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D4. DNA-Bindungsstellen - Biologie

D4. DNA-Bindungsstellen - Biologie


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Da die RNA-Polymerase an der Promotorstelle aller Gene interagieren muss, könnte man erwarten, dass alle Gene eine ähnliche Nukleotidsequenz in der Promotorregion aufweisen. Dies gilt sowohl für prokaryontische als auch für eukaryontische Gene. Sie würden jedoch erwarten, dass nicht alle Transkriptionsfaktoren identische DNA-Bindungssequenzen aufweisen. Die DNA-Sequenzen direkt stromaufwärts der Startstelle des Proteins (RNA-Polymerase, Transkriptionsfaktoren usw.) werden als Promotoren bezeichnet. Die folgende Tabelle zeigt das gemeinsame DNA-Sequenzmotiv namens Pribnow oder TATA-Box gefunden bei etwa -10 Basenpaaren stromaufwärts von der Startstelle und ein weiteres bei -35. Proteine ​​binden an diese Stellen und erleichtern die Bindung von RNA-Polymerase, was zur Gentranskription führt.

Prokaryotische Promotorsequenzen
Promoter-35 RegionAbstandshalter-10 RegionAbstandshalterRNA-Start
trp operonTTGACAN17TTAACTN7EIN
tRNAtyrTTACAN16TATGATN7EIN
P2TTGACAN17GATACTN6g
lac OperonTTTACAN17TATGTTN6EIN
rec ATTGATAN16TATAATN7EIN
lex ATTCCAAN17TATAKTN6EIN
T7A3TTGACAN17TACGATN7EIN
KonsensTTGACATATAAT

Eine ähnliche Sequenz wird in Eukaryoten (Konsensus TATAAA) gefunden, die sich etwa 25 Nukleotide stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle befinden. Es heißt Goldstein-Hogness-Box.

Jmol: Aktualisiertes TATA-Box-Bindungsprotein Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Darüber hinaus binden in Eukaryoten Sequenzen weiter stromaufwärts, die als Response-Elemente bezeichnet werden, spezifische Proteine ​​(wie CREB oder cyclisches AMP-Response-Element-Bindungsprotein), um die Gentranskription weiter zu kontrollieren.

Eukaryotische Reaktionselemente (RE)s

Aufsichtsbehörde

Modul

KonsensDNA gebundenFaktorGröße (Dalton)
HitzeschockHSECNNGAANNTCCNNG27 bpHSTF93,000
GlukokortikoidGRETGGTACAAATGTTCT20 bpRezeptor94,000
CadmiumMRECGNCCCGGNCNC.?.
PhorbolesterTRETGACTCA22 bpAP139,000
SerumSRECCATATTAGG20 bpSRF52,000
AntioxidansSINDGTGACTCAGC
Pheromon (Pilz)ACAAAGGGA
HypoxieHRE

CCACAGTGCATACGT

GGGCTCCAACAGGTC

CTCTCCCTCCCATGCA

Hypoxie-induzierbarer Faktor826 aa
Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR)PPREaGG_CAAAGGT(CG)APPAR59,000
Steroid (allgemein) (Progesteron, Androgen, Mineralkortikoide, Glukokortikoide)

AGAACAxxxACAAGA

(invertierte Wiederholung)

Eukaryotischer Promotor-Datenbank (EPD) - kommentierte nicht-redundante Sammlung von eukaryotischen POL II-Promotoren, für die die Transkriptionsstartstelle experimentell bestimmt wurde. Link zum Artikel, der die EPD und ihre Verwendung beschreibt.

Promoter und Terminatoren

Zusätzlich zu den Promotoren gibt es andere DNA-Sequenzen, die distaler von der Transkriptionsstartstelle sind als der proximale Promotor, die die Gentranskription beeinflussen. Dazu gehören Verstärker, Schalldämpfer und Isolatoren. Die Abbildung unten zeigt, wie ein Enhancer die Gentranskription beeinflussen könnte, indem er distale DNA (vielleicht Tausende von Basenpaaren von der Startstelle der Transkription entfernt) in die Nähe des Promotors für ein Gen bringt. Man könnte sich leicht vorstellen, wie ein Schalldämpfer analog funktionieren würde.

Abbildung: Verstärker der Transkription

Isolatoren werden benötigt, um zu verhindern, dass ein Enhancer (oder Silencer) ein anderes nahe gelegenes Gen aktiviert (oder hemmt), das betroffen sein sollte. Sie sind Sequenzen zwischen dem Enhancer (oder Silencer) und dem Promotor oder einem Gen oder einem Cluster von Genen. Eukaryotische Isolatoren haben eine CCCTC-Nukleotidstelle, die Proteine ​​bindet, die als CCCTC-Bindungsfaktoren (CTCF) bezeichnet werden.

Die folgende Abbildung und Bildunterschriften, die mit Genehmigung von Nature abgedruckt wurden (wie in der Abbildung gezeigt), zeigen eine detailliertere Beschreibung einer einfachen eukaryotischen Transkriptionseinheit, die die Gentranskription kontrolliert.

Abbildung: Eukaryontische Promotoren und regulatorische Regionen

A. „Einfache eukaryotische Transkriptionseinheit. Ein einfacher Kernpromotor (TATA), Upstream-Aktivatorsequenz (UAS) und Silencer-Element im Abstand von 100 200 bp von der TATA-Box, die typischerweise in einzelligen Eukaryoten gefunden wird“.

