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11.1: „Korrekturlesen“ der DNA - Biologie

11.1: „Korrekturlesen“ der DNA - Biologie


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Die DNA-Replikation ist ein hochpräziser Prozess, aber gelegentlich können Fehler auftreten, wie beispielsweise das Einfügen einer falschen Base durch eine DNA-Polymerase. In seltenen Fällen werden Fehler nicht korrigiert, was zu Mutationen führt; in anderen Fällen sind Reparaturenzyme selbst mutiert oder defekt.

Die meisten Fehler bei der DNA-Replikation werden von der DNA-Polymerase umgehend korrigiert, indem die gerade hinzugefügte Base Korrektur gelesen wird (Abbildung 1). In Korrekturlesen, liest der DNA pol die neu hinzugefügte Base, bevor die nächste hinzugefügt wird, sodass eine Korrektur vorgenommen werden kann. Die Polymerase prüft, ob die neu hinzugefügte Base korrekt mit der Base im Matrizenstrang gepaart wurde. Wenn es die richtige Base ist, wird das nächste Nukleotid hinzugefügt. Wurde eine falsche Base hinzugefügt, schneidet das Enzym an der Phosphodiesterbindung und setzt das falsche Nukleotid frei. Dies wird durch die Exonuklease-Wirkung von DNA pol III durchgeführt. Sobald das falsche Nukleotid entfernt wurde, wird wieder ein neues hinzugefügt.

Einige Fehler werden während der Replikation nicht korrigiert, sondern nach Abschluss der Replikation korrigiert. Diese Art der Reparatur ist bekannt als Reparatur von Fehlanpassungen (Figur 2). Die Enzyme erkennen das falsch hinzugefügte Nukleotid und schneiden es heraus; diese wird dann durch die richtige Basis ersetzt. Bleibt dies unkorrigiert, kann dies zu dauerhafteren Schäden führen. Wie erkennen Mismatch-Repair-Enzyme, welche der beiden Basen die falsche ist? In E coli, nach der Replikation erhält die stickstoffhaltige Base Adenin eine Methylgruppe; der elterliche DNA-Strang weist Methylgruppen auf, während dem neu synthetisierten Strang diese fehlen. Somit ist die DNA-Polymerase in der Lage, die falsch eingebauten Basen aus dem neu synthetisierten, nicht methylierten Strang zu entfernen. Bei Eukaryoten ist der Mechanismus nicht sehr gut verstanden, aber es wird angenommen, dass er die Erkennung von unversiegelten Kerben im neuen Strang sowie eine kurzfristige fortgesetzte Assoziation einiger der Replikationsproteine ​​mit dem neuen Tochterstrang nach Abschluss der Replikation beinhaltet .

Bei einer anderen Art von Reparaturmechanismus, Nukleotidexzisionsreparatur, ersetzen Enzyme falsche Basen, indem sie sowohl am 3′- als auch am 5′-Ende der falschen Base einen Schnitt machen (Abbildung 3).

Das DNA-Segment wird entfernt und durch die Wirkung von DNA pol durch die korrekt gepaarten Nukleotide ersetzt. Nach dem Auffüllen der Basen wird die verbleibende Lücke mit einer durch DNA-Ligase katalysierten Phosphodiesterbindung verschlossen. Dieser Reparaturmechanismus wird häufig verwendet, wenn UV-Exposition die Bildung von Pyrimidin-Dimeren verursacht.


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    • Autoren: Julianne Zedalis, John Eggebrecht
    • Herausgeber/Website: OpenStax
    • Buchtitel: Biologie für AP®-Kurse
    • Erscheinungsdatum: 8. März 2018
    • Ort: Houston, Texas
    • Buch-URL: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/1-introduction
    • Abschnitts-URL: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/14-key-terms

    © 12.01.2021 OpenStax. Von OpenStax produzierte Lehrbuchinhalte sind unter einer Creative Commons Attribution License 4.0-Lizenz lizenziert. Der OpenStax-Name, das OpenStax-Logo, die OpenStax-Buchcover, der OpenStax CNX-Name und das OpenStax CNX-Logo unterliegen nicht der Creative Commons-Lizenz und dürfen ohne die vorherige und ausdrückliche schriftliche Zustimmung der Rice University nicht reproduziert werden.


    Korrekturlesen (Biologie)

    Der Begriff Korrekturlesen wird in der Genetik verwendet, um sich auf die fehlerkorrigierenden Prozesse zu beziehen, die zuerst von John Hopfield und Jacques Ninio vorgeschlagen wurden und an der DNA-Replikation, der Spezifität des Immunsystems, der Enzym-Substrat-Erkennung und vielen anderen Prozessen beteiligt sind, die eine erhöhte Spezifität erfordern. Die Korrekturlesemechanismen von Hopfield und Ninio sind nicht gleichgewichtsaktive Prozesse, die ATP verbrauchen, um die Spezifität verschiedener biochemischer Reaktionen zu erhöhen.

