interaktionen des Zubehör-Gvp bestimmt durch Split-GFP. (EIN) Höchste relative Fluoreszenz (rf-Werte), die für die Protein-Protein-Wechselwirkungen bestimmt wurde, berechnet wie im Abschnitt Methoden beschrieben. Alle Experimente wurden mit zwei biologischen und drei technischen Replikaten durchgeführt. (B) Zusammenfassung der verschiedenen Protein-Protein-Interaktionen bestimmt durch Split-GFP. Die getesteten Gvp-Proteine ​​sind in der grauen Box links dargestellt und ihre Interaktionspartner sind nach dem höchsten ermittelten HF-Wert (unten angegeben) geordnet. Eine Fluoreszenz über rf > 5 wurde als deutliche Wechselwirkung angesehen. Rf-Werte < rf 4 gelten als schwache oder keine Wechselwirkung.

Die höchste relative Fluoreszenz aller Wechselwirkungen wurde mit dem beobachtet nG/CL-Transformante (rf 77,5), was eine starke Wechselwirkung von GvpL mit GvpG impliziert (Abbildung 3A). Alle anderen Interaktionspartner von GvpL ergaben rf-Werte unter 20. Für die Interaktion F . wurden Rf-Werte zwischen 10 und 20 beobachtetC/nL, nIch/LC, MC/Ln, Hn/LC, und JC/nL, und rf 7.4 wurde für K . bestimmtC/nL (Abbildungen 3A, B und ergänzende Abbildung 5). Diese Ergebnisse implizierten, dass das 32-kDa-GvpL mit allen anderen akzessorischen Gvp interagierte. GvpL ist das größte der zusätzlichen Gvp und könnte als Plattform fungieren, um alle anderen zu binden. Außerdem interagierte GvpF mit mehreren Gvp-Proteinen (GvpL, GvpH, GvpI und GvpG) (Fig. 3B). Die FC/Ln Die Transformante (rf 16.6) zeigte die höchste relative Fluoreszenz, während die anderen drei Bindungspartner niedrigere rf-Werte ergaben (rf 5.0𠄶.3). Im Fall von GvpF sollte erwähnt werden, dass die höchste Fluoreszenz immer beobachtet wurde, wenn N- oder CGFP an den C-Terminus von GvpF fusioniert wurde, was darauf hindeutet, dass eine Fusion an den N-Terminus den Aufbau von mGFP2 behindert. Das 23-kDa-GvpF ist kleiner als GvpL, aber beide Proteine ​​weisen Sequenzähnlichkeiten und eine ähnliche 3D-Struktur auf, wenn sie mit der Kristallstruktur des cyanobakteriellen GvpF als Matrize modelliert werden (Xu et al., 2014 Winter et al., 2018).

Die zweithöchste Fluoreszenz (rf 20) aller Kombinationen wurde für H . beobachtetC/nI-Transformante (Abbildung 3), was bedeutet, dass sich GvpH und GvpI gegenseitig anziehen. Beide Proteine ​​interagierten auch mit GvpF und GvpL (rf 6.3). Für GvpG wurden zwei Partnerproteine ​​identifiziert (GvpL und GvpF), und GvpL schien der einzige Interaktionspartner der drei Proteine ​​GvpJ, GvpK und GvpM zu sein (Fig. 3B). Insgesamt zeigten diese Ergebnisse dieser Split-GFP-Analysen, dass alle akzessorischen Gvp-Proteine ​​mindestens ein weiteres Gvp-Protein als Interaktionspartner aufwiesen. Da GvpL alle gebunden hat, ist es möglich, dass sie einen größeren Komplex bilden. Im Vergleich zu den Ergebnissen der Affinitätschromatographie mit CBDGvp wurden mit Split-GFP weniger Wechselwirkungen beobachtet, insbesondere für die beiden hydrophoben Proteine ​​GvpJ (12 kDa) und GvpM (9,2 kDa) und für GvpK (12,6 kDa).

Interaktionspartner von GvpA

Um Wechselwirkungen zwischen dem wichtigsten strukturellen Gasvesikelprotein GvpA und diesen akzessorischen Gvp aufzudecken, wurde jede Kombination von A/X (X = GvpF bis GvpM) durch Split-GFP untersucht. GvpA wurde am N- oder C-Terminus an N- oder CGFP fusioniert und paarweise mit den jeweiligen N/CGFP-Fusionsvarianten von GvpF bis GvpM getestet. Für jedes Paar wurden acht verschiedene Kombinationen untersucht, und die jeweils höchsten berechneten HF-Werte sind in Abbildung 4A dargestellt. Die in diesen Experimenten erhaltenen Originaldaten sind in der ergänzenden Abbildung 6 dargestellt. Die höchste relative Fluoreszenz wurde für A . erhaltenC/Fn Transformante (rf 20), wohingegen alle anderen Transformanten rf-Werte < 1 ergaben, was auf sehr schwache Kontakte zwischen GvpA und den anderen Gvp-Proteinen schließen lässt ( 4A ). Außer nA/LCwurde die höchste Fluoreszenz eines Proteinpaares immer beobachtet, wenn N- oder CGFP an den C-Terminus von GvpA fusioniert wurde. Diese Ergebnisse implizierten, dass GvpF der einzige Interaktionspartner von GvpA ist und dass die N-terminale Region von GvpA an der Interaktion beteiligt sein könnte.

Figur 4. Split-GFP-Wechselwirkungsstudien mit GvpA/GvpX. Es wird nur die höchste für jede Kombination ermittelte relative Fluoreszenz angegeben. Es wurden jeweils zwei biologische und drei technische Replikate durchgeführt. (EIN) Interaktionsstudie von GvpA mit den acht akzessorischen Proteinen GvpF bis GvpM. (B) Interaktion von fünf verschiedenen GvpA-Fragmenten mit GvpF. (C) Sequenz der fünf GvpA-Fragmente in Bezug auf die oben gezeigte aa-Sequenz von GvpA. Zahlen über der Sequenz zeigen die aa-Positionen in GvpA. Die Helices 㬑 und 㬒 und die β-Blätter 㬡 und 㬢 sind fett und unten markiert und ebenfalls grau schattiert.

To define the interaction site of GvpF in GvpA more precisely, five GvpA fragments harboring different structural features (according to the model obtained by Strunk et al. (2011)) were studied by split-GFP. Fragment A1-22 encompasses the first 22 amino acids of GvpA including α-helix 1 (㬑), fragment A1-34 contains in addition β-sheet 1 (㬑-㬡), and A1-43 the 㬑-㬡-㬢 elements of GvpA (Figure 4C). Fragment A20-47 contains 㬡-㬢, and A44-76 the α-helix 2 up to the C-terminus of GvpA (㬒) (Figure 4C). Each of these GvpA fragments was fused at the N- or C-terminus to N- or CGFP and tested with the respective N/CGFP fusion of GvpF. Transformant Fn/A1-22C yielded the highest fluorescence (rf 41), i.e., more than twice as high as obtained for the interaction of GvpF with the entire GvpA (rf 20) (Figure 4B). Smaller protein fragments offer less steric hindrance supporting the interaction (Ghosh et al., 2000 Winter et al., 2018). An increased fluorescence was also found for the transformants harboring F/A1-34 and F/A1-43 (rf 33 – 35), whereas a very low relative fluorescence (rf < 1) was obtained for the transformants harboring F/A20-47 or F/A44-76. These results implied that the C-terminal portion of GvpA is not involved, and that the N-terminal portion contains the interaction site of GvpF.

To further confine the interaction site of GvpF in GvpA, various substitution variants of GvpA were tested by split-GFP. Many of these point mutations in GvpA are known to influence the formation of gas vesicles in 㥊+Amut transformants (Strunk et al., 2011 Knitsch et al., 2017). These transformants carry two vector plasmids, the 㥊 construct (contains except gvpA alle gvp genes of the p-vac region) and construct A (gvpA or mutant gvpA expressed in pMDS20 under the control of the native PEIN promoter). The different GvpA variants were investigated by split-GFP analysis for their potential to interact with GvpF in Hfx. volcanii. Die Fn fusion protein was used as interaction partner in all these cases (Figure 5A). The strongest reductions in relative fluorescence (rf < 6) compared to GvpA wild type (rf 15-18) were observed for the GvpA substitutions G20D, G20A, D24A, D24Y, R28A, R28D, or E40A, but also R15A, K19D, A27E, or G33V resulted in a low relative fluorescence of the F/Amut transformants (Figure 5A and Supplementary Figure 6). Especially the charged aa in 㬡 and 㬢 (D24, R28, E40) and G20 of GvpA had a strong influence on the interaction with GvpF (Figure 5). All these aa are located in the N-terminal half of GvpA, whereas any of the single substitutions in the C-terminal half had no effect on the interaction with GvpF, supporting the results described above. It is likely that these aa of GvpA are involved in the GvpF/GvpA interaction. In respect to the gas vesicle phenotype of the 㥊+Amut transformants, most of these mutations result in a Vac – phenotype, except for D24A (cylindrical) and R28A (mini gas vesicles) (Knitsch et al., 2017 Figure 5B). It is possible that the Vac – phenotype is caused by the lack of an interaction between GvpF and GvpA, rather than (or in addition to) an influence of the mutation on the GvpA/GvpA contact in the gas vesicle wall.