B. "Komplexe Metazoen (zum Königreich Animalia gehörend) Transkriptionskontrollmodule. Eine komplexe Anordnung von mehreren geclusterten Enhancer-Modulen, die mit Schalldämpfer- und Isolatorelementen durchsetzt sind, die sich 10,50 kb entweder stromaufwärts oder stromabwärts eines zusammengesetzten Kernpromotors mit TATA-Box (TATA .) befinden können ), Initiatorsequenzen (INR) und Downstream-Promotorelemente (DPE)".

Die folgende Abbildung und Bildunterschrift, wiederum mit Genehmigung von Nature, zeigt eine detailliertere Ansicht eines allgemeinen Transkriptionsapparats mit mehreren Untereinheiten, einschließlich gewebespezifischer und genselektiver Untereinheiten und Transkriptionsinitiationskomplexe.

Abbildung: Allgemeiner Transkriptionsapparat mit eukaryotischen Multisubunit

A. "Der eukaryotische Transkriptionsapparat kann in drei breite Klassen von Ensembles mit mehreren Untereinheiten unterteilt werden, die den RNA-Polymerase-II-Kernkomplex und die damit verbundenen allgemeinen Transkriptionsfaktoren (TFIIA, -B,-D,-E,-F und -H) umfassen, multi -Untereinheits-Cofaktoren (Mediator, CRSP, TRAP, ARC/DRIP usw.) und verschiedene Chromatin modifizierende oder umbauende Komplexe (SWI/SNF, PBAF, ACF, NURF und RSF).

b, c. "Metazoa-Organismen haben mehrere genselektive und gewebespezifische TFIID-ähnliche Aggregate entwickelt, indem sie alternative TAFs (TBP-[TATA Binding Protein Associated Factors] wie das ovarialspezifische TAF105) sowie TRFs (TBP-[TATA Binding Protein .) assoziierte Faktoren] verwandte Faktoren wie TRF2 bei Drosophila und Mäusen), um die Bildung spezialisierter RNA-Polymerase-Initiationskomplexe zu vermitteln, die die Transkription gewebespezifischer und genselektiver Expressionsprogramme steuern." (Naturbezug in Abbildung oben.)"

Genregulation bei Eukaryoten

Proteine ​​können durch elektrostatische, H-Brücken- und hydrophobe Wechselwirkungen spezifisch mit DNA interagieren. AT- und GC-Basenpaare haben verfügbare H-Bindungs-Donoren und -Akzeptoren, die in der Haupt- und Nebenhöhle der ds-DNA-Helix exponiert sind und spezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen ermöglichen.

Abbildung: AT- und GC-Basenpaare haben verfügbare H-Brücken-Donoren und -Akzeptoren

Jmol: Aktualisiertes einfaches DNA-Tutorial Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5) (siehe letzte Auswahlschaltflächen, um H-Bindungs-Donoren und -Akzeptoren im Haupt-Hain zu sehen.

Jmol: Aktualisierter RNA-Polymerase II/DNA/RNA-Komplex Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Gentranskription, Proteolyse und Membranlipide

Ein interessantes Beispiel veranschaulicht, wie die transkriptionelle Kontrolle das Gleichgewicht der Lipide in biologischen Membranen aufrechterhält. Die Phospholipide und Sphingolipide in Membranen sind aufgrund der Vielfalt der Kopfgruppen und der Acylkettenzusammensetzung äußerst heterogen. Angesichts dieser großen Diversität ist es bemerkenswert, dass die verschiedenen Zellen in der Lage sind, die Spezifität der Lipidtypen in verschiedenen Zellen, in verschiedenen Membranen innerhalb von Zellen und innerhalb eines bestimmten Faltblatts einer Membran aufrechtzuerhalten (erinnern Sie sich an unsere Diskussion über Lipid-Rafts). Wie kann die Zelle die Art der Lipide regulieren, die sie synthetisiert? Was steuert die Transkription von Genen für die Lipidsynthese?

Die Regulation der Transkription dieser Gene scheint durch Multidomänenproteine ​​kontrolliert zu werden, die an Sterol-Response-Elemente in der DNA binden. Die Proteine, die als Sterol Response Element Binding Proteins (SREBPs) bezeichnet werden, werden durch Proteolyse aktiviert, um eine Transkriptionsfaktordomäne freizusetzen, die in den Zellkern wandert. Die Proteolyse von SREBP erfolgt im Golgi durch residente Proteasen. Das SREBP im Golgi steht im Komplex mit einem anderen Protein, dem SREP spaltungsaktivierenden Protein (SCAP), das die Bewegung des SREBP von seiner Synthesestelle im endoplasmatischen Retikulum zum Golgi erleichtert. Die Lipidregulation tritt auf, wenn Fettsäuren, Cholesterin oder PL-Derivate wie Phosphoethanolamin (aus Ceramid) die proteolytische Aktivierung des SREBP hemmen. Die Regulierung hängt davon ab, ob SCAP SREBP zum Golgi "übersetzt". SCAP bindet an SREP und überträgt es auf die Golgi-Membran, jedoch nur, wenn der Sterolspiegel niedrig ist. Bei hohem Cholesterinspiegel bindet es an die Transmembrandomäne von SCAP und verhindert, dass SCAP mit SREP interagiert und es auf den Golgi überträgt.

Auxin, ein wichtiges Pflanzenhormon, das die Genexpression induziert, scheint auch die Transkription durch Proteolyse zu aktivieren. Wenn es an seine löslichen zytoplasmatischen Rezeptoren, die Ubiquitin-Proteinligase SCFTIR1, gebunden wird, aktiviert es die Proteolyse von Proteinen, die die Transkription hemmen.

Jmol: Aktualisierter Auxinrezeptor Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5) Auxin-Rezeptor


Identifizierung proteinbindender DNA-Sequenzen in einem Auxin-regulierten Gen von Sojabohnen

Die Promotorregion eines Sojabohnen-Auxin-responsiven Gens, GmAux28, wurde analysiert, um proteinbindende DNA-Sequenzen zu identifizieren, die an der Regulation der Expression beteiligt sein könnten. Mithilfe von DNase-I-Footprinting- und Gel-Mobility-Shift-Assays wurden mehrere Interaktionsregionen, darunter acht Hauptproteinbindungsstellen, in der GmAux28 Gen. Zwei Sequenzmotive, TGACGACA und TCCACGTGTC, bezogen auf as-1/Hex- bzw. G-Box-Elemente, die in mehreren Pflanzenpromotoren gefunden werden, wurden identifiziert. Vier verschiedene A/T-reiche Domänen wurden identifiziert, wobei solche A/T-reichen Domänen die Expression vieler Gene zu modulieren, aber nicht zu spezifizieren scheinen. Zwei neue Sequenzmotive, Delta-1 (D1) und Delta-4 (D4) wurden ebenfalls identifiziert. D1 und D4 teilen sich eine sehr ähnliche Kernsequenz, TAGTxxCTGT bzw. TAGTxCTGT. In Gel-Mobility-Shift-Analysen zeigen D1- und D4-Elemente eine komplexe Interaktion von Bindungsproteinen. Die GmAux22 Promotor enthält auch D1-verwandte Elemente, die mit dem GmAux28 Elemente. Sequenzvergleiche haben D1/D4-ähnliche Sequenzen in mehreren anderen Auxin-responsiven Genen identifiziert, was auf die mögliche Bedeutung von D1/D4 und den entsprechenden Bindungsproteinen bei der Regulation der Expression dieser Gene hindeutet.

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Hintergrund

Die Reparatur von DNA-Schäden ist ein wesentlicher zellulärer Prozess, der durch eine spezielle molekulare Maschinerie reguliert wird. Der Basenexzisionsreparaturweg (BER) [1] zur Reparatur kleiner Läsionen wird durch monofunktionelle DNA-Glykosylasen initiiert. Diese Enzyme verwenden ein Wassermolekül als Nukleophil, um die N-glykosidische Bindung zwischen der Zielbase und Desoxyribose zu spalten, die beschädigte Base freizusetzen und eine apurinische/apyrimidinische (AP)-Stelle zu hinterlassen [2]. Der BER-Weg zur Entfernung von Uracil (Ura), das in DNA durch Desaminierung von Cytosin (Cyt) oder Einbau von dUTP während der DNA-Synthese entsteht, wird durch Uracil-DNA-Glykosylasen (UDGs) initiiert [3]. UDGs werden aufgrund ihrer Substratspezifität in verschiedene Familien eingeteilt [4]. Mitglieder der Familie I-V haben ähnliche Strukturen und Motive. UDGs der Familie I, die auch als UNGs bekannt sind, exzidieren spezifisch Uracil aus einzelsträngiger DNA (ssDNA) und doppelsträngige DNA (dsDNA) mit der Präferenz ssU > dsU: G > dsU:A [5]. UNGs sind allgegenwärtige Enzyme, die hochkonservierte Motive für die DNA-Bindung, Uracil-Erkennung und Exzision verwenden.

Der Reaktionsmechanismus für UNGs wurde durch eine Reihe eleganter Strukturstudien aufgeklärt, in denen Wildtyp- und katalytisch inaktive mutierte UNGs in der DNA-gebundenen Form in verschiedenen Wirkstadien eingefangen wurden [6–12]. Zum Nachweis von Uracil in der DNA verwenden UNGs einen „Pinch-Push-Pull“-Mechanismus, der einen mehrstufigen Basen-Flip-Prozess beinhaltet. Im ersten Schritt führen Serin- und Prolinreste in drei verschiedenen Schleifen (der 'Pro-rich loop', der 'Gly-Ser loop' und der 'Leu-intercalation loop') zu einer leichten Verbiegung der DNA durch Kompression (' Pinch') des Rückgrats. Im zweiten Schritt dringt ein konservierter Leucinrest der „Leu-Interkalationsschleife“ in die kleine Furche ein und die DNA wird vollständig gebogen und geknickt, was zum Flippen der Uracilbase („Push“) führt. Das Uracil-Nukleotid interagiert mit der „Uracil-Erkennungstasche“, in der die Spaltung der glykosidischen Bindung stattfindet, und im letzten Schritt wird der Leucinrest zurückgezogen („Pull“). Zwei katalytische Reste, eine Asparaginsäure und ein Histidin, sind in allen UNGs unveränderlich (Tabelle 1).