    In Bakterien haben alle drei DNA-Polymerasen (I, II und III) die Fähigkeit, mithilfe der 3’ → 5’-Exonuklease-Aktivität Korrektur zu lesen. Wenn ein falsches Basenpaar erkannt wird, kehrt die DNA-Polymerase ihre Richtung um ein DNA-Basenpaar um und schneidet die fehlgepaarte Base aus. Nach der Basenexzision kann die Polymerase die richtige Base wieder einfügen und die Replikation kann fortgesetzt werden.

    In Eukaryoten haben nur die Polymerasen, die sich mit der Elongation (Delta und Epsilon) befassen, die Fähigkeit zum Korrekturlesen (3’ → 5’ Exonuklease-Aktivität). [1]

    Korrekturlesen findet auch bei der mRNA-Translation für Protein Synthese. [2] In diesem Fall ist ein Mechanismus die Freisetzung einer falschen Aminoacyl-tRNA vor der Bildung der Peptidbindung. [3]

    Das Ausmaß des Korrekturlesens bei der DNA-Replikation bestimmt die Mutationsrate und ist bei verschiedenen Spezies unterschiedlich. [4] Zum Beispiel führt der Verlust des Korrekturlesens aufgrund von Mutationen im DNA-Polymerase-Epsilon-Gen zu einem hypermutierten Genotyp mit >100 Mutationen pro Mbase DNA bei humanem kolorektalen Karzinom. [5]

    Der Umfang des Korrekturlesens bei anderen molekularen Prozessen kann von der effektiven Populationsgröße der Art und der Anzahl der Gene abhängen, die vom gleichen Korrekturlesemechanismus betroffen sind. [6]

    Bakteriophage (Phagen) T4-Gen 43 kodiert das Replikationsenzym der DNA-Polymerase des Phagen. Temperaturempfindlich (ts) Gen 43-Mutanten identifiziert wurden, die einen Antimutator-Phänotyp aufweisen, d. h. eine geringere Rate spontaner Mutationen als der Wildtyp. [7] Studien an einer dieser Mutanten, tsB120, zeigten, dass die von dieser Mutante spezifizierte DNA-Polymerase DNA-Matrizen langsamer kopiert als die Wildtyp-Polymerase. [8] Die 3’ bis 5’-Exonukleaseaktivität war jedoch nicht höher als beim Wildtyp. Bei der DNA-Replikation ist das Verhältnis von umgesetzten zu stabil in neu gebildeter DNA eingebauten Nukleotiden bei der tsB120 mutant als im Wildtyp. [8] Es wurde vorgeschlagen, dass der Antimutatoreffekt sowohl durch eine größere Genauigkeit bei der Nukleotidauswahl als auch durch eine effizientere Entfernung nichtkomplementärer Nukleotide (Korrekturlesen) durch die tsB120 Polymerase.

    Wenn Phagen-T4-Virionen mit einer Wildtyp-Gen 43-DNA-Polymerase entweder ultraviolettem Licht ausgesetzt werden, das Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer-Schäden in die DNA einführt, oder Psoralen-plus-Licht, das Pyrimidin-Addukte einführt, erhöht sich die Mutationsrate. Diese mutagene Wirkung wird jedoch gehemmt, wenn die DNA-Synthese des Phagen durch die tsCB120 Antimutator-Polymerase oder eine andere Antimutator-Polymerase, tsCB87. [9] Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Ausmaß der Induktion von Mutationen durch DNA-Schäden stark durch die Korrekturlesefunktion der Gen 43 DNA-Polymerase beeinflusst werden kann.


    Was ist Treue?

    New England Biolabs ist seit vielen Jahren an der Entdeckung und Entwicklung von High-Fidelity-Polymerasen beteiligt (Tabelle 1). Beginnend mit der Entdeckung der Vent® DNA Polymerase von Thermococcus litoralis 1990 (1,2) haben NEB-Forscher mehrere High-Fidelity-Polymerasen &ndash alle mit unterschiedlichen Prozessivitäten, Geschwindigkeiten und Genauigkeitsgraden identifiziert und konstruiert.

