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Was ist der Unterschied zwischen einem freien Chromosomenfragment und einem extrachromosomalen Array?

Was ist der Unterschied zwischen einem freien Chromosomenfragment und einem extrachromosomalen Array?


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Dies bezieht sich auf eine Übersicht über die Mosaikanalyse von C. elegans von Yochem und Herman, in der die Autoren zwischen freien Chromosomenfragmenten und extrachromosomalen Arrays unterscheiden.

Für erstere verweisen sie auf Herman 1984. Für letztere verweisen sie auf Lackner et al. 1994 und Miller et al. 1996, aber dies sind Studien, die extrachromosomale Arrays verwenden, keine Veröffentlichungen, die sie per se als Technik definieren.

Ich bin neugierig, was der Unterschied ist - ich habe den Eindruck, dass extrachromosomale Arrays sind Fragmente mit vielen Kopien des interessierenden Gens + einem Marker.


Ich habe meinen Professor gefragt, und die Antwort scheint Unterschiede sowohl in der Generation als auch im Endprodukt zu sein.

Freie Chromosomenfragmente entstehen durch Bestrahlung/andere Schädigung der Keimbahn bei einem Tier. Durch eine Reihe von Kreuzungen ist es möglich, einzelne Fragmente (die eine Duplikation Ihres interessierenden Gens sowie einen Marker enthalten) in einen mutierten Hintergrund einzuführen. Das extrachromosomale Fragment geht während der Mitose zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung verloren, und in einer Mosaikanalyse können Sie nach dem Verlust Ihres Markers (und damit dem Verlust des Wildtyp-Allels) suchen und sehen, ob in bestimmten Zellen yfg-Produkt erforderlich ist Typen für einen Wildtyp-Phänotyp.

Extrachromosomale Arrays werden durch Klonen erstellt, und Sie haben normalerweise viele Kopien sowohl des Gens als auch des Markers. Es ist das gleiche Prinzip wie freie Chromosomenfragmente in Bezug auf die Mosaikanalyse, aber es ist sehr leistungsfähig, da Sie einzelne Gene (im Gegensatz zu Bestrahlung und Hoffnung, yfg auf einem Fragment zu entdecken) und Marker (und jetzt können Sie nicht-endogene Marker) leicht klonen wie GFP).

Obwohl extrachromosomale Arrays vergleichsweise einfacher zu generieren sind, besteht das Problem darin, dass Sie am Ende viele Kopien des Gens erhalten, was zu nicht-endogenen Dosierungen führt. Auch wenn dies nicht zu einem völlig anderen mutierten Phänotyp in den Zellen führt, ist es möglich, dass sich genügend dieser Proteine ​​bei der Mitose in die Tochterzellen segregieren, so dass Sie Ihr Genprodukt auch bei Verlust des Fragments noch in der Nähe haben könnten in den Tochterzellen (wenn Ihr Markerprotein nicht auch so segregiert wurde, könnten Sie falsche Schlussfolgerungen über die Notwendigkeit des yfg-Produkts in diesen bestimmten Zellen ziehen).


Identifizierung von Chromosomensequenzmotiven, die meiotische Paarung und Synapse in vermitteln C. elegans

Caenorhabditis elegans Chromosomen enthalten spezialisierte Regionen, sogenannte Paarungszentren, die während der Meiose homologe Paarung und Synapse vermitteln. Vier verwandte Proteine, ZIM-1, 2, 3 und HIM-8, assoziieren mit diesen Stellen und werden für ihre wesentlichen Funktionen benötigt. Hier zeigen wir, dass kurze Sequenzelemente, die in den entsprechenden Chromosomenregionen angereichert sind, diese Proteine ​​selektiv rekrutieren in vivo. In vitro Eine Analyse mit SELEX zeigt, dass die Bindungsspezifität jedes Proteins aus einer Kombination von zwei Zinkfingern und einer angrenzenden Domäne resultiert. Die Insertion eines Clusters von Rekrutierungsmotiven in ein Chromosom, dem sein endogenes Paarungszentrum fehlt, reicht aus, um die homologe Paarung, Synapse, Crossover-Rekombination und -Segregation wiederherzustellen. Diese Ergebnisse helfen zu beleuchten, wie Chromosomenstellen wesentliche Aspekte der meiotischen Chromosomendynamik vermitteln.