UNGs von Pockenviren sind jedoch außergewöhnliche und vielfältigste Mitglieder dieser Familie. Die von diesen Enzymen verwendeten Motive sind in allen Orthopoxviren vollständig konserviert, unterscheiden sich jedoch signifikant von ihren Gegenstücken in anderen Organismen (Zusatzdatei 1: Tabelle S1) [4, 13–15]. Noch wichtiger ist, dass UNGs von Pockenviren eine neue und wesentliche Rolle bei der viralen Replikation einnehmen und als intrinsischer Bestandteil der Replikationsmaschinerie dienen. Im prototypischen Pockenvirus Vaccinia bindet UNG (bekannt als D4) an ein anderes virales Protein A20, um den heterodimeren Prozessivitätsfaktor zu bilden. A20 bindet auch an die DNA-Polymerase E9 und bindet dadurch D4 an E9 [15–20] und baut den heterotrimeren (D4:A20:E9)-Kern des prozessiven Polymerasekomplexes zusammen. In Abwesenheit von D4 synthetisiert Vaccinia E9 nur kurze (<10 Nukleotide) DNA-Abschnitte [18, 21]. Diese wesentliche Rolle von D4 bei der Unterstützung der prozessiven DNA-Synthese hängt nicht von seiner katalytischen Aktivität (Glycosylase) ab [15].

Kristallstrukturen von D4 wurden in freier Form beschrieben [13,22 2owr 1 , Fußnote 1 2owq, 3 nt7, 4dof, 4dog] und als unproduktiver 2 Fußnote 2 Uracil-Komplex [14 4lzb]. Die dreidimensionale Struktur von D4 behält die Gesamtfaltung der UNG-Proteine ​​bei – ein zentrales 4-strängiges paralleles β-Faltblatt mit α-Helices auf beiden Seiten (Abb. 1). Es gibt zwei zusätzliche β-Faltblätter in D4 (Reste 2-6/12-16 und 107-109/215-217), die in keiner anderen UNG zu sehen sind (Abb. 1a, b). Obwohl die UNG-spezifischen Motive sehr unterschiedlich sind, ist die Architektur der Uracil-bindenden Tasche in D4 bemerkenswert ähnlich zu anderen UNGs und fünf der sechs die Tasche bildenden Reste sind identisch. Zu diesen Resten gehören das katalytische Asp68 und His181, die für die Bindung von Uracil und die Spaltung der glykosidischen Bindung geeignet positioniert sind [14]. Angesichts der einzigartigen Eigenschaften von Pockenvirus-UNGs sollte es hochinteressant sein zu verstehen, wie sich diese Proteine ​​an die Nutzung der veränderten Motive für die DNA-Bindung und das Erkennen und Ausschneiden von Uracil anpassen.

Aufbau von D4. A. Gesamtstruktur von D4. Cartoon-Diagramm zeigt die dreidimensionale Struktur von D4. Die A- und B-Untereinheiten aus der freien D4-Struktur (4dof) werden angezeigt und beschriftet. Der C-terminale Strang des zentralen β-Faltblatts ist grün gefärbt. Zusätzliche β-Faltblätter, die in D4-Strukturen zu sehen sind, sind gefärbte magentafarbene Aminosäurereste, die die markierten Stränge bilden. Strukturelemente, die an Homodimer-Wechselwirkungen in verschiedenen D4-Strukturen beteiligt sind, sind in Blau, Violett und Grün eingefärbt. B. Vergleich mit menschlicher UNG (hUNG). Cartoon-Zeichnung zeigt die Überlagerung der Struktur von substratfreier hUNG (1akz) in Weizenfarbe und D4 (4dof Untereinheit ein) in Cyan. Die Gesamtstrukturfaltung ist für beide Proteine ​​sehr ähnlich. Die N- und C-terminalen zusätzlichen β-Faltblätter in D4 sind dunkel gefärbt. N- und C-terminale Enden von D4 sind markiert. C. A20 Bindung auf D4. Die Cartoon-Zeichnung zeigt die A20-Bindungsstelle auf der D4-Struktur. Struktur von D4 (4dof, Untereinheit A, Cyan) wurde der D4-Kette A des D4:A20-Komplexes (4od8, Gelb). A20-Segment ab 4od8 wird in Weizenfarbe angezeigt. Die Aminosäurereste Arg167 und Pro173 von D4 und Trp43 und Lys44 von A20 spielen eine wichtige Rolle bei der Bindung. Diese Reste sind als Stabmodelle dargestellt. N- und C-Terminus von A20 sind markiert

Alle Kristallstrukturen von freiem D4 und die Struktur des Uracil-Komplexes weisen eine charakteristische dimere Packung auf. Obwohl spezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen D4-Untereinheiten bis zu einem gewissen Grad variieren, ist die Dimer-Schnittstelle in diesen Strukturen sehr ähnlich [13, 14, 22]. Diese Homodimer-Schnittstelle wird von Resten gebildet, die sich im C-terminalen β-Strang des zentralen β-Faltblatts in jeder Untereinheit befinden, einer flexiblen Schleife/kurzen Helix (Reste 161–173) und einer langen Helix (187–206), die sich in der Nähe des . befindet C-Terminus. Die erste Stelle, die sich in einer Schleife befindet, die die beiden C-terminalen β-Stränge verbindet, stellt einen der flexibelsten Bereiche in den D4-Strukturen dar (Abb. 1a). Bei hoher Proteinkonzentration nutzt D4 dieselbe Grenzfläche zur Dimerisierung in Lösung. Wenn jedoch A20 vorhanden ist, führt eine sehr spezifische Wechselwirkung an dieser Oberfläche zur Bildung eines D4:A20-Heterodimers (Abb. 1c) [19, 20]. Kumulative strukturelle und biochemische Beweise deuten darauf hin, dass D4 im prozessiven DNA-Polymerase-Komplex katalytisch aktiv bleibt und möglicherweise kontinuierlich Uracil aus neu synthetisierter DNA scannt und entfernt [18–20]. Details über die Fähigkeit von D4, DNA zu binden und zu scannen, seine enzymatische Funktion und Substratspezifität wurden berichtet [22, 23]. Eine strukturelle Charakterisierung der DNA-Bindungsstelle(n) auf D4 fehlt jedoch.

Hier berichten wir über die erste detaillierte Ansicht von D4-DNA-Wechselwirkungen aus einer Kristallstruktur von D4 im Komplex mit einem unspezifischen unbeschädigten dsDNA. Die Struktur dieses Komplexes zeigt erstmals die DNA-bindenden Wechselwirkungen einer UNG aus der Pockenvirus-Familie. Es stellt auch die erste dreidimensionale Struktur einer UNG dar, die an eine wirklich unbeschädigte . gebunden ist dsDNA und bietet eine repräsentative Momentaufnahme der anfänglichen Interaktion zwischen UNG und DNA. Wir präsentieren auch einen Strukturvergleich von D4 und humaner UNG (hUNG), für die Kristallstrukturen im DNA-freien Zustand, im Komplex mit Uracil-haltiger DNA und im Komplex mit einer DNA mit abasischer Stelle vorliegen [6–8, 10 ].


John Wise

Moderne Computermethoden geben neue Einblicke in die Struktur und Funktion von Proteinen und Enzymen. Im Folgenden werden zwei Beispiele für die visuelle Ausgabe dieser Berechnungsmethoden angegeben.

Linkes Feld:Ein kurzes Modellpeptid, modifiziert an einem Cysteinrest mit einer stabilen Nitroxid-Sonde für freie Radikale. Proteinmodifikationen wie diese erlauben es, die Struktur und Funktion eines Proteins im Detail zu bestimmen.

Rechtes Panel:Eine weitere modellierte Spinsonde für freie Radikale. Das Peptidrückgrat ist als violette Linie dargestellt. Der Rückstand wird in den für jeden Atomtyp kodierten Farben angezeigt (Dunkelblau = Stickstoff, Hellblau = Kohlenstoff, Rot = Sauerstoff, Weiß = Wasserstoff, Gelb = Schwefel).

Linkes Feld:Modell eines transkriptionellen Kontrollproteins, das an seine spezifische DNA-Bindungssequenz gebunden ist. Protein-DNA-Interaktionen wie diese sind der gemeinsame Ausgangspunkt für die Kontrolle der Genexpression. Diese Struktur des 434 Cro-Proteins komplexiert mit einem 20 Basenpaar langen DNA-Stück, das seinen Operator OR1 enthält, wurde von A. Mondragon & S. C. Harrison (Proteindatenbank-Zugangscode 3cro) bestimmt. Die Sekundärstruktur des Proteins ist schematisch grau dargestellt, die DNA-Doppelstränge sind farblich für jeden Atomtyp kodiert (siehe linkes Feld - Orange = Phosphor).

Rechtes Panel:Modell einer Multidrug-Resistenz-Pumpe vom Menschen, die einen sterischen Konflikt zwischen einem Substrat und einem Arzneimittel zeigt. Diese Proteine ​​sind wichtig für Krebs- und virale Chemotherapien. Die violetten Stäbchen und gelben Bänder zeigen das Enzym und die Wirkstoff- und Substratmoleküle sind mit van der Waals-Kugeln dargestellt.

ausgewählte Publikationen

Hornung, T., Volkov, O., Zaida, T.M.A., Delannoy, S., Wise, J. und Vogel, P.D. &bdquoStruktur des zytosolischen Teils der Untereinheit b-Dimer von Escherichia coli FoF1-ATP Synthase&rdquo (2008) Biophys. J. 94, 5053-5064

Weise, J. G. und Vogel, P.D. &ldquoUntereinheit b-Dimer der ATP-Synthase von Escherichia coli kann linkshändige Coiled-Coils bilden&rdquo (2008) Biophysikalische J. 94, 5040-5052

Hossann, M., Li, Z., Shi, Y., Kreilinger, U., Blattner, J., Vogel, P.D., Yuan, J.M., Wise, J.G., Trommer, W.E. (2006) &bdquoNovel Immunotoxin: A Fusion Protein, bestehend aus Gelonin und einem Acetylcholinrezeptorfragment als potentielles Immuntherapeutikum zur Behandlung von Myasthenia gravis&rdquo, Protein Expression and Purification46, 73-84.

Motz C, Hornung T, Kersten M, McLachlin DT, Dunn SD, Wise JG, Vogel PD (2004) &ldquoDas Dimer der Untereinheit b der FoF1-ATP-Synthase: Interaktion mit F1-ATPase, wie durch ortsspezifische Spinmarkierung abgeleitet&rdquo, J Biol. Chem.-Nr. 279, 49074-81.

Guo, C., Li, Z., Shi, Y., Xu, M., Wise, JG, Trommer, WE, Yuan, J. (2004) &bdquoIntein-vermittelte Fusionsexpression, hocheffiziente Rückfaltung und einstufige Reinigung von Gelonintoxin&rdquo, Protein Expression and Purification 37, 361-367.