    Die Geschichte der High-Fidelity-DNA-Polymerase von New England Biolabs

    JAHRE PRODUKTE) NEB-Nr.
    1990-91 Vent® DNA-Polymerase M0254
    1992 Vent® (exo-) DNA-Polymerase
    Deep Vent® DNA-Polymerase
    M0257
    M0258
    1993-1994 Deep Vent® (exo-) DNA-Polymerase M0259
    1995 9&GradNm&DNA-Polymerase handeln M0260
    2007-2008 Phusion® High-Fidelity-DNA-Polymerase M0530
    2011 Phusion® Hot Start Flex DNA Polymerase M0535
    2012 Q5® High-Fidelity-DNA-Polymerase
    Q5® Hot-Start-High-Fidelity-DNA-Polymerase
    M0491
    M0493

    Die Genauigkeit einer DNA-Polymerase bezieht sich auf ihre Fähigkeit, eine Matrize genau zu replizieren. Ein kritischer Aspekt dabei ist die Fähigkeit der DNA-Polymerase, einen Matrizenstrang zu lesen, das geeignete Nukleosidtriphosphat auszuwählen und das richtige Nukleotid am 3&prime-Primerterminus einzufügen, so dass die kanonische Watson-Crick-Basenpaarung aufrechterhalten wird. Die Fehleinbaurate (Einbau des falschen Nukleotids) ist als "Fehlerrate" der Polymerase bekannt. Zusätzlich zu einer wirksamen Unterscheidung zwischen korrektem und inkorrektem Nukleotideinbau besitzen einige DNA-Polymerasen eine 3&prime&rarr5&prime-Exonukleaseaktivität. Diese Aktivität, auch "Korrekturlesen" genannt, wird verwendet, um falsch eingebaute Mononukleotide auszuschneiden, die dann durch das richtige Nukleotid ersetzt werden. High-Fidelity-PCR verwendet DNA-Polymerasen, die niedrige Fehleinbauraten mit Korrekturleseaktivität koppeln, um eine getreue Replikation des interessierenden DNA-Ziels zu ermöglichen.

    (1) Mattila, P., et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19, 4967 &ndash 4973. PMID: 1923765
    (2) Eckert, K.A., &. Kunkel, T.A. (1991) Genome Research, 1, 17 &ndash24. PMID: 1842916

    Vent ® ist eine eingetragene Marke von New England Biolabs, Inc.
    DeepVent®, 9°Nm&trade sind Marken von New England Biolabs, Inc.


    11.1: „Korrekturlesen“ der DNA - Biologie

    1. DNA ist eine Doppelhelix aus zwei antiparallelen Nukleotidsträngen, die miteinander verbunden sind durch Wasserstoffbrückenbindung zwischen komplementären Basenpaaren.

    • Fähigkeit: Analyse der Ergebnisse des Hershey- und Chase-Experiments Beweis, dass DNA das genetische Material ist.

    • Anwendung: Die DNA-Untersuchung von Rosalind Franklin und Maurice Wilkins Struktur durch Röntgenbeugung.

    • 5’-Ende: An einem Ende jedes DNA-Strangs befindet sich eine Phosphatgruppe, die mit dem Kartonatom 5 der Desoxyribose verbunden ist
    • 3’-Ende: An einem Ende jeder DNA ist eine Hydroxylgruppe an das Kohlenstoffatom 3 der Desoxyribose gebunden
    • benachbarte Nukleotide sind durch eine kovalente Bindung zwischen der Phosphatgruppe, die am 5’-Ende eines Nukleotids befestigt ist, und dem Kohlenstoffatom 3’ des anderen Nukleotids verbunden
    • zwischen Purinen und Pyrimidinen
    • Purine: Adenin und Guanin haben zwei Ringe in ihren Molekülen
    • Pyrimidine: Cytosin und Thymin haben einen einzigen Ring in ihren Molekülen

    • 8 Histonproteine ​​(4 Typen, 2 von jedem Typ) in jedem Nukleosom
    • 1 Histonprotein außerhalb jedes Nukleosoms, das dazu dient, das Nukleosom zu organisieren und zusammenzuhalten
    • eine Struktur zum Wickeln von DNA durch Kombination mit Histonproteinen
    • DNA wird zweimal um jedes Nukleosom gewickelt

    • Skill: Einsatz von molekularer Visualisierungssoftware zur Analyse der Assoziation zwischen Protein und DNA innerhalb eines Nukleosoms.

    einzigartige oder Single-Copy-Gene umfassen Exons und Introns

    • Exons kodieren für reife mRNA, die für Polypeptide kodiert
    • Introns werden in RNA transkribiert, aber dann von Enzymen entfernt, die Exons zu reifen mRNA zusammenspleißen, die für Polypeptide kodiert

    Gene für andere RNA-Typen kodieren nicht für Proteine

    einige Abschnitte der DNA fungieren als Regulatoren der Genexpression

    Telomere an den Enden der Chromosomen kodieren nicht für Proteine

    stark repetitive Sequenzen erfüllen keine bekannte Funktion

    • auch bekannt als Satelliten-DNA, machen 5-45% des Genoms aus
    • Sequenzen sind 5-300 Basenpaare pro Wiederholung und können bis zu 10.000 Mal pro Genom wiederholt werden
    • die Funktion der repetitiven DNA ist nicht bekannt
    • Da sich wiederholende Sequenzen von Person zu Person variieren, sind sie bei der Erstellung von DNA-Profilen nützlich, die es ermöglichen, DNA-Fingerabdrücke zur Identifizierung von Proben von Einzelpersonen zu verwenden

    • Die DNA-Regionen, die nicht für Proteine ​​kodieren, sollten beschränkt werden auf Regulatoren der Genexpression, Introns, Telomere und Gene für tRNAs.

    • DNA-Sequenzierung des menschlichen Genoms zeigt, dass 98,5% nicht für Proteine, rRNA oder tRNA kodieren
    • etwa ein Viertel des menschlichen Genoms kodiert für Introns und genbezogene regulatorische Sequenzen

    • Anwendung: Verwendung von Nucleotiden, die Didesoxyribonucleinsäure enthalten, um DNA-Replikation bei der Vorbereitung von Proben für die Basensequenzierung.

    • viele Kopien der Proben-DNA + Didesoxyribonukleinsäure (dDNA)-Nukleotide, jedes mit einer einzigartigen, in Lösung gemischten Fluoreszenz
    • dDNA stoppt die Replikation, wenn sie in DNA eingebaut wird
    • Gelelektrophorese trennt DNA-Fragmente nach Größe
    • Bilder von fluoreszierenden Fragmenten ermöglichen eine Sequenzierung basierend auf der Größe

    • Anwendung: Tandem-Repeats werden beim DNA-Profiling verwendet.

    • Jedes Nukleotid enthält ein Desoxyribose-Molekül mit 5 Kohlenstoffatomen, mit einer stickstoffhaltigen Base an Kohlenstoff 1 und einem Phosphat an Kohlenstoff 5
    • ein DNA-Strang wird mit einem sich wiederholenden Desoxyribose-Phosphat-Desoxyribose-Phosphat-Rückgrat aufgebaut
    • Daher hat ein Ende des DNA-Moleküls ein freies 5’-Phosphat und das andere ein freies 3’-Kohlenstoffreplikation fügt nur DNA-Nukleotide am 3’-Ende hinzu

    5. Die DNA-Replikation erfolgt durch ein komplexes System von Enzymen und ist auf dem voreilenden Strang kontinuierlich und auf dem nacheilenden Strang diskontinuierlich.

    • Details der DNA-Replikation unterscheiden sich zwischen Prokaryoten und Eukaryoten. Nur das prokaryontische System wird erwartet.

    • Die Proteine ​​und Enzyme, die an der DNA-Replikation beteiligt sind, sollten Folgendes umfassen: Helikase, DNA-Gyrase, einzelsträngige Bindungsproteine, RNA-Primase und DNA Polymerasen I und III.


    Inhalt

    Die in der DNA enthaltene Information bestimmt die Proteinfunktion in den Zellen aller Organismen. Transkription und Translation ermöglichen die Übertragung dieser Informationen in die Herstellung von Proteinen. Ein Fehler beim Lesen dieser Mitteilung kann jedoch dazu führen, dass die Proteinfunktion inkorrekt ist und schließlich Krankheiten verursachen, selbst wenn die Zelle eine Vielzahl von Korrekturmaßnahmen umfasst.

    Zentrales Dogma Bearbeiten

    1956 beschrieb Francis Crick als zentrales Dogma den Fluss der genetischen Information von der DNA zu einer bestimmten Aminosäureanordnung zur Herstellung eines Proteins. [1] Damit eine Zelle richtig funktioniert, müssen Proteine ​​für ihre strukturellen und katalytischen Aktivitäten genau produziert werden. Ein falsch hergestelltes Protein kann sich nachteilig auf die Lebensfähigkeit der Zellen auswirken und in den meisten Fällen dazu führen, dass der höhere Organismus durch abnormale Zellfunktionen ungesund wird. Damit das Genom die Informationen erfolgreich weitergibt, werden Korrekturlesemechanismen wie Exonukleasen und Mismatch-Reparatursysteme in die DNA-Replikation eingebaut. [1]

    Transkription und Übersetzung Bearbeiten

    Nach der DNA-Replikation erfolgt das Lesen eines ausgewählten Abschnitts der genetischen Information durch Transkription. [1] Nukleotide, die die genetische Information enthalten, befinden sich jetzt auf einer einzelsträngigen Messenger-Vorlage namens mRNA. Die mRNA wird in eine Untereinheit des Ribosoms eingebaut und interagiert mit einer rRNA. Die in den Codons der mRNA enthaltene genetische Information wird nun von Anticodons der tRNA gelesen (dekodiert). Während jedes Codon (Triplett) gelesen wird, werden Aminosäuren zusammengefügt, bis ein Stoppcodon (UAG, UGA oder UAA) erreicht wird. An diesem Punkt wurde das Polypeptid (Protein) synthetisiert und wird freigesetzt. [1] Für jede 1000 in das Protein eingebaute Aminosäure ist nicht mehr als eine falsch. Diese Genauigkeit der Codon-Erkennung, die die Bedeutung des richtigen Leserahmens beibehält, wird durch die richtige Basenpaarung an der Ribosom-A-Stelle, die GTP-Hydrolyseaktivität von EF-Tu, eine Form der kinetischen Stabilität, und einen Korrekturlesemechanismus bei der Freisetzung von EF-Tu erreicht . [1]

    Frameshift kann auch während der Prophase-Translation auftreten, wodurch verschiedene Proteine ​​aus überlappenden offenen Leserastern produziert werden, wie die retroviralen gag-pol-env-Proteine. Dies ist bei Viren ziemlich häufig und kommt auch bei Bakterien und Hefen vor (Farabaugh, 1996). Es wird angenommen, dass die reverse Transkriptase im Gegensatz zur RNA-Polymerase II eine stärkere Ursache für das Auftreten von Frameshift-Mutationen ist. In Experimenten traten nur 3–13% aller Rasterverschiebungsmutationen aufgrund der RNA-Polymerase II auf. Bei Prokaryonten liegt die Fehlerrate, die Frameshift-Mutationen induziert, nur irgendwo im Bereich von 0,0001 und 0,00001. [5]

    Es gibt mehrere biologische Prozesse, die dabei helfen, Frameshift-Mutationen zu verhindern. Es treten Rückmutationen auf, die die mutierte Sequenz zurück in die ursprüngliche Wildtypsequenz ändern. Eine weitere Möglichkeit zur Mutationskorrektur ist die Verwendung einer Suppressor-Mutation. Dies gleicht den Effekt der ursprünglichen Mutation aus, indem eine sekundäre Mutation erzeugt wird, die die Sequenz verschiebt, damit die richtigen Aminosäuren gelesen werden können. Guide-RNA kann auch verwendet werden, um Uridin nach der Transkription in die mRNA einzufügen oder zu löschen, dies ermöglicht den korrekten Leserahmen. [1]

    Codon-Triplett-Bedeutung Bearbeiten

    Ein Codon ist ein Satz von drei Nukleotiden, ein Triplett, das für eine bestimmte Aminosäure kodiert. Das erste Codon bildet den Leserahmen, wodurch ein neues Codon beginnt. Die Aminosäure-Rückgratsequenz eines Proteins wird durch zusammenhängende Tripletts definiert. [6] Codons sind der Schlüssel zur Translation genetischer Informationen für die Synthese von Proteinen. Der Leserahmen wird gesetzt, wenn die Translation der mRNA beginnt, und wird beibehalten, während sie ein Triplett zum nächsten liest. Das Auslesen des genetischen Codes unterliegt drei Regeln, die Codons in mRNA überwachen. Zuerst werden Codons in 5'-3'-Richtung gelesen. Zweitens überlappen sich die Codons nicht und die Nachricht hat keine Lücken. Die letzte Regel, wie oben erwähnt, besagt, dass die Nachricht in einem festen Leserahmen übersetzt wird. [1]

    Frameshift-Mutationen können zufällig auftreten oder durch einen externen Stimulus verursacht werden. Der Nachweis von Frameshift-Mutationen kann über verschiedene Methoden erfolgen. Frameshifts sind nur eine Art von Mutation, die zu unvollständigen oder falschen Proteinen führen kann, aber sie machen einen erheblichen Prozentsatz der Fehler in der DNA aus.

    Genetisch oder Umweltbearbeiten

    Dies ist eine genetische Mutation auf der Ebene der Nukleotidbasen. Warum und wie Frameshift-Mutationen auftreten, wird ständig gesucht. Eine Umweltstudie, insbesondere die Erzeugung von UV-induzierten Rasterverschiebungsmutationen durch DNA-Polymerasen, denen die 3′ → 5′-Exonuklease-Aktivität fehlt, wurde durchgeführt. Die normale Sequenz 5' GTC GTT TTA CAA 3' wurde in GTC GTT T TTA CAA (MIDT) von GTC GTT C TTA CAA (MIDC) geändert, um Frameshifts zu untersuchen. E. coli pol I Kf- und T7-DNA-Polymerase-Mutantenenzyme ohne 3' → 5'-Exonuklease-Aktivität produzieren UV-induzierte Revertanten mit höherer Frequenz als ihre Exonuklease-fähigen Gegenstücke. Die Daten zeigen, dass der Verlust der Korrekturleseaktivität die Häufigkeit von UV-induzierten Frameshifts erhöht. [7]

    Erkennung Bearbeiten

    Fluoreszenz Bearbeiten

    Die Auswirkungen benachbarter Basen und der Sekundärstruktur auf die Erkennung der Häufigkeit von Rasterverschiebungsmutationen wurden unter Verwendung von Fluoreszenz eingehend untersucht. Fluoreszierend markierte DNA mit Hilfe von Basenanaloga erlaubt es, die lokalen Veränderungen einer DNA-Sequenz zu untersuchen. [8] Studien zu den Auswirkungen der Länge des Primerstrangs zeigen, dass eine Gleichgewichtsmischung von vier Hybridisierungskonformationen beobachtet wurde, wenn die Templatbasen als Ausbuchtung ausgeschleift wurden, d. h. eine Struktur, die auf beiden Seiten von Duplex-DNA flankiert wurde. Im Gegensatz dazu wurde eine Doppelschleifenstruktur mit einer ungewöhnlichen ungestapelten DNA-Konformation an der stromabwärtigen Kante beobachtet, wenn die extrudierten Basen an der Primer-Templat-Verbindung positioniert wurden, was zeigt, dass Fehlausrichtungen durch benachbarte DNA-Sekundärstrukturen modifiziert werden können. [9]

    Sequenzierung bearbeiten

    Sanger-Sequenzierung und Pyrosequenzierung sind zwei Methoden, die verwendet wurden, um Frameshift-Mutationen zu erkennen, jedoch ist es wahrscheinlich, dass die generierten Daten nicht von höchster Qualität sind. Dennoch wurden durch die Sanger-Sequenzierung 1,96 Millionen Indels identifiziert, die sich nicht mit anderen Datenbanken überschneiden. Wenn eine Frameshift-Mutation beobachtet wird, wird sie mit der Human Genome Mutation Database (HGMD) verglichen, um festzustellen, ob die Mutation eine schädigende Wirkung hat. Dies geschieht durch Betrachten von vier Funktionen. Erstens das Verhältnis zwischen betroffener und konservierter DNA, zweitens die Lage der Mutation relativ zum Transkript, drittens das Verhältnis von konservierten und betroffenen Aminosäuren und schließlich der Abstand des Indels zum Exonende. [10]

    Massively Parallel Sequencing ist eine neuere Methode, mit der Mutationen erkannt werden können. Mit dieser Methode können bis zu 17 Gibasen auf einmal sequenziert werden, im Gegensatz zu begrenzten Bereichen für die Sanger-Sequenzierung von nur etwa 1 Kilobase. Zur Durchführung dieses Tests stehen mehrere Technologien zur Verfügung, und es wird geprüft, ob er in klinischen Anwendungen eingesetzt werden kann. [11] Beim Testen auf verschiedene Karzinome erlauben die derzeitigen Methoden nur die Betrachtung eines Gens auf einmal. Massively Parallel Sequencing kann im Gegensatz zu mehreren spezifischen Tests gleichzeitig auf eine Vielzahl von krebserregenden Mutationen testen. [12] Ein Experiment zur Bestimmung der Genauigkeit dieser neueren Sequenzierungsmethode wurde auf 21 Gene getestet und hatte keine falsch positiven Aufrufe für Frameshift-Mutationen. [13]

    Diagnose Bearbeiten

    Ein US-Patent (5.958.684) aus dem Jahr 1999 von Leeuwen beschreibt die Verfahren und Reagenzien zur Diagnose von Krankheiten, die durch ein Gen mit einer somatischen Mutation, die eine Rasterverschiebungsmutation verursacht, verursacht werden oder damit verbunden sind. Die Verfahren umfassen das Bereitstellen einer Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe und die Durchführung einer Genanalyse für eine Rasterverschiebungsmutation oder ein Protein aus dieser Art von Mutation. Die Nukleotidsequenz des verdächtigen Gens wird aus veröffentlichten Gensequenzen oder aus der Klonierung und Sequenzierung des verdächtigen Gens bereitgestellt. Die von dem Gen kodierte Aminosäuresequenz wird dann vorhergesagt. [14]

    Frequenz bearbeiten

    Trotz der Regeln, die den genetischen Code und die verschiedenen Mechanismen, die in einer Zelle vorhanden sind, regeln, um die korrekte Übertragung der genetischen Information während des Prozesses der DNA-Replikation sowie während der Translation zu gewährleisten, treten Mutationen nicht nur bei der Frameshift-Mutation auf. Es gibt mindestens zwei andere Arten von erkannten Punktmutationen, insbesondere die Missense-Mutation und die Nonsense-Mutation. [1] Eine Frameshift-Mutation kann die Kodierungskapazität (genetische Information) der Nachricht drastisch verändern. [1] Kleine Insertionen oder Deletionen (weniger als 20 Basenpaare) machen 24% der Mutationen aus, die sich in derzeit anerkannten genetischen Erkrankungen manifestieren. [10]

    Es wurde gefunden, dass Frameshift-Mutationen in Wiederholungsregionen der DNA häufiger vorkommen. Ein Grund dafür ist das Gleiten des Polymerase-Enzyms in Wiederholungsregionen, wodurch Mutationen in die Sequenz eindringen können. [15] Experimente können durchgeführt werden, um die Häufigkeit der Frameshift-Mutation durch Hinzufügen oder Entfernen einer voreingestellten Anzahl von Nukleotiden zu bestimmen. Experimente wurden durchgeführt, indem vier Basenpaare hinzugefügt wurden, die als +4-Experimente bezeichnet wurden, aber ein Team der Emory University untersuchte den Unterschied in der Häufigkeit der Mutation durch Hinzufügen und Löschen eines Basenpaars. Es zeigte sich, dass es keinen Unterschied in der Häufigkeit zwischen der Addition und Deletion eines Basenpaares gab. Es gibt jedoch einen Unterschied im Endergebnis des Proteins. [fünfzehn]

    Die Huntington-Krankheit ist eine der neun Codon-Wiederholungsstörungen, die durch Polyglutamin-Expansionsmutationen verursacht werden, zu denen Spino-Zerebelläre Ataxie (SCA) 1, 2, 6, 7 und 3, spinobulbäre Muskelatrophie und dentatorubale-Pallidoluysianatrophie gehören. Möglicherweise gibt es einen Zusammenhang zwischen Krankheiten, die durch Polyglutamin- und Polyalanin-Expansionsmutationen verursacht werden, als Frame-Shifting des ursprünglichen SCA3-Genprodukts, das für CAG/Polyglutamine kodiert, zu GCA/Polyalaninen. Ribosomaler Schlupf während der Translation des SCA3-Proteins wurde als Mechanismus vorgeschlagen, der zu einer Verschiebung vom Polyglutamin- zum Polyalanin-kodierenden Rahmen führt. Eine Dinukleotid-Deletion oder einzelne Nukleotid-Insertion innerhalb des Polyglutamin-Trakts von Huntingtin-Exon 1 würde den CAG, Polyglutaminen-kodierenden Rahmen um +1 (+1 Rahmenverschiebung) zum GCA, Polyalanin-kodierenden Rahmen verschieben und ein neues Epitop am C-Terminus von einführen Htt-Exon 1 (APAAAPAATRPGCG). [16]

    Mehrere Krankheiten haben Frameshift-Mutationen als zumindest einen Teil der Ursache. Die Kenntnis vorherrschender Mutationen kann auch bei der Diagnose der Krankheit helfen. Derzeit gibt es Versuche, Frameshift-Mutationen nutzbringend bei der Behandlung von Krankheiten zu verwenden, indem das Leseraster der Aminosäuren verändert wird.


    Korrekturlesen

    Korrekturlesen (in der Genetik) Ein Reparaturmechanismus, der dazu beiträgt, die originalgetreue DNA-Replikation in lebenden Zellen sicherzustellen. Es ist eine Funktion des Enzyms DNA-Polymerase, das den Replikationsprozess katalysiert. Dieses Enzym identifiziert und schneidet fehlgepaarte Basen am Ende des wachsenden Strangs aus und lässt das Ende frei, um stattdessen das richtige Nukleotid aufzunehmen, wodurch die korrekte komplementäre Basensequenz wiederhergestellt wird. Siehe auch DNA-Reparatur.

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    11.1: „Korrekturlesen“ der DNA - Biologie

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    Während der DNA-Replikation werden dem neuen Strang normalerweise Nukleotide in einer zur Matrize komplementären Sequenz hinzugefügt. Mit Adenosinbindung an Thymin und Cytosinbindung an Guanin.

    Nukleotide können jedoch falsch gepaart werden. Zum Beispiel Adenosin mit Cytosin. Diese Fehler können während der Replikation durch eine Reihe von Korrekturleseschritten verhindert oder behoben werden, die von der DNA-Polymerase, dem Enzym, das DNA synthetisiert, durchgeführt werden.

    Erstens hat DNA-Polymerase eine höhere Affinität für korrekt gepaarte Nukleotide, was die Wahrscheinlichkeit falscher Paarungen verringert.

    Zweitens durchläuft die DNA-Polymerase eine Konformationsänderung, wenn Nukleotide mit der Matrize gepaart werden, was dazu führt, dass falsch gepaarte Nukleotide eher dissoziieren und die richtigen Nukleotide hinzugefügt werden können.

    Drittens, wenn es gelingt, einer wachsenden DNA-Kette ein falsches Nukleotid hinzuzufügen, wird es aufgrund struktureller Probleme nicht korrekt mit der Matrize gepaart. Diese falsche Paarung an den drei Primzahlenden der wachsenden Kette führt dazu, dass die DNA-Synthese pausiert.

    Das Drei-Prime-Ende bewegt sich dann zu einer spezifischen Exonuklease-Stelle auf der DNA-Polymerase, die Nukleotide in der Drei-Prime-zu-Fünf-Prime-Richtung entfernt. Bei diesem exonukleolytischen Korrekturleseschritt wird das fehlgepaarte Ende entfernt und dann durch die richtigen Nukleotide ersetzt.

    6.5: Korrekturlesen

    Überblick

    Die Synthese neuer DNA-Moleküle beginnt, wenn die DNA-Polymerase Nukleotide in einer zum DNA-Matrizenstrang komplementären Sequenz miteinander verknüpft. DNA-Polymerase hat eine höhere Affinität für die richtige Base, um die Genauigkeit der DNA-Replikation sicherzustellen. Die DNA-Polymerase führt außerdem während der Replikation ein Korrekturlesen durch, wobei eine Exonuklease-Domäne verwendet wird, die falsche Nukleotide vom entstehenden DNA-Strang abschneidet.

    Fehler während der Replikation werden durch das DNA-Polymerase-Enzym korrigiert

    Genomische DNA wird in der Richtung 5&rsquo bis 3&rsquo synthetisiert. Jede Zelle enthält eine Reihe von DNA-Polymerasen, die unterschiedliche Rollen bei der Synthese und Korrektur von Fehlern in der DNA spielen. Diese Polymerasen „lesen„ jede Base, nachdem sie zum neuen Strang hinzugefügt wurde. Wenn die neu hinzugefügte Base falsch ist, kehrt die Polymerase die Richtung um (von 3 auf 5) und verwendet eine exonukleolytische Domäne, um die falsche Base abzuschneiden. Anschließend wird es durch die richtige Basis ersetzt.

    Mutationen in der Exonuklease-Domäne der DNA-Polymerase sind mit Krebserkrankungen verbunden

    Korrekturlesen ist wichtig, um das Auftreten von Mutationen in neu synthetisierter DNA zu verhindern, aber was passiert, wenn der Korrekturlesemechanismus versagt? Wenn eine Mutation die Exonuklease-Domäne der DNA-Polymerase verändert, verliert sie die Fähigkeit, falsche Nukleotide zu entfernen. Folglich können sich Mutationen im gesamten Genom schnell ansammeln. Diese Art von Mutation wurde mit verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht.

    Low-Fidelity-DNA-Polymerase kann mutierte DNA-Sequenzen erzeugen

    Modifizierte DNA-Polymerasen werden in der Laborwissenschaft für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und in vitro Verfahren zur Herstellung vieler Kopien spezifischer DNA-Fragmente. Während High-Fidelity-Polymerasen verwendet werden, wenn es wichtig ist, dass das Endprodukt perfekt ist, versuchen einige Techniken, wie die fehleranfällige PCR, absichtlich Mutationen in einem DNA-Abschnitt zu erzeugen. Diese Techniken verwenden Polymerasen, die eine eingeschränkte Korrekturlesefähigkeit aufweisen.

    Barbari, Stephanie R. und Polina V. Shcherbakova. "Replikative DNA-Polymerase-Defekte bei menschlichen Krebserkrankungen: Konsequenzen, Mechanismen und Implikationen für die Therapie." DNA-Reparatur 56 (2017): 16-25. [Quelle]


    Geschwindigkeitsbestimmende Schritte im Reaktionsweg der DNA-Polymerase I

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    Abschluss

    Die extrem niedrige Fehlerrate von Q5 ist für viele Anwendungen äußerst vorteilhaft. Die geringe Anzahl identifizierter Fehler erschwert jedoch die Quantifizierung der absoluten Fehlerrate für dieses Enzym selbst bei umfangreichen Experimenten und Analysen. Beim Blau/Weiß-Screening haben wir beobachtet, dass Q5 bei der Replikation von DNA etwa 200-mal zuverlässiger ist als Taq, aber die Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung deuten darauf hin, dass dieser Wert tatsächlich unterschätzt werden kann.

    Da die mit Blau/Weiß-Methoden generierten Werte zwischen einzelnen Replikaten erheblich variieren und auf einer Reihe von berechneten Extrapolationen beruhen, haben wir uns entschieden, die Genauigkeit der Q5 High-Fidelity DNA Polymerase konservativ als >100X . darzustellen Taqund Phusion HighFidelity DNA Polymerase als >50X Taq. Mit ständig sinkenden Kosten und extrem großen Datensätzen könnten Sequenzierungstechniken der nächsten Generation bald in der Lage sein, direkte, kostengünstige Methoden zur genaueren Quantifizierung der Fehlerraten für eine Ultra-High-Fidelity-Polymerase wie Q5 bereitzustellen.

    Überträgt man die Blau/Weiß-Fehlerraten in die praktische Anwendung, legen diese Daten nahe, dass nach 25 PCR-Zyklen zur Amplifikation eines 400 bp-Fragments mit Taq, sollten mehrere Isolate gescreent werden, da bei ungefähr der Hälfte der Klone ein Fehler vorhergesagt wird. Für größere Fragmente von

    1000 bp, jeder Klon amplifiziert mit Taq wahrscheinlich eine unerwünschte Mutation aufweist, während die extrem niedrigen Fehlerraten der Q5 High-Fidelity DNA Polymerase vorhersagen, dass 199/200 Klone, die mit diesem neuen Enzym amplifiziert wurden, korrekt sein werden.