Ergebnisse

SDC-Proteine ​​fungieren in vivo als Komplex zur Unterdrückung vonsie-1 und x Chromosomen

Wie unterscheidet SDC-2 zwischen verschiedenen Zielen und unterdrückt sie unterschiedlich stark? Um diese Frage zu beantworten, identifizierten wir zunächst Proteine, die mit SDC-2 at . funktionieren sie-1. sdc-2 bekannt war, genetisch mit . zu interagieren sdc-1 und sdc-3 Geschlechtsbestimmung und Dosiskompensation in XXTiere (Villeneuve und Meyer 1990 Davis und Meyer 1997 Dawes et al. 1999), aber die genaue molekulare Rolle von SDC-1 und SDC-3 wurde nicht verstanden. Hier präsentieren wir drei Beweislinien dafür, dass die drei SDC-Proteine ​​in vivo einen Komplex bilden, um zu reprimieren sie-1 undx Chromosomen direkt.

Zuerst kolokalisieren SDC-1, SDC-2 und SDC-3 alle zu x Chromosomen und to sie-1 regulatorische Regionen in vivo. Hermaphroditen mit mehreren Tandemkopien von sie-1 regulatorische Regionen auf GFP-markierten extrachromosomalen Arrays wurden mit affinitätsgereinigten SDC-Antikörpern gefärbt (siehe Materialien und Methoden). Die SDC-Proteinlokalisation wurde in adulten Darmkernen untersucht, deren große Größe und polyploider DNA-Gehalt den Test erleichtern. Das hochgeladene SDC-2-Protein, das ein Coiled-Coil-Motiv trägt, lokalisiert an x Chromosomen und sie-1 Arrays in adulten Darmzellen (Abb. 1A), wie zuvor in Embryonen gezeigt (Dawes et al. 1999), wodurch der Assay validiert wurde. Die Zinkfingerproteine ​​SDC-1 und SDC-3 (Nonet und Meyer 1991, Klein und Meyer 1993) kolokalisierten mit SDC-2 at sie-1 und weiter x Chromosomen (Abb. 1A,B), im Einklang mit einer direkten Rolle für diese Proteine ​​in sie-1Repression und Dosiskompensation. In XX Tiere, die eine tragensdc-3(Tra)-Mutation, Lokalisierung von SDC-1, SDC-2 und SDC-3 zu sie-1 stark reduziert, aber die Lokalisierung auf diex Chromosom schien unbeeinflusst ( Fig. 1F Daten nicht gezeigt), was mit der Mutation übereinstimmt, die die Geschlechtsbestimmung beeinträchtigt, aber nicht die Dosiskompensation (DeLong et al. 1993). sdc-3(Tra) deprimiertsie-1 Transkription, die 100 % der XX Tiere stark maskulinisiert werden, indem ein mutmaßliches ATP-Bindungsmotiv in SDC-3 zerstört wird (DeLong et al. 1993 Klein und Meyer 1993). Daher werden SDC-1, SDC-2 und SDC-3 entsprechend lokalisiert, um sowohl eine genspezifische als auch eine chromosomenweite Repression zu erreichen.