Abbildung 5. Split-GFP studies of GvpF and variants of GvpAmut. (EIN) Rf-values of the GvpF/GvpA (WT) and the various F/Amut transformants. The single substitutions in GvpA are indicated below. F/Amut transformants with relative fluorescence φ are labeled in blue. The fluorescence was determined in LAU/mm 2 , and the relative fluorescence in relation to the fluorescence of Hfx. volcanii wild type calculated. Two biological and three technical replicates were performed in each case. (B). Sequence of GvpA and summary of the rf-values of the various GvpA mutants. The sequence of GvpA is presented on top and the structural features 㬑–㬡–㬢–㬒 shaded in grey. The substitutions in GvpA are summarized underneath each GvpA contains only a single substitution. Rf < 6 is regarded as weak interaction, whereas rf > 11 is similar to GvpA wild type. The Vac phenotype of the respective 㥊+Amut transformants is indicated by color: red, Vac negative green, cylinder shaped yellow, mini gas vesicles without color, wild type gas vesicles.


REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction

Klaus Apel and Heribert Hirt
vol. 55, 2004

Abstrakt

▪ Abstract Several reactive oxygen species (ROS) are continuously produced in plants as byproducts of aerobic metabolism. Depending on the nature of the ROS species, some are highly toxic and rapidly detoxified by various cellular enzymatic and . Weiterlesen

Figure 1: Generation of different ROS by energy transfer or sequential univalent reduction of ground state triplet oxygen.

Figure 2: The principal features of photosynthetic electron transport under high light stress that lead to the production of ROS in chloroplasts and peroxisomes. Two electron sinks can be used to alle.

Figure 3: The principal modes of enzymatic ROS scavenging by superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), the ascorbate-glutathione cycle, and the glutathione peroxidase (GPX) cycle. SOD converts hydro.

Figure 4: Schematic depiction of cellular ROS sensing and signaling mechanisms. ROS sensors such as membrane-localized histidine kinases can sense extracellular and intracellular ROS. Intracellular RO.

Figure 5: Different roles of ROS under conditions of (a) pathogen attack or (b) abiotic stress. Upon pathogen attack, receptor-induced signaling activates plasma membrane or apoplast-localized oxidase.


REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction

Klaus Apel and Heribert Hirt
vol. 55, 2004

Abstrakt

▪ Abstract Several reactive oxygen species (ROS) are continuously produced in plants as byproducts of aerobic metabolism. Depending on the nature of the ROS species, some are highly toxic and rapidly detoxified by various cellular enzymatic and . Weiterlesen

Figure 1: Generation of different ROS by energy transfer or sequential univalent reduction of ground state triplet oxygen.

Figure 2: The principal features of photosynthetic electron transport under high light stress that lead to the production of ROS in chloroplasts and peroxisomes. Two electron sinks can be used to alle.

Figure 3: The principal modes of enzymatic ROS scavenging by superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), the ascorbate-glutathione cycle, and the glutathione peroxidase (GPX) cycle. SOD converts hydro.

Figure 4: Schematic depiction of cellular ROS sensing and signaling mechanisms. ROS sensors such as membrane-localized histidine kinases can sense extracellular and intracellular ROS. Intracellular RO.

Figure 5: Different roles of ROS under conditions of (a) pathogen attack or (b) abiotic stress. Upon pathogen attack, receptor-induced signaling activates plasma membrane or apoplast-localized oxidase.


Types of Vesicles

Different types of vesicles are found within the cell that has a wide variety of functions.

  • Vacuoles: These are tiny lipid enclosed structures that usually contain water, and are mostly seen in Pflanzen and certain Bakterien. They are used for regulating osmotic pressure in the cell.
  • Lysosomen: Lysosomes are a type of vesicle which is involved in zellular Verdauung. A lysosome contains proteolytic enzymes that can break down food molecules.
  • Peroxisomen: Similar to lysosomes, peroxisomes are specialized vesicles that contain hydrogen peroxide. These vesicles are primarily involved in cellular oxidation reactions.
  • Transport vesicles: As the name suggests, these are tiny sacs enclosed by a lipid bilayer that is heavily involved in the transport of materials from and to the cell and between organelles.
  • Secretory vesicles: A type of specialized vesicle that carries substances out of the cell. They usually generate from the Golgi apparatus.
  • Synaptic vesicles: A type of specialized vesicle found in the types of neurons that store and transport neurotransmitter molecules.
  • Extracellular vesicles: Extracellular vesicles are found outside the cell and are used for transport into the cell. These type of vesicles are seen in both eukaryotic and prokaryotic cells.
  • Gas vesicles: These are found in bacteria and provide buoyancy to the cell.


The Gas Vesicle Gene Cluster from Microcystis aeruginosa and DNA Rearrangements That Lead to Loss of Cell Buoyancy

FEIGE. 1. Die gvp gene cluster region in M. aeruginosa and IS found in the GV-deficient mutants. (A) Strain PCC 7806 (B) strain PCC 9354. From top to bottom, names and sizes of the IS, localizations of the insertions, names of the putative genes, maps of the ORFs and their orientations, and intergenic regions (ig) in base pairs (bp) are shown. Arrows, ORFs black arrows and lines, sequenced regions grey-shaded arrows and lines, nonsequenced regions. Precise locations (with respect to the sequence submitted to DDBJ/EMBL/GenBank under no AJ577136) of the insertion elements are as follows: between nucleotides 115 and 2206 for ISMae1, between nucleotides 4033 and 4034 for ISMae2, between nucleotides 7633 and 7634 for ISMae3, and between nucleotides 8301 and 8302 for ISMae4. FEIGE. 2. Transcription analysis of the gvp Cluster. (A) RNA blot analysis of the gvpA, gvpC, und rnpB transcripts from M. aeruginosa PCC 7806 grown under a day-night cycle (16 h-8 h). The cells were harvested for RNA extraction after 1 h of light when the culture reached OD750 = 0.4. The same blot (15 μg of total RNA per lane) was successively hybridized with different probes: a 180-bp gvpA fragment (obtained by PCR amplification with primers 635 and 636), a 400-bp gvpC fragment (amplified with primers 870 and 871), and (as a control for RNA loading and transfer) a 0.6-kb rnpB fragment (obtained by PCR with the primers mentioned in Materials and Methods). The sizes of the different transcripts are indicated in kilobases (kb). (B) RT-PCR analysis showing cotranscription between the genes of the gvp Cluster. Die gvpC-N fragment was amplified with primers 893 and 973, the gvpN-J fragment was amplified with primers 975 and 1108, the gvpJ-X fragment was amplified with primers 974 and 1110, the gvpX-K fragment was amplified with primers 978 and 1109, the gvpK-F fragment was amplified with primers 1111 and 1113, the gvpF-G fragment was amplified with primers 965 and 1018, and the gvpK-G fragment was amplified with primers 965 and 1111. s, analyzed sample (with cDNA as a template) −, negative control (with RNA as a template) +, positive control (with genomic DNA as a template). A DNA ladder (100 bp [Amersham Biosciences] or 1 kb [Invitrogen Life Technologies]) was used as a size marker (lanes m). FEIGE. 3 . Detection of the IS by PCR analysis of the gvp region of the wild-type (WT) and the GV-deficient mutant (M1, M2, M3, and M4) strains of M. aeruginosa. Primers used for amplification (see Table 1) were as follows: primers 1006 and 1017 for the 5′ gvpAich-5′ gvpC region, primers 1081 and 1082 for gvpV, primers 949 and 972 for gvpN, and primers 983 and 1077 for gvpW. A 1-kb DNA ladder (Invitrogen Life Technologies) was used as a size marker (lanes m). FEIGE. 4 . Transcription analysis of gvp genes in the wild-type and the GV-deficient mutant strains of M. aeruginosa. (A) RT-PCR with the gvpA-specific primers 994 and 995 (see Table 1). The results for PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M2 and M3) strains and PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains are shown. (B) RT-PCR results for the three genes carrying an IS (gvpN, gvpV, und gvpW) and for gvpJ und gvpX. The results for PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M3 and M2) strains and PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains are shown. Die gvpV gene was amplified with primers 1081 and 1082, gvpN was amplified with primers 949 and 972, gvpJ was amplified with primers 974 and 975, gvpX was amplified with primers 1109 and 1110, and gvpW was amplified with primers 983 and 1077. A DNA ladder (100 bp [Amersham Biosciences] or 1 kb [Invitrogen Life Technologies]) was used as a size marker (lanes m). FEIGE. 5. Immunodetection of GvpA on isolated GV and cell extracts from the wild-type and the GV-deficient mutant strains of M. aeruginosa. GV, enriched GV fraction (20 μg) from PCC 7806 wild-type strain. Other lanes show the results for crude extracts (200 μg) from PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M1, M2, and M3) strains and from PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains. FEIGE. 6 . Electron micrographs of the wild-type strains (A and E) and the GV-deficient mutant strains (B, C, D, and F) of M. aeruginosa. (A) PCC 7806 wild type (B) PCC 7806 M1 (C) PCC 7806 M2 (D) PCC 7806 M3 (E) PCC 9354 wild type (F) PCC 9354 M4. gv-l, GV in longitudinal section gv-c, GV in cross-section. Bars, 500 nm.

Supporting information

S1 Abb. Die sic1 mutant exhibits developmental defects in rosette leaves.

(A) The 3-week-old sic1 mutant grown on artificial soil shows growth retardation compared to Col-0. Scale bar represents 3 cm. (B) The rosette leaf number of Col-0 and sic1. Scale bar represents 2 cm. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S2 Fig. The leaf developmental phenotype of sic1 is partially driven by root.

The images were taken on the 20th day after grafting. Col-0/sic1, grafted plants with Col-0 shoot and sic1 Wurzel sic1/Col-0, grafted plants with sic1 shoot and Col-0 root. Col-0, Columbia-0 NG, non-grafted plants SG, self-grafted plants sic1, significant ionome changes 1.

S3 Fig. CTL1 is highly conserved among different species.

Protein sequence alignment of CTL1 among different species shows CTL1 is highly conserved and the mutation site of sic1 is located in a conserved domain. And the red boxes show the TMHs. The red triangle indicates the mutation site of sic1. CTL1, choline transporter-like 1 sic1, significant ionome changes 1 TMH, transmembrane helix.

S4 Fig. The expression of CTL1 in sic1 und cher1-4.

(A) The insertion site of cher1-4 and the position of primers used in this experiment. The triangle showed the insertion site of cher1-4 and the arrows shows the positions of primers used in this experiment (B) RT-PCR analysis of CTL1 transcripts in Col-0, sic1, und cher1-4. UBC was used as an internal standard for the RT-PCR. Single PCR reactions were performed on RNA from individual plants of each genotype. (C) The qRT-PCR result of CTL1 in Col-0, sic1 und cher1-4. The data represent the means ± SE n = 3. The raw data can be found in S1 Data. Col-1, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 PCR, polymerase chain reaction qRT-PCR, quantitative real-time polymerase chain reaction RT-PCR, real-time polymerase chain reaction sic1, significant ionome changes 1.

S5 Fig. Genetic and transgenic complementation of developmental phenotype sic1.

(A) The 6-day-old seedlings of Col-0, sic1, cher1-4, and complementation lines grown on agar-solidified 1/2 MS medium plate. Scale bar represents 1 cm. (B) Primary root length of Col-0, sic1, cher1-4, and complementation lines. Letters above bars indicate statistically different groups using a one-way ANOVA, followed by an LSD test at the probability of P < 0,05. Data represent means ± SE, n = 10 for each genotype. (C) Root patterning of Col-0 and sic1_CO plants. Scale bars represent 50 μm. The raw data can be found in S1 Data. Col-0, Columbia-0 LSD, least significant difference sic1, significant ionome changes 1.

S6 Fig. The expression pattern of CTL1 in different tissues of EIN. thaliana.

(A-D) CTL1-GFP showed the expression pattern in root tip (A), root maturation zone (B and C), leaf pavement cells (D). Three independent transgenic lines were observed and showed the same expression pattern. Green channel represents CTL1-GFP signal and red channel represents propidium iodide signal. Scale bars represent 50 μm for (A) and (D). (E) The relative expression of CTL1 in the shoot and root of Col-0 plants. Data represent means ± SE, n = 3. The raw data can be found in S1 Data. CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein.

S7 Fig. CTL1 localizes to PM and endosome membrane vesicles.

(A) An enlarged view of CTL1-GFP in the root tip of Col-0 plant. Green channel shows the GFP signal and red channel shows the PI signal. Scale bar represents 10 μm. (B) Subcellular localization of CTL1-GFP after plasmolysis in Col-0 root. Green channel shows the GFP signal. Scale bar represents 50 μm. (C) CTL1 is co-localized with FM4-64 in root cells. Green channel shows the CTL1-GFP signal red channel shows the FM4-64 signal. The insets showed an enlarged view of epidermal cell. Scale bars represent 5 μm. Col-0, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein FM4-64, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide PM, plasma membrane.

S8 Fig. The aggregation of NRAMP1 and PDCB proteins locate in different intracellular organelles.

(A) The intracellular aggregation of NRAMP1-GFP is co-localized with FM4-64 signal in sic1. (B and C) The intracellular aggregations of PDCB1-GFP (B) and PDCB2-GFP (C) are not co-localized with FM4-64 in sic1. The transgenic seedlings of sic1 background were stained with FM4-64 for 1 h and then observed in confocal microscope. Green channels represent the GFP signal, and red channels represent the FM4-64 signal. The scale bars represent 7.5 μm in (A) and 5 μm in (B and C). (D) The intracellular aggregation of NRAMP1-GFP in sic1 localized to TGN. The scale bars represent 7.5 μm. Col-0, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein FM4-64, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide NRAMP1, natural resistance-associated macrophage protein 1 PDCB, plasmodesmata callose-binding protein sic1, significant ionome changes 1.

S9 Fig. The expression pattern of HMA4 in the roots of Col-0 and sic1.

The insets showed an enlarged view of sic1 root hair. Scale bars represent 50 μm. Col-0, Columbia-0 HMA4, heavy metal ATPase 4 sic1, significant ionome changes 1.

S10 Fig. The expression of iron uptake related genes in the roots of Col-0 and sic1.

(A-B) The expression levels of IRT1 (A) and AHA2 (B) in the roots of Col-0 and sic1. The data represent the mean ± SE, n = 3. The asterisks above the bar represent a statistically significant difference (P < 0.01) calculated using Student T Prüfung. The raw data can be found in S1 Data. AHA2, Arabidopsis H + -ATPase 2 Col-0, Columbia-0 IRT1, iron regulated transporter 1 sic1, significant ionome changes 1.

S11 Fig. The recycling of PIN1 was affected in sic1 Mutant.

(A) The BFA compartments were observed after CHX and BFA treatment in Col-0 and sic1. (B) The subcellular localization of PIN1 in Col-0 and sic1 after BFA washout. Scale bars represent 20 μm. (C) The statistics analysis of percentage of cells with BFA bodies. The data represent the mean ± SE, ten seedlings of three independent transgenic lines were used in this analysis. The asterisks above the bar represent a statistically significant difference (P < 0.01) calculated using Student T Prüfung. The raw data can be found in S1 Data. BFA, brefeldin A CHX, cycloheximide Col-0, Columbia-0 PIN1, PIN formed 1 sic1, significant ionome changes 1.

S1 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 grown in artificial soil.

Data represents means ± SE, P-values were calculated by Student T Prüfung, n = 12. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S2 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 grown in Hoagland’s solution.

Data represents means ± SE, P-values were calculated by Student T Prüfung, n = 7. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S3 Table. Root ionome of Col-0 and sic1 grown in Hoagland’s solution.

Data represents means ± SE, P-values were calculated by Student T Prüfung, n = 7. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S4 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 reciprocal grafting experiment.

Data represents means ± SE. sic1 /Col-0, grafted plants with sic1 shoot and Col-0 root Col-0/sic1, grafted plants with Col-0 shoot and sic1 root. n = 7–19. Col-0, Columbia-0 NG, non-grafted plants SG, self-grafted Col-0 sic1, significant ionome changes 1.

S5 Table. Leaf ionome of genetic complementation.

Data represents means ± S.E., n = 12 for each genotype.

S6 Table. Leaf ionome of sic1 transgenic complementation.

Data represents means ± SE, sic1 _CO1, sic1 _CO2 and sic1 _CO3, three independent transgenic complementation lines of sic1 with wild-type pSIC1::SIC1-GFP, n = 7 for each genotype. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S7 Table. Root ionome of sic1 transgenic complementation.

Data represents means ±S.E., sic1 _CO1, sic1 _CO2 and sic1 _CO3, three independent transgenic complementation lines of sic1 with wildtype pSIC1::SIC1-GFP, n = 7 for each genotype. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S8 Table. Primers used in this study (from 5ʹ–3ʹ).

S1-Daten. Data used to generate the figures.


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