Fromknecht, K., Vogel, P. und Wise, J.G. (2003) &bdquoKombinatorisches Redesign der DNA-Bindungsspezifität eines prokaryotischen Helix-Turn-Helix-Repressors&rdquo, J. Bacteriology 185, 475-81

Guhr, P., Neuhofen, S., Coan, C., Wise, J.G. und Vogel, P.D., (2002) &bdquoNew Aspects on the Mechanism of GroEL-Assisted Protein Folding&rdquo, Biochim. Biophys. Akta 1596, 326-335

Chelius, D., Loeb-Hennard, C., Fleischer, S., McIntyre, JO, Marks, AR, De, S., Hahn, S., Jehl, MM, Moeller, J., Philipp, R., Wise , JG & Trommer, W.E. (2000) &ldquoPhosphatidylcholin-Aktivierung von humanen (R)-3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Mutanten, denen Sulfhydryle im aktiven Zentrum fehlen: Ortsgerichtete Mutagenese eines neuen rekombinanten Fusionsproteins&rdquo, Biochemistry 39, 9687-9697.

Kersten, M. V., Dunn, S. D., Wise, J. G. und Vogel, P. D. &ldquoOrtsgerichtete Spinmarkierung der katalytischen Zentren gibt Einblick in die Struktur des Fo F1-ATP-Synthase von Escherichia coli&rdquo, (2000) Biochemistry 39, 3856-3860.

Vogel, P. D. und Weise J. G. &ldquoStudienbrief Technik in der Medizin: Gentechnische Arbeitsmethoden&rdquo, (1999) Zentrum für Fernstudien & Universitäre Weiterbildung, Universität Kaiserslautern

Loesel, R. M., Wise, J. G. und Vogel, P.D. (1997) &ldquoAsymmetrie in katalytischen Zentren, aber nicht in nichtkatalytischen Zentren im Escherichia coli F1-ATPase&rdquo, Biochemie 36, 1188-1193

Schanding, T., Vogel, P.D., Trommer, W.E. und Wise, J. G. (1996) &ldquoSynthesis of a pH-Sensitive Spin-marked Cyclohexylcarbodiimid Derivative for Sonding Protonation Reactions in Proton-Pumping Enzymes&rdquo, Tetrahedron 52, 5783-5792

Von mir verfasste oder mitverfasste Artikel über Evolution und den Wert der Wissenschaft

Aus den Dallas MORNING NEWS:

"Aussprechen gegen intelligentes Design" 5. April 2007

Aus der Zeitung SMU DAILY CAMPUS:

"Intelligentes Design ist keine Wissenschaft: Warum das wichtig ist" 4. Mai 2007

"Ausweisansprüche halten nicht stand" 26. April 2007

"Brief an den Herausgeber - Täuschende Taktiken vom Discovery Institute" 25. April 2007


Methoden zum Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen

Die Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) kann verwendet werden, um die Transkriptionsregulation durch Histonmodifikation (Epigenetik) oder Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen zu überwachen. Die ChIP-Assay-Methode ermöglicht die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen, indem die Zellen mit Formaldehyd oder anderen Vernetzungsreagenzien behandelt werden, um die Wechselwirkungen für die nachgeschaltete Aufreinigung und Detektion zu stabilisieren. Die Durchführung von ChIP-Assays erfordert die Kenntnis des zu analysierenden Zielproteins und der zu analysierenden DNA-Sequenz, da die Forscher einen Antikörper gegen das interessierende Protein und PCR-Primer für die interessierende DNA-Sequenz bereitstellen müssen. Der Antikörper wird verwendet, um den Protein-DNA-Komplex selektiv aus den anderen genomischen DNA-Fragmenten und Protein-DNA-Komplexen auszufällen. Die PCR-Primer ermöglichen eine spezifische Amplifikation und Detektion der Ziel-DNA-Sequenz. Die quantitative PCR-Technik (qPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Menge der Ziel-DNA-Sequenz. Der ChIP-Assay eignet sich für Array-basierte Formate (ChIP-on-chip) oder die direkte Sequenzierung der vom immunpräzipitierten Protein eingefangenen DNA (ChIP-seq).

  • Schnappschuss einer spezifischen Protein-DNA
    Wechselwirkungen, wie sie in lebenden Zellen vorkommen
  • quantitativ in Verbindung mit qPCR-Analyse
  • Fähigkeit, einen Promotor für verschiedene Proteine ​​zu profilieren
  • Forscher müssen Antikörper in ChIP-Qualität beschaffen
  • erfordert die Entwicklung spezifischer Primer
  • schwer an Hochdurchsatz-Screening anzupassen

Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für erfolgreiche Chromatin-Immunopräzipitations-(ChIP)-Assays

Diese aktualisierte Übersicht über das ChIP-Verfahren enthält zusätzliche Details zur Auswahl von primären Antikörpern (d. h. ChIP-validierte Antikörper). Die Application Note beschreibt und liefert auch Beispiele für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) als Technik zur Untersuchung der Epigenetik, da sie es Forschern ermöglicht, eine Momentaufnahme spezifischer Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erfassen.

Unser 72-seitiges technisches Handbuch zur Proteininteraktion bietet Protokolle sowie technische und Produktinformationen, um die Ergebnisse von Proteininteraktionsstudien zu maximieren. Das Handbuch bietet Hintergrundinformationen, hilfreiche Hinweise und Ratschläge zur Fehlerbehebung für Immunpräzipitations- und Co-Immunpräzipitationsassays, Pulldown-Assays, Far-Western-Blotting und Crosslinking. Das Handbuch enthält auch einen erweiterten Abschnitt über Methoden zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen, einschließlich ChIP, EMSA und RNA-EMSA. Das Handbuch ist eine unverzichtbare Ressource für jedes Labor, das Proteininteraktionen untersucht.

Inhalt: Einführung in Proteininteraktionen, Co-Immunpräzipitationsassays, Pulldown-Assays, Far-Western-Blotting, Proteininteraktionskartierung, Hefe-Zwei-Hybrid-Reporterassays, Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays [EMSA], Chromatin-Immunpräzipitationsassays (ChIP), Protein –Nukleinsäurekonjugate und mehr.

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Der DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) wird verwendet, um Proteine ​​zu untersuchen, die an bekannte DNA-Oligonukleotidsonden binden, und kann verwendet werden, um den Grad der Affinität oder Spezifität der Wechselwirkung zu bestimmen. Die Technik basiert auf der Beobachtung, dass Protein-DNA-Komplexe langsamer wandern als freie DNA-Moleküle, wenn sie einer nicht denaturierenden Polyacrylamid- oder Agarosegelelektrophorese unterzogen werden. Da die DNA-Migrationsrate bei Proteinbindung verschoben oder verzögert wird, wird der Assay auch als Gelshift- oder Gelretardationsassay bezeichnet. Durch Hinzufügen eines proteinspezifischen Antikörpers zu den Bindungskomponenten entsteht ein noch größerer Komplex (Antikörper-Protein-DNA), der während der Elektrophorese noch langsamer wandert. Dies wird als „Supershift“ bezeichnet und kann verwendet werden, um Proteinidentitäten zu bestätigen. Bis zur Konzeption der EMSA wurden Protein-DNA-Wechselwirkungen hauptsächlich durch Nitrocellulosefilter-Bindungsassays mit radioaktiv markierten Sonden untersucht.

  • Nachweis von DNA-bindenden Proteinen in geringer Menge aus Lysaten
  • Testen von Mutationen der Bindungsstelle unter Verwendung vieler Sondenkonfigurationen mit demselben Lysat
  • Testen der Bindungsaffinität durch DNA-Sonden-Mutationsanalyse
  • nicht-radioaktive EMSA mit biotinylierten oder fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden möglich
  • analysieren Protein-DNA-Wechselwirkungen in vitro
  • schwer zu quantifizieren
  • müssen einen Supershift-Assay mit Antikörpern durchführen, um die Proteinidentität in einem Komplex sicherzustellen

Traditionell wurden DNA-Sonden mit ³²P radiomarkiert, indem ein [γ-³²P]dNTP während einer 3'-Auffüllreaktion unter Verwendung des Klenow-Fragments eingebaut wurde, oder durch 5'-Endmarkierung unter Verwendung von [γ-³²P]ATP und T4-Polynukleotidkinase. Nach der Elektrophorese wird das Gel einem Röntgenfilm ausgesetzt, um die Ergebnisse zu dokumentieren. Das Thermo Scientific LightShift Chemilumineszenz-EMSA-Kit ist ein nicht-radioaktiver Assay, der eine robuste und empfindliche Leistung bietet. Das Kit enthält Reagenzien zum Einrichten und Anpassen von DNA-Bindungsreaktionen, einen Kontrollsatz aus DNA und Proteinextrakt zum Testen des Kit-Systems, stabilisiertes Streptavidin-HRP-Konjugat zur Sondierung des biotinmarkierten DNA-Ziels und ein außergewöhnlich empfindliches chemilumineszierendes Substratmodul zur Erkennung.

Chemilumineszierende EMSA von vier verschiedenen DNA-Protein-Komplexen. Biotin-markierte Zielduplexe hatten eine Größe von 21–25 bp. Die Transkriptionsfaktoren Oct-1, AP1 und NF-κB wurden aus HeLa-Kernextrakt abgeleitet. EBNA-1-Extrakt wird als Kontrolle im LightShift Chemiluminescent EMSA Kit bereitgestellt. Unmarkierte spezifische Kompetitorsequenzen (wo verwendet) waren in einem 200-fachen molaren Überschuss gegenüber dem markierten Ziel vorhanden. Die Belichtungszeiten für Röntgenfilme für jedes System reichten von 2 Minuten für EBNA, Oct-1 und AP1 und 5 Minuten für NF-κB.


<p>Dieser Abschnitt bietet nützliche Informationen über das Protein, hauptsächlich biologisches Wissen.<p><a href='/help/function_section' target='_top'>Mehr. </a></p> Funktion i

Protein, das sowohl an der DNA-Reparatur als auch an der Protein-Ubiquitinierung beteiligt ist, als Teil des UV-DDB-Komplexes bzw. des DCX-Komplexes (DDB1-CUL4-X-box) (PubMed:10882109, PubMed:11278856, PubMed:11705987, PubMed: 9892649, PubMed:12732143, PubMed:15882621, PubMed:16473935, PubMed:18593899).

Kernkomponente des UV-DDB-Komplexes (UV-damaged DNA-binding protein complex), einem Komplex, der UV-induzierte DNA-Schäden erkennt und Proteine ​​des Nukleotidexzisions-Reparaturwegs (NER-Weg) rekrutiert, um die DNA-Reparatur einzuleiten (PubMed:10882109 .). , PubMed:11278856, PubMed:11705987, PubMed:16260596, PubMed:12944386, PubMed:14751237.

Der UV-DDB-Komplex bindet bevorzugt an Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere (CPD), 6-4 Photoprodukte (6-4 PP), apurinische Stellen und kurze Fehlpaarungen (PubMed:10882109, PubMed:11278856, PubMed:11705987, PubMed:16260596, PubMed: 12944386).

Funktioniert auch als Substraterkennungsmodul für den DCX (DDB2-CUL4-X-box) E3-Ubiquitin-Protein-Ligase-Komplex DDB2-CUL4-ROC1 (auch bekannt als CUL4-DDB-ROC1 und CUL4-DDB-RBX1) (PubMed:12732143 , PubMed:15882621, PubMed:16473935, PubMed:18593899, PubMed:26572825).

Der DDB2-CUL4-ROC1-Komplex kann Histon H2A, Histon H3 und Histon H4 an Stellen UV-induzierter DNA-Schäden ubiquitinieren (PubMed:16678110, PubMed:16473935).

Die Ubiquitinierung von Histone kann ihre Entfernung aus dem Nukleosom erleichtern und die anschließende DNA-Reparatur fördern (PubMed:16678110, PubMed:16473935).

Der DDB2-CUL4-ROC1-Komplex ubiquitiniert auch XPC, was die DNA-Bindung durch XPC verstärken und NER fördern kann (PubMed:15882621).

Der DDB2-CUL4-ROC1-Komplex ubiquitiniert auch KAT7/HBO1 als Reaktion auf DNA-Schäden, was zu dessen Abbau führt: erkennt KAT7/HBO1 nach Phosphorylierung durch ATR (PubMed:26572825).

<p>Manuell kuratierte Informationen, für die experimentelle Beweise veröffentlicht wurden.</p> <p><a href="/manual/evidences#ECO:0000269">Mehr. </a></p> Manuelle Behauptung basierend auf dem Experiment in i


Kennzeichnung und Detektion

Wenn große DNA-Mengen in EMSA-Reaktionen verwendet werden, können die DNA-Banden durch Ethidiumbromid-Färbung oder andere fluoreszierende DNA-Färbungen sichtbar gemacht werden. Allerdings können auch die Träger- und unspezifische Kompetitor-DNA, die in den meisten EMSA-Bindungsreaktionen verwendet werden, gefärbt werden und ein hohes Hintergrundsignal verursachen. Dieses Nachweisverfahren erfordert auch viel DNA, wobei es normalerweise bevorzugt (und wirtschaftlich) ist, niedrige DNA-Konzentrationen in Bindungsreaktionen zu verwenden, um unspezifische Bindungen zu begrenzen. Daher besteht der üblichere Ansatz darin, die Sonde vor der Durchführung des Experiments zu markieren, um ihren spezifischen Nachweis nach der Elektrophorese zu ermöglichen. Traditionell wurden DNA-Sonden mit ³²P radiomarkiert, indem ein [γ-³²P]dNTP während einer 3'-Auffüllreaktion unter Verwendung des Klenow-Fragments eingebaut wurde, oder durch 5'-Endmarkierung unter Verwendung von [γ-³²P]ATP und T4-Polynukleotidkinase. Nach der Elektrophorese wird das Gel einem Röntgenfilm ausgesetzt, um die Ergebnisse zu dokumentieren.

Viele Labore sind aufgrund der Kosten und regulatorischen Bedenken im Zusammenhang mit Radioaktivität auf alternative EMSA-Detektionssysteme umgestiegen. Da dNTPs modifiziert mit Haptenen (z. B. Biotin und Digoxigenin) oder Fluoreszenzfarbstoffen erhältlich sind, gibt es zahlreiche nicht radioaktive Methoden zur Durchführung von EMSA. Fluoreszierende Sonden können mit Hilfe eines geeigneten Bildgebungssystems im Gel nachgewiesen werden, aber diese Methode ist bisher nicht sehr beliebt, da teure Instrumente benötigt werden und ihre Empfindlichkeit noch nicht mit radioaktiven Sonden vergleichbar ist.

Hapten-modifizierte DNA-Sonden können über sekundäre Nachweisreagenzien wie Streptavidin oder Anti-DIG-Antikörper in Systemen mit enzymatischen Substraten ähnlich denen für Western-Blotting sichtbar gemacht werden. Der einzige zusätzliche Schritt, der für dieses Verfahren erforderlich ist, besteht darin, die getrennten Protein- und DNA-Proben auf einen geeigneten Membranträger zu übertragen. Bei Verwendung mit einem geeigneten Substrat ist das Biotin-Streptavidin-System sehr robust und kann optimiert werden, um Nachweisgrenzen zu erreichen, die denen mit radioaktiven Sonden entsprechen. Es ist wichtig anzumerken, dass die Durchführung solcher Blotting-Assays mit Nukleotiden die Verwendung von positiv geladenen Membranen erfordert, um die kleinen Nukleinsäurefragmente einzufangen und zu immobilisieren. Obwohl dieser Membrantyp gewisse technische Herausforderungen in Bezug auf Blockierung und unspezifische Bindung mit sich bringt, können diese mit optimierten Kits überwunden werden. Das Thermo Scientific Pierce RNA 3'-End-Biotinylierungskit ist beispielsweise für die Markierung des 3-Prime-terminalen Endes von RNA-Sonden optimiert, um deren Verwendung als Sonden oder Targets in EMSA und anderen Methoden zur Untersuchung von Protein-RNA-Wechselwirkungen zu erleichtern.

3’-Ende-Markierung von RNA. Die T4-RNA-Ligase katalysiert die Ligation des 3'-OH aus der RNA mit dem biotinylierten Cytidinbisphosphat aus dem Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit. Diese Biotin-Markierung ermöglicht den Nachweis mit Avadin-Proteinen. Die Verwendung dieses Kits führt zur 3'-Endmarkierung von RNA-Sonden.


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