Die x-Chromosom-Dosiskompensationsmaschinerie lokalisiert auf sie-1 regulatorische Regionen in vivo. Konfokale Bilder eines einzelnen Darmkerns (EINF) oder ein embryonaler Kern (G,H) von Wildtyp oder Mutante [sdc-3(Tra) oder dpy-27] XX Tiere, die mit SDC-, DPY- oder MIX-Antikörpern immungefärbt wurden, wie in jedem Panel angegeben. Die Kerne enthalten extrachromosomale DNA-Arrays, die mehrere Kopien von sie-1 regulatorische Regionen (Plasmid pHD25 von Fig. 3A),lac Operator wiederholt (lacO) und ein Transgen, das ein LacI-GFP-Fusionsprotein kodiert. LacI-GFP-Repressor-Bindung anlacO ermöglicht die Array-Detektion durch GFP-Autofluoreszenz. Kolokalisation (gelb) zwischen Arrays (grün) und Antikörpern (rot) in den zusammengeführten Bildern (rechts Panels) zeigten eine Assoziation des Proteins mit sie-1 regulatorische Sequenzen. Pfeilspitzen markieren diex Chromosomen. In Übereinstimmung mit sdc-3(Tra) verursacht Derepression von sie-1, blockiert es die Assoziation von SDC- und DPY-Proteinen mit sie-1.

Zweitens interagieren die SDC-Proteine ​​physikalisch, um einen Komplex zu bilden. Antikörper gegen eines der SDC-Proteine ​​koimmunpräzipitierten alle drei SDC-Proteine ​​aus embryonalen Wildtyp-Extrakten (Fig. 2B). Diese Präzipitationsreaktionen waren spezifisch, da keines der Präimmunseren eines der SDC-Proteine ​​präzipitierte (Fig. 2B) und keiner der SDC-Antikörper präzipitierte (Daten nicht gezeigt) oder ihre verwandten Proteine ​​aus Extrakten der jeweilig sdc Null-Mutanten.

Die SDC-Proteine ​​bilden in vivo einen Komplex. (EIN) Nachweis von SDC-Proteinen in embryonalen Extrakten. Western Blots von Extrakten aus Wildtyp (N2) oder sdc (null) mutierte Embryonen, die eine Deletion oder Nonsense-Mutation in der sdc Gen wurden mit dem links angezeigten SDC-Antikörper sondiert. Proteine ​​von 250 kD, 240 kD (ein Dublett) und 140 kD wurden durch SDC-2-, SDC-3 bzw. SDC-1-Antikörper im Wildtyp nachgewiesen, aber nicht sdc (null) Extrakte, die Antikörperspezifität zeigen. (B) Antikörper gegen ein beliebiges SDC-Protein coimmunpräzipitierten alle drei SDC-Proteine. Coimmunpräzipitationen wurden mit jedem SDC-Antikörper an embryonalen Wildtyp-Extrakten durchgeführt. Das coimmunpräzipitierte Material wurde durch SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem links angegebenen Antikörper immungeblottet. (PI) Präimmunseren für SDC-1-Antikörper, (IP) Immunpräzipitation.

Drittens unterdrückt der SDC-Komplex die Transkription von sie-1, da ektopische Produktion von SDC-Proteinen in XO Tiere (normalerweise Männchen) induzierten eine hermaphroditische sexuelle Entwicklung. SDC-2 wird normalerweise nur in . ausgedrückt XX Tiere, und die ektopische Expression von SDC-2 transformierte 36% der XO Tiere in Hermaphroditen (Dawes et al. 1999), eine sexuelle Transformation, die Wildtyp erfordertesdc-3 Aktivität. Angesichts der unvollständigen Feminisierung mit SDC-2 allein überexprimierten wir SDC-2 gleichzeitig mit entweder SDC-1 oder SDC-3, um ihren kombinierten Beitrag zur Hermaphroditenentwicklung zu bewerten. Überexpression von nur SDC-1 (Daten nicht gezeigt) oder SDC-3 (Davis und Meyer 1997) konnte nicht feminisiert werden XO Tiere. Die Überexpression sowohl von SDC-2 als auch von SDC-1 erhöhte jedoch die XOFeminisierung, die ∼88 % davon verursacht XO sexuell zu transformierende Tiere (Tabelle 1). Fast alle waren selbstfruchtbar, im Gegensatz zu transformierten XO Tiere, die nur SDC-2 exprimierten. Erhöhung des Niveaus von SDC-3 in XOTiere verstärkten, wie durch Antikörperfärbung verifiziert, die durch SDC-2 verursachte Feminisierung (31 % Feminisierung mit beiden Proteinen) nicht, was darauf hindeutet, dass SDC-3 nicht limitierend war (Tabelle 1). Die Synergie zwischen SDC-1 und SDC-2 bei der Feminisierung XO Tiere in einer SDC-3-abhängigen Weise liefert einen funktionellen Beweis dafür, dass alle drei SDC-Proteine ​​zusammenwirken, um zu unterdrücken sie-1 direkt.

sdc-1 verbessert sdc-2 beim FeminisierenXO Tiere

SDC-Proteine ​​rekrutieren die x-Chromosom-Dosiskompensationskomplex zu sie-1

Da SDC-2 und SDC-3 eine zentrale Rolle beim Aufbau des Dosiskompensationskomplexes auf x Chromosomen (Chuang et al. 1996Davis und Meyer 1997 Dawes et al. 1999) fragten wir, ob SDC-Proteine ​​diesen Komplex rekrutieren, um sie-1. Der Dosiskompensationskomplex umfasst das Dosiskompensations-spezifische Protein DPY-27 und die Doppelfunktionsproteine ​​DPY-26 und MIX-1, die auch bei Meiose bzw. Mitose wirken (Chuang et al. 1996 Lieb et al. 1996, 1998 ). Die Dosiskompensationsproteine ​​ähneln Komponenten des weit verbreiteten Kondensinkomplexes, der in vitro die mitotische Chromosomenkondensation antreibt, was darauf hindeutet, dass die Regulation vonx-Chromosomenexpression beinhaltet die Modulation der Chromatinstruktur (Koshland und Strunnikov 1996 Hirano 2000). Alle Dosiskompensationsproteine ​​außer SDC-2 benötigen SDC-3 für ihre Lokalisation am x Chromosom (Chuang et al. 1996 Davis und Meyer 1997) und SDC-3 wiederum benötigt SDC-2 für seine Lokalisation auf demx Chromosom (Davis und Meyer 1997). SDC-2 kann diex Chromosom ohne andere Dosiskompensationsproteine ​​(Dawes et al. 1999), was darauf hindeutet, dass es die x Chromosom und verleiht der Dosiskompensation Chromosomenspezifität. Nicht alle Komponenten der Dosiskompensation erscheinen wesentlich für sie-1Repression, weil die seltenen dpy-26, dpy-27, oderdpy-28 XX Mutanten, die der Letalität entgehen, entwickeln sich als Hermaphroditen (Plenefisch et al. 1989). Daher ist die Entdeckung der kompletten Dosiskompensationsmaschinerie auf sie-1 würde zeigen, dass SDC-2 diese Maschinerie auf das Chromatin abzielt, das es bindet.

DPY-26, DPY-27 und MIX-1 sind alle mit SDC-Proteinen auf beiden kolokalisiertsie-1 Arrays und x Chromosomen (Abb. 1C–E). Darüber hinaus ist die Lokalisierung der drei Dosiskompensationsproteine ​​zusie-1 war von SDC-Proteinen abhängig, weil diesdc-3(Tra)-Mutation störte die Lokalisierung zusie-1 aber nicht an die x Chromosom (Fig. 1F Daten nicht gezeigt). Die Lokalisierung von SDC-2 und SDC-3 war nicht von DPY-27 abhängig (Abb. 1G), aber DPY-26 benötigte DPY-27 für seine Lokalisierungsie-1 (Abb. 1H), wie es für seine Lokalisierung zumx Chromosom. Somit ist die Montage bekannter Dosiskompensationskomponenten auf sie-1 ähnelt ihrer Montage auf demx Chromosom. Darüber hinaus rekrutiert SDC-2 die Dosiskompensationsmaschinerie für seine Chromatin-Ziele, auch wenn einige Komponenten für die Repression entbehrlich sein können.

Der SDC/Dosierungskompensationskomplex verbindet sich mit drei verschiedenen Chromatin-Targets innerhalb von sie-1

Wir haben die genauen Standorte innerhalb bestimmt sie-1 die die Dosiskompensationsmaschinerie rekrutieren. Unter Verwendung des extrachromosomalen Array-Assays zur Untersuchung einzelner 1-kb-Fragmente über sie-1, fanden wir, dass SDC-1, SDC-2, SDC-3, DPY-26, DPY-27 und MIX-1 alle mit drei verschiedenen Regionen kolokalisiert sind, die durch die Fragmente B, C und D definiert sind (Abb. 3A, B). . Die Lokalisation aller Proteine ​​wurde durch eine sdc-3(Tra)-Mutation (Daten nicht gezeigt), die zeigt, dass die Bindung spezifisch war.

SDC-2-Lokalisierung nach sie-1 wird durch drei verschiedene DNA-Erkennungselemente spezifiziert, deren Bindungskapazität durch spezifische Mutationen gestört wird. (EIN) Schema dersie-1 Gen und Zusammenfassung der Subregionen, die durch den Array-Assay auf SDC-2-Kolokalisation getestet wurden. Die Transkription vom P1-Promotor erzeugt das funktionelle männlich-spezifische sie-1 Transkript, einschließlich vier Exons (grün). Ein Promotor (P2) befindet sich im zweiten Intron von sie-1. P2 wird mit P1 koreguliert und erzeugt ein 0,8-kb-Transkript unbekannter Funktion, das die letzten beiden Exons von . enthältsie-1 (Trent et al. 1991 Perry et al. 1993). Der Grad der SDC-2-Kolokalisation mit sie-1 Regionen werden farbig dargestellt, mit der Taste rechts. Die drei kleinsten Regionen mit starker SDC-2-Kolokalisation (Region 1 [B], Region 2 [C5] und Region 3 [D6]) sind dunkelgrau schattiert. C5 und D6 teilen ein identisches 15-bp-Element (durchgezogene vertikale Linien) und 50% Gesamtsequenzidentität. B hat keine offensichtliche Ähnlichkeit mit C5 oder D5, enthält aber die Stelle vonsie-1(gf) (gestrichelte vertikale Linie). Die SDC-2-Kolokalisation wurde durch ein randomisiertes 15-mer in entweder C5 oder D5 und durch den G → A-Übergang von . vollständig unterbrochen sie-1(gf) in B (gelbe Sterne in B‘, C5′ und D5′). (B) Konfokale Bilder eines einzelnen Darmkerns aus einem Wildtyp XX Tier mit GFP-markierten extrachromosomalen Arrays (grün) mit entweder Wildtyp- (B, C5 und D5) oder mutanten (B‘, C5′ und D5′) Versionen der Regionen 1–3. Die Tiere wurden mit Antikörpern gegen DPY-27 (rot) oder SDC-3 (blau) immungefärbt. Die Kolokalisation zwischen Array und Protein erscheint im zusammengeführten Bild gelb. Pfeilspitzen zeigen an x Chromosomen.

Fragment B enthält den P1-Promotor, der das 1,2-kb-funktionelle produziertsie-1 Transkript (Trent et al. 1991 Perry et al. 1993). Diese regulatorische Region wurde zuerst in sie-1 Verdrängung durch eine Gain-of-Function-Mutation, sie-1(gf), das teilweise deprimiert sie-1 Transkription, was zu einer erheblichen, aber unvollständigen Maskulinisierung von XX Mutanten (Trent et al. 1988). Die Lage der sie-1(gf) 2 bp vor der Transkriptionsstartstelle veranlasste uns zu testen, ob sie-1(gf) stört die Bindung des Repressionskomplexes (Perry et al. 1994). Tatsächlich konnten SDC-2, SDC-3 und DPY-27 nicht mit einem Fragment (B‘) assoziieren, das den A → T-Übergang von enthält sie-1(gf), was zeigt, dass derepression von sie-1 die Transkription wird zumindest teilweise durch das Unterbrechen der Repressorbindung verursacht (Daten in Fig. 3A, B nicht gezeigt). Diesie-1(gf)-Mutation scheint die SDC-Bindung eher zu eliminieren als zu reduzieren, da die Überexpression von SDC-2 dieXX Vermännlichung durch sie-1(gf) (siehe Materialien und Methoden).

Fragmente C und D befinden sich innerhalb des großen zweiten Introns von sie-1. Im Gegensatz zu P1 war diese spezielle Region nicht mitsie-1 Repression durch Gain-of-Function-Mutationen. Die teilweise Maskulinisierung von XX Tiere von sie-1(gf) im Vergleich zur nahezu vollständigen Vermännlichung durchsdc-3(Tra) schlug vor, dass die DEZA-vermittelte sie-1Repression erfordert Sequenzen außerhalb der Freundin Region. Darüber hinaus deuteten indirekte Experimente auf eine mögliche Beteiligung des zweiten Introns in sie-1 Repression (Li et al. 1999).

Wir untersuchten, ob die Protein-DNA-Wechselwirkungen, die mit den Fragmenten C und D auf extrachromosomalen Arrays beobachtet wurden, auch am endogenen sie-1 Gen durch Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) aus Lysaten von mit Formaldehyd behandelten Wildtyp-Embryonen. SDC-2-Antikörper wurden verwendet, um den SDC-Komplex mit seiner assoziierten DNA immunpräzipitieren, und die DNA wurde auf Anreicherung von . analysiert sie-1 Fragmente unter Verwendung von Primern zu den Regionen A–F in ​​separaten PCR-Reaktionen. Primer flankierend er-1, ein Gen auf einem anderen Chromosom, und genomische Fragmente direkt stromaufwärts der Region A wurden als Kontrollen verwendet. Nur DNA aus den Regionen C und D wurde im Vergleich zur Negativkontrolle um das Drei- bis Vierfache spezifisch angereichert (Fig. 4A). Parallel durchgeführte ChIPs mit SDC-2- oder SDC-3-Antikörpern, nur DNA vom Wildtyp, aber nichtsdc-3(Tra)-Lysate wurde für Fragment C angereichert (Fig. 4B). Dieses Ergebnis bestätigte die Spezifität des ChIP, indem es zeigte, dass es die Unterbrechung der SDC-Bindung an . korrekt widerspiegelt sie-1verursacht durch sdc-3(Tra). In Kontrollen wurden äquivalente Mengen an DNA der Region C in PCRs unter Verwendung von DNA nachgewiesen, die aus Wildtyp- und mutanten Lysaten extrahiert wurde ( 4B ). Ebenso wurden vergleichbare Mengen an SDC-Proteinen in beiden Lysaten mit Western-Blots ( 4C ) und IP-Experimenten ( 4D ) nachgewiesen. Zusammen zeigen diese Experimente, dass der SDC-Komplex mit den Regionen C und D im endogenensie-1 Gen. Die Unfähigkeit, Region B durch diesen Assay nachzuweisen, deutete darauf hin, dass Region B eine geringere Kapazität für die SDC-Bindung hat als die Regionen C und D, wie unten gezeigt und zuvor vermutet (Li et al. 1999).

Chromatin-Immunopräzipitationsexperimente (ChIP) zeigen die Wechselwirkung von SDC-Proteinen mit dem endogenen sie-1Gen. (EIN) PCR-Analyse von DNA aus einem ChIP, durchgeführt mit SDC-2-Antikörpern und Lysaten von quervernetztem Formaldehyd XXEmbryonen. Primer-Sets speziell für sie-1 Regionen oder ein Kontrollgen (er-1) wurden für PCRs mit mock-präzipitierter DNA (M) und zweifachen seriellen Verdünnungen von SDC-2-präzipitierter DNA (SDC-2) oder Input-DNA (Input) verwendet. Die Intensität der PCR-Bande, die von jedem Primerpaar aus IP-angereicherter DNA produziert wurde, wurde auf die entsprechende PCR-Bande normalisiert, die aus der höchsten Konzentration an Eingangs-DNA produziert wurde. Regionen D und C von sie-1 wurden oben speziell angereichert er-1Kontroll-DNA um das Dreifache bzw. Vierfache. (Primer flankierender-1 produzierten ein PCR-Produkt aus IP-angereicherter DNA mit 22 % normalisierter Intensität, während Primer, die die Regionen D und C flankierten, Banden von 67 % bzw. 86 % normalisierter Intensität produzierten.) (B) Die PCR-Analyse mit Region-C-Primern wurde an zweifachen seriellen Verdünnungen von DNA aus einem ChIP unter Verwendung von SDC-2- oder SDC-3-Antikörpern und Lysaten von mit Formaldehyd behandeltem Wildtyp oder . durchgeführtsdc-3(Tra) XX Embryonen. Die Intensität jeder PCR-Bande wurde auf die Intensität der PCR-Bande normalisiert, die aus der höchsten Konzentration an IP-angereicherter DNA aus dem Wildtyp-Lysat hergestellt wurde. Die durchschnittlichen Intensitäten und Standardabweichungen wurden aus vier Sätzen von PCR-Analysen an Material von zwei unabhängigen ChIP-Experimenten berechnet. Die Spezifität des ChIP-Protokolls wurde durch die Präzipitation von Region-C-DNA aus Wildtyp-, aber nicht mutierten Lysaten gezeigt. Ähnliche Mengen an DNA der Region C wurden durch PCR unter Verwendung von zweifachen seriellen Verdünnungen von Wildtyp und . nachgewiesen sdc-3(Tra) Input-Lysate. (CD) Ähnliche Konzentrationen von SDC-2 und SDC-3 wurden durch Western-Blot-Analyse von entweder (C) ganze Lysate oder (D) SDC-2 IP-Material aus Lysaten von mit Formaldehyd behandeltem Wildtyp und sdc-3(Tra) Embryonen.

Diverse DNA-Erkennungselemente befinden sich in den drei verschiedenensie-1 Chromatin-Ziele

Nachdem wir gezeigt haben, dass die Fragmente B, C und D echte SDC-Ziele sind, haben wir die DNA-Sequenzanforderungen für die SDC-Bindung genauer definiert. Von vier Subfragmenten der Region B unterstützte nur B2 eine signifikante SDC-2-Kolokalisation ( 3A ). Die Lokalisierung an B2 war jedoch weniger konsistent als die Lokalisierung an B, was darauf hindeutet, dass eine starke SDC-2-Bindung mehr als ein diskretes Element innerhalb der Region B erfordert. C5) von C und zu einem 192-bp-Fragment (D6) von D (Fig. 3A,B). SDC-1, SDC-3, DPY-26, DPY-27 und MIX-1 kolokalisierten alle mit SDC-2 auf diesen Fragmenten, was zeigt, dass alle Informationen, die für SDC-Proteine ​​erforderlich sind, um mit Chromatin zu interagieren und den Dosiskompensationskomplex zu rekrutieren, durch 192 bp DNA (Daten in Fig. 3A, B nicht gezeigt) spezifiziert werden, die aus ihrem nativen chromosomalen Kontext entfernt wurde.

Eine sehr begrenzte Ähnlichkeit der DNA-Sequenzen wurde zwischen B (Region 1) und entweder C5 (Region 2) oder D6 (Region 3) gefunden. Im Gegensatz dazu teilen sich C5 und D5 (ein 287-bp-Fragment, das D6 enthält) 50% Gesamtidentität und einen 15-bp-Abschnitt (CAAAAACTGAGCCTG) vollständiger Identität auf dem Antisense-Strang von C5 und dem Sense-Strang von D5. Eine exakte Kopie dieses Elements findet sich nicht auf x oder an anderer Stelle im Genom. Die Randomisierung des 15-bp-Elements zu ACAGACTGCAGATAC (für C5′ und D5′) oder GA CAGACGTCAATAC (für D5′) verhinderte die Lokalisierung der SDC-2-, SDC-3- und DPY-27-Proteine ​​in Arrays mit den mutierten Fragmenten (Fig. 3A .). ,B-Daten nicht gezeigt). Die wiederholte 15-bp-Sequenz ist daher notwendig, um SDC- und DPY-Proteine ​​auf die Regionen 2 und 3 zu lenken -mer oder ein 28-bp-Element, das das 15-mer und benachbarte gemeinsame Sequenzen enthält (Daten nicht gezeigt). Sonstiges cis-Schauspielsequenzen müssen wesentlich sein. Somit sind die drei DNA-Elemente, die verwendet werden, um die Dosiskompensationsmaschinerie auf sie-1 sind vielfältig. Entweder weisen SDC-Proteine ​​selbst Flexibilität bei der Sequenzerkennung auf oder andere zelluläre Komponenten helfen, Sequenzspezifität und Bindung zu verleihen.

Differenzielle Rekrutierung von SDC-2 an sie-1 durch einzelne Erkennungselemente

Identifizierung von Mutationen, die die SDC-Bindung an einzelne Stellen in eliminierten sie-1 ermöglichte es uns, den funktionellen Beitrag jeder Stelle zur gesamten SDC-Bindung und Repression von . in vivo zu bewerten und zu korrelieren sie-1. Wir stellten das vorsie-1(gf) Mutation von Region 1 und den randomisierten 15-meren der Regionen 2 und 3 zusammen oder getrennt in volle Längesie-1-Rettungskonstrukte, um die Rolle jeder Site zu testen.XX Tiere, die ein einzelnes Konstrukt aus einem GFP-markierten extrachromosomalen Array exprimierten, wurden auf die Häufigkeit der SDC-2-Lokalisation in Arrays und auf die sexuelle Transformation in das männliche Schicksal untersucht, ein Indikator für die transkriptionelle Derepression (siehe Materialien und Methoden). Die funktionelle Bedeutung einer Stelle könnte dann durch Vergleich der Veränderung der SDC-Lokalisierung mit dem Grad der sexuellen Transformation, die durch die Unterbrechung dieser Stelle verursacht wird, abgeleitet werden (Fig. 5A).

Die relativen Beiträge der drei sie-1Erkennungselemente unterscheiden sich für die SDC-Bindung und sie-1Repression. (EIN) Mutation spezifischer DNA-Sequenzen in voller Länge sie-1 Transgene stört die SDC-2-Lokalisierung zusie-1 und Unterdrückung von sie-1. sie-1Konstrukte, die in transgenen Arrays enthalten sind, werden durch Diagramme auf der linken Seite dargestellt, wobei Mutationen durch weiße Sterne angezeigt werden. Die prozentuale SDC-2-Lokalisierung an transgenen Arrays wird durch graue Balken dargestellt. Die Standardabweichung zwischen den untersuchten Linien wird durch eine gepunktete Linie dargestellt. (n) Gesamtzahl der in allen Linien bewerteten Kerne. Maskulinisierung durch die volle Länge sie-1 Transgene wurde quantifiziert (siehe Materialien und Methoden) und dann als (–) keine, (+) schwach, (++) moderat, (+++) stark oder (++++) schwer bewertet. (Bg) Beispiele für Vermännlichung durch Derepression von sie-1. DIC Mikrophotographien von Schwänzen aus (B) ein Wildtