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Hilfe bei der Zubereitung von Congo Red TSA

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Also möchte ich Congo Red TSA machen. Mein Lehrer hat einige Tipps gegeben, aber ich habe noch einige Fragen:

  1. Ich beginne mit zwei Stammlösungen: 20 mg/ml Kongorot und Coomassie in zwei verschiedenen Falkenröhrchen. Um jeweils 30 ml zuzubereiten, würde ich 600 mg in sterilem Wasser auflösen?
  2. Die Endkonzentration in einer 500 ml TSA-Lösung muss 40 μl/ml CR und 20 μg/ml Coomassie betragen. Wie berechne ich die benötigte Lösungsmenge für die TSA?

1) Ja, das ist richtig.

2) Dies ist nur eine einfache Frage der Anwendung der Gleichung $C_1V_1=C_2V_2$. Für Kongorot:

  • $C_1=20frac{mg}{ml}$
  • $C_2=0.04frac{mg}{mL}$
  • $V_2=500 ml$

Ich bin sicher, Sie und ein Taschenrechner können den Rest herausfinden.


Aseptische Labortechniken: Beschichtungsmethoden

Mikroorganismen sind auf allen unbelebten Oberflächen vorhanden und bilden im Labor allgegenwärtige Quellen für mögliche Kontaminationen. Der experimentelle Erfolg hängt von der Fähigkeit eines Wissenschaftlers ab, Arbeitsflächen und -geräte zu sterilisieren sowie den Kontakt steriler Instrumente und Lösungen mit nicht sterilen Oberflächen zu verhindern. Hier stellen wir die Schritte für verschiedene Plattierungsmethoden vor, die routinemäßig im Labor verwendet werden, um Mikroorganismen wie Bakterien und Phagen zu isolieren, zu vermehren oder zu zählen. Alle fünf Methoden beinhalten aseptische Techniken oder Verfahren, die die Sterilität des experimentellen Materials erhalten. Die beschriebenen Verfahren umfassen (1) Streak-Plating-Bakterienkulturen zur Isolierung einzelner Kolonien, (2) Pour-Plating und (3) Spread-Plating zur Zählung lebensfähiger Bakterienkolonien, (4) Weichagar-Overlays zur Isolierung von Phagen und zur Zählung von Plaques und ( 5) Replica-Plating, um Zellen in einem identischen räumlichen Muster von einer Platte auf eine andere zu übertragen. Diese Verfahren können am Labortisch durchgeführt werden, sofern es sich um nicht pathogene Stämme von Mikroorganismen handelt (Biosafety Level 1, BSL-1). Wenn mit BSL-2-Organismen gearbeitet wird, müssen diese Manipulationen in einer Biosicherheitswerkbank erfolgen. Konsultieren Sie die aktuellste Ausgabe der Biosicherheit in mikrobiologischen und biomedizinischen Labors (BMBL) sowie Produktsicherheitsdokumente (MSDS) für infektiöse Stoffe zur Bestimmung der Biohazard-Einstufung sowie der Sicherheitsvorkehrungen und Eindämmungseinrichtungen, die für den betreffenden Mikroorganismus erforderlich sind. Bakterienstämme und Phagenbestände können von Forschern, Unternehmen und Sammlungen von bestimmten Organisationen wie dem Amerikanische Art Kultur Sammlung (ATCC). Es wird empfohlen, beim Erlernen der verschiedenen Plattierungsmethoden nicht-pathogene Stämme zu verwenden. Durch Befolgen der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren sollten die Schüler in der Lage sein: ● Plattierungsverfahren ohne Kontamination des Mediums durchzuführen. ● Isolieren Sie einzelne Bakterienkolonien durch die Streak-Plating-Methode. ● Verwenden Sie Gießplattierungs- und Spread-Plating-Methoden, um die Bakterienkonzentration zu bestimmen. ● Führen Sie Weichagarüberlagerungen durch, wenn Sie mit Phagen arbeiten. ● Übertragen Sie Bakterienzellen von einer Platte auf eine andere mit dem Replika-Plating-Verfahren. ● Wählen Sie bei einer experimentellen Aufgabe die geeignete Beschichtungsmethode.


Abstrakt

Pathogene Biotypen von Yersinia enterocolitica (Serotypen O:3, O:8, O:9 und O:13), aber keine Umweltbiotypen (Serotypen O:5, O:6, O:7,8 und O:7,8,13,19 ), erhöhte ihre Permeabilität für hydrophobe Sonden, wenn sie bei pH 5,5 oder in EGTA-supplementierten (Ca 2+ -beschränkten) Medien bei 37ଌ gezüchtet wurden. Eine ähnliche Beobachtung wurde auch gemacht, als repräsentative Stämme der Serotypen O:8 und O:5 nach kurzem Kontakt mit menschlichen Monozyten getestet wurden. Die Erhöhung der Permeabilität war unabhängig vom Virulenzplasmid. Die Rolle von Lipopolysaccharid (LPS) bei diesem Phänomen wurde mit Hilfe von Y. enterocolitica Serotyp O:8. LPS-Aggregate von Bakterien, die in saurer oder mit EGTA ergänzter Brühe gezüchtet wurden, nahmen mehr auf n-Phenylnaphthylamin als LPS-Aggregate von Bakterien, die in Standardbrühe gezüchtet wurden, und zeigte auch eine deutliche Zunahme der Acylketten-Fluidität, die mit der Permeabilität korrelierte, wie durch Messungen bestimmt, die in Gegenwart von hydrophoben Farbstoffen erhalten wurden. Es wurden keine signifikanten Veränderungen der O-Antigen-Polymerisation beobachtet, aber die Lipid-A-Acylierung veränderte sich in Abhängigkeit von den Wachstumsbedingungen. Im Standardmedium bei 37ଌ gab es Hexa-, Penta- und Tetraacyllipid A-Formen, wobei die Pentaacylform dominant war. Die Menge an Tetraacyllipid A stieg in EGTA-supplementierten und sauren Medien an, und Hexaacyllipid A verschwand unter den letztgenannten Bedingungen fast. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass pathogene Y. enterocolitica Stämme modulieren die Lipid-A-Acylierung koordiniert mit der Expression von Virulenzproteinen, wodurch die LPS-Packung reduziert und die Permeabilität der äußeren Membran erhöht wird. Die Veränderungen der Permeabilität, der LPS-Acylketten-Fluidität und der Lipid-A-Acylierung bei pathogenen Y. enterocolitica Dehnungen nähern sich den Eigenschaften in Yersinien pseudotuberculosis und Yersinien pestis und legen nahe, dass es ein gemeinsames Muster der äußeren Membran gibt, das mit der Pathogenität assoziiert ist.

Die Yersinien sind gramnegative Bakterien, die zur Familie gehören Enterobakterien. Die Gattung Yersinien umfasst nichtpathogene Arten, die hauptsächlich in der Umwelt vorkommen, zwei pathogene Arten (Yersinien pseudotuberculosis und Yersinien pestis), und Yersinia enterocolitica, die typische Umweltstämme sowie Stämme umfasst, die, obwohl sie sich in der Umwelt vermehren können, beim Menschen mesenteriale Lymphadenitis, Durchfall und Enteritis verursachen. Die zwei Arten von Y. enterocolitica Stämme können bakteriologisch und serologisch unterschieden werden. Fünf Biogruppen (und zwei Untergruppen der Biogruppe 1) und mehrere Serotypen werden als Cluster der Umweltstämme in Biogruppe 1A erkannt, und die pathogenen Stämme sind Mitglieder der Biogruppen 1B, 2, 3, 4 und 5 und gehören zu relativ wenigen Serotypen (Serotypen O:3, O:4, O:5,27, O:8, O:9, O:13 und O:21) (8). Der auffälligste Unterschied besteht jedoch darin, dass die pathogenen Stämme ein Plasmid (pYV) tragen, das für Virulenzproteine ​​kodiert, wie z Yersinien äußere Proteine ​​(Yops) und die Yersinien Adhäsin A (YadA), das Phagozytose, Opsonisierung und Komplementaktivierung blockiert (13, 16, 23). Die pathogenen Stämme exprimieren auch chromosomal kodierte Virulenzfaktoren, einschließlich der Yersinien Enterotoxin (Yst), mucoid Yersinien Faktor (Myf), Invasin (Inv) und Attachment-Invasion (Ail) Proteine ​​im Zusammenhang mit Invasion und Serumresistenz (22, 44). Da diese Bakterien von der Umgebung in den Darm wandern und dann durch M-Zellen in benachbarte Gewebe wandern, ist es nicht verwunderlich, dass die Expression der Virulenzgene sequentiell durch ein oder mehrere Signale ein- und ausgeschaltet wird, die als Orientierungspunkte für die Milieus, denen sie begegnen, dienen (44). Dementsprechend werden pYV-kodierte Proteine ​​bei 37ଌ (der Körpertemperatur des Wirts) exprimiert, und die Expression von Yops erfordert auch den Kontakt zwischen Bakterien und eukaryotischen Zellen oder in vitro eine eingeschränkte Verfügbarkeit von Ca 2+ (9, 11, 44) . Die Expression von Yst und Inv in vitro ist bei 23ଌ und in der stationären Phase höher, aber beide Proteine ​​werden auch bei 37ଌ unter angemessenen Osmolaritäts- und pH-Bedingungen exprimiert. Ail und Myf werden bei 37ଌ ausgedrückt und werden auch durch die Sauerstoffspannung bzw. den pH-Wert reguliert (23).

Neben diesen klassischen Virulenzfaktoren Y. enterocolitica pathogene Stämme unterscheiden sich von Umweltstämmen in einigen Eigenschaften der äußeren Membran (OM). Wenn diese Bakterien bei 37ଌ wachsen, sind die OMs der pathogenen Stämme resistenter gegen bakterizide Peptide als die OMs der Umweltstämme (4). Darüber hinaus werden die OMs der pathogenen Stämme für hydrophobe Sonden in Mg 2+-Oxalatmedium (verwendet, um die Ca 2+-armen Bedingungen zu erzeugen, die in vitro die pYV-Expression induzieren) durchlässig, während die OMs der Umweltstämme dies nicht tun ( 4). Eine ergänzende Tatsache ist, dass im gleichen Mg 2+-Oxalat-Medium eine Erhöhung der Permeabilität auch bei pYV-geheilten pathogenen Stämmen beobachtet wird (4), was darauf hindeutet, dass die Faktoren, die die pYV-Expression auslösen, die OM-Struktur und -Physiologie auf chromosomaler Ebene modulieren. Diese Beobachtungen werden umso faszinierender, wenn die Tatsache, dass Y. pseudotuberkulose und Y. pestis OMs sind durchlässig für hydrophobe Verbindungen in Standardmedien wird als (3) angesehen, und daher kann es sein, dass die Durchlässigkeit für hydrophobe Verbindungen ein gemeinsames Merkmal aller pathogenen . ist Yersinien spp. die in pathogenen . reguliert wird Y. enterocolitica. In der vorliegenden Studie haben wir diese Hypothese untersucht, indem wir die Auswirkungen von saurem pH, Ca 2+-Restriktion und Kontakt mit humanen Monozyten auf die Permeabilität von getestet haben Y. enterocolitica zu hydrophoben Sonden. Da außerdem bekannt ist, dass die Permeabilitätsbarriere zumindest teilweise mit den Eigenschaften des OM-Lipopolysaccharids (LPS) zusammenhängt (46, 47), haben wir dieses Molekül auch auf chemische und physikalisch-chemische Veränderungen im Zusammenhang mit Veränderungen der Permeabilität untersucht. Wir berichten hier, dass pathogene Y. enterocolitica Stämme verändern die OM-Permeabilität und Lipid-A-Zusammensetzung als Reaktion auf Faktoren, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von regulieren Yersinien Virulenzproteine, die entweder pYV oder chromosomal kodiert sind.


Flecken

Die meisten Bakterien sind nicht nur sehr klein, sondern auch sehr klar und ohne vorherige Färbung unter dem Mikroskop schwer zu erkennen. Sie müssen Ihre Bakterien fest auf einem Objektträger befestigen, bevor Sie sie färben können. Bei der Vorbereitung eines Objektträgers zum Färben sind zwei wichtige Dinge zu beachten:

  1. Die Bakterien müssen gleichmäßig und leicht verteilt sein. Wenn sich zu viele Bakterien auf dem Objektträger befinden, bilden sie einen großen Klumpen und Sie können die Morphologie der einzelnen Zellen nicht sehen. Große Zellklumpen färben sich auch nicht richtig und könnten durch unsachgemäße Färbung zu falschen Ergebnissen führen.
  2. Die Bakterien müssen fest mit dem Objektträger verbunden sein, damit sie während des Färbevorgangs nicht abgewaschen werden. Alle Verfahren, bei denen die Bakterien auf dem Objektträger befestigt werden, führen zu einigen morphologischen Veränderungen. Die Zellen schrumpfen typischerweise in ihrer Größe und zeigen einige Veränderungen der Form und der extrazellulären Matrizen.

Sie bereiten Objektträger für die Färbung von Brühe- und Agar-Oberflächen vor. Während die Ziele für gleichmäßig und leicht dispergierte Zellen, die fest an der Objektträgeroberfläche haften, gleich sind, unterscheiden sich die Techniken geringfügig. Färben ist ebenso viel Kunst wie Wissenschaft. Sie werden zweifellos mehrere Versuche brauchen, bis Sie erfolgreich sind.

Materialien

  • Glasobjektträger reinigen
  • Impfösen oder -nadeln
  • Steriles Wasser
  • Markierstift
  • Verschiedene Brühen und Plattenkulturen

Sicherheitsaspekte

Achten Sie auf Aerosole, wenn Sie Bakterien von Ihrer Schlinge auf den Objektträger übertragen. Die Schlaufe ist sehr flexibel und es ist einfach, eine Schlaufe voller Organismen abzureißen. Gehen Sie nicht davon aus, dass Ihr Organismus tot ist. Die Abtötung des Organismus durch Hitze oder Methanolfixierung ist nicht garantiert. Entsorgen Sie Ihre fertigen Objektträger im Desinfektionsmitteleimer an Ihrer Werkbank.

Allgemeine Überlegungen

Sie streben nach einer leichten Zellsuspension, die eine schwach trübe Ablagerung auf Ihrem Objektträger hinterlässt. Sie haben viel Platz auf Ihrer Folie, verwenden Sie es! Es hilft, zunächst einen Kreis am unteren Rand der Folie zu zeichnen, damit Sie wissen, wo Sie nach Ihrem Abstrich suchen müssen. Es ist sehr leicht zu verwechseln, auf welcher Seite des Objektträgers sich Ihr Abstrich befindet. Achten Sie darauf, die hintere Kante der Folie zu beschriften. Tun Sie dies konsequent am selben Ende der Folie, um die Ausrichtung Ihrer Folie zu erleichtern.

Seien Sie geduldig und nehmen Sie sich die Zeit, Ihren Objektträger an der Luft trocknen zu lassen, bevor Sie ihn auf den Objektträger kleben. Wenn Ihr Objektträger nass ist und Sie ihn heiß fixieren, kochen die Bakterien und die Zellmorphologie geht verloren. Wenn Ihr Objektträger nass ist und ihn in Methanol fixiert, wird er höchstwahrscheinlich vom Objektträger abgewaschen. Zu dicke Ausstriche werden höchstwahrscheinlich unabhängig von der Fixierungsmethode vom Objektträger abgewaschen.

Abstrich aus Brühe

Brühenkulturen sind in der Regel einfacher zu verarbeiten, da die Zellen bereits in der Brühe verdünnt sind. Achten Sie darauf, das Kulturröhrchen sorgfältig zu mischen, um die Bakterien in der Brühe zu suspendieren.

  1. Beschriften Sie Ihre Folie. Übertragen Sie aseptisch eine Schleife voller Organismen auf die Mitte Ihres Objektträgers.
  2. Verwenden Sie den flachen Teil der Schlaufe, um den Brühentropfen um den Objektträger zu schmieren. Verwenden Sie eine spiralförmige, kreisende Bewegung, um den Tropfen zu verteilen. Da die Brühe proteinreich ist, bleibt der Ausstrich normalerweise ausgebreitet und perlt nicht auf der Oberfläche des Objektträgers ab.
  3. Legen Sie den Objektträger zum Trocknen beiseite. Dies dauert mindestens einige Minuten. Überstürzen Sie diesen Schritt nicht.

Abstrich vom Teller

Sie können mit Ihrer Schlaufe viele Organismen abschöpfen. Möglicherweise möchten Sie eine Impfnadel verwenden, um Ihren Organismus auf den Objektträger zu übertragen. Verwenden Sie unbedingt steriles Wasser, um Ihre Proben zu verdünnen. Regelmäßiges Leitungswasser oder das entionisierte Wasser in Ihren Spülflaschen sind oft mit Bakterien verunreinigt.

  1. Beschriften Sie Ihre Folie. Übertragen Sie aseptisch eine Schleife mit sterilem Wasser in die Mitte des Objektträgers.
    • Dies dient dazu, Ihre Bakterien zu verdünnen und Ihnen etwas zu geben, um sich zu verteilen.
  2. Wählen Sie eine gut isolierte Kolonie.
  3. Stechen Sie es mit Ihrer sterilen Nadel ein oder schöpfen Sie den Rand der Kolonie mit Ihrer sterilen Schlaufe leicht ab.
  4. Platzieren Sie Ihre Nadel/Schlinge in der Mitte des Tropfens und verteilen Sie die Bakterien mit einer spiralförmigen kreisförmigen Bewegung auf dem Objektträger.
  5. Legen Sie den Objektträger zum Trocknen beiseite. Dies dauert mindestens einige Minuten. Überstürzen Sie diesen Schritt nicht.

Fixierung

Das Fixierverfahren ist unabhängig von Abstrichquelle, Platte oder Brühe gleich. Es gibt zwei Methoden, um Ihre Bakterien auf dem Objektträger zu befestigen, die Hitzefixierung oder die Methanolfixierung. Die Heißfixierung wird nur bei BSL1-Organismen verwendet. Die Organismen, mit denen wir arbeiten werden, sind BSL2, daher müssen Sie die Methanol-Fixierungstechnik verwenden. Das Fixieren des Objektträgers durch Hitze kann Aerosole erzeugen, und bei BSL2-Organismen müssen wir dies so weit wie möglich verhindern. Die Methanolfixierung verursacht weniger Veränderungen in der Zellmorphologie und erzeugt keine Aerosole.

Bitte seien Sie beim Arbeiten mit dem Methanol vorsichtig, wenn Sie vergessen, dass Sie es mit Methanol fixiert haben und Ihr Objektträger nicht ganz trocken ist, fängt das restliche Methanol Feuer.

Methanolfixierung (BSL2)

  1. Stellen Sie sicher, dass Ihre Folie vollständig trocken ist. Stellen Sie es auf das Färbegestell über der Spüle.
  2. Fluten Sie den Objektträger vorsichtig mit 95 % Methanol. Lassen Sie es zwei Minuten einwirken.
  3. Kippen Sie den Objektträger und gießen Sie das Methanol ab.
    • Berühren Sie die Kante des Objektträgers mit einem Papiertuch, um das überschüssige Methanol abzusaugen.
  4. Legen Sie den Objektträger beiseite, um ihn vor dem Färben an der Luft zu trocknen.

Einfacher Fleck

Einfache Flecken sind genau das – fügen Sie einen Fleck zu einem fixierten Abstrich-Objektträger hinzu, lassen Sie ihn einwirken, spülen Sie ihn ab, lassen Sie ihn trocknen und betrachten Sie ihn. Es ist ein schnelles Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Morphologie von Bakterien in klinischen Proben wie Stuhl und Ausfluss.

Methylenblau wird verwendet, um die Morphologie von spindelförmigen und Spirochäten bei oralen Infektionen zu bestimmen. Es ist auch das Färbemittel der Wahl zur Identifizierung der metachromatischen Granula in Corynebacterium diphtheriae. Das Granulat färbt sich deutlich tiefer blau als die umgebenden blauen Bakterien. Andere Arten von Corynebakterium haben nicht die metachromatischen Körnchen. Alle basischen Farbstoffe wie Methylenblau, Kristallviolett, Malachitgrün oder Safranin funktionieren gut.

Basische (kationische oder positiv geladene) Farbstoffe binden an negativ geladene Komponenten in der Zellmembran und im Zytoplasma.

Materialien

  • Methylenblau
  • Safranin
  • Kristallviolett
  • Malachitgrün
  • Färbegestelle
  • Mikro-Werkzeugkästen
  • Vorbereitete Abstrich-Objektträger

Allgemeine Überlegungen

Färben ist teils Kunst und teils Wissenschaft. Für Färbe- und Spülzeiten gibt es keine festen Regeln. Die aufgeführten Zeiten sind Vorschläge, die normalerweise gut funktionieren. Sie müssen damit experimentieren, was für die Bakterien, die Sie haben, und die Techniken, die Sie verwenden, funktioniert.

Es ist wichtig, dass Sie genau das, was Sie tun und die Ergebnisse, die Sie beobachten, in Ihrem Laborbuch festhalten. Sie werden diese Färbungen später im Semester wiederholen und möchten Ihre Zeit nicht damit verschwenden, Ihr erfolgreiches Färbeverfahren neu zu erfinden. Es wäre nützlich, wenn jedes Labortisch-Mitglied einen anderen Fleck auswählt, damit Sie sehen können, wie sie alle aussehen.

Einfaches Färbeverfahren

  1. Legen Sie Ihre sorgfältig vorbereiteten fixierten Abstrich-Objektträger auf den Fleckenrost über der Spüle.
    • Machen Sie eine Folie nach der anderen.
    • Bedecke den Abstrich mit einer der verfügbaren Grundfarben.
    • Sie brauchen nur genug Farbe, um den Ausstrich zu bedecken. Der Fleck sollte nicht vom Objektträger tropfen.
  2. Lassen Sie den Fleck 1-5 Minuten einwirken.
  3. Greifen Sie mit der Wäscheklammer das lange Ende des Objektträgers, kippen Sie den Objektträger über das Waschbecken und spülen Sie den Fleck mit einem Wasserstrahl aus der Waschflasche ab.
    • Sprühen Sie unbedingt über den Abstrich und lassen Sie ihn nach unten tropfen.
    • Wenn Sie direkt auf den Ausstrich sprühen, besteht die Gefahr, dass der Ausstrich vom Objektträger abgewaschen wird.
    • Spülen, bis das Wasser klar oder nur leicht gefärbt ist.
  4. Berühren Sie die Kante des Objektträgers mit einem Papiertuch, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Sie können es jetzt an der Luft trocknen lassen. Alternativ können Sie es mit Löschpapier trocknen, indem Sie es in das Löschpapierbuch legen und leicht andrücken. Diese Methode ist zwar schneller, du kannst aber auch einen schlecht haftenden Abstrich abtupfen.
  5. Betrachten Sie Ihren Objektträger unter Ölimmersion und notieren Sie Ihre Beobachtungen in Ihrem Laborbuch.
  6. Entsorgen Sie Ihre gebrauchten gefärbten Objektträger in den Desinfektionseimer in der Spüle.

Negativer Fleck

Negative Flecken sind noch einfacher als einfache Flecken, weil Sie keinen Abstrich machen müssen. Ein Zelltropfen wird auf einem Objektträger verteilt und ohne Fixierung betrachtet. Der Fleck ist eine Suspension von Kohlenstoff, die in Tusche oder Nigrosin enthalten ist. Die Kohlenstoffpartikel sind negativ geladen, ebenso die Zellmembran. Der Hintergrund sieht schwarz oder sepiafarben aus und die Zellen bleiben klar, da sie den Farbstoff abstoßen.

Einige positiv geladene Einschlusskörper, wie beispielsweise Schwefel, können sich verfärben. Diese Färbung gibt genaue Informationen über die Zellmorphologie und das Vorhandensein von Kapseln, da die Zellen nicht fixiert sind. Die Zellgröße erscheint etwas größer, da sich auch keine extrazellulären Beschichtungen oder Sekrete auf der Außenseite der Zellmembran nicht färben. Negative Färbungen sind nützlich für die schnelle Bestimmung des Vorhandenseins von Cryptococcus neformans, dem Erreger der Kryptokokzise, ​​in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit. Diese Technik wird auch verwendet, wenn Sie auf Endosporen und Kapseln färben.

Materialien

Allgemeine Überlegungen

Genau wie beim Anfertigen eines Abstrichs benötigen Sie nur eine geringe Menge an Organismus. Wenn Sie zu viele Organismen haben, können Sie die Morphologie einzelner Zellen nicht sehen. Es ist auch wichtig, nicht zu viel Nigrosin zu verwenden. Wenn es zu dick ist, hat der Hintergrund ein rissiges Aussehen, ähnlich wie Schlammpfützen, die in der Sonne trocknen. Sie möchten einen leichten Film bekommen. Ihr Lehrer wird Ihnen diese Technik demonstrieren.

Negatives Färbeverfahren

  1. Beschriften Sie Ihre Folie. Wenn Sie mit einer Brühe arbeiten, platzieren Sie eine Schleife voller Organismen zu etwa drei Vierteln auf der linken Seite des Objektträgers. Wenn Sie mit einer Plattenkultur arbeiten, geben Sie einen Tropfen steriles Wasser auf den Objektträger und verdünnen Sie Ihren Organismus im Tropfen, ohne den Tropfen zu verteilen.
  2. Geben Sie ein oder zwei Tropfen Nigrosin auf einen anderen Objektträger. Verwenden Sie Ihre sterilisierte Schlinge, um eine Schlinge voller Nigrosin aufzunehmen. Mischen Sie es vorsichtig mit dem Zelltropfen, ohne den Tropfen zu stark zu verteilen.

  1. Halten Sie das rechte Ende des Objektträgers mit der linken Hand in Ihrer rechten Hand – nehmen Sie einen weiteren Objektträger in einem Winkel von 45° oder weniger zum ersten Objektträger, direkt hinter Ihrem Nigrosin-/Zelltropfen.
  2. Schieben Sie die abgewinkelte Rutsche entlang der Oberfläche der ersten Rutsche zurück, bis sie nur berührt den Tropfen von Nigrosin und Zellen. Warten Sie auf die Kapillarwirkung, um die Flüssigkeit entlang der Vorderkante des abgewinkelten Objektträgers zu ziehen.
  3. Schieben Sie den abgewinkelten Objektträger über die Oberfläche des flachen Objektträgers. Das meiste Nigrosin sollte noch an der ursprünglichen Stelle belassen werden. Entsorgen Sie den Objektträger im Desinfektionsmitteleimer.
  4. Legen Sie den gefärbten Objektträger zum Trocknen beiseite, bevor Sie ihn in Öl betrachten. Achten Sie darauf, Ihren Objektträger in dem Bereich mit dem schwächsten grauen Hintergrund zu untersuchen.
  5. Notieren Sie Ihre Beobachtungen in Ihrem Laborbuch.
  6. Entsorgen Sie Ihren gebrauchten gefärbten Objektträger im Desinfektionsmitteleimer.

Spezielle Notiz

Nigrosin löst sich sehr leicht vom Objektträger und auf Ihr Ölimmersionsobjektiv. Achten Sie darauf, Ihre Öllinse gründlich zu reinigen, wenn Sie fertig sind. Dann wieder sauber machen. Sobald es auf dem Objektiv getrocknet ist, ist es sehr schwer zu entfernen und beeinträchtigt Ihre Fähigkeit (und die anderen Mikroschüler, die dieses Zielfernrohr verwenden), klar aus dem Objektiv zu sehen.

Gramm-Färbung

Die Gram-Färbung ist die am häufigsten verwendete Differenzialfärbung in der Mikrobiologie. Differentielle Flecken verwenden mehr als einen Farbstoff. Die einzigartigen zellulären Bestandteile der Bakterien bestimmen, wie sie auf die verschiedenen Farbstoffe reagieren. Das Gram-Färbungsverfahren ist seit seiner ersten Entwicklung im Jahr 1884 im Wesentlichen unverändert geblieben. Fast alle Bakterien können in zwei Gruppen eingeteilt werden, Gram-negativ oder Gram-positiv. Einige Bakterien sind gramvariabel. Trichomonas, Strongyloides, einige Pilze und einige Protozoenzysten haben auch eine Gram-Reaktion. Sehr kleine Bakterien oder Bakterien ohne Zellwand, wie z Treponema, Mykoplasmen, Chlamydien, oder Rickettsien keine Grammreaktion haben. Die Charakterisierung neuer Bakterien muss ihre Gram-Reaktion einschließen.

Typischerweise besteht eine Differentialfärbung aus vier Komponenten, der Primärfärbung, einem Beizmittel, das die Färbung festigt, einem Entfärbungsmittel, um die Primärfärbung zu entfernen, und einer Gegenfärbung. Bei der Gram-Färbung ist die primäre Färbung Kristallviolett. Dadurch erhält die Zelle eine intensive violette Farbe. Das Beizmittel Jod bildet mit dem Kristallviolett innerhalb der Zellwand einen Komplex. Die Zelle wird dann entweder mit Grams Entfärber oder 95 % Ethanol gewaschen. Gram-positive Zellen behalten den Farbstoffkomplex und bleiben violett. Der Farbstoff wird in gramnegativen Zellen ausgespült. Die Gegenfärbung, Safranin, wird verwendet, um die Zellen zu färben, die die primäre Färbung verloren haben, andernfalls würden sie farblos bleiben und Sie könnten sie nicht sehen.

Der große Jod-Kristallviolett-Komplex wird aufgrund der molekularen Struktur der vielen Peptidoglycanschichten in der Zellwand in den Zellwänden grampositiver Zellen zurückgehalten. Es gibt viele vernetzte Teichonsäuren und der Jod-Farbstoff-Komplex kann physikalisch nicht austreten. Außerdem befindet sich weniger Lipid in der Membran und das Entfärbungsmittel kann auch nicht dorthin gelangen. Gram-negative Zellen haben eine äußere Membran und nur eine Peptidoglycan-Schicht mit mehr Lipid. Der Kristallviolettfarbstoff lässt sich leicht auswaschen.

Allgemeine Überlegungen

Die Genauigkeit der Gram-Färbung hängt von der Integrität der Bakterienzellwand ab. Es gibt eine Vielzahl von Dingen, die die Integrität der Zellwand beeinflussen können alte Zellen (dh Kulturen, die älter als 24 Stunden sind), die Probe stammt von jemandem, der mit Antibiotika behandelt wurde, die auf diese Zellwand wie Penicillin abzielen, die Zellen wurden grob behandelt oder Sie über Hitze fixierte sie. Unter diesen Bedingungen erscheinen grampositive Zellen als gramnegativ. Wenn Sie zu lange entfärben, sehen grampositive Zellen wie gramnegative Zellen aus. Umgekehrt, wenn Sie nicht genug entfärben, sehen Gram-Negative wie Gram-Positive aus. Nur so können Sie Ihren Ergebnissen vertrauen, wenn Sie immer ein bekanntes Gram-Positiv und ein bekanntes Gram-Negativ auf demselben Objektträger laufen lassen. Wenn sie sich wie vorhergesagt färben, können Sie ziemlich sicher sein, dass das Ergebnis Ihrer unbekannten Probe zuverlässig ist.

Die Gram-Färbung erfordert Übung, um richtig zu werden. Erwarten Sie nicht, dass Sie beim ersten Versuch einen guten Gram-Fleck bekommen. Es ist eine gute Idee, deine Folie mit einer Wäscheklammer zu halten, deine Handschuhe werden ziemlich psychedelisch, genauso wie alles, was du berührst!

Gram-Färbungsverfahren

  1. Beschriften Sie Ihre Folie. Bereiten Sie Ihre Abstriche auf einem Objektträger mit einem Gram-Negativ auf der linken Seite, Ihrem Unbekannten in der Mitte und einem Gram-Positiv auf der rechten Seite vor.
    • Vergessen Sie nicht, Ihren Objektträger mit Methanol zu reparieren!
  2. Legen Sie Ihren Objektträger auf das Färbegestell und bedecken Sie die Ausstriche 1 Minute lang mit Kristallviolett.
    • Verwenden Sie gerade genug Färbemittel, um den Ausstrich vollständig zu bedecken, aber nicht so viel, dass er vom Objektträger läuft oder tropft.
  3. Kippen Sie den Objektträger und gießen Sie das Kristallviolett ab und spülen Sie es kurz mit Wasser aus Ihrer Waschflasche aus.
    • Denken Sie daran, nicht direkt auf die Abstriche zu sprühen, da Sie sie sonst abwaschen.
  4. Fluten Sie den Objektträger 1 Minute lang mit Jodbeizmittel.
  5. Kippen Sie den Objektträger, gießen Sie das überschüssige Jod ab und entfärben Sie es vorsichtig mit dem Entfärber von Gram, bis es gerade anfängt, klar zu laufen.
    • Dies ist der schwierige Teil!
  6. Kippen Sie Ihre Folie auf einigen Papiertüchern, um überschüssiges Entfärbemittel zu entfernen.
  7. Fluten Sie Ihren Objektträger 1 Minute lang mit dem Safranin.
  8. Kippen Sie den Objektträger, um das überschüssige Safranin abzugießen, und spülen Sie ihn vorsichtig mit Wasser ab, bis er klar ist.
  9. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen
  10. Unter Ölimmersion beobachten.
    • Die Gram-Positivkontrolle sollte lila und die Gram-Negativkontrolle sollte rosa sein.
  11. Entsorgen Sie Ihren gebrauchten Objektträger im Desinfektionsmitteleimer.

Kongoroter Kapselfleck

Die Kongorot-Kapselfärbung ist eine Modifikation der Nigrosin-Negativfärbung, die Sie möglicherweise zuvor durchgeführt haben. Die Bakterien nehmen den Kongorot-Farbstoff auf und der Hintergrund wird dann mit saurem Fuchsin-Farbstoff angefärbt. Die Kapsel- oder Schleimschichten, stark hydratisierte Polymere, schließen beide Farbstoffe aus. Der Hintergrund erscheint blau, die Bakterienzellen erscheinen rosa und die klaren Höfe sind die Kapseln.

Klinisch sind die Kapseln einiger hochpathogener Bakterien (z. B. Pneumokokken, Hämophilis influenzaeund Meningokokken) können durch die Verwendung von Antiseren, die für diesen Kapseltyp spezifisch sind, unterschieden werden. Die Bakterien werden in den Antiseren suspendiert und anschließend mit Methylenblau vermischt. Bei der Antiseren-Färbung erscheinen die Bakterien blau, umgeben von einem klaren Halo und dann umgeben von einer dünnen blauen Linie, wo die Antiseren an der Kapsel angeheftet sind.

Materialien

  • Kongoroter Fleck
  • Saurer Fuchsinfleck
  • Säurealkohol
  • Klebsiella pneumoniae Kultur
  • Enterobacter aerogenes Kultur

Kongorotes Kapselfärbeverfahren

  1. Legen Sie eine Schleife voller Kongorot auf eine Folie
  2. Mischen Sie eine kleine Menge Ihres Organismus in den Tropfen Congo Red.
    • Die Organismus-/Farbstoffsuspension gut auf dem Objektträger verteilen
  3. Lassen Sie den Objektträger gründlich an der Luft trocknen.
    • Nicht Methanol fixieren!
  4. Fixieren Sie den getrockneten Objektträger 15 Sekunden lang mit saurem Alkohol.
  5. Spülen Sie mit destilliertem Wasser und bedecken Sie den Objektträger 1-5 Minuten lang mit Säurefuchsin.
  6. Mit Wasser abspülen und an der Luft trocknen lassen.
  7. Untersuchen Sie den Objektträger unter Ölimmersion.
    • Die Zellen färben sich rot/rosa und die Kapseln erscheinen als farblose Höfe vor einem dunkelblauen Hintergrund.

Wirtz's Endosporen-Färbung

Die Bildung von Endosporen ist charakteristisch für Clostridum und Bazillus spp. Die Fähigkeit, ihr Protoplasma zu konzentrieren und zu beschichten, ermöglicht es ihnen, die widrigen Umweltbedingungen zu überleben, denen sie in ihrem Bodenlebensraum ausgesetzt sind. Dadurch können die Sporen auch der Verfärbung widerstehen. Die „lebenden“ Organismen lassen sich leicht mit einfachen Färbungen und Gram-Färbungen visualisieren.

Endosporen sind typischerweise stark lichtbrechend, auf sie treffendes Licht wird abgelenkt. Viele Bazillus Arten haben Einschlusskörper, die hochgradig lichtbrechend sind. Diese Einschlusskörperchen können bei regelmäßiger Färbung wie Endosporen aussehen. Das Vorhandensein von Endosporen muss mit endosporenspezifischen Färbungen bestätigt werden. Das Vorhandensein und die charakteristische Form und Position von Endosporen erfordern spezielle Verfahren, um die Endosporenhülle zu durchdringen. Bei den meisten Endosporen-Färbungen werden die Objektträger erhitzt, während sie kontinuierlich mit dem Farbstoff feucht gehalten werden. Obwohl es schneller ist, produziert es flüchtige Chemikalien und ist nur ein großes Durcheinander. Die gleichen Ergebnisse können erzielt werden, indem man den Farbstoff 30 Minuten lang auf dem Objektträger einwirken lässt. Es ist eine gute Idee, zuerst mit diesem Objektträger zu beginnen und an einem anderen Fleck zu arbeiten, während Sie darauf warten, dass der Farbstoff die Endosporen durchdringt.

Allgemeine Überlegungen

Sie werden a . verwenden Bazillus Arten für die Endosporenfärbung. Die Form und Position von B. cereus Sporen sind denen von . sehr ähnlich B. anthrazit. Bazillus beginnt erst dann Sporen zu bilden, wenn ihm die Nahrung ausgeht. Sind die Kulturen zu jung, sieht man meist nur die rosafarbenen Stäbchen der Bakterien. Sind die Kulturen zu alt, sieht man meist nur noch die kleinen grünen Ovale der Endosporen. Idealerweise sollten Sie die grünen ovalen Körper der Endosporen sehen, die von der rosa vegetativen Bakterienzelle umgeben sind. Wählen Sie mit der geraden Impfnadel eine Probe aus der Mitte einer Kolonie, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Der Rand der Kolonie wächst noch aktiv und weist wenige Endosporen auf.


Konstruktion komplexer gerichteter komplementärer DNA-Bibliotheken in SfiI

Enzympuffer

Alle Restriktionsendonuklease-Verdauungen wurden in 0,5–2 × KGB-Puffer durchgeführt [2 × = 200 mlm Kaliumglutamat, 20 mlm Tris-Acetat, pH 7,6, 20 mm Magnesiumacetat, 100 µg/ml Rinderserumalbumin (BSA) 1 mlm 2-Mercaptoethanol (2-ME)]. 7 Phosphorylierungen wurden in 1 × Polynukleotidkinasepuffer [PNKB 1 × = 70 mm Tris, pH 7,6, 10 mlm MgCl2, 50 mm Dithiothreitol (DTT)]. Ligationen wurden entweder in 0,5 × KGB oder 1 × PNKB unter Zugabe von ATP bis zu einer Endkonzentration von 1 ml durchgeführtm.

Medien

SB: Bactotrypton, 32 g Bacto-Hefe-Extrakt, 20 g Natriumchlorid, 5 g. 1 Liter doppelt destilliertes H . hinzufügen 2O und im Autoklaven sterilisieren

LB: Bacto-Trypton, 10 g Bacto-Hefe-Extrakt, 5 g Natriumchlorid, 5 g. Platten werden durch Zugabe von Bacto-Agar, 15 g, hergestellt. 1 Liter doppelt destilliertes H . hinzufügen2O und im Autoklaven sterilisieren SOC: Bacto-Trypton, 20 g Bacto-Hefe-Extrakt, 5 g 10 mlm NaCl (2 ml von 5 m Lösung) 2,5 mm KCl (1,25 ml von 2 m Lösung) 10 mm MgCl2 (1 ml von 1 m Lösung) 10 mm MgSO4 (1 ml von 1 m Lösung) 20 mm Glukose (2 ml von 1 m Lösung). 1 Liter doppelt destilliertes H . hinzufügen2O, aliquotieren und im Autoklaven sterilisieren


Ergebnisse

Keratinabbau aus Monospezies-Kulturen

Der Keratinabbau wurde in Schüttelkolbenkulturen mit Keratin-Flüssigmedium (KLM) mit 10 mg/ml Keratin getestet. Nach 4 Tagen Kultivierung wurde der Keratinabbau durch Messen des Resttrockengewichts bewertet. Das Populationswachstum wurde durch Zählen von koloniebildenden Einheiten (CFU) bewertet. x. Retroflexus eine signifikant größere Menge an Keratin abgebaut (2,1 ± 0,2 mg/ml, Standardabweichung [SD]) (padj < 0,05, Lin.1) (Fig. 1A) und erreichte signifikant höhere CFU-Zahlen im Vergleich zu den anderen Einzelarten (S8A Fig.). Keratinabbau wurde beobachtet von S. Rhizophila, aber m. Oxydane und P. amylolyticus zeigte eine begrenzte Fähigkeit, Keratin aus dem Medium zu entfernen. CFU zählt in Kulturen von S. Rhizophila und m. Oxydane waren höher als die von P. amylolyticus, die die deutlich niedrigsten KBE-Zahlen (padj < 0,05, Lin.1) (S8A Fig.). Co-Kultivierungen erhöhten die Anzahl von P. amylolyticus (S8B-Abb.). Der Keratinabbau wurde auf CFU-Zahlen normalisiert, um das Abbaupotential jeder Spezies zu untersuchen. Mit CFU-Normalisierung, x. Retroflexus und S. Rhizophila waren beim Keratinabbau gleich effizient und hatten einen signifikant höheren Abbau als m. Oxydane (S9 Abb) (padj < 0,05, Lin.1). Berechnung des Keratinabbaus pro KBE für P. amylolyticus wurde weggelassen, da P. amylolyticus nicht als Monokultur gewachsen. Zellfreie Überstände von x. Retroflexus auf Keratin gezüchtet, konnte das Wachstum der anderen Stämme nicht fördern, was darauf hindeutet, dass die Umgebung sehr nährstoffarm ist und abgebautes Keratin schnell verstoffwechselt wird. Der Abbau von Keratin wurde auch durch eine beobachtete Alkalisierung des Mediums im Laufe der Zeit für x. Retroflexus Mono- und Kokulturen. Bei diesen Kulturen wurde eine Alkalisierung vom anfänglichen pH-Wert von 7 auf pH 8,5 beobachtet.

S. Rhizophila, x. Retroflexus, m. Oxydane und P. amylolyticus werden durch die Buchstaben S, X, M bzw. P dargestellt. Co-Kulturen werden durch Buchstaben dargestellt, die ihre einzelnen Artenbestandteile bezeichnen, z.B. XS steht für die Co-Kultur von x. Retroflexus und S. Rhizophila. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. A) Keratin degradation (mg/mL) for mono-species cultures after 4 days of incubation. Different letters define statistical grouping (ascending order, padj < 0.05, Lin.1) B) Fold increase of keratin degradation in co-cultures of x. retroflexus, compared to the x. retroflexus mono-culture (indicated by dotted red line). Statistical difference is inferred by Lin.3. C) Measured and theoretical keratin degradation (mg/mL) in the x. retroflexus mono-culture and co-cultures. ‘Measured’ refers to the measured keratin degradation, whereas ´expected´ refers to the expected theoretical amount of keratin degraded by the given co-culture. The expected amount was calculated as follows: Expected XS co-culture degradation = Degradation potential of x. retroflexus in mono-culture per CFU * CFU count of x. retroflexus in XS co-culture + degradation potential of S. rhizophila in mono-culture per CFU * CFU count of S. rhizophila in the XS co-cultures. For convenience a complete calculation of the XS co-culture has been added as S12 Fig. Significant difference was inferred by a two-tailed independent two-sample t-test.

Keratin degradation in co-cultures

Degradation from co-cultivation was evaluated for all combinations of dual-species and the 4-species cultures. However, only co-cultures containing x. retroflexus had enhanced keratin degradation as compared to the best single species degrader of the individual co-cultures. x. retroflexus constituted the majority of these communities according to CFU counts (S8A Fig). The enhanced degradative effect of co-cultures had an average fold-change of 1.29, indicating that keratin degradation in co-cultures was on average enhanced by

30% as compared to x. retroflexus mono-cultures (Fig 1B). Co-cultures XM (mean fold change [MFC] = 1.297, p = 0.02, Lin.3), XP (MFC = 1.38, p < 0.01, Lin.3) and XSMP (MFC = 1.27, p = 0.03, Lin.3) displayed significantly enhanced keratin degradation (Fig 1B). Measurements of keratin degradation for all x. retroflexus mono and co-cultures are presented in S10A Fig. Although average total cell counts of co-cultures were not significantly different from that of x. retroflexus mono-cultures, keratin degradation was normalized to cell counts to account for potential variations. Measurements of keratin degradation normalised to CFU counts for all x. retroflexus mono and co-cultures are shown in S10B Fig. With CFU normalisation, the co-culture of XP and the four-species co-culture still had significantly enhanced keratin degradation compared to that in x. retroflexus mono-cultures (S10C Fig).

Community-intrinsic properties

To test for the presence of community-intrinsic properties, the measured degradation of the individual co-cultures was compared to the predicted maximum degradation from the sum of their constituent single species cultures (S11A Fig). Data included three biological replicates, yielding three measures of community degradation with associated measures of single species degradation. Notably, co-culture XP had a significantly higher mean degradation than the predicted maximum. The XM co-culture non-statistically supported the trend of co-cultures having higher degradation than the predicted level. However, comparing co-culture degradation to the sum of multiple single species cultures can make identification of community-intrinsic properties difficult. Instead co-culture degradation was compared to a normalised theoretical degradation of the co-culture, e.g. for the XS culture (Fig 1C) Expected theoretical degradation of the XS co-culture = Degradation potential of x. retroflexus in mono-culture per CFU * CFU count of x. retroflexus in XS co-culture + degradation potential of S. rhizophila in mono-culture per CFU * CFU count of S. rhizophila in the XS co-culture. For convenience a complete calculation of the XS co-culture has been added as S12 Fig. All co-cultures had a higher mean of measured keratin degradation, as compared to the theoretical degradation, indicating that community-intrinsic properties resulted in enhanced degradation. For co-cultures of XP and XSMP (p < 0.0073 and 0.0042 respectively, independent two-tailed t-test) the measured mean was significantly higher than the theoretical estimate. Normalizing with CFU revealed that co-cultures XP and the four-species community were still significantly more productive than the expected theoretical degradation (S11B Fig).

Quantitative PCR analysis for keratin adhered cells

Previous studies on microbial degradation of recalcitrant material have linked the degree of degradation to the amount of microbes physically associated to the material. Quantitative analysis using universal eubacterial primers targeting the 16S rRNA gene (qPCR) was used to address the number of cells adhered to the keratin particles, with the assumption that total bacterial cell counts on the particles could indicate a level of biofilm formation on the particles. QPCR analysis was performed on mono- and co-cultures after 2 and 4 days of incubation. Among the mono-cultures cultures of x. retroflexus contained significantly higher counts of copy numbers, as compared to any other type of mono-culture (S13A Fig, p < 0.001, Lin.1) at both time points. S. rhizophila displayed the second highest level of copy numbers, although it was not significantly different from M. oxydans und P. amylolyticus, (S13A Fig).

After two days of incubation only the co-culture XM contained higher amounts of attached cells, as compared to the x. retroflexus mono-culture (Fig 2). However, after 4 days of incubation all co-cultures contained more attached cells than the x. retroflexus mono-culture, suggesting that a synergistic biofilm production or attachment was at play during co-cultivation. Co-cultures of XM (MFC = 1.61, p = 0.018, Lin.3) and XP (MFC = 1.52, p = 0.014, Lin.3) displayed significantly higher numbers of attached cells, as compared to x. retroflexus mono-cultures. Co-cultures of XS and the four-species culture also presented higher fold change, although not significantly (Fig 2). Biofilm counts from co-cultures are included in S13B Fig.

Q-PCR analysis was based on universal eubacterial 16s rDNA gene primers. Keratin particles were isolated from mono- and co-cultures after 2 and 4 days of incubation. Counts of 16S gene copy numbers were believed to correspond to cells associated to the particles in a biofilm state. Co-culture counts were compared to counts of x. retroflexus mono-cultures. Dotted red line corresponds to the x. retroflexus mono-culture. Co-cultures are represented by letters of their constituent species e.g. x.retroflexus–S.rhizophila (XS), x.retroflexus–M.oxydans (XM) and x.retroflexus–P.amylolyticus (XP). At day 2, the level of adhered cells was not significantly different between co-cultures and the x. retroflexus mono-culture. At day 4, the co-cultures trended an increased fold change of adhered cells, as compared to the x. retroflexus mono-culture. Co-cultures of x.retroflexus–M.oxydans und x.retroflexus–P.amylolyticus had a significantly increased fold change (Lin. 3).

To further investigate the relevance of cell attachment in relation to keratin degradation, we performed a correlation analysis between measured keratin degradation, total cell counts in the supernatant and biofilm counts. The correlation analysis was performed on day 4 data of x. retroflexus mono- and co-cultures. Using Pearson’s correlation, a significant (padj = 0.04, FDR corrected p-value) strong positive (r = 0.98) correlation coefficient was observed between keratin degradation and biofilm counts. Oppositely, total CFU counts from the supernatant (as presented in S8 Fig) showed only a non-significant weak negative correlation with keratin degradation. Hence, biofilm formation on the keratin particles is a better predictor for keratin degradation than total CFU counts (S15 Fig and S2 Table). To further support this observation a Spearman’s ranked correlation approach was also adopted. Similar to the Pearson’s approach a strong positive correlation (rs = 1) was observed for keratin degradation and biofilm counts, although the correlation in this case was only nominal significant (p = 0.01667, padj = 0.14 with FDR correction). Again, total culture CFU and keratin degradation only showed a weak negative non-significant correlation (S15 Fig and S3 Table).

Enzymatic assays and protein measurements

Protease and keratinase activity were measured on a spectrophotometer using azocasein and azokeratin dyed substrates, respectively. Among mono-cultures, protease activity, keratinase activity and soluble protein concentration in the medium were found to increase with time for x. retroflexus und S. rhizophila (S16A–S16C Fig). Zum M. oxydans und P. amylolyticus, no clear proteinase and keratinase activity was observed, and protein content did not change over time. At day 4, the protease and keratinase activity of x. retroflexus was significantly higher than that of all other mono-cultures (protease: 39.42 ±2.34 U/mL, keratinase: 34.58 ±12.1 U/mL, standard deviation, Lin.1). S. rhizophila had the second highest proteinase and keratinase activity at day 4 (S16A and S16B Fig), which was significantly higher than M. oxydans und P. amylolyticus in regards to protease activity, but only nominal significant in regards to keratinase activity (protease: 12.26 ±1.96 U/mL, keratinase: 15.57 ±4.59 U/mL, standard deviation, Lin.1). x. retroflexus und S. rhizophila (0.29 ±0.01 mg/ml and 0.24 ±0.005 mg/ml respectively, SD) produced significantly higher amounts of soluble protein (Lin.1) compared to M. oxydans und P. amylolyticus, but there was no significant difference between the production from x. retroflexus und S. rhizophila (S16C Fig). At day 4, observed protease and keratinase activities for co-cultures of x. retroflexus were similar to that of x. retroflexus mono-cultures Only the protease activity of the XS co-culture deviated significantly, and was significantly lower (padj = 0.0118, Lin.1) (Fig 3A and 3B).

Lines represent a linear regression of three biological replicates across sampling time. A) Protease production by different co-cultures using azo-casein as substrate. One unit protease activity was defined (U) as the amount of protein that increased the absorbance by 0.01. B) Keratinase production by different co-cultures using azo-keratin as substrate. One unit keratinase activity was defined as the amount of protein that increases the absorbance by 0.01 under given conditions. C) Protein production from degraded keratin by different co-cultures. Bradford assay was used for protein quantification with BSA as standard.

When comparing changes in activity over time, steeper activity increases were observed for some co-cultures, as judged from linear slope’s coefficients. Slope coefficients and p-values have been appended as S4 Table. The slope coefficient for the four-species community was higher for both protease and keratinase activity (slope = 7.87 and p = 0.007 and padj = 0.0276 for protease activity slope = 8.03 and p = 0.0184 and padj = 0.0718 for keratinase activity, Lin.2) as compared to the x. retroflexus mono-culture, indicating an increased turn-over within the tested time-span. Co-cultures of XM and XP also trended a higher slope coefficient, although not significantly different (p = 0.0571 and padj = 0.2095 for XM p = 0.064 and padj = 0.2323 for XP, Lin.2).

Although slope coefficients of most co-cultures with x. retroflexus were higher, the soluble protein concentration did not vary significantly between these co-cultures and that of x. retroflexus mono-cultures (Fig 3C).

Observation of protease activity, keratinase activity and protein concentration was included in the correlation analysis with keratin degradation, total CFU counts and biofilm counts, with day 4 observations. For both the Pearson’s and Spearman’s ranked correlation analysis keratinase activity displayed a higher correlation coefficient with keratin degradation than protease activity. However, none of the correlations were significant (S14 and S15 Figs and S2 and S3 Tables). Of the three, protein concentration had the second highest correlation coefficients to keratin degradation, although not significant for neither Pearson’s nor Spearman’s ranked correlations.

Secretome analysis by mass spectroscopy

To further resolve the increased keratin degradation in co-culture, the secretome of x. retroflexus was assessed through LC-MS/MS-based proteomics profiling. Secretome profiling was restricted to x. retroflexus as it was i) the species with the highest potential for degradation and ii) constituted the majority of cells in the co-cultures making it unlikely to obtain good proteome coverage from the other species present in the co-cultures. Secretome profiling was conducted after two days of cultivation, as preliminary tests showed that secretome profiling quality was inversely proportional to incubation time due to build-up of keratin degradation products that hampered identification of secreted bacterial proteins over time. Identified proteins from x. retroflexus were mapped with i) function and subsystem features from the RAST database [60,61], ii) prediction of signal peptides for secretion to the extracellular environment using SignalP [64] and iii) MEROPS protease functions [32,63]. Data quality is summarised in S2–S7 Figs, and the materials and methods section. Identified proteins were filtered according to the presence of signal peptides based on SignalP [64], narrowing the search towards secreted and/or membrane exported proteins. Total counts of identified proteins after SignalP filtration are summarised in Fig 4. Noticeably, several proteins were uniquely observed in the co-culture sample and not in the mono-culture x. retroflexus samples.

Identified proteins from the secretome samples were filtered by i) removing the two outlying biological replicates and ii) removing proteins which did not contain a signal peptide. A) Identified proteins and their overlap between different sample groups, only requiring that the protein is observed in one sample of all biological replicates. B) Quantifiable proteins are defined as proteins which were detectable in 4 out of the 6 biological replicates of a given culture. From each co-culture type, only proteins shared with the x. retroflexus mono-culture were included in the differential abundance analysis.

Secretome differences of x. retroflexus in mono- and co-cultures were addressed by both a supervised and un-supervised statistical approach. A supervised approach was used to make pairwise comparisons of the secretome profiles of the x. retroflexus mono-cultures to x. retroflexus in the different co-cultures using paired t-test with FDR correction. An unsupervised approach (principal component analysis) was used to identify the proteins causing separation between the different culture types.

For the paired t-test the tested proteins were required to be present in four out of the six biological replicates in both of the compared groups. Fig 4 summarises counts and culture overlap of proteins included in the pairwise comparison. Pairwise comparison identified several proteins of x. retroflexus with a significantly changed abundance between the mono-culture and either the four-species or the XS co-culture (Table 1). Notably, many of the proteins with significant changes in abundance were hypothetical proteins without known functions in the RAST or MEROPS database. When comparing the mono-culture to any of the two co-cultures, the same serine protease (S08A) was found to be significantly more abundant in the mono-cultures. An additional predicted protease was significantly more abundant in the mono-cultures when compared to the four-species co-culture (S08A / U69). Oppositely, a glutathionine peroxidase family protein was significantly more abundant for both co-cultures as compared to the mono-culture. From the four-species co-cultures, a nikel transport family protein (NikM) and a PQQ-dependent oxidoreductase, gdhB family protein were also found to be significantly increased.

Significant proteins (after FDR correction, padj < 0.05) were only observed between mono- and co-cultures of x.retroflexus-S.rhizophila and the four-species culture. Proteins are listed according to their genome reference name (Protein ID) with the log2 fold change between mono- and co-culture and the FDR corrected p-value of the paired two-sided t-test. Proteins are mapped with RAST subsystem function (Function) and MEROPS functions (MEROPS). a The first part of the Protein ID’s (fig|305959.5) were removed from the presented IDs.

Proteins with a nominal significantly increased abundance were observed from comparison of the XM and XP co-cultures to the x. retroflexus mono-cultures, but no proteins presented a significantly changed abundance after FDR correction. Among these nominal significant proteins, the predicted S08A / U69 protease and a M28B protease were more abundant for the x. retroflexus mono-cultures when compared to the XP co-cultures, supporting that x. retroflexus alone had increased abundance of secreted proteases. For the XP co-culture, the glutathionine peroxidase family protein was also found to be nominal significantly more abundant than in the mono-cultures.

Principal component analysis did not yield a complete group separation on the two main axes (PCA1: 47.69% and PCA2: 35.97%). However, a trend was observed with co-cultures of XM, XP and the four-species separating away from the XS co-culture and x. retroflexus mono-cultures (S17 Fig). Focusing on the top ten features causing group separation in either direction of PCA1 and PCA2, revealed a similar protein profile as presented by the supervised approach (S18 Fig). For instance, the three proteins causing the largest separation on PCA2 were proteases, including two serine proteases and a metallo-protease, supporting that a large difference between the x. retroflexus mono-culture and the majority of the co-cultures was related to the abundance of secreted proteases. The protein with the strongest impact on group separation on both PCA1 and PCA2 was a chitinase. However, the effect from the chitinase was mostly due to its fluctuating presence and absence between culture groups, and not its abundance-variation between groups, which was revealed by performing a binary principal component analysis. Oppositely, the effect of the proteases on PCA2 could not be attributed to mere presence and absence between groups.


Affiliations

Department of Microbial Ecology, Netherlands Institute of Ecology, P.O. Box 50, Wageningen, 6700 AB, The Netherlands

Irene de Bruijn, Victor de Jager, Ruth Gómez Expósito & Jos M. Raaijmakers

Wageningen University and Research Centre, Laboratory of Phytopathology, P.O. Box 8025, Wageningen, 6700 EE, The Netherlands

Irene de Bruijn, Xu Cheng & Ruth Gómez Expósito

Departments of Pharmacology, Chemistry and Biochemistry Center for Marine Biotechnology and Biomedicine, Scripps Institution of Oceanography Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California at San Diego, La Jolla, San Diego, USA

Jeramie Watrous & Pieter C. Dorrestein

Department of Plant Biology & Pathology, Cook College, Rutgers, The State University of New Jersey, New Brunswick, NJ, 08901-8520, USA

Nrupali Patel & Donald Kobayashi

Wageningen University and Research Centre, Plant Research International, PO Box 16, Wageningen, 6700 AA, The Netherlands


W-JL, MX, WH, and S-XG designed the research and project outline. B-BL and M-ML performed the DNA extraction and physicochemical analysis. MN, Z-HL, and Z-YD performed the culture-dependent and culture-independent analyses. MN drafted the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

Funding. This work was financially supported by the Key Realm Rɭ Program of Guangdong Province (Grant No. 2018B020206001) and the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32061143043, 91951205, and 31800001). The Scientific Investigation Voyage supported by Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Zhuhai). The authors are grateful to the Deanship of Scientific Research, King Saud University for funding through Vice Deanship of Scientific Research Chairs.


1. Einleitung

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (formerly Actinobacillus actinomycetemcomitans) is a member of the Pasteurellaceae, a family of Gram-negative bacteria that includes many important human and animal pathogens. A. actinomycetemcomitans colonizes the human oral cavity and causes periodontitis and nonoral infections including endocarditis [1]. Clinical isolates of A. actinomycetemcomitans are known for their ability to form extremely tenacious biofilms on abiotic surfaces in vitro [2, 3]. Mutants that fail to form biofilms in vitro are unable to colonize the oral cavity of the rat or cause bone loss in a rat model of periodontitis [4, 5]. These findings suggest that biofilm formation is an important virulence factor in A. actinomycetemcomitans.

Tenacious biofilm formation by A. actinomycetemcomitans requires the production of adhesive, bundled, type IV pili (known as Flp-pili) that form on the surface of the cell [3, 6, 7]. Mutants that lack Flp-pili are deficient in surface attachment, autoaggregation, biofilm formation and colonization of the rat oral cavity [3, 5𠄷]. However, Flp-pili mutants still form weak biofilms on abiotic surfaces in vitro [6]. These findings indicate that additional adhesins mediate cohesion in A. actinomycetemcomitans biofilm colonies. Interestingly, biofilms produced by a Flp-pili mutant strain were sensitive to detachment by DNase I [6], which suggests that extracellular DNA (eDNA) may function as a biofilm matrix adhesin in A. actinomycetemcomitans.

Another major component of the A. actinomycetemcomitans biofilm matrix is a hexosamine-rich polysaccharide that is functionally and genetically related to extracellular polysaccharide adhesins produced by Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Escherichia coli und Actinobacillus pleuropneumoniae [8]. These polysaccharides, usually referred to as PNAG, PIA (polysaccharide intercellular adhesin), or PGA, consist of linear chains of N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) residues in β(1,6) linkage (hereafter referred to as PGA). Various forms of PGA appear to differ in their molecular weight, in the degree of N-deacetylation of the GlcNAc residues, and in the presence of O-succinate substituents [9�]. PGA has been shown to play a role in abiotic surface attachment and intercellular adhesion [11�], protection from killing by antibiotics, antimicrobial peptides and phagocytes [12, 16], and virulence [17]. In A. actinomycetemcomitans, PGA has been shown to mediate intercellular adhesion and resistance to killing by the anionic detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) [8, 18].

The purpose of the present study was to gain better insight into the structure, synthesis and function of A. actinomycetemcomitans PGA. We purified PGA polysaccharide from a biofilm-producing clinical strain of A. actinomycetemcomitans and analyzed its chemical structure by using NMR spectroscopy. We also investigated the genetics of PGA production and the role of PGA in biofilm cohesion and detergent resistance in A. actinomycetemcomitans. In this report we present evidence that A. actinomycetemcomitans PGA is a β(1,6)-linked GlcNAc polymer that mediates intercellular adhesion and detergent resistance in A. actinomycetemcomitans biofilm colonies.


Surface Spreading Motility Shown by a Group of Phylogenetically Related, Rapidly Growing Pigmented Mycobacteria Suggests that Motility Is a Common Property of Mycobacterial Species but Is Restricted to Smooth Colonies

FIG. 1 . Smooth and rough colonies of M. chubuense (A), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E). The images are representative of hundreds of colonies obtained through the study. FIG. 2 . SEM images of smooth colonies of M. chubuense (A), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E). The right column shows the same sample as the left column but at greater magnification. These images are representative of the studies performed with six colonies of each species. FIG. 3 . SEM images of rough colonies of M. chubuense (A), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E). The right column shows the same sample as the left column but at greater magnification. These images are representative of the studies performed with six colonies of each species. FIG. 4 . Spreading of smooth colonies on motility medium after 6 days of growth. (A) M. chubuense (B) M. gilvum (C) M. obuense (D) M. parafortuitum (E) M. vaccae. Arrows indicate the external margins of the colonies. The right column shows pictures obtained with a binocular stereomicroscopy. These images are representative of the studies performed with 10 colonies of each species. FIG. 5 . Spreading of rough colonies on motility medium after 6 days of growth. (A) M. chubuense (B) M. gilvum (C) M. obuense (D) M. parafortuitum (E) M. vaccae. Arrows indicate the external margins of the colonies. In the right column are pictures obtained with a binocular stereomicroscopy. These images are representative of the studies performed with 10 colonies of each species. FIG. 6 . TLC images of chloroform-methanol extracts from M. vaccae (lanes 1 and 2), M. gilvum (lanes 3 and 4), M. obuense (lanes 5 and 6), M. chubuense (lanes 7 and 8), and M. parafortuitum (lanes 9 and 10). In the odd-numbered lanes, extracts are from smooth colonies, and in the even-numbered lanes, extracts are from rough colonies. TLC was developed with methanol-chloroform (90:10, vol/vol) and revealed with anthrone. Red spots indicate SP and SP-L. FIG. 7 . Cellular adhesion of smooth and rough variants of M. chubuense (A), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E) strains to glass tubes at 1, 2, 3, 4, and 7 days of incubation. The cellular adhesion level is expressed as the number of CFU/cm 2 . The results are expressed as means ± standard deviations obtained from triplicates. The results are representative of one out of three independent experiments. Cellular adhesion levels of smooth variants were significantly higher than those of rough variants (*, P < 0.05 **, P < 0.01). Cellular adhesion levels of rough variants were significantly higher than those of smooth variants (&, P < 0.05). FIG. 8 . Cellular adhesion of smooth and rough variants of M. chubuense (A), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E) strains to polystyrene tubes at 1, 2, 3, 4, and 7 days of incubation. The cellular adhesion level is expressed as the number of CFU/cm 2 . The results are expressed as means ± standard deviations obtained from triplicates. The results are representative of one out of three independent experiments. Cellular adhesion levels of smooth variants were significantly higher than those of rough variants (**, P < 0.01). Cellular adhesion levels of rough variants were significantly higher than those of smooth variants (&&, P < 0.05).


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