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1.13: Transformation - Biologie

1.13: Transformation - Biologie


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Lernziele

Ziele:

  • Erklären Sie, wie die in einem Gen kodierten Informationen als a . ausgedrückt werden Merkmal
  • Beschreiben Sie die Rolle der Transformation beim Klonen von Genen
  • Erklären Sie den Zweck jeder Kontrolle im Transformationsexperiment

Lernergebnisse der Schüler:

Nach Abschluss dieses Labs sind die Studierenden in der Lage:

  • Eine Transformation durchführen
  • Vorhersage der Wachstumsergebnisse für die Negativkontrolle und die Plasmid-haltige Reaktion sowohl auf antibiotikahaltigen als auch auf Nähragar-Nur-Medien
  • Erklären Sie Ihre Argumentation, wenn die vorhergesagten Wachstumsergebnisse nicht mit den tatsächlichen Wachstumsergebnissen übereinstimmen

Einführung

Gentechnik oder DNA-Technologie hat sich zur Herstellung großer Mengen eines spezifischen Proteins zur Behandlung menschlicher Krankheiten als nützlich erwiesen. Zum Beispiel benötigen Patienten mit Diabetes, Hämophilie oder Anämie Behandlungen mit Insulin, Gerinnungsfaktor und Wachstumsfaktorproteinen. Zielgene (DNA) können mit Restriktionsenzymen geschnitten und mit dem Enzym Ligase mit anderer DNA verbunden werden. Ein Klonierungsvektor wird verwendet, um die rekombinante DNA in lebende Zellen zu transportieren, damit die Zellen die kodierten Proteine ​​synthetisieren können. Die besten Klonierungsvektoren sind klein, können ihre DNA replizieren, enthalten Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme und haben ein Markergen (normalerweise ein Antibiotikaresistenzgen). In diesem Labor verwenden wir ein rekombinantes Plasmid als Klonierungsvektor. Dieses rekombinante Plasmid enthält (1) a Promoter das ermöglicht Transkription des gewünschten Gens, (2) eine Sequenz zur Initiation der DNA-Replikation (ori Stelle) und (3) ein Antibiotikaresistenzgen.

Transformieren von Bakterien mit rekombinantem Plasmid

Das Einfügen eines Gens in einen Plasmidvektor ist ein wichtiger erster Schritt im Genklonierungsprozess. Wenn das ultimative Ziel jedoch darin besteht, eine große Menge eines bestimmten Proteins zu produzieren, muss das Plasmid replizieren, um sicherzustellen, dass es viele Kopien des Gens gibt und das interessierende Gen muss ausgedrückt, Das bedeutet, dass das Gen verwendet wird, um das kodierte Protein zu produzieren. Beide Aktivitäten können nur innerhalb einer Zelle stattfinden. Daher werden wir in diesem Lab a rekombinant Plasmid in E coli Bakterien durch einen Prozess, der genannt wird Transformation, so genannt, weil es den DNA-Gehalt der Bakterien verändert.

Das Plasmid wird von Bakterien aufgenommen, wo es repliziert, und seine Gene werden mithilfe der bakteriellen Zellmaschinerie exprimiert. Wenn ein interessierendes Gen in den Plasmidvektor eingefügt wurde, produzieren die Bakterien das von diesem Gen codierte Produkt.

In dieser Übung führen Sie die Transformation von E coli Bakterien mit einem rekombinanten Plasmid, das ein Gen enthält, das farbige Proteine ​​produziert.

Bakterielle Transformation

Sobald ein rekombinantes Plasmid hergestellt wurde, das ein interessierendes Gen wie Insulin enthält, kann das Plasmid durch einen als Transformation bezeichneten Prozess in Bakterienzellen eindringen. Abbildung 13.1 veranschaulicht den Wandel. Die Aufnahme von DNA aus der Umgebung einer Bakterienzelle erfolgt in der Natur mit sehr geringer Effizienz. E coli Bakterien besitzen komplexe Plasmamembranen, die die äußere Umgebung von der inneren Umgebung der Zelle trennen und sorgfältig regulieren, welche Substanzen in die Zelle ein- und austreten können. Außerdem ist die Zellwand negativ geladen und stößt negativ geladene DNA-Moleküle ab.

Zellen, die behandelt wurden, um zu werden kompetent sind effizienter bei der Aufnahme von DNA aus ihrer Umgebung. Kompetente Zellen können hergestellt werden, indem die Bakterien mit einer Calciumlösung behandelt werden. Calciumionen sind positiv geladen und neutralisieren die negativ geladene äußere Membran auf der E coli Bakterien. Mit der positiven Ladung, die nun die Membran bedeckt, bewegen sich die von Natur aus negativ geladenen DNA-Moleküle durch die Plasmamembranen und in die Zelle. Die Transformationseffizienz kann weiter gesteigert werden, indem die Zellen in einem Hitzeschock gestresst werden. Durch die drastische Temperaturänderung der Zellen von kalt zu warm werden die Plasmamembranen flüssiger und bilden Poren in ihnen. Durch diese Poren kann die Plasmid-DNA aus der Umgebung in die Zelle gelangen. Anschließend werden die Zellen wieder in eine kalte Temperatur getaucht, wodurch sich die Poren schließen und die Plasmid-DNA in der Zelle verbleibt.

Jedoch nehmen selbst kompetente Zellen das Plasmid nicht immer auf. Bei einigen Plasmid-DNA-Molekülen wird nur etwa 1 von 10.000 Zellen transformiert. Wenn so wenige Zellen das Plasmid aufgenommen haben, wie können Sie transformierte Zellen identifizieren? Beim Design eines rekombinanten Plasmids besteht eine der Anforderungen darin, ein Gen für eine Antibiotikaresistenz hinzuzufügen. Auf diese Weise können die Bakterien in den Medien gezüchtet werden, denen ein Antibiotikum zugesetzt ist, und nur Zellen, die das Resistenzgen aufweisen, beispielsweise solche, die das rekombinante Plasmid exprimieren, können wachsen.

Von der Plasmid-DNA zum Protein

Nachdem ein rekombinantes Plasmid in eine Bakterienzelle eingedrungen ist, beginnt die Zelle, die darauf befindlichen Gene zu exprimieren. DNA-Polymerase lokalisiert die ori- den Replikationsursprung und beginnt mit der Replikation des Plasmids mit der Maschinerie der Bakterienzelle. Mehrere Kopien des rekombinanten Plasmids können es der Bakterienzelle ermöglichen, große Mengen eines Proteins zu exprimieren. Normalerweise wird eine Bakterienzelle das interessierende Protein erst herstellen, nachdem sie dazu durch Zugabe einer Chemikalie, die die Transkription des Gens fördert, induziert wurde. Denken Sie daran, dass zur Expression des Gens, das das Protein auf dem rekombinanten Plasmid kodiert, DNA in mRNA transkribiert wird, die dann in Protein translatiert wird (Abbildung 13.2). Die exprimierten Proteine ​​können die sichtbaren Merkmale bei der Beobachtung der Bakterienkolonien beeinflussen.

Rekombinante Plasmide und andere Formen der Gentechnik sind möglich, weil alle lebenden Organismen die DNA als Plattform verwenden, um genetische Informationen zu kodieren. Gene aus verschiedenen Organismen können in anderen Organismen wie Bakterien exprimiert werden, da sie in der DNA kodiert sind. Die DNA-Anweisungen können übertragen werden und andere Organismen können fremde Merkmale exprimieren.

Proteine ​​haben viele verschiedene Funktionen im Inneren und in den Zellen. Sie bestehen aus kleineren Untereinheiten, Aminosäuren, die von DNA kodiert werden Nukleotide. Eine spezifische Sequenz aus drei Nukleotiden, die für eine einzelne Aminosäure kodiert, wird als a . bezeichnet Kodon. Beispielsweise kodiert das Codon TTG für die Aminosäure Tryptophan, während das Codon AAG für die Aminosäure Lysin kodiert. In vielen Fällen kann mehr als ein Codon dieselbe Aminosäure kodieren. AAA ist beispielsweise auch ein Codon für Lysin. Darüber hinaus gibt es Informationscodons, wie z Startcodon (ATG) und die Codon stoppen (TTA), die zeigen, wo in der DNA-Sequenz der Code für das Protein beginnt und endet.

Bakterien mit Plasmiden transformieren

In diesem Laborexperiment verwandelst du dich E coli Bakterienzellen mit Plasmiden. Sie werden verwenden E coli die durch eine Calciumchlorid-Behandlung kompetent gemacht wurden, und bilden zwei verschiedene Testgruppen: eine negative Kontroll-Zellgruppe, der keine Plasmide hinzugefügt wurden, und die experimentelle Gruppe, der die Plasmide hinzugefügt wurden. Nachdem die Zellen einem Hitzeschock unterzogen wurden, werden sie unter verschiedenen Testbedingungen gezüchtet:

  • Die Kontrollgruppe auf Nähragar (eine Art Wachstumsmedium, auf dem Bakterien gedeihen).
  • Die Kontrollgruppe auf Nähragar mit zugesetztem Antibiotikum.
  • Die experimentelle Gruppe zu Nähragar.
  • Die Versuchsgruppe zu Nähragar mit einem Antibiotikum.
  • Die experimentelle Gruppe zu Nähragar, Antibiotikum und einem Induktor (wie IPTG).

Indem Sie das Bakterienwachstum unter diesen Bedingungen untersuchen, können Sie überprüfen, ob Ihr Verfahren funktioniert hat, und Sie können die mit dem hinzugefügten Plasmid transformierten Bakterien identifizieren. Wie werden Sie wissen, ob Sie erfolgreich sind? In den Beispielen für Plasmide, die wir für diese Übung empfohlen haben, werden die rekombinanten Bakterien eine neue und gut sichtbare Eigenschaft haben: Sie produzieren jetzt farbiges Protein, das die Zellen selbst färbt! Wenn sich die Bakterien auf dem Medium vermehren, bilden sie sichtbare Ansammlungen von Zellen, die als Kolonien bezeichnet werden. Jede Kolonie stellt die Nachkommen der ursprünglichen Bakterienzelle dar, die an dieser Stelle auf dem Medium gelandet ist und sich zu replizieren begann. Kolonien sind somit Klone (exakte Kopien) der Zelle, die den Replikationsprozess begonnen hat.

Die relevanten Bestandteile Ihres Plasmids sind das Gen für das farbige Protein, der induzierbare Promotor und das Ampicillin-Resistenzgen (ampR). Die ampR Gen verleiht Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin. (Biotechnologen nennen diese Gene wählbare Marker weil nur Bakterien mit dem Gen in Gegenwart eines Antibiotikums überleben.) Wenn der Induktor in den Bakterien vorhanden ist, wird der Promotor „angeschaltet“, damit die RNA-Polymerase das interessierende Gen transkribieren kann. Dadurch kann Protein produziert werden.

Prelab-Fragen

Besprechen Sie folgendes untereinander. Seien Sie bereit, Ihre Gedanken mit dem Rest der Klasse zu teilen.

  1. Ampicillin ist ein Derivat des Antibiotikums Penicilliin. Es stört die Zellwandbildung in Bakterienzellen, die die Zellen abtötet. Unser rekombinantes Plasmid enthält jedoch ein Gen, das Antibiotikaresistenz bietet, indem es ein Protein produziert, das Ampicillin abbaut. Warum schließen wir Ampicillin in das Testmedium ein?
  2. Was passiert, wenn die transformierten Zellen in Gegenwart des chemischen Induktors nicht wachsen?
  3. Im Experiment fügen Sie die Kontroll- und Versuchszellengruppen auf verschiedene Medienkombinationen hinzu. Was prognostizieren Sie für jede Bedingung? Ergänze Tabelle 1 indem Sie angeben, ob Sie Wachstum oder kein Wachstum vorhersagen, und wenn Wachstum, wird es minimales Wachstum oder viel Wachstum geben.

Lesen Sie die nachstehenden Verfahren durch und skizzieren Sie die Schritte mithilfe von Wörtern und einem Flussdiagramm in Ihrem Labornotizbuch.

Tabelle 1. Vorhersagen für Ihr Experiment; Transformation von E. coli

Mittel

Keine Plasmidkontrolle

Behandlung mit Plasmid

Nährstoff-Agar

Nähragar + Ampicillin

Nähragar + Ampicillin + Induktor

Transformieren E coli

MATERIALIEN

Reagenzien

  • Plasmid – im Mikrozentrifugenröhrchen
  • Nährbrühe (NB) – im Mikrozentrifugenröhrchen
  • Kompetente E. coli-Zellen (CC) – im Mikrozentrifugenröhrchen (CC-Röhrchen immer auf Eis halten)
  • 3 Agarplatten:

Platte 1: NA

Platte 2: NA/Amp

Platte 3: NA/Amp/Ind

Vorräte und Ausrüstung

  • P-20 Mikropipette
  • P-200 Mikropipette
  • Pipettenspitzenbox (für P-20, P-200)
  • Gestell für Mikrozentrifugenröhrchen
  • Zwei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen
  • Permanent-Marker
  • Wegwerf Handschuhe
  • Crushed Ice in einem Styroporbecher (Becher zuerst mit Eis füllen, bevor CC-Röhrchen genommen wird.)
  • Packung Zellspreizer (Spreizer nicht aus der Packung nehmen, bevor Sie dazu aufgefordert werden)
  • Timer oder Uhr
  • Schwimmendes Gestell für Mikrozentrifugenröhrchen
  • 42°C Wasserbad
  • 37°C Inkubator
  • Band
  • Müllcontainer
  • Biohazard-Beutel (für Verbrauchsmaterialien, die mit Zellen umgehen)

SICHERHEIT

Überprüfen Sie Ihr Protokoll und befolgen Sie alle Sicherheitsmaßnahmen und tragen Sie angemessene Kleidung, bevor Sie das Experiment durchführen.

Üben aseptische Technik während dem Benutzen E coli oder andere lebende Proben in einer Laborumgebung. Aseptische Technik ist die Praxis, Vorkehrungen zu treffen, um eine potenzielle Kontamination sowohl für die Person, die das Experiment durchführt, als auch für die Probe/n zu begrenzen. Bitte beachten Sie Folgendes:

  • Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie mit Bakterien arbeiten.
  • Vermeiden Sie es, kontaminierte Bereiche zu berühren, die alles enthalten, was mit Bakterien in Berührung gekommen ist. Benachrichtigen Sie Ihren Lehrer so schnell wie möglich, wenn sich ein Unfall ereignet, z. B. ein Verschütten.
  • Legen Sie alle Materialien, die Bakterien ausgesetzt waren, entweder in einen Biohazard-Beutel oder einen dafür vorgesehenen Bioabfallbehälter. Diese kontaminierten Verbrauchsmaterialien können Pipettenspitzen, Zellspreizer und Mikrozentrifugenröhrchen umfassen.
  • Halten Sie die Agarplatten immer geschlossen, nachdem Sie sie aus dem Inkubator genommen haben.
  • Waschen Sie Ihre Hände immer 20 Sekunden lang mit Wasser und Seife, bevor Sie das Labor verlassen.

VERFAHREN

  1. Stellen Sie sicher, dass sich alle Reagenzien in einem Röhrchenständer befinden.
  2. Nehmen Sie ein gekühltes CC-Röhrchen und geben Sie es in den Becher mit zerstoßenem Eis. Halten Sie die kompetenten Zellen kalt bei jederzeit. Halten Sie den Schlauch am Rand fest, nicht am Boden.
  3. Beschriften Sie die Oberseite und die Seiten von zwei neuen Mikrozentrifugenröhrchen mit „P-“ und „P+“.
  1. Legen Sie die Röhrchen P– und P+ mit dem CC-Röhrchen auf Eis.
    Um die bestmöglichen Ergebnisse zu erzielen, ist es entscheidend, dass jeder Schritt genau befolgt wird. Beschränken Sie jede mögliche Kontamination auf die Materialien, sich selbst und die Umgebung.
  2. Hinzufügen E coli kompetente Zellen (CC-Röhrchen) sowohl zu den P- als auch zu den P+-Röhrchen.
  3. Nehmen Sie die P-200-Pipette, stellen Sie sie auf 50 µL ein und setzen Sie eine Spitze auf.
  4. Halten Sie das CC-Röhrchen am Rand und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie mit der Pipette langsam zwischen dem ersten und keinem Stopp pumpen (eine sanfte Kolbenbewegung nach unten zum ersten Widerstandspunkt, dann eine sanfte Aufwärtsbewegung zur oberen Kolbenposition).
  5. 50 µl Zellen in das P+-Röhrchen geben und das P+-Röhrchen sofort auf Eis stellen. Entsorgen Sie die Spitze in den Behälter für scharfe Gegenstände.
  6. Schnappen Sie sich eine neue Pipettenspitze. Wiederholen Sie dies für das P-Rohr. Entsorgen Sie die Spitze. Sowohl P- als auch P+-Röhrchen sollten auf Eis stehen und 50 µl kompetenter Zellen enthalten.
  7. Fügen Sie nur dem P+-Röhrchen Plasmid hinzu.
    1. Nehmen Sie die P-20-Pipette, stellen Sie sie auf 10 µL ein und setzen Sie eine Spitze auf.
    2. Entfernen Sie 10 µL des Plasmids und fügen Sie es dem P+-Röhrchen hinzu. Mischen Sie durch langsames Pumpen zwischen dem ersten und keinem Stopp 2-3 Mal und legen Sie das Röhrchen dann wieder auf Eis.
  8. Legen Sie die Röhrchen P- und P+ für 15 Minuten auf Eis.
  9. Während die Röhrchen abkühlen, besorgen Sie Ihre Agarplatten und Marker. Öffnen Sie die Platten während dieses Schritts nicht
    1. Jede Agarplatte enthält unterschiedliche Medien – eines von nur Nähragar (NA), eines von Nähragar + Ampicillin (NA/AMP) und eines von Nähragar + Ampicillin + Induktor (NA/AMP/IND). Diese können mit einem Streifenmuster beschriftet oder auf die Platte geschrieben werden
    2. Öffnen Sie die Platten nicht. Drehen Sie jeden Teller auf den Kopf; der Agar sollte oben sein. Beschriften Sie die Agarseite mit 1) Datum 2) Gruppennummer 3) Klassenperiode. Versuchen Sie, entlang der unteren Kante der Platte klein zu schreiben.
    3. Zeichnen Sie als Nächstes eine Linie in der Mitte der NA- und NA/AMP-Platten. Eine Hälfte ist mit „P-“ und die andere mit „P+“ gekennzeichnet. Der NA/AMP/IND ist nur mit „P+“ gekennzeichnet. Sie sollten ähnlich wie in Abb. 4 aussehen
  1. Nachdem die Röhrchen P- und P+ 15 Minuten auf Eis gestanden haben, halten Sie die Röhrchen auf Eis und bringen Sie den Eisbecher in das 42 °C warme Wasserbad. Sie benötigen auch Ihren Timer / Ihre Uhr. Stellen Sie beide Röhrchen in ein schwimmendes Mikrozentrifugenröhrchengestell und stellen Sie es dann für genau 45 Sekunden.
  2. Sobald die 45 Sekunden verstrichen sind, stellen Sie die Röhrchen sofort wieder in den Eisbecher und halten Sie sie mindestens 1 Minute lang auf Eis.
  3. Fügen Sie den P- und P+-Röhrchen Nährbrühe (NB) hinzu.
    1. Nehmen Sie die P-200-Pipette, stellen Sie sie auf 150 µL ein und setzen Sie eine Spitze auf.
    2. 150 µL NB entfernen und in das P-Röhrchen geben. Mischen Sie durch langsames Pumpen zwischen dem ersten und keinem Stopp mit der Pipette. Entsorgen Sie die Spitze in den Bioabfallbehälter.
    3. Holen Sie sich eine neue Pipettenspitze. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für das P+-Rohr.
  4. Bewahren Sie die Röhrchen 15 Minuten bei Raumtemperatur auf. Wenn die Zeit knapp wird, kann dieser Schritt verkürzt werden.
  5. Fügen Sie Zellen aus dem P–-Röhrchen auf Ihre NA- und NA/amp-Platten hinzu. Halten Sie die Platten mit der rechten Seite nach oben, so dass der Agar auf dem Boden liegt. Sie fügen Zellen auf die Oberfläche des Agars (nicht auf den Plastikdeckel).
    1. Nehmen Sie die P-200-Pipette, stellen Sie sie auf 50 µL ein und setzen Sie eine Spitze auf
    2. Nimm das P-Rohr. Pumpen Sie die Pipette langsam zwischen dem ersten und keinem Stopp mit der Pipette, um die Zellen zu resuspendieren. Entfernen Sie 50 µL der Zellen.
    3. Heben Sie den Deckel der NA-Platte wie eine „Muschelschale“ an, um einen ausreichend großen Spalt für die Abgabe der Zellen zu lassen und gleichzeitig das Risiko einer Kontamination durch die Luft zu verringern. Fügen Sie die 50 µL Zellen zur P-Hälfte der Platte hinzu. Schließen Sie die Platte und bereiten Sie das Verteilen der Zellen vor.
    4. Wiederholen Sie dies für die NA/AMP-Platte, indem Sie die P-Röhrchen-Zellen mit der Pipette und derselben Spitze resuspendieren. Fügen Sie erneut 50 µL der Zellen zur P-Seite der NA/AMP-Platte mit der Clamshell-Methode hinzu. Entsorgen Sie die Spitze in den Behälter für scharfe Gegenstände.
  1. Verteilen Sie die Zellen aus dem P-Röhrchen auf Ihren NA- und NA/amp-Platten. Sie müssen Ihre Teller in dieser Reihenfolge verteilen.
    1. Öffnen Sie die sterilisierte Zellspreizer-Verpackung. Nehmen Sie einen einzelnen Spreizer heraus und halten Sie ihn nur an dem Ende fest, an dem Sie ihn entfernt haben. Achten Sie darauf, das andere Ende des Streuers nicht mit etwas anderem als den Zellen und dem Agar zu berühren. Schließen Sie das Paket.
    2. Öffnen Sie mit der „Clamshell“-Methode den NA-Deckel und verteilen Sie die Zellen auf der P-Hälfte der Platte. Halten Sie den Streuer vorsichtig flach gegen die Oberfläche des Agars; Behandeln Sie es vorsichtig, als ob Sie mit Gelatine umgehen würden. Schließen Sie die Platte.
    3. Wiederholen Sie die gleiche Technik für die NA/AMP-Platte auf der P-Seite mit demselben Spreizer. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Streuer in den dafür vorgesehenen Bioabfallbehälter.
  2. Fügen Sie Zellen aus dem P+-Röhrchen zu Ihren NA-, NA/amp- und NA/amp/ind-Platten hinzu:
    1. Nehmen Sie die P-200-Pipette, überprüfen Sie, ob sie auf 50 µL eingestellt ist, und setzen Sie eine Spitze auf.
    2. Nehmen Sie das P+-Rohr. Entfernen Sie 50 µL der Zellen.
    3. Öffnen Sie die NA-Platte wieder wie eine Muschelschale, um 50 µL Zellen an die P+-Hälfte der Platte zu liefern. Schließen Sie die Platte.
    4. Wiederholen Sie dies für die NA/AMP-Platte, indem Sie die Zellen mit der Pipette und derselben Spitze resuspendieren. Fügen Sie 50 µL Zellen zur P+-Hälfte der Platte hinzu. Schließen Sie die Platte.
    5. Wiederholen Sie dies für die NA/AMP/IND-Platte, indem Sie die Zellen mit der Pipette und derselben Spitze resuspendieren. 50 µL Zellen hinzufügen zweimal auf die ganze Platte. Es werden insgesamt 100 µl P+-Zellen auf die Platte gegeben und müssen beim Ausstreichen die gesamte Oberfläche bedecken. Schließen Sie die Platte.
  1. Verteilen Sie die P+-Zellen auf den NA-, NA/AMP- und NA/AMP/IND-Platten. Sie müssen Ihre Teller in dieser Reihenfolge verteilen.
    1. Öffnen Sie die Zellstreuerverpackung wieder und nehmen Sie einen einzelnen Streuer heraus, indem Sie nur den Griff berühren. Achten Sie darauf, dass Sie mit dem anderen Ende des Streuers nichts anderes als die Zellen und den Agar berühren.
    2. Öffnen Sie mit der Clamshell-Methode den NA-Deckel und verteilen Sie die Zellen auf der P+-Hälfte der Platte. Schließen Sie die Platte.
    3. Wiederholen Sie mit dem gleichen Spreizer die gleiche Technik für die NA/AMP-Platte auf der P+-Seite .
    4. Wiederholen Sie die gleiche Technik für die NA/AMP/IND-Platte, außer dass die Zellen auf der gesamten Platte verteilt werden müssen, nicht nur auf einer Hälfte. Drehen Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen mit dem Streuer gleichmäßig zu verteilen. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Streuer in den dafür vorgesehenen Bioabfallbehälter.
  2. Halten Sie alle Teller 5 Minuten lang mit der rechten Seite nach oben, bis die Flüssigkeit vollständig in den Teller aufgenommen wurde. Stapeln Sie die Platten zusammen und beschriften Sie sie mit Ihrer Unterrichtsstunde, Gruppennummer und Datum.
  3. Legen Sie die Platten mit der Oberseite nach unten (Agarseite nach oben) in den 37 °C-Inkubator, um zu verhindern, dass sich Kondenswasser bildet und auf die Zellen fällt.
  4. Geben Sie alles, was die Zellen berührt hat, in den Biohazard-Beutel, einschließlich Pipettenspitzen, Mikrozentrifugenröhrchen und Zellspreizer. Tischplatten mit Desinfektionsmittel abwischen und Hände waschen.
  5. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 24-36 Stunden und suchen Sie nach Wachstum. Halten Sie die Platten geschlossen.
  6. Legen Sie die Agarplatten in den Biohazard-Beutel, wenn Sie dazu aufgefordert werden.

Analyse

  1. Betrachten Sie die Ergebnisse Ihrer Transformation. Ausfüllen Tabelle 2 mit Beobachtungen, ob Sie Wachstum auf den verschiedenen Medien sehen oder nicht.
  2. Stimmen Ihre tatsächlichen Ergebnisse mit Ihren prognostizierten Ergebnissen überein? Wenn nicht, welche Unterschiede sehen Sie und was sind einige Erklärungen für diese Unterschiede?
  3. Wie viele farbige Kolonien waren auf Ihrer NA/AMP/IND-Platte vorhanden?
Tabelle 2. Transformation von E. coli

Mittel

Keine Plasmidkontrolle

Behandlung mit Plasmid

Nährstoff-Agar

Nähragar + Ampicillin

Nähragar + Ampicillin + Induktor

Studienfragen

  1. Warum sollten sich farbige Kolonien auf der NA/AMP/IND-Platte und nicht auf der NA/AMP-Platte bilden?
  2. Was sind mögliche Gründe für die Bildung farbiger Kolonien auf der NA/AMP-Platte?
  3. Extrachromosomale DNA in Bakterien kann sich wie ein rekombinantes Plasmid innerhalb der Zelle replizieren, ohne dass der Rest der DNA der Zelle repliziert. Dies kann zu mehreren Plasmiden innerhalb einer Zelle führen. Warum ist das wichtig?
  4. Zuvor haben Sie die Wechselwirkungen zwischen DNA, RNA, Proteinen und Merkmalen kennengelernt. Erklären Sie, wie ein inseriertes Gen wie eines in Plasmid-DNA als Merkmal exprimiert wird.
  5. Wie können Bakterien aus fremder DNA Proteine ​​wie Humaninsulin oder ein Protein aus einer Qualle wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) herstellen?
  6. Was würde passieren, wenn wir die transformierten Bakterien in Gegenwart eines anderen Antibiotikums wie Kanamycin anstelle von Ampicillin züchten würden?

ESEP 20:1-13 (2020) - DOI: https://doi.org/10.3354/esep00189

ZUSAMMENFASSUNG: Der selbstgewählte Auftrag der Menschheit, die Natur zu unterwerfen und zu beherrschen, ist Teil der kognitiven Grundlage der modernen Welt – eine Perspektive, die tief in Wissenschaft und Technologie verwurzelt ist. Die Meeresbiologie war gegen diese anthropozentrische Voreingenommenheit nicht immun. Aber das muss sich ändern und die Kluft zwischen wissenschaftlichen Grundlagendisziplinen und den globalen Naturschutzimperativen unserer Zeit müssen überbrückt werden. Angesichts einer drohenden Umwelt- und Klimakrise müssen Meeresbiologen ihre Werte und beruflichen Standards verbessern und den radikalen Wandel vorantreiben, der zur Abwendung eines Klima- und ökologischen Zusammenbruchs erforderlich ist. Um einen Teil des Schadens zu verhindern, müssen sie die imaginäre Grenze überschreiten, die Wissenschaft von wissenschaftsbasiertem Aktivismus trennt, und bewusst die Gesundheit und Beständigkeit menschlicher und natürlicher Gemeinschaften verfolgen. Zu diesem Zweck können sie (1) überzeugende Narrative entwickeln, die die menschliche Gesellschaft einbeziehen, mit Schwerpunkt auf der Sorge für die wild lebende Welt (2) auf dem Papier über den Meeresschutz hinausgehen und eigennützige Gefälligkeit vermeiden (3) konstruktive Veränderungen des Marktes befürworten und menschliches Verhalten, nicht nur durch die Dokumentation von Schäden, sondern auch durch die Klärung, wie das Gewinnungs-, Produktions- und Konsumsystem von Praktiken abgelenkt werden kann, die der Natur schaden fordern eine Politik zum Schutz der Biosphäre und (5) unterstützen eine ökozentrischere und ganzheitlichere Weltvision, die die Verachtung für spirituelle Weisheit aufgibt und sich mit spirituellen Traditionen verbindet (oder zumindest nicht ablehnt), die Gleichheit, Selbstbeherrschung und ökologische Nachhaltigkeit fördern.

SCHLÜSSELWÖRTER: Meeresbiologie · Meeresschutz · Umweltkrise · Klimawandel · Erhaltung der Biodiversität · Raubbau · Nachhaltigkeit · Outreach · Activism


Zellverletzung, zelluläre Reaktionen auf Verletzungen und Zelltod

Metaplasie

Metaplasie ist die Umwandlung von einer Art normaler adulter Zellen in eine andere Art normaler adulter Zellen. Die häufigsten von Pathologen beobachteten Arten von Metaplasie umfassen die Umwandlung von Plattenepithelzellen in Drüsenzellen und umgekehrt. Eine Drüsenmetaplasie kann als Reaktion auf eine Verletzung auftreten, wie sie auch in der distalen Speiseröhre mit saurem Reflux aus dem Magen auftreten kann. Diese Form der chronischen Verletzung kann die Umwandlung der entzündeten Plattenepithelschleimhaut in eine Drüsenschleimhaut bewirken, die viele Merkmale einer normalen Dünndarmschleimhaut aufweist. Metaplasie kann auch als normale physiologische Reaktion auftreten. Ein Beispiel für eine physiologische Metaplasie ist die Plattenepithelmetaplasie, die während des Menstruationszyklus im Gebärmutterhals auftritt, wenn der Plattenepithel-Übergang über die Transformationszone wandert (Abb. 1-13). Obwohl einige Formen der Metaplasie adaptiv sind und die Auswirkungen einer chronischen Verletzung mildern können, können andere Arten von Metaplasie zu einer erheblichen Funktionsstörung führen. Zum Beispiel entwickelt sich eine Plattenepithelmetaplasie des respiratorischen Epithels als Folge des Zigarettenrauchens und führt zum Verlust der normalen Schleimhautdecke, die eine wichtige Wirtsbarriere gegen Infektionen und toxische Substanzen in der Umwelt darstellt. Die meisten Formen der Metaplasie sind reversibel, wenn der Stimulus entfernt wird, während einige (z.


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Diskussion

MBs, die aggressivsten pädiatrischen Hirntumore, können basierend auf Transkriptom- und Methylierungsprofilen in vier molekulare Gruppen unterteilt werden: WNT, SHH, Gruppe 3 und Gruppe 4 [63]. Jüngste Studien haben jedoch gezeigt, dass die derzeitige molekulare Gruppierung nicht ausreicht, um die Prognose der Patienten vorherzusagen. Zum Beispiel das Tumorprotein P53 (TP53) Mutation ist sowohl in der WNT- als auch in der SHH-MB-Untergruppe ein kritischer Risikofaktor [64]. Darüber hinaus wird eine abweichende DNA-Methylierung an den Genen, die an der embryonalen Morphogenese beteiligt sind, auch als potenzieller Treiber des onkogenen Prozesses in der SHH-Untergruppe angesehen, die nach dem 5.SHH-Kinder) [65]. Da der Verlust von 5hmC, dem ersten oxidativen Derivat von 5mC, als ungünstiger Indikator für mehrere bösartige Tumoren (z. In Übereinstimmung mit früheren Befunden bei anderen Tumorarten haben wir eine signifikante Reduktion von 5hmC in MB-Genomen und eine starke inverse Korrelation zwischen 5hmC-Spiegeln und Prognose identifiziert. Wichtig ist, dass wir die Anreicherung einer MB-spezifischen 5hmC-Signatur bei NANOG identifiziert haben, einem wichtigen Transkriptionsfaktor, der an der Selbsterneuerung und Pluripotenz von ESCs beteiligt ist. NANOG wird in MBs überexprimiert, was die Differenzierung verhindert und die Stammhaftigkeit von Tumoren aufrechterhält [67]. Darüber hinaus waren die 5hmC-Signale in MBs im Vergleich zu normalen Geweben bei den MB-aktiven Enhancern der cis-wirkenden Transkriptionsaktivierungselemente höher, was darauf hindeutet, dass 5hmC eine kritische Rolle bei der Regulierung der MB-assoziierten Genexpression spielt. Wir identifizierten auch, dass Gewinn-von-5hmC-Regionen an der Aktivierung von Signalwegen der embryonalen Entwicklung wie dem Notch-Signalweg beteiligt sind. Die Aktivierung des Notch-Signalwegs induziert nicht nur die Expression von stammähnlichen Markern und das Zellwachstum in Tumoren, sondern verleiht auch Medikamentenresistenz durch Multidrug Resistance ABC (ATP-binding Kassette)-Transporter [68, 69]. Tatsächlich zeigt die Ähnlichkeit von 5hmC-Verstärkungsregionen mit fötalen 5hmC-Mustern, dass die 5hmC-Verstärkung eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung stammzellähnlicher Eigenschaften in MBs spielt.

Zehn-Elf-Translokations-(TET)-Enzyme (TET1, TET2 und TET3) sind α-Ketoglutarat-abhängige Dioxygenasen, die 5mC in 5hmC umwandeln [70, 71], und daher neigt ihre Expression dazu, stark mit 5hmC-Spiegeln zu korrelieren. Tatsächlich unterdrückt die Überexpression von TET2 in Melanomzellen die Tumorinitiation und -progression durch Erhöhung der 5hmC-Spiegel [72], und erhöhte 5hmC durch hochreguliertes TET1 rekrutiert den CHOIP-Methylosom-Komplex in der Nähe der an der Glioblastomogenese beteiligten Gene [73]. Überraschenderweise beobachteten wir in klinischen MB-Proben einen Gesamtverlust von 5hmC und erhöhte TET1 und TET2. Angesichts der häufigen Identifizierung von TET-Funktionsverlustmutationen zusammen mit globaler Hypomethylierung, regionaler Hypermethylierung bei Krebs und der redundanten Wirkungen von TET-Proteinen in Bezug auf die 5hmC-Bildung [74, 75], kann die abnormale Expression von TET-Proteinen nicht immer mit . korrelieren globale 5hmC-Pegel. Außerdem beim Überqueren Tet1 +/- Mäuse mit dem SmoA1 Mausmodell, das eine hohe Inzidenz spontaner MB-Entwicklung aufweist, fanden wir eine dramatische Abnahme der Tumorinzidenz und des Tumorausbruchs, während die Abschaffung von Tet2 die Tumorinzidenz und das Erkrankungsalter nicht veränderten. Darüber hinaus ist die shRNA- und chemisch vermittelte Herunterregulation von Tet1 förderte den Zelltod sowohl bei murinen als auch bei menschlichen Tumoren. Weitere Ermittlungen identifiziert Pdgfra und Pdgfrb als potenzielle nachgelagerte Ziele, die von TET1 und NANOG reguliert werden. Die Regulierungsregionen von Pdgfra und Pdgfrb sind nicht nur Bindungsstellen für TET1 und NANOG, sondern zeigen auch hohe 5hmC-Spiegel in MBs im Vergleich zu NCs. Darüber hinaus nahm ein TET1-Inhibitor signifikant ab Pdgfrs' Ausdruck. Obwohl zusätzliche Untersuchungen erforderlich sind, um festzustellen, ob TET1 ein echtes Onkoprotein bei der MB-Tumorentstehung ist und ob überexprimiertes TET2 mit TET1 kooperiert, um den globalen 5hmC-Spiegel während der MB-Tumorentstehung zu etablieren, zeigen unsere genetischen Studien, dass TET1 die MB-Tumorentstehung durch tumorspezifische 5hmC-Bildung entlang . moduliert mit NANOG. Darüber hinaus sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die Beziehung zwischen überexprimiertem TET1 und der tumorspezifischen 5hmC-Signatur zu zeigen.


EINLEITUNG

DNA-Klonierung erfolgt traditionell durch Verdauen eines Quellplasmids oder DNA-Fragments und eines Empfängervektors mit Restriktionsenzymen, Extrahieren der verdauten Fragmente aus einem Gel und Ligieren der gereinigten Fragmente unter Verwendung von DNA-Ligase (siehe Aktuelle Protokolle Artikel Struhl, 1991). Dieser Ansatz ist zum Ligieren eines oder zweier DNA-Fragmente in einem Vektor geeignet, funktioniert jedoch nicht gut zum Ligieren mehrerer Fragmente in einem Vektor in einem einzigen Schritt. Glücklicherweise sind neue Klonierungsmethoden verfügbar, die den Zusammenbau mehrerer Fragmente in einem Vektor in einem einzigen Schritt ermöglichen, einschließlich homologiebasierter Klonierungsmethoden (z Hinweis auf das Klonen von Gateways, aber auch als Wortspiel mit dem Namen der Brücke). Golden Gate wird unter Verwendung einer Restriktionsligationsreaktion in einem Thermocycler durchgeführt. Parameter zum Einrichten und Durchführen einer Standard-Golden-Gate-Assembly-Reaktion sind in Basic Protocol 1 beschrieben und in 1 skizziert. Die Golden Gate-Klonierung erfordert, dass der Vektor und die Inserts eine spezifische Struktur in Bezug auf das Vorhandensein oder Fehlen spezifischer Restriktionsstellen aufweisen. Ein Verfahren zur Umwandlung eines regulären Klonierungsvektors in einen Golden Gate-kompatiblen Klonierungsvektor wird in Basisprotokoll 2 bereitgestellt. Ein Beispiel für die Aufnahme eines Inserts in die Golden Gate-Klonierung wird in Basisprotokoll 3 bereitgestellt, das erklärt, wie Primer für die Amplifikation und Klonierung entworfen werden eines interessierenden Gens in einen Golden Gate-Vektor.

Die Erzeugung definierter Transkriptionseinheiten und der anschließende Zusammenbau von Transkriptionseinheiten zu Multigenkonstrukten unter Verwendung traditioneller Klonierungsverfahren ist keine einfache Aufgabe. Dies liegt nicht nur am DNA-Assembly selbst, sondern auch an der Schwierigkeit, Klonierungsstrategien für große Konstrukte zu entwerfen. Ein Grund für diese Einschränkung besteht darin, dass Erkennungsstellen für die bei jedem Klonierungsschritt verwendeten Restriktionsenzyme normalerweise nach der Ligation in den Konstrukten noch vorhanden sind. Daher müssen für jeden nachfolgenden Schritt unterschiedliche Restriktionsenzyme verwendet werden, was die Planung einer Klonierungsstrategie bei der Arbeit mit einer großen Anzahl von Genen äußerst schwierig oder unmöglich macht. Eine Lösung für dieses Problem bietet die Standardisierung der Teile und der Montagestrategie, kombiniert mit der Verwendung von Golden Gate-Klonierung für die DNA-Assemblierung bei jedem Klonierungsschritt. Diese Strategie wird von dem modularen Klonierungssystem MoClo verwendet (Engler et al., 2014 Weber, Engler, Gruetzner, Werner, & Marillonnet, 2011 Werner, Engler, Weber, Gruetzner & Marillonnet, 2012). Das MoClo-System basiert auf der Verwendung von Standardteilen, die durch PCR hergestellt, in ein Vektorrückgrat kloniert und sequenziert werden. Standardteile enthalten die DNA-Sequenz eines grundlegenden genetischen Elements, beispielsweise eines Promotors, einer kodierenden Sequenz oder eines Terminators. Das Basisprotokoll 4 stellt ein Verfahren zum Klonen von Teilen von PCR-Produkten in einem einzigen Schritt bereit ( 1 ), und ein alternatives Protokoll stellt ein Verfahren zum Klonen größerer Teile in zwei aufeinanderfolgenden Schritten bereit. Die standardisierte Struktur der Teile ermöglicht die Wiederverwendung in vielen verschiedenen Konstrukten ohne die Notwendigkeit einer PCR-Amplifikation. Es ermöglicht auch die Standardisierung des Montagevorgangs. Multigen-Konstrukte werden aus Basisteilen in einer Reihe von Eintopf-Montageschritten zusammengesetzt. Die Klonierungsstrategie und die verschiedenen Klonierungsschritte, die mit dem MoClo-System verwendet werden, sind im Basisprotokoll 5 beschrieben.

1: DURCHFÜHREN EINER TYPISCHEN GOLDEN GATE-KLONIERUNGSREAKTION

Das Prinzip der Golden Gate Klonierung besteht darin, ein Restriktionsenzym vom Typ IIS und Ligase in einer Restriktionsligation zu verwenden, um in einem einzigen Schritt mehrere DNA-Fragmente in einer definierten linearen Reihenfolge in einem Vektor zusammenzusetzen (Fig. 2A). Restriktionsenzyme vom Typ IIS spalten DNA außerhalb ihrer DNA-Erkennungsstellensequenz. Zum Beispiel die Restriktionsstelle von BsaI (GGTCTC N ↓N1n2n3n4) besteht aus einer DNA-Erkennungsstellensequenz (GGTCTC) und einer DNA-Spaltungsstelle (↓), die zu einem 4-nt-einzelsträngigen DNA-Überhang (N1n2n3n4) nach der Verdauung. Um für die Golden Gate-Klonierung geeignet zu sein, müssen alle DNA-Fragmente von Restriktionsschnittstellen für ein Restriktionsenzym vom Typ IIS flankiert werden, mit einer nach innen gerichteten Orientierung, so dass die DNA-Erkennungsstellensequenzen während des Verdauungsschritts von den DNA-Fragmenten abgespalten werden (Abb. 2B). . Der Zielvektor muss auch zwei Restriktionsstellen für das gleiche Enzym vom Typ IIS enthalten, jedoch mit einer nach außen gerichteten Orientierung, so dass die DNA-Erkennungsstellen ebenfalls durch den Verdauschritt vom Vektor abgespalten werden. Schließlich müssen alle einzelsträngigen 4-nt-Überhänge (auch Fusionsstellen genannt) an den Enden der DNA-Fragmente und des Vektors einzigartig und komplementär sein, um eine Anlagerung an das Ende des nächsten Fragments oder des Vektors zu ermöglichen. Da das erwartete zirkuläre rekombinante DNA-Molekül keine Restriktionsstellen für das verwendete Enzym enthält, kann es nicht erneut verdaut werden, wodurch Restriktion und Ligation im gleichen Reaktionsgemisch durchgeführt werden können. Dadurch können DNA-Fragmente, die in ihr ursprüngliches Plasmidrückgrat zurückligiert wurden, weiteren Verdau- und Ligationszyklen unterzogen werden, bis sie schließlich in das gewünschte rekombinante Produkt eingebaut werden (Fig. 2C). Dies ist nützlich für die Übertragung eines Fragments von einem Vektor zum nächsten, wird jedoch immer wichtiger, wenn mehrere Fragmente in einem einzigen Schritt kloniert werden müssen. Dies liegt daran, dass die Zahl der möglichen Ligationsereignisse exponentiell mit der Zahl der Plasmide im Ligationsgemisch ansteigt, während die Chance, in einem einzigen Schritt ein korrekt ligiertes Produkt zu erhalten, immer unwahrscheinlicher wird (Fig. 2D). Die Restriktionsligation führt zu einer hohen Klonierungseffizienz und ermöglicht die Ligierung von bis zu 24 Fragmenten in einer einzigen Klonierungsreaktion (Potapov et al., 2018).

Die verwendeten DNA-Fragmente können lineare Fragmente sein, die durch PCR erhalten wurden, aber auch Sequenzen, die in ein zirkuläres Plasmid kloniert wurden. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Golden Gate-Klonierungsreaktion durchgeführt wird, wenn sowohl DNA-Teile als auch der Zielvektor als Plasmide verfügbar sind.

Materialien

  • Gereinigte Plasmid-DNA:
    • Golden Gate-Zielvektor (siehe Basic Protocol 2 oder erhältlich von Addgene oder anderen Forschern)
    • Inserts (Plasmid-DNA)
    • 10 U/µl BsaI (New England Biolabs, Kat.-Nr. R0535L)
    • 10 U/µl BpiI (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. ER1012)
    • 10 U/µl BsmBI (New England Biolabs, Kat.-Nr. R0580s)
    • Spektralphotometer (z. B. Nanodrop 1000, Peqlab)
    • 0,2-ml-PCR-Platten (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. AB0600)
    • Klebende PCR-Plattensiegel (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. AB0588)
    • Thermocycler (z. B. C1000 Touch, BioRad)
    • 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen
    • 37° und 42°C Blockinkubator (z. B. Eppendorf ThermoMixer)
    • 37°C Inkubator und Schüttelinkubator
    • Kulturflaschen oder Röhrchen
    • DNA-Analysesoftware (z. B. Vector NTI, Thermo Fisher Scientific)

    HINWEIS: Enzyme vom Typ IIS, die bei der Spaltung einen 3-nt-Überhang erzeugen, wie z LguI (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. ER1931) kann ebenfalls verwendet werden.

    Restriktionsligation durchführen

    1. Messen Sie die DNA-Konzentration von Insert- und Vektorplasmiden mit einem Spektrophotometer.

    2. Geben Sie gleiche Mengen jedes Inserts und Vektors zum Reaktionsgemisch. Verwenden Sie 20 fmol jedes Plasmids in einem Gesamtreaktionsvolumen von 15 oder 25 µl wie folgt:

    • x1 µl Vektor-DNA
    • x2 µl-Einsatz 1
    • x3 µl Einsatz 2
    • x4 µl-Einsatz 3
    • 1,0 µl T4-DNA-Ligase
    • 0,5 µl Typ IIS Enzym
    • 1,5 µl 10× Ligationspuffer
    • h20 bis 15 µl
    • x1 µl Vektor
    • x2 µl-Einsatz 1
    • x3 µl Einsatz 2
    • … …
    • xn µl-Einsatz n
    • 1,5 µl T4-DNA-Ligase
    • 1,0 µl Typ IIS Enzym
    • 2,5 µl 10× Ligationspuffer
    • h20 bis 25 µl

    Das Volumen jedes DNA-Plasmids wird durch die Formel berechnet: 20 (fmol) × Größe (bp)/Konzentration (ng/ul)/1520. Wenn das berechnete Volumen für ein genaues Pipettieren zu gering ist (<0,3 µl), sollte das Plasmid 10-fach in Wasser verdünnt und ein 10-fach größeres Volumen aus dieser Verdünnung hinzugefügt werden.

    3. Inkubieren Sie die Mischung in einem Thermocycler unter den folgenden Bedingungen:

    • 50 Zyklen: 37°C für 2 min, 16°C für 5 min
    • 50 °C für 5 Minuten
    • 80°C für 10 Minuten
    • 16°C

    Wenn BsaI verwendet wird, wird der letzte 5-minütige Verdauschritt bei 50 °C durchgeführt, da BsaI sowohl bei 37 °C als auch bei 50 °C verdaut werden kann. Im Gegensatz dazu wird bei Verwendung von BpiI der letzte Verdauungsschritt immer noch bei 37 °C durchgeführt, da dies die optimale Verdauungstemperatur für dieses Enzym ist.

    Produkt in E. coli . umwandeln

    4. Den gesamten Ligationsmix (15 oder 25 µl) zu 50 µl kompetenten E coli Zellen und inkubieren auf Eis für 30 min.

    5. Hitzeschock bei 42 °C für 90 s. Lassen Sie die Zellen 2 min auf Eis erholen.

    6. Fügen Sie 500 µl LB- oder SOC-Medium hinzu und schütteln Sie die Zellen 45 Minuten lang bei 37 °C in einem ThermoMixer.

    7. Auf LB-Platten ausplattieren, die das entsprechende Antibiotikum und X-gal enthalten. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.

    Für Klonierungsreaktionen mit ein bis drei Einsätzen 10-20 µl plattieren. Platten mit größeren Volumina für eine steigende Anzahl von Inserts, da die Anzahl der erhaltenen Kolonien geringer ist. Zum Beispiel 50 ul oder mehr für Konstrukte, die aus mehr als drei Fragmenten bestehen, ausplattieren.

    Wähle Kolonien und bewerte Klone

    8. Wählen Sie einzelne Kolonien und beimpfen Sie 5 ml LB-Medium. Inkubation über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelinkubator.

    Golden-Gate-Klonierungsvektoren enthalten normalerweise ein LacZ-Fragment für das Blau-Weiß-Screening (manchmal wird ein Carotinoid-Biosynthese-Operon als Marker für das Rot-Weiß-Screening verwendet). Weiße Kolonien werden gepflückt. Für Klonierungsreaktionen, die keine PCR zur Präparation der Fragmente erforderten, ist es im Allgemeinen ausreichend, zwei Kolonien zu pflücken. Für Klonierungsreaktionen aus durch PCR amplifizierten Fragmenten können mehr als zwei Klone erforderlich sein, um einen zu finden, der keine PCR-induzierten Mutationen enthält.

    9. Bereiten Sie die DNA mit einem Miniprep-Kit vor, indem Sie in einem Volumen von 50 μl eluieren.

    10. Verdauen Sie 1 µl Eluat in einer 10-µl-Reaktion mit einem geeigneten Enzym (oft Bsaich oder BpiI bei Verwendung des MoClo-Systems siehe Basisprotokoll 4), um den korrekten Zusammenbau durch DNA-Fingerabdruck zu bestätigen.

    11. Falls die PCR-Amplifikation zur Herstellung der DNA-Fragmente verwendet wurde, sequenzieren Sie das Plasmid.

    2: UNTERBRINGUNG EINES VEKTORS ZUM KLONEN VON GOLDEN GATE

    Die Golden-Gate-Klonierung erfordert, dass die DNA-Fragmente und der Empfängervektor spezifischen Anforderungen entsprechen, wie z Vektor. Viele für das Golden Gate Klonen geeignete Vektoren sind von mehreren Forschungsgruppen erhältlich, und die Zahl der verfügbaren Vektoren wird wahrscheinlich in Zukunft zunehmen. Dennoch ist die Umwandlung eines Standard-Klonierungsvektors in einen Golden Gate-Klonierungsvektor manchmal für die spezifischen Bedürfnisse eines Benutzers erforderlich. Es gibt viele Strategien, dies zu tun, einschließlich der Verwendung von Gibson-DNA-Assembly oder Golden Gate-Klonen.

    Hier wird ein Beispiel zum Konvertieren des pET-28b (+)-Vektors zur Verwendung beim Golden Gate-Klonieren bereitgestellt. In diesem Beispiel ist a LacZ Alpha-Fragment, flankiert von zwei BsaI-Stellen werden in den Vektor eingefügt und ersetzen die Multiklonierungsstelle (Fig. 3A). Die LacZ Fragment wird später für das Blau-Weiß-Screening verwendet. Hier sind die beiden Fusionsstellen, die die LacZ Fragment sind AATG und GCTT, entsprechend dem MoClo-Standard zum Klonen von kodierenden Sequenzen (siehe Basic Protocol 4). Sie können jedoch beliebige andere Sequenzen sein, die ein Benutzer möglicherweise wünscht, solange sie sich voneinander unterscheiden und nicht palindrom sind. Tatsächlich können Überhänge, die aus palindromischen Sequenzen bestehen, an denselben Überhang einer zusätzlichen Kopie desselben Fragments in der anderen Orientierung anlagern, was zu stabilen Ligationsprodukten führt, die dennoch falsch sind und zu einer signifikanten Verringerung der Klonierungseffizienz führen. In dem hier bereitgestellten Beispiel entspricht das ATG, das Teil der ersten Fusionsstelle ist, einem Methionin-Startcodon, das im Leseraster mit einem His-Tag kloniert ist, das in den stromaufwärts gelegenen Vektorsequenzen vorhanden ist. Der Vektor und der LacZ Fragmente werden durch PCR erhalten, und der Zusammenbau erfolgt unter Verwendung eines zweiten Enzyms vom Typ IIS, BpiI. Da es vier sind BpiI-Stellen im Vektor werden sie unter Verwendung von Primern entfernt, die dazu bestimmt sind, Einzelnukleotid-Mutationen in die DNA-Erkennungssequenzen einzufügen.

    Zusätzliche Materialien (siehe auch Basisprotokoll 1 )

    • Genspezifische Primer von kommerziellen Anbietern (z. B. Eurofins Genomics)
    • Plasmid-Template zur Amplifikation von LacZ Kassette (z. B. pUC19, New England Biolabs, Kat.-Nr. N3041S)
    • Vektor-Plasmid-DNA (z. B. pET-28b (+), Novagen, Merck Millipore, Kat.-Nr. 69418)
    • High-Fidelity-PCR-Amplifikationskit (z. B. KOD Hot Start DNA Polymerase, Millipore Sigma, VWR, Kat.-Nr. 71086-3)
    • PCR-Fragment-Reinigungskit (z. B. NucleoSpin Gel und PCR Clean-up, Macherey Nagel, Kat.-Nr. 740609.250)

    1. Entwerfen Sie Primer zur Amplifikation LacZ Fragment.

    Die Positionen und Sequenzen der Primer für dieses Beispiel sind in Abbildung 3 dargestellt. Die ersten beiden Primer, Pr1 und Pr2, wurden entwickelt, um die zu amplifizieren LacZ Fragment von pUC19. pUC19 wird als Matrize ausgewählt, da es ein anderes Antibiotikaresistenzgen (Amp R ) als der Empfängervektor (Kan R ) aufweist. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, beim Screenen von Klonen nach der Transformation falsche Konstrukte durch Verschleppung des unverdauten Matrizenvektors zu erhalten. Das amplifizierte Fragment enthält eine funktionelle Einheit für die LacZ Marker für Blau-Weiß-Rasterung. Primer Pr1 und Pr2 haben BpiI-Restriktionsstellen (gaagac in Fig. 3B) mit 4-nt-Fusionsstellen, die den Sequenzen AATG bzw. GCTT entsprechen. Auf die Fusionsstellen in den beiden Primern folgt BsaI-Restriktionsstellen in entgegengesetzter Orientierung (umgekehrtes Komplement von ggtctc = gagacc in Fig. 3B). Die BsaI-Sites werden Teil des resultierenden Vektors und werden für das Golden Gate-Klonen verwendet, sobald der Vektor erstellt wurde.

    Der pET-28b-Vektor enthält vier BpiI Restriktionsstellen in internen Sequenzen, die durch Einzelnukleotid-Substitutionen entfernt werden müssen (ein Vorgang, der als Domestikation bezeichnet wird). Dazu werden acht Primer benötigt (Pr3 und Pr6-14). Stille Mutationen werden für Restriktionsstellen vorgenommen, die sich in kodierenden Sequenzen befinden (in diesem Fall der Lac I-Repressor, der zwei BpiI-Sites). Ein letztes Primerpaar (Pr4 und Pr5) wird hergestellt, um zu vermeiden, dass Fragmente, die größer als 2 kb sind, amplifizieren müssen, dieses Primerpaar ist optional. Primer Pr3-14 haben alle a BpiI-Stelle mit einer Fusionsstelle, die so ausgewählt wurde, dass sie mit der Fusionsstelle des Fragments kompatibel ist, an das es ligiert wird.

    Bei der Bestellung reicht es aus, eine möglichst geringe Menge (d. h. 0,01 µmol) mit minimaler Aufreinigung (salzfrei) zu erhalten.

    1. Richten Sie eine 50-μl-PCR-Reaktion mit dem Primerpaar Pr1-2 unter Verwendung von pUC19 als Vorlage ein.
    2. Richten Sie sechs 50-μl-Reaktionen mit Primerpaaren Pr3-4 bis Pr13-14 mit pET-28b (+) als Vorlage ein.

    3. Lassen Sie 5 µl von jeder Reaktion auf einem Gel laufen, um zu sehen, ob die PCR erfolgreich war.

    4. Reinigen Sie die verbleibenden 45 µl jeder Reaktion mit einem säulenbasierten Kit (d. h. Macherey Nagel NucleoSpin DNA Clean-up Kit).

    Dadurch wird das PCR-Produkt von verbleibender DNA-Polymerase und dNTPs sowie von Primer-Dimeren getrennt, die in den meisten PCR-Reaktionen auf verschiedenen Ebenen produziert werden.

    5. Quantifizieren Sie gereinigte PCR-Produkte mit einem Spektrometer wie einem Nanodrop.

    6. Führen Sie die Golden Gate Klonierungsreaktion (siehe Basisprotokoll 1) mit dem Enzym durch BpiI. Verwandeln Sie das Produkt in E coli (siehe Basisprotokoll 1) und blaue Kolonien auswählen.

    In diesem speziellen Beispiel sollten Transformanten auf LB ausplattiert werden, das Kanamycin und X-gal enthält. Richtige Kolonien sollten nicht weiß, sondern blau sein.

    7. Bereiten Sie DNA mit einem Miniprep-Kit vor.

    8. Verdauen Sie 1 µl mit BsaI in einer 10-µl-Reaktion.

    Für dieses spezielle Konstrukt werden zwei Fragmente von 5,3 kb und 506 bp erwartet.

    Die Sequenzierung des gesamten Plasmids mit Primern, die an verschiedenen Positionen innerhalb des Plasmids entworfen wurden, ist wünschenswert, da PCR zur Amplifikation des gesamten Vektors verwendet wurde. Da jedoch einige Regionen, die für die Replikation oder Expression des LacZ-Markers erforderlich sind, funktionell sein sollten, wenn das Plasmid repliziert und die Kolonien blau sind, muss möglicherweise nicht das gesamte Plasmid sequenziert werden. Zumindest alle Elemente, die später für die Expression des Gens benötigt werden, sollten sequenziert werden, einschließlich der Region, die sich vom T7-Promotor bis zum Terminator erstreckt. Die Sequenzierung der Region, die die beiden eingeführten BsaI-Stellen enthält, ist wesentlich, um sicherzustellen, dass die Sequenz der beiden Fusionsstellen wie erwartet ist.

    Der Klonierungsvektor kann nun für das Golden Gate Klonen verwendet werden.

    3: UNTERBRINGUNG EINES EINSATZES ZUM KLONEN VON GOLDEN GATE

    Dieses Protokoll erklärt, wie Primer entworfen werden, um eine Sequenz von Interesse für die Golden Gate-Klonierung aufzunehmen und dann die amplifizierten Fragmente in einen Golden Gate-Zielvektor zu klonen. Ein Beispiel wird für die Klonierung der kodierenden Sequenz von an . gegeben Arabidopsis thaliana Isoflavon-Reduktase, amplifiziert aus einem Arabidopsis cDNA-Matrize (Genbank-Zugang NM_106183).

    Zusätzliche Materialien (siehe auch Basisprotokolle 1 und 2)

    • cDNA oder DNA-Template für PCR (hier cDNA aus Arabidopsis)
    • Plasmid-DNA des Golden Gate-Zielvektors

    1. Entwerfen Sie stille Mutationen im offenen Leseraster der interessierenden Sequenz in silico unter Verwendung von Klonierungssoftware (z. B. Vector NTI).

    In diesem Beispiel enthält die kodierende Sequenz eins BsaI-Stelle (Abb. 4A). Es wird in silico durch eine Einzelnukleotid-Substitution entfernt, was zu einer stillen Mutation führt (in 4B rot dargestellt).

    2. Fügen Sie der kodierenden Sequenz zwei flankierende Fusionsstellen zur Kompatibilität mit dem Vektor hinzu.

    Fügen Sie in diesem Fall ein A vor dem Startcodon hinzu, um AATG zu erhalten, und fügen Sie GCTT nach dem Stoppcodon hinzu.

    Die hinzugefügte Sequenz ist in 4B rot dargestellt und Fusionsstellen sind blau dargestellt.

    3. Wählen Sie eine Fusionsstelle an der Mutationsstelle aus.

    Zwei PCR-Fragmente werden amplifiziert, eines auf jeder Seite der Mutation (I und FR in Fig. 4A) und dann über eine Fusionsstelle zusammengesetzt, die das mutierte Nukleotid überlappt oder nahe daran liegt. Die Fusionsstelle muss sich von den anderen Fusionsstellen (AATG und GCTT) unterscheiden und darf nicht palindrom sein. Es sollte mindestens ein G oder C (wenn möglich mehr) enthalten, da Stellen, die nur As oder Ts enthalten, möglicherweise weniger gut für die DNA-Assemblierung geeignet sind (Potapov et al., 2018). Wenn viele Fusionsstellen benötigt werden, kann das Programm Ligase Fidelity Viewer (New England Biolabs, http://ggtools.neb.com/viewset/run.cgi) verwendet werden, um die Eignung aller Stellen zu überprüfen. Im vorliegenden Beispiel wird eine einzelne Sequenz, GGAC, ausgewählt (in Fig. 4B gelb dargestellt).

    4. Entwerfen Sie Primer, die an allen Fusionsstellen beginnen. Wählen Sie zwei Primer in entgegengesetzter Orientierung für jede mutierte Stelle (in diesem Fall nur eine Stelle). Machen Sie die Primer lang genug, um eine geeignete Schmelztemperatur für die PCR-Amplifikation zu erhalten.

    5. Fügen Sie die Reihenfolge der hinzu BsaI Erkennungsstelle (tt ggtctc a) an den Anfang aller Primer.

    Die endgültige Liste der Primer ist in 4C gezeigt.

    6. Amplifizieren Sie die beiden PCR-Fragmente mit den entsprechenden Primerpaaren (Isof1-2 und Isof3-4 Abb. 4A) aus dem Arabidopsis cDNA-Template in einer 50-µl-Reaktion. Lassen Sie 5 µl auf einem Gel laufen, um zu überprüfen, ob das richtige Fragment amplifiziert wurde. Reinigen Sie die restlichen 45 µl mit einem säulenbasierten Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

    7. Aufbau und Durchführung der Montagereaktion wie beschrieben (siehe Basisprotokoll 1).

    Da dieses Beispiel eine einfache Klonierung mit nur zwei in den Vektor klonierten Fragmenten beschreibt, sollte eine einfache Inkubation bei 37 °C für 2 Stunden, 50 °C für 5 Minuten und 80 °C für 10 Minuten ausreichend sein.

    8. Verwandeln Sie den Ligationsmix in kompetente E coli, auf LB, das Kanamycin und X-gal enthält, ausplattieren und die resultierenden Kolonien durchmustern.

    Minipreps werden mit zwei Enzymen verdaut, deren Restriktionsschnittstellen das Insert flankieren, oder mit Enzymen, die Stellen im Vektor im Insert aufweisen. Da zur Klonierung PCR verwendet wurde, muss das klonierte Insert unter Verwendung von Primern für Sequenzen in dem das Insert flankierenden Vektor sequenziert werden.

    4: ERSTELLEN VON KLEINEN STANDARDISIERTEN TEILEN, DIE MIT HIERARCHICAL MODULAR CLONING (MoClo) UNTER VERWENDUNG VON LEVEL 0-VEKTOREN KOMPATIBEL SIND

    Der Zusammenbau von DNA-Fragmenten aus Plasmiden unter Verwendung der Golden Gate-Klonierung kann schnell und effizient erfolgen. Im Gegensatz dazu erfordert der Zusammenbau aus PCR-Produkten mehr Arbeit, da PCR-Produkte oft Primer-Dimere enthalten, die durch Fehl-Annealing von Primern während der PCR-Amplifikation gebildet werden. Da Primerdimere von denselben Typ-IIS-Restriktionsschnittstellen wie die PCR-Produkte flankiert werden, können sie kloniert werden, was zu falschen Konstrukten führt und die Klonierungseffizienz verringert (Fig. 5). Auch wenn keine Primer-Dimere hergestellt werden, müssen die klonierten Konstrukte sequenziert werden, um sicherzustellen, dass sie keine PCR-induzierten Mutationen enthalten. Daher ist es sehr sinnvoll, ein System zu haben, in dem klonierte und sequenzierte DNA-Teile in verschiedenen Konstrukten wiederverwendet werden können. Beispielsweise können Teile, die regulatorische Sequenzen wie Promotoren und Terminatoren enthalten, in vielen verschiedenen Konstrukten wiederverwendet werden.

    Das modulare Klonierungssystem MoClo wurde entwickelt, um die Wiederverwendung geklonter Teile in verschiedenen Konstrukten zu erleichtern (Abb. 6). Es basiert auf der Verwendung von Basisteilen, die mithilfe des Golden Gate-Klonens zusammengestellt werden. Die Basisteile werden als Level 0 Module kloniert und in Level 1 Klonierungsvektoren zu Transkriptionseinheiten zusammengesetzt. Die Level-1-Konstrukte werden dann zusammengesetzt, um Multigen-Konstrukte der Level M und P herzustellen. Basisteile enthalten die kodierende Sequenz eines genetischen Grundelements, flankiert von zwei BsaI-Restriktionsstellen in entgegengesetzter Orientierung (Fig. 7). Das Klonen der Basisteile erfordert eine Amplifikation von DNA oder cDNA als Matrize. Das amplifizierte Produkt wird unter Verwendung der Golden Gate-Klonierung in einen Empfängervektor kloniert. Die Klonierungsschritte bestehen aus der Definition des Teiletyps, Design-Primern mit BsaI Restriktionsstellen an den Enden der Fragmente, Entfernen von Stellen aus internen Sequenzen und Klonieren der amplifizierten Fragmente in einen Vektor.

    Zusätzliche Materialien (siehe auch Basisprotokolle 1 und 2)

    • cDNA oder DNA-Template für PCR (hier cDNA aus Arabidopsis)
    • Universeller Klonierungsvektor pAGM9121 der Stufe 0 (Addgene, Plasmid #51833)

    1. Definieren Sie den Typ des Moduls der Ebene 0 (Teil).

    Teile können aus Promotoren, kodierenden Sequenzen mit oder ohne Stoppcodon, C- oder N-terminalen Fusions-Tags und Terminatoren bestehen (Fig. 7A). Jeder Teil wird von zwei flankiert BsaI-Stellen in entgegengesetzter Orientierung (Fig. 7B). Die 4-bp-Sequenzen der BsaI-Spaltungsstellen (Fusionsstellen) sind für jeden Modultyp spezifisch und definieren, welche Teile miteinander verschmolzen werden können. Beispielsweise kann ein Promotormodul mit TACT als 3'-Fusionsstelle (Pro in Fig. 7A) nur an eine untranslatierte Leadersequenz mit derselben Fusionsstelle am 5'-Ende (5UTR2 in Fig. 7A) fusioniert werden. Für jeden Teiltyp steht ein spezifischer Klonierungsvektor mit kompatiblen Fusionsstellen zur Verfügung. Alternativ können alle Teiltypen in den universellen Klonierungsvektor pAGM9121 der Stufe 0 (Fig. 7D und 8) wie in diesem Protokoll beschrieben kloniert werden. Module der Stufe 0 können auch aus mehreren Basisteilen zusammengesetzt sein. Beispielsweise können Konstrukte, die eine vollständige Transkriptionseinheit enthalten, direkt als Level 0 Module zwischen den Fusionsstellen GGAG und CGCT kloniert werden. Andere Arten von genetischen Elementen, wie beispielsweise eine Phagen-Rekombinationsstelle oder eine Matrix-Anheftungsregion, können auch als Module der Ebene 0 zwischen den Fusionsstellen GGAG und CGCT kloniert werden.

    2. Führen Sie stille Mutationen in die Gensequenz ein in silico.

    Basisteile sollten keine Restriktionsschnittstellen für Enzyme vom Typ IIS enthalten, die mit dem MoClo-System verwendet werden (BsaICH, Bpiich und optional BsmBI). Restriktionsstellen werden durch Einführung von Einzelnukleotid-Mutationen entfernt, was zuerst durchgeführt wird in silico. Die Entfernung interner Stellen in kodierenden Sequenzen kann immer mit einer stillen Mutation erfolgen. Die Entfernung von Sequenzen in Promotorregionen ist schwieriger, da für die Promotorfunktion wichtige Sequenzen nicht immer bekannt sind. Daher wird es nach der Domestikation von Promotorsequenzen notwendig sein, im Wirtsorganismus experimentell zu validieren, dass der Promotor noch wie beabsichtigt funktioniert. Domestizierung der Arabidopsis Als Beispiel wird hier das UGT78D2-Gen (GenBank Accession NM_121711) vorgestellt. Dieses Gen enthält einen BsaIch Website, zwei BpiIch Websites, und eine BsmBI-Stelle (Fig. 9A), die durch Einführung von vier stillen Mutationen (rot in Fig. 10) entfernt werden.

    3. Fügen Sie die beiden Standard-Fusionsstellen hinzu, die das Teil flankieren.

    Da dieses Modul eine kodierende Sequenz mit einem Stopcodon (CDS1) ist, wird ein A vor dem Startcodon hinzugefügt, um AATG zu ergeben, und die Sequenz GCTT wird nach dem Stopcodon hinzugefügt (beide Fusionsstellen sind in Abb. 10 blau hervorgehoben). .

    4. Fügen Sie Sequenzen zur Kompatibilität mit dem universellen Klonierungsvektor hinzu.

    In diesem Beispiel wird der Teil in den universellen Klonierungsvektor pAGM9121 der Stufe 0 kloniert. Daher werden CTCA und CGAG am Anfang und am Ende des Fragments hinzugefügt, um die notwendige Kompatibilität bereitzustellen (in Abb. 10 grün hervorgehoben). Diese Sequenzen werden Teil der BsaI Restriktionsschnittstellen, die das letzte Modul der Ebene 0 flankieren.

    5. Wählen Sie die nicht standardmäßigen Fusionsstellen aus, die für die PCR-Fragment-Assemblierung verwendet werden.

    Dies sind die 4-nt-Sequenzen, die verwendet werden, um die PCR-Produkte während der Klonierung zusammenzusetzen. Sie müssen sich voneinander und von den Fusionsstellen unterscheiden, die im Vektor verwendet werden (CTCA und CTCG für den universellen Klonierungsvektor oder AATG und GCTT für den CDS1-spezifischen Klonierungsvektor). Sie müssen sich auch von dem reversen Komplement einer der ausgewählten Fusionsstellen unterscheiden, um eine unangemessene Fragmentligation zu vermeiden. Die ausgewählten Sequenzen sind in Abbildung 10 gelb markiert.

    6. Entwerfen Sie Primer, beginnend an allen Fusionsstellen, Standard und Nichtstandard.

    Für Fusionsstellen an Stellen, die mutiert sind, um Restriktionsstellen zu entfernen, werden Primer in beiden Orientierungen entworfen. Die Grundierungen sollten lang genug sein, um eine geeignete Schmelztemperatur zu haben. Dies kann mit einem der vielen online verfügbaren Programme berechnet oder manuell durchgeführt werden.

    7. Fügen Sie die Enzymerkennungssequenz vom Typ IIS hinzu.

    Weil BpiI wird für die Montage verwendet, die Sequenz tt gaagac aa wird allen Primern zugesetzt. Primersequenzen und -orte sind in Abbildung 9 dargestellt.

    8. PCR amplifizieren die Fragmente.

    Amplifizieren Sie fünf Fragmente von Arabidopsis cDNA in separaten 50-µl-Reaktionen unter Verwendung der Primerpaare Gtpr1-2 bis Gtpr9-10 und einer Korrekturlese-Polymerase. Lassen Sie 5 µl auf einem Gel laufen, um zu überprüfen, ob jedes Fragment wie erwartet amplifiziert wurde.

    9. Reinigen Sie die Fragmente in einer Säule.

    Die amplifizierten Fragmente müssen gereinigt werden, um verbleibende Polymerase, Primer und dNTPs sowie die meisten der Primer-Dimere, die häufig in der Reaktion vorhanden sind, zu entfernen. Wenn ein einzelnes Fragment amplifiziert wurde, ist die Verwendung eines DNA-Reinigungskits (z. B. Macherey Nagel DNA-Reinigungskit) ausreichend. Eine Gelextraktion der PCR-Fragmente der richtigen Größe kann erforderlich sein, wenn mehrere DNA-Fragmente amplifiziert wurden.

    10. Klonen im universellen Level 0 Vektor pAGM9121 wie beschrieben einrichten (siehe Basisprotokoll 1).

    11. Transformiere in E coli und wähle zwei weiße Kolonien. Weitere Kolonien können später gepickt werden, wenn die Sequenzierung dieser Klone nicht die richtige Sequenz zeigt.

    12. Screenen Sie Kolonien durch Verdauen von Miniprep-DNA mit BsaICH.

    13. Sequenzieren Sie die Klone unter Verwendung der Vektorprimer lev0seqf und lev0seqr (Fig. 9B).

    : ERZEUGUNG GROSSER STANDARDISIERTER TEILE KOMPATIBEL MIT HIERARCHICAL MODULAR CLONING (MoClo) MIT LEVEL –1 VEKTOREN

    Während kleine Teile (< 1,2 kb) unter Verwendung von Standardprimern, die sich in flankierenden Vektorsequenzen befinden, sequenziert werden können, können große Teile nicht vollständig von Vektorprimern sequenziert werden. Zusätzliche Sequenzierungsprimer müssen innerhalb des Teils entworfen werden, um seinen mittleren Abschnitt zu sequenzieren. Um die Sequenzierung zu erleichtern, ohne dass benutzerdefinierte Sequenzierungsprimer für jeden Teil erforderlich sind, besteht eine alternative Strategie darin, Teilfragmente (Unterteile), die nicht länger als 1-1,2 kb sind, zu klonieren, die Unterteile mit Vektorprimern zu sequenzieren und dann zusammenzusetzen die sequenzierten Unterteile unter Verwendung einer zweiten Montagereaktion, um das endgültige Modul der Ebene 0 zu bilden (Abb. 11). Unterteile werden in einen universellen Klonierungsvektor der Ebene –1 (pAGM1311, Fig. 12) kloniert.

    Zusätzliche Materialien (siehe auch Basisprotokoll 4 )

    1. Definieren Sie den Teiltyp, führen Sie stille Mutationen ein, fügen Sie die Standardfusionsstellen hinzu und fügen Sie Sequenzen für die Kompatibilität mit dem universellen Klonierungsvektor wie beschrieben hinzu (siehe Basisprotokoll 4, Schritte 1-4).

    2. Wählen Sie die nicht standardmäßigen Fusionsstellen aus, die für die PCR-Fragmentmontage verwendet werden.

    Dies sind die 4-nt-Sequenzen, die verwendet werden, um die PCR-Produkte während der Klonierung zusammenzusetzen. Sie müssen sich voneinander und von den Fusionsstellen unterscheiden, die im Vektor verwendet werden (in diesem Fall ACAT und TTGT für den universellen Vektor der Ebene –1 siehe Schritt 5 unten). Sie müssen sich auch von dem reversen Komplement einer der ausgewählten Fusionsstellen unterscheiden, um eine unangemessene Fragmentligation zu vermeiden. Die ausgewählten Sequenzen sind die gleichen wie in Basic Protocol 4 (in Abb. 10 gelb hervorgehoben).

    3. Entwerfen Sie Primer, beginnend an allen Fusionsstellen, Standard und Nichtstandard, wie beschrieben (siehe Basisprotokoll 4, Schritt 6).

    4. Fügen Sie die Enzymerkennungssequenz vom Typ IIS hinzu.

    Für das Klonen in Vektoren der Ebene –1, BsaI wird für die Assemblierung verwendet, und damit die Sequenz tt ggtctc a wird an das 5'-Ende aller Primer angehängt.

    5. Fügen Sie Sequenzen für die Kompatibilität mit dem universellen Klonierungsvektor der Stufe –1 hinzu.

    Die beiden Fusionsstellen des universellen Klonierungsvektors sind ACAT und TTGT, und sie enthalten einen Teil von a BpiI-Restriktionsstelle, die den Unterteil nach der Klonierung flankiert (Fig. 12). Daher müssen die Sequenzen ACAT und ACAA (reverses Komplement von TTGT) zu den beiden Primern hinzugefügt werden, die die Gruppe von PCR-Fragmenten begrenzen, die zusammen kloniert werden. Diese Sequenzen werden sofort 3′ der . hinzugefügt BsaI-Stelle und vor der universellen Vektorfusionsstelle der Ebene 0 (CTCA oder CTCG). In diesem Beispiel werden die ersten drei PCR-Produkte zusammen in den universellen Level –1 Vektor pAGM1311 kloniert und das vierte und fünfte Produkt werden auch in pAGM1311 zusammen kloniert. Primersequenzen und -orte für das erste Level-1-Konstrukt (Gtpr1′ bis 6′) und das zweite Level-1-Konstrukt (Gtpr7′ bis 10′) sind in Abbildung 11 gezeigt.

    6. PCR-Amplifikation der Fragmente (siehe Basic Protocol 4, Schritt 8) unter Verwendung der entsprechenden Primerpaare (Gtpr1′-2′ bis Gtpr9′-10′).

    7. Säulenreinigung der Fragmente (Basic Protocol 4, Schritt 9).

    8. Richten Sie zwei Golden-Gate-Klonierungsreaktionen wie beschrieben ein (siehe Basisprotokoll 1) unter Verwendung des universellen Vektors pAGM1311 der Stufe –1. Klonen Sie die ersten drei Produkte in einer Reaktion zusammen und die vierten und fünften Produkte in der zweiten Reaktion (Module der Ebene -1 in Abb.11A).

    9. Transformiere in E coli und wähle zwei weiße Kolonien. Weitere Kolonien können später gepickt werden, wenn die Sequenzierung dieser Klone nicht die richtige Sequenz liefert.

    10. Screenen Sie Kolonien durch Verdauen von Miniprep-DNA mit BpiICH.

    11. Sequenzieren von Klonen unter Verwendung der Vektorprimer Levm1seqF und Levm1seqR (Fig. 11B).

    12. Bauen Sie Module der Ebene 0 aus den Unterteilen der Ebene –1 zusammen. Richten Sie eine Golden-Gate-Klonierungsreaktion ein, um die beiden ausgewählten Klone der Stufe –1 im universellen Klonierungsvektor pAGM9121 der Stufe 0 (siehe Basisprotokoll 1) zusammenzusetzen.

    13. Transformiere in E coli Zellen.

    14. Screenen Sie Kolonien durch Verdauen von Miniprep-DNA mit BsaICH.

    Da keine PCR verwendet wurde, um diese Konstrukte herzustellen, ist eine Sequenzierung nicht erforderlich.

    5: ZUSAMMENBAUEN VON TRANSKRIPTIONSEINHEITEN UND MULTIGENEN KONSTRUKTEN MIT DEN EBENEN 1, M UND P MoClo-VEKTOREN

    Der Zusammenbau von Multigenkonstrukten unter Verwendung des MoClo-Systems erfolgt hierarchisch (Abb. 6). Der erste Schritt besteht darin, Teile der Ebene 0 in Zielvektoren der Ebene 1 zu assemblieren, um Konstrukte herzustellen, die normalerweise eine Transkriptionseinheit enthalten. Die zweite ist der Zusammenbau von Multigenkonstrukten, der in alternierenden Stufen unter Verwendung von Vektoren der Ebenen M und P erfolgt. Bis zu sechs Transkriptionseinheiten können in einem Level-M-Klonierungsvektor zusammengesetzt werden, um ein Level-M-Multigenkonstrukt herzustellen. Dann können bis zu sechs Level-M-Konstrukte weiter zu einem Level-P-Vektor zusammengesetzt werden, um ein Level-P-Konstrukt herzustellen, das bis zu 36 Transkriptionseinheiten enthält. Konstrukte der Ebene P können selbst weiter zu Vektoren der Ebene M zusammengesetzt werden, um noch größere Konstrukte herzustellen. Dieser Vorgang kann unbegrenzt wiederholt werden, bis die Konstrukte zu groß werden, um als Plasmide in kloniert zu werden E coli. Verwendung von Level-M- und P-Baugruppen BsaIch und Bpiich abwechselnd.

    Zusätzliche Materialien (siehe auch Basisprotokoll 1 )

    • Teile der Stufe 0
    • Level 1, M und P Zielvektoren aus dem MoClo Toolkit (Addgene, Kit #1000000044)

    Transkriptionseinheiten in Level-1-Vektoren zusammenbauen

    1. Wählen Sie Standardteile der Ebene 0 aus.

    Der erste Schritt zur Planung des Zusammenbaus eines Multigenkonstrukts besteht darin, alle für jede Transkriptionseinheit erforderlichen grundlegenden Teile zu identifizieren. Um beispielsweise ein Konstrukt herzustellen, das vier Transkriptionseinheiten enthält, die jeweils aus drei Teilen bestehen – einschließlich eines Promotors mit 5′-UTR (pro + 5U), einer kodierenden Sequenz (CDS1) und einer 3′-UTR mit Terminator (3U + Ter) – insgesamt sind zwölf Teile erforderlich.

    Eine Liste aller Teiletypen ist in Abbildung 7 dargestellt. Noch nicht vorhandene Teile werden wie beschrieben geklont (siehe Basisprotokoll 4). Einige sind bereits für Pflanzen erhältlich (MoClo Plant Parts Kit, Addgene, Kit #1000000047), Chlamydomonas (https://www.chlamycollection.org/product/moclo-toolkit/Crozet et al., 2018) und Cyanobakterien (http://www.addgene.org/browse/article/28196941/ Vasudevan et al., 2019 ).

    2. Wählen Sie die Zielvektoren der Ebene 1 aus.

    Vierzehn Vektoren der Ebene 1 stehen zur Verfügung: sieben zum Klonieren einer Transkriptionseinheit in Vorwärtsorientierung in sieben verschiedenen Positionen im endgültigen Konstrukt und sieben für die Rückwärtsorientierung ( 13A ). Alle enthalten zwei BsaI-Standorte und die Fusionsstandorte GGAG und CGCT, um die Kompatibilität mit Modulen der Stufe 0 zu gewährleisten. Sie enthalten auch zwei BpiI-Stellen für die Exzision der zusammengesetzten Transkriptionseinheit im nächsten Schritt des Zusammenbaus. Die BpiI-Fusionsstellen sind entworfen, um Kompatibilität von einem Vektor zum nächsten bereitzustellen. In einem Beispiel, bei dem vier Transkriptionseinheiten in Vorwärtsorientierung kloniert werden, werden Vektoren für die Positionen 1 bis 4 für die Vorwärtsorientierung (pL1F-1, pL1F-2, pL1F-3 und pL1F-4) ausgewählt.

    Die BpiDie I-Fusionsstelle am Ende von Vektor 7 (TGCC) ist die gleiche wie die Stelle am Anfang von Vektor 1, wodurch man mehr als sieben Gene in ein Multigenkonstrukt klonieren kann, indem man dieselben sieben Vektoren auf unbestimmte Zeit wiederverwendet. Somit wird eine achte Transkriptionseinheit unter Verwendung von Vektor 1 kloniert, eine neunte Transkriptionseinheit wird unter Verwendung von Vektor 2 kloniert, und so weiter ( 13C ).

    In dem Beispiel in Fig. 13C werden zwei Transkriptionseinheiten in umgekehrter Orientierung kloniert, und daher werden Vektoren zum Klonen in umgekehrter Orientierung ausgewählt. Die Wahl, ob eine Transkriptionseinheit in die eine oder andere Richtung geklont werden soll, wird allein durch die Benutzerbedürfnisse entschieden.

    3. Bauen Sie Level-1-Konstrukte zusammen.

    Die Konstrukte werden mithilfe von vier Golden Gate-Klonierungsreaktionen zusammengesetzt, von denen jede die drei ausgewählten Basisteile und den Vektor der Ebene 1 enthält. Ein Beispiel für die Klonierung der ersten Transkriptionseinheit ist in 14 gezeigt. Die Klonierungsreaktion wird wie beschrieben durchgeführt (siehe Basisprotokoll 1). Da Vektoren der Ebene 1 a . enthalten LacZ Fragment für das Blau-Weiß-Screening werden zwei weiße Kolonien gepickt. Da assemblierte Transkriptionseinheiten von flankiert werden BpiI-Sites, Miniprep-DNA wird überprüft von BpiIch verdaue.


    Muskelaufbau in der Bambussohle Heteromycteris japonicus mit besonderem Bezug auf Larvenkiemenlevatoren

    Muskelaufbau in der Bambussohle Heteromycteris japonicus untersucht, wobei der Schwerpunkt hauptsächlich auf der Schädelmuskulatur lag, wobei eine verbesserte immunhistochemische Whole-Mount-Färbungsmethode mit Kaliumhydroxid, Wasserstoffperoxid und Trypsin verwendet wurde. Larven von H. japonicus hatten Kiemenlevatoren, aber nicht alle von ihnen wurden bei Erwachsenen beibehalten, ein Zustand, der auch bei der japanischen Flunder beobachtet wurde Paralichthys olivaceus. Insbesondere verschwanden die Kiemenlevatoren II und III der Larven während der Entwicklung, während I und IV verblieben und zu den Levator Internus I und Levator posterior wurden, die bei Erwachsenen gut definierte Muskeln waren. Anstelle der atrophierten Muskulatur entwickelten und regulierten Levatores externi und Levator internus II die Kiemenbögen. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die Muskelzusammensetzung in den dorsalen Kiemenbögen vor der Metamorphose in die adulte Form veränderte H. japonicus, wie in ... gesehen P. olivaceus, und diese Transformation kann allen Mitgliedern dieser Gruppe gemeinsam sein.


    1.13: Transformation - Biologie

    Die Antwort ist, dass Liebe „bedingungslose Selbstlosigkeit“ ist, ABER das ist eine Wahrheit, die wir nicht sicher zugeben können, bis wir den MENSCHLICHEN ZUSTAND erklären konnten – erklären, WARUM unser menschliches Verhalten oft so konkurrenzfähig, egoistisch und aggressiv war, so scheinbar lieblos. Daraus folgt, dass das eigentliche Thema hinter der Frage „Was ist Liebe“ die Frage des menschlichen Daseins war.

    AM WUNDERBAREN jedoch ist die Biologie nun endlich in der Lage, die erträumte versöhnende, erlösende und damit psychologisch rehabilitierende, menschlich-rassentransformierende Erklärung unseres scheinbar lieblosen menschlichen Daseins zu liefern und uns so zu erlauben, sicher zuzugeben, dass Liebe bedingungslose Selbstlosigkeit ist. (Und es sollte erwähnt werden, dass diese Erklärung des zutiefst psychisch gestörten Zustands unserer Spezies nicht die psychosevermeidende, verharmlosende, unehrliche Darstellung des menschlichen Zustands ist, die der Biologe EO Wilson in seiner Theorie der Eusozialität aufgestellt hat, sondern die Psychose- adressieren-und-lösen, echte Erklärung dafür.)

    Bevor wir die so wichtige, psychologisch rehabilitierende, die Menschheit verändernde, echte Erklärung des menschlichen Zustands präsentieren, macht die folgende wissenschaftliche Antwort auf „was ist Liebe“ sehr deutlich, warum es – bis jetzt – nicht möglich war, es zuzugeben dass Liebe eigentlich bedingungslose Selbstlosigkeit ist.

    Die größten Physiker der Welt, Stephen Hawking und Albert Einstein, haben jeweils gesagt, dass „der überwältigende Eindruck von Ordnung ist … [im] Universum“ („The Time of His Life“, Gregory Benford, Sydney Morning Herald, 28. 2002 ) , und dass " hinter allem eine Ordnung steht " ( Einstein Revealed , PBS , 1997 ) . Ja, diese „Ordnung“ IST überall offensichtlich. Über die Äonen hinweg organisierte sich ein chaotisches Universum in Sterne, Planeten und Galaxien. Hier auf der Erde wurden Atome geordnet oder integriert, um Moleküle zu bilden → die wiederum zu Verbindungen integriert wurden → virusähnliche Organismen → einzellige Organismen → mehrzellige Organismen → und dann Gesellschaften mehrzelliger Organismen. Insgesamt geschieht auf der Erde, dass Materie zu größeren Ganzen geordnet wird. Das Thema, der Zweck oder der Sinn des Lebens ist also die Ordnung oder Integration oder Komplexifizierung der Materie, ein Prozess, der durch das physikalische Gesetz der negativen Entropie angetrieben wird. 'Holismus', den das Wörterbuch definiert als 'die Tendenz in der Natur, Ganzheiten zu bilden' ( Concise Oxford Dictionary , 5. Auflage, 1964 ) und 'Teleologie', die auf Seite 34 der PDF-Version definiert wird als 'der Glaube, dass Zweck und Design are a part of nature“ (Macquarie Dictionary, 3. Auflage, 1998), sind beides Begriffe, die diese integrative „Tendenz“ anerkennen.

    Ein wesentlicher Teil dieser integrativen Ordnung der Materie ist Selbstlosigkeit, denn damit ein größeres Ganzes gebildet und zusammengehalten werden kann, müssen die Teile dieses Ganzen das Wohlergehen des Ganzen über ihr eigenes Wohlergehen berücksichtigen – vereinfacht gesagt ist Egoismus spaltend oder desintegrativ, während Selbstlosigkeit integrativ ist . Betrachten Sie also andere über sich selbst, altruistisch, BEDINGUNGSLOSE SELBSTLOSIGKEIT ist das zugrunde liegende Thema der Existenz. Es ist der Klebstoff, der die Welt zusammenhält, und das ist es, was wir mit dem Begriff „Liebe“ meinen. In der Tat, wenn wir die religiöse Terminologie betrachten, war das alte christliche Wort für Liebe „caritas“, was Nächstenliebe oder Geben oder Selbstlosigkeit bedeutet, siehe Kol. 3:14, 1 Kor. 13:1-13, 10:24 und Johannes 15:13. Von diesen biblischen Hinweisen fasst Kolosser 3,14 die integrative Bedeutung der Liebe perfekt zusammen: „Und über alle diese Tugenden ziehe die Liebe an, die sie alle in vollkommener Einheit verbindet.“ In Johannes 15,13 sehen wir auch, dass Christus das Bedingungslose betonte selbstlose Bedeutung des Wortes 'Liebe', wenn er sagte: 'Niemand hat größere Liebe als diese, die sein Leben für seine Freunde hingibt.'

    Das große Problem bei der Anerkennung und Akzeptanz dieser Antwort auf „Was ist Liebe?“ besteht jedoch darin, dass sich die Menschen unerträglich als schlecht, böse oder unwürdig verurteilt fühlen, weil sie spalterisch, egoistisch und aggressiv sind – in der Tat, weil sie so rücksichtslos konkurrieren , egoistisch und brutal, dass das menschliche Leben fast unerträglich geworden ist und wir fast unseren eigenen Planeten zerstört haben! Weit davon entfernt, liebevoll und liebenswert zu sein, schienen wir lieblos und nicht liebenswert gewesen zu sein, weshalb wir erklären mussten, WARUM sich die Menschen nicht ideal verhalten haben – nicht weniger den menschlichen Zustand erklären, was wir glücklicherweise jetzt können – bevor es psychologisch sicher wäre zu konfrontieren, zuzugeben und zu akzeptieren, dass die Antwort auf „was ist der Sinn der Liebe“ darin besteht, integrativ und bedingungslos selbstlos zu sein. Tatsächlich ist das Konzept von „ Gott “ tatsächlich unsere Personifizierung der Wahrheit des integrativen, selbstlosen, liebevollen Sinns des Lebens, und wenn wir mehr von dem einbeziehen, was Hawking und Einstein gesagt haben, können wir sehen, dass sie beide übereinstimmen. Hawking: „Der überwältigende Eindruck ist Ordnung. Je mehr wir über das Universum erfahren, desto mehr stellen wir fest, dass es von rationalen Gesetzen regiert wird. Wenn man wollte, könnte man sagen, dieser Orden sei das Werk Gottes. Einstein dachte so… Wir könnten Ordnung mit dem Namen Gottes nennen“ („The Time of His Life“, Gregory Benford, Sydney Morning Herald, 28. April 2002) und „Ich würde den Begriff Gott als Verkörperung der Gesetze verwenden“ der Physik“ (Master of the Universe, BBC, 1989). Einstein: „Im Laufe der Zeit ist mir klar geworden, dass hinter allem eine Ordnung steckt, die wir nur indirekt erahnen [weil sie unerträglich konfrontierend/verurteilend ist!] . Das ist Religiosität. In diesem Sinne bin ich ein religiöser Mann“ (Einstein Revealed, PBS, 1997). Auf einer tieferen Ebene heißt es also, wie es in der Bibel heißt: „Gott ist Liebe“ (1. Johannes 4:8, 16).

    Auch hier bestand das Problem darin, dass wir es uns nicht leisten konnten, „Gott“ als integrative Bedeutung zu entmystifizieren und zuzugeben, dass Liebe bedingungslose Selbstlosigkeit ist, bis wir den menschlichen Zustand erklären konnten. Es ist daher nicht verwunderlich, dass wir Menschen, wie wir sagen, „gottesfürchtig“ waren – in der Tat Gott-verehrend bis hin zur Anbetung – nicht Gott-konfrontierend! Es überrascht nicht, dass auch die mechanistische Wissenschaft dieser Vermeidung der Frage „Was ist Liebe“ nachkommen musste, so sehr, dass sie keine Interpretation von „Liebe“ anbieten konnte, obwohl sie eine der am häufigsten verwendeten und geschätzten der Menschheit ist und sinnvolle Worte! Der Linguist Robin Allott fasste kurz und bündig die Ausreden zusammen, die traditionell vom wissenschaftlichen Establishment verwendet wurden, um die Frage zu vermeiden, was Liebe ist: „Liebe wurde als ein Tabuthema beschrieben, nicht ernst, nicht angemessen für Seite 35 von PDF-Version wissenschaftliche Studie“ („Evolutionary Aspects of Love and Empathy“, Journal of Social and Evolutionary Systems, 1992, Bd. 15, Nr. 4, S. 353-370). Tatsächlich war die Umgehung so groß, dass „mehr als 100.000 wissenschaftliche Studien über Depression und Schizophrenie (die negativen Aspekte der menschlichen Natur) veröffentlicht wurden, aber nicht mehr als ein Dutzend gute Studien über selbstlose Liebe“ ( Science & Theology News, Feb. 2004).

    Ja, das Konzept der „selbstlosen Liebe“ hat uns viel zu nahe an die Wahrheit gebracht, dass Liebe das integrative, bedingungslos selbstlose, „göttliche“ Thema oder der Sinn des Daseins ist! Wir mussten zuerst unseren sich nicht ideal verhaltenden menschlichen Zustand erklären, bevor wir uns damit auseinandersetzen konnten. Während also sicherlich viel über die Notwendigkeit gesprochen wurde, einander zu lieben und die Umwelt zu lieben, bestand das WIRKLICHE Bedürfnis und der wahre Grund auf der Erde darin, die Mittel zu finden, die dunkle Seite von uns selbst zu lieben, um Verständnis für diesen Aspekt unserer bilden. Der berühmte Psychoanalytiker Carl Jung hat immer gesagt, dass „Ganzheit für den Menschen von der Fähigkeit abhängt, seinen eigenen Schatten zu besitzen“, weil er erkannte, dass nur das Verständnis unserer dunklen, lieblosen Seite unsere zugrunde liegende Unsicherheit über unsere grundlegende Güte und unseren Wert als Menschen beenden könnte und , machen uns dabei 'ganz'. Der herausragende Philosoph Sir Laurens van der Post meinte dasselbe, als er sagte: „Wahre Liebe ist Liebe zum Schwierigen und Unliebenswerten“ (Reise in Russland, 1964, S. 145) und dass „Nur indem wir verstehen, wie wir waren“ alle Teil des gleichen zeitgenössischen Musters [von Kriegen, Grausamkeit, Gier und Gleichgültigkeit] könnten wir diese dunklen Mächte mit einem wahren Verständnis ihrer Natur und ihres Ursprungs besiegen“ (Jung und die Geschichte unserer Zeit, 1976, S. 24).

    Wahres Mitgefühl war letztendlich das einzige Mittel, mit dem Frieden und Liebe zu unserem Planeten gelangen konnten, aber es konnte nur durch Verständnis erreicht werden. Nochmals aus den Schriften von van der Post: „Mitgefühl hinterlässt eine unauslöschliche Blaupause der Anerkennung, die das Leben zwischen einem Individuum und einem anderen, einer Nation und einer anderen, einer Kultur und einer anderen so dringend braucht. Es gilt auch für den Weg, den unser Geist jetzt bauen sollte, um den historischen Abgrund zu überwinden, der uns noch von einer wahrhaft zeitgenössischen Vision des Lebens trennt, und für die Zunahme des Lebens und des Sinns, die uns in der Zukunft erwartet“ (ebd., S. 29). Ja, nur ein "wahres Verständnis der Natur und Herkunft" unserer von "Gut und Böse" heimgesuchten, sogar "gefallenen" oder korrumpierten Zustände könnte es uns ermöglichen, "den historischen Abgrund" zu überqueren, der "uns trennt". “ aus einer „mitfühlenden [at]“, versöhnten, verbesserten, „bedeutungsvollen“ Sicht auf uns selbst. Eines Tages musste es, um die Rolling Stones zu zitieren, „Sympathie für den Teufel“ geben – eines Tages mussten wir „wahres Verständnis“ für die „Natur und den Ursprung“ der „dunklen Kräfte“ in der menschlichen Natur finden. In der Tat war die große Hoffnung, der Glaube, das Vertrauen und tatsächlich der Glaube der Menschheit, dass eines Tages eine erlösende, rehabilitierende und damit umwandelnde Erklärung des menschlichen Daseins gefunden werden würde – was, zu der größten Erleichterung, nun endlich war! Ja, die „Zukunft“, auf die sich Jung und van der Post freuten, ein Verständnis für unser menschliches Wesen zu finden, ist endlich da! (Wiederum muss betont werden, dass diese Erklärung unseres zutiefst psychisch gestörten Zustands nicht die Psychose-vermeidende, trivialisierende, unehrliche Darstellung davon ist, die EO Wilson in seiner Theorie der Eusozialität vorgebracht hat, sondern die Psychose-Adressierung und -Lösung , wahrheitsgemäße, echte Erklärung davon.)

    Romantische Liebe : In Bezug auf andere Aspekte der Frage, was Liebe ist, insbesondere die romantische Liebe, den Traum, in einem bedingungslos liebevollen, vollständig integrierten Zustand mit einer anderen Person zu leben (wie wir sagen, wir „verlieben uns“, geben wir uns dem Traum hin einer menschenkonditionsfreien, idealen Beziehung), lesen Sie die Erläuterungen im frei verfügbaren Online-Buch FREEDOM .

    Seite 36 der PDF-Version Also, was ist die wunderbare, bahnbrechende, versöhnende, erlösende und damit psychologisch heilende, wahrheitsgetreue Erklärung unseres scheinbar lieblosen, vom menschlichen Zustand geplagten Verhaltens, das es endlich sicher macht, zuzugeben, dass Liebe bedingungslose Selbstlosigkeit ist?

    Sicherlich haben wir Ausreden erfunden, um das scheinbar lieblose, wettbewerbsorientierte, egoistische und aggressive Verhalten unserer Spezies zu rechtfertigen. Natürlich ist diese „Erklärung“, die in den biologischen Theorien des Sozialdarwinismus, der Soziobiologie, der Evolutionspsychologie, der Mehrebenenselektion und der E.O. Wilsons Eusozialität und argumentiert im Grunde, dass „Gene kompetitiv und egoistisch sind und deshalb sind wir es“, kann nicht die wahre Erklärung für unser wettbewerbsorientiertes, egoistisches und aggressives Verhalten sein. Erstens übersieht es die Tatsache, dass unser menschliches Verhalten unser einzigartiges, voll bewusstes Denken beinhaltet. Beschreibungen wie egozentrisch, arrogant, verblendet, künstlich, hasserfüllt, gemein, unmoralisch, entfremdet usw. implizieren alle eine vom Bewusstsein abgeleitete psychologische Dimension unseres Verhaltens. Das eigentliche Problem – das psychologische Problem in unserem denkenden Verstand, unter dem wir gelitten haben – ist das Dilemma unseres menschlichen Daseins, das Problem, dass unsere Spezies von „Gut und Böse“ betroffen, weniger als ideal, sogar „gefallen“ ist ' oder beschädigt, Zustand.Wir Menschen leiden an einem vom Bewusstsein abgeleiteten, psychologischen MENSCHLICHEN ZUSTAND, nicht an einem instinktgesteuerten Tierzustand – unser Zustand ist einzigartig für uns voll bewusste Menschen. (Eine kurze Beschreibung der Theorien des Sozialdarwinismus, der Soziobiologie, der Evolutionspsychologie, der Mehrebenenselektion und der Eusozialität, die unser spaltendes Verhalten eher auf wilde Instinkte als auf eine vom Bewusstsein abgeleitete Psychose beschuldigen, findet sich im Artikel Was ist Wissenschaft? in diesem Buch of Real Answers to Everything! , mit dem vollständigen Konto im frei verfügbaren Online-Buch Freedom: Expanded Book 1 .

    Der zweite Grund, warum die Entschuldigung der Wilden – Instinkte – in uns unmöglich die wahre Erklärung für unser spaltendes, selbstsüchtiges und aggressives Verhalten sein kann, ist, dass sie die Tatsache übersieht, dass wir Menschen altruistische, kooperative, liebevolle moralische Instinkte haben – was wir als unser „Gewissen“ – und diese moralischen Instinkte in uns stammen nicht aus der Gegenseitigkeit, aus Situationen, in denen Sie nur etwas für andere tun, um einen Nutzen daraus zu ziehen, wie Evolutionspsychologen uns glauben machen wollen. Und sie stammen auch nicht aus dem Krieg mit anderen Menschengruppen, wie es uns die Verfechter der Theorie der Eusozialität glauben machen wollen. Nein, wir haben ein bedingungslos selbstloses, völlig altruistisches, wirklich liebevolles, universell-rücksichtsvolles-gegenüber-andere-nicht-konkurrenzfähige-mit-anderen-Gruppen, ein wahrhaft moralisches Gewissen. Unser ursprünglicher instinktiver Zustand war das Gegenteil von Konkurrenz, Egoismus und Aggressivität: er war vollkommen kooperativ, selbstlos und liebevoll. (Wie wir Menschen bedingungslos selbstlose moralische Instinkte erworben haben, wenn es den Anschein hat, dass ein bedingungslos selbstloser, völlig altruistischer Charakterzug sich selbst auslöscht und sich daher niemals in einer Spezies etablieren kann, wird in dem oben erwähnten Was ist Wissenschaft kurz erklärt ?-Artikel und ausführlicher in Kapitel 5 von FREEDOM erklärt – hier wird jedoch darauf hingewiesen, dass die Entschuldigung für wilde Instinkte in uns völlig unvereinbar mit der Tatsache ist, dass wir echte und ausschließlich moralische Instinkte haben, KEINE wilden Instinkte. Charles Darwin erkannte den Unterschied in unserer moralischen Natur, als er sagte, dass „der moralische Sinn den besten und höchsten Unterschied zwischen dem Menschen und den niederen Tieren bietet“ (The Descent of Man, 1871, S. 495).

    Was ist also die wahrheitsgemäße, den menschlichen Zustand ansprechende biologische Erklärung für das gegenwärtig scheinbar höchst unvollkommene, wettbewerbsorientierte, egoistische und aggressive Verhalten unserer Spezies? Die Antwort beginnt mit einer Bewusstseinsanalyse.

    Seite 37 der PDF-Version Kurz gesagt, Nerven wurden ursprünglich für die Bewegungskoordination bei Tieren entwickelt, aber sobald sie entwickelt wurden, ermöglichte ihre Fähigkeit, Eindrücke zu speichern – was wir als „Gedächtnis“ bezeichnen – das Potenzial, Verständnis zu entwickeln von Ursache und Wirkung. Wenn Sie sich an vergangene Ereignisse erinnern können, können Sie diese mit aktuellen Ereignissen vergleichen und regelmäßig auftretende Erfahrungen identifizieren. Dieses Wissen oder die Einsicht in das, was in der Vergangenheit häufig passiert ist, ermöglicht es Ihnen, vorherzusagen, was in der Zukunft wahrscheinlich ist, und Ihr Verhalten entsprechend anzupassen. Sobald die Einsichten in die Art der Veränderung umgesetzt sind, beginnt das selbstmodifizierte Verhalten, Feedback zu geben und die Einsichten weiter zu verfeinern. Vorhersagen werden mit Ergebnissen verglichen usw. Die Nerven sind weit entwickelt und haben solche Verfeinerungen im menschlichen Gehirn stattgefunden. Sie können Informationen ausreichend assoziieren, um zu begründen, wie Erfahrungen zusammenhängen, lernen zu verstehen und werden sich der Beziehung zwischen Ereignissen, die im Laufe der Zeit auftreten, BEWUSST, bewusst oder intelligent. Bewusstsein bedeutet also, sich ausreichend bewusst zu sein, wie Erfahrungen zusammenhängen, um zu versuchen, Veränderungen auf der Grundlage des Verstehens zu bewältigen.

    Das Bedeutsame an diesem Prozess ist, dass unser bewusster Intellekt, sobald unser nervenbasiertes Lernsystem so weit entwickelt war, dass wir bewusst und in der Lage waren, Ereignisse effektiv zu bewältigen, in der Lage war, den Instinkten unseres genetischen Lernsystems die Kontrolle zu entreißen , die bis dahin unser Leben bestimmt hat. Im Grunde genommen war unser sich selbst anpassender Intellekt in der Lage, die Führung unseres Lebens von den instinktiven Orientierungen zu übernehmen, die wir durch die natürliche Selektion genetischer Merkmale erworben hatten, die uns an unsere Umwelt angepasst haben.

    JEDOCH brach zu diesem Zeitpunkt, als unser bewusster Intellekt unsere Instinkte nach Kontrolle herausforderte, ein schrecklicher Kampf zwischen unseren Instinkten und dem Intellekt aus, dessen Auswirkungen der extrem konkurrierende, egoistische und aggressive Zustand war, den wir den menschlichen Zustand nennen.

    Um genauer zu sagen, dass unser bewusster Intellekt, als er auftauchte, weder geeignet noch nachhaltig war, um sich an Instinkten zu orientieren – er musste Verständnis finden, um effektiv zu operieren und sein großes Potenzial zur Bewältigung des Lebens auszuschöpfen. Als unser Intellekt jedoch begann, sich anzustrengen und zu experimentieren, um das Leben auf der Grundlage des Verstehens zu managen und die Rolle des bereits etablierten instinktiven Selbst in Frage zu stellen, brach unvermeidlich ein Kampf zwischen dem instinktiven Selbst und dem neueren bewussten Selbst aus.

    Unser Intellekt begann mit dem Verstehen zu experimentieren, als einziges Mittel, um das richtige und falsche Verständnis für das Management der Existenz zu entdecken, aber die Instinkte – da sie sich der Notwendigkeit des Intellekts, diese Experimente durchzuführen, tatsächlich „unbewusst“ oder „unwissend“ waren – „widersetzten“ sich allen Verstehensbedingte Abweichungen von den etablierten instinktiven Orientierungen: Sie "kritisierten" und "versuchten", die notwendige Erkenntnissuche des Bewusstseins zu stoppen. Um die Situation zu veranschaulichen, stellen Sie sich vor, was passieren würde, wenn wir bei vollem Bewusstsein auf den Kopf eines Zugvogels setzen. Der Vogel folgt einer instinktiven Flugbahn, die er über Tausende von Generationen natürlicher Auslese erworben hat, aber er hat jetzt ein Bewusstsein, das verstehen muss, wie er sich verhält, und der einzige Weg, dieses Verständnis zu erlangen, besteht darin, beim Verstehen zu experimentieren – zum Beispiel denkend: „Ich fliege auf diese Insel und ruhe mich aus.“ Aber eine solche Abweichung von der Migrationsflugbahn würde natürlich dazu führen, dass die Instinkte der Abweichung widerstehen und den bewussten Intellekt in ein ernsthaftes Dilemma bringen: wenn er seinen Instinkten gehorcht es wird sich von seinen Instinkten nicht „kritisiert“ fühlen, aber es wird auch kein Wissen finden. Offensichtlich konnte es sich der Intellekt nicht leisten, den Instinkten nachzugeben, und unfähig zu verstehen und damit zu erklären, warum seine Experimente zur Selbstanpassung notwendig waren, hatte der bewusste Intellekt keine Möglichkeit, die implizite Kritik der Instinkte zu widerlegen obwohl es wusste, dass es ungerecht war. Bis das Bewusstsein das erlösende Verständnis dafür fand, warum es den Instinkten trotzen musste (nämlich das wissenschaftliche Verständnis des Unterschieds in der Art und Weise, wie Gene und Nerven Informationen verarbeiten, dass das eine ein orientierendes Lernsystem ist, während das andere ein aufschlussreiches Lernsystem ist), der Intellekt musste einen psychisch angeschlagenen, aufgewühlten Zustand ertragen, der keine andere Wahl hatte, als diesem Widerstand der Instinkte zu trotzen. Die einzigen Formen des Trotzes, die dem bewussten Intellekt zur Verfügung standen, waren Attacke die ungerechte Kritik der Instinkte, versuche es aberkennen oder die ungerechte Kritik der Instinkte aus seinem Verstand verdrängen und versuchen, unter Beweis stellen die ungerechte Kritik der Instinkte ist falsch. Kurz gesagt – und um zu unserer menschlichen Situation zurückzukehren, weil wir die Spezies waren, die das volle Bewusstsein erlangt hat – die psychisch verstörten verärgert, entfremdet und egozentrisch Zustand, der vom menschlichen Zustand betroffen ist, erschien. Unser „bewusst denkendes Selbst“, was die Wörterbuchdefinition von „Ego“ ist, wurde „zentriert“ oder konzentrierte sich auf die Notwendigkeit, sich selbst zu rechtfertigen. Wir wurden egozentrisch, egozentrisch oder egoistisch, beschäftigt damit, aggressiv um Gelegenheiten zu konkurrieren, um zu beweisen, dass wir gut und nicht schlecht sind – wir wurden unvermeidlich egoistisch, aggressiv und wettbewerbsfähig.

    Was an dieser Erklärung des menschlichen Zustands so entlastend, rehabilitieren und heilend ist, ist, dass wir endlich erkennen können, dass es einen sehr guten Grund für unser wütendes, entfremdetes und egozentrisches Verhalten gab – tatsächlich können wir jetzt sehen, warum wir nicht einfach so gewesen sind egozentrisch, aber ego-wütend, sogar ego-wahnsinnig-mit-mörderischer-Wut, weil ich mit so viel ungerechter Kritik leben musste. Wir können jetzt sehen, dass unser Bewusstsein NICHT der böse Bösewicht war, als der es so lange dargestellt wurde – wie in der Bibel, wo Adam und Eva dämonisiert und „aus dem Garten Eden verbannt“ (Gen 3 : 23) von unser ursprünglicher unschuldiger, allliebender, moralischer Zustand, um die „Frucht… vom Baum der Erkenntnis“ zu nehmen (ebd. 3:3, 2:17). Nein Leben auf der Erde! Dies liegt daran, dass unser vollbewusstes Denken sicherlich die größte Erfindung der Natur ist und die Folter, so lange zu Unrecht als böse verurteilt zu werden (die anthropologischen Beweise deuten darauf hin, dass wir Menschen seit etwa zwei Millionen Jahren bei vollem Bewusstsein sind) ertragen zu müssen, muss uns zum absolute Helden der Geschichte des Lebens auf der Erde. Schließlich versöhnen sich Gott und Mensch, Religion und Wissenschaft, unser Instinkt und Intellekt, der integrative Sinn des Lebens und die Widersprüchlichkeit unseres Verhaltens mit diesem Sinn, unsere liebevollen und scheinbar lieblosen Zustände.

    Und DAS BESTE VON ALLEM, weil diese Erklärung des menschlichen Daseins erlösend und damit rehabilitierend ist, lässt all unser aufgeregtes, wütendes, egozentrisches und entfremdetes Verhalten jetzt nach, was die vollständige TRANSFORMATION DER MENSCHLICHEN Rasse bewirkt – und was noch wichtiger ist, das Verständnis des menschlichen Zustands 'schlechtes' Verhalten duldet nicht, es heilt und beendet es dadurch. Von Konkurrenz, Egoismus und Aggressivität kehren die Menschen zu kooperativen, selbstlosen und liebevollen Menschen zurück. Unsere Abfahrtsrunde ist beendet. Der Dichter T. S. Eliot hat die Reise unserer Spezies von einem ursprünglich unschuldigen, aber unwissenden Zustand zu einem psychisch verstörten, „gefallenen“, korrumpierten Zustand und zurück zu einem unverdorbenen, aber diesmal erleuchteten Zustand wunderbar artikuliert, als er schrieb: „Wir werden nicht aufhören von Erkundung und das Ende all unserer Erkundungen wird sein, dort anzukommen, wo wir begonnen haben, und den Ort zum ersten Mal kennenzulernen“ (Little Gidding, 1942).

    Ja, das entlastende, erlösende Verständnis unserer dunklen, scheinbar nicht liebenswerten, psychologisch gestörten, vom menschlichen Zustand heimgesuchten Existenz zu finden, ermöglicht endlich die Heilung und damit die VERWANDLUNG der Menschheit – es macht uns wieder „ganz“, wie Jung es sagte . Um Professor Harry Prosen, einen ehemaligen Präsidenten der Canadian Psychiatric Page 39 of PDF Version Association, zu diesem erträumten, größten aller Durchbrüche in der Wissenschaft zu zitieren: „Ich habe keinen Zweifel, dass diese biologische Erklärung des menschlichen Zustands der heilige Gral der Menschheit ist Einsichten, die wir für die psychologische Rehabilitation der Menschheit gesucht haben“ ( FREEDOM , 2016 , Einführung) .


    Schlussfolgerungen

    Mit einer abgeschlossenen Genomsequenz und vielen neuen Werkzeugen, P. patens entwickelt sich als Hefeäquivalent der Pflanzenforschung. P. patens ist schnell vermehrt, leicht transformiert und im Vergleich zu den meisten Gefäßpflanzen relativ einfach in Entwicklung und Morphologie. Obwohl ihr Genom nicht unbedingt eine „abgespeckte“ Version von vaskulären Pflanzengenomen ist, hat die Leichtigkeit, mit der genetische Manipulationen an dieser Pflanze durchgeführt werden können, in kurzer Zeit mehrere wichtige Erkenntnisse ermöglicht, die von der Pflanzenevolution bis hin zu Stummschaltungswege zur molekularen Grundlage des Zellwachstums.


    Danksagung

    Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien K01HG003418-02 und GM059964-06S1 unterstützt. Der Autor ist besonders dankbar für die Laborunterstützung und die Ermutigung von Isaac Kohane, dem Direktor des Boston Informatics-Programms des Children's Hospital an der Harvard-MIT Division of Health Sciences. Besonderer Dank gilt dem Mitarbeiter und Freund Rong Li vom Stowers Institute for Medical Research für die anfängliche Motivation zu dieser Arbeit und für viele hilfreiche Diskussionen über Zellzyklusmaschinen, Modellierung und Systembiologie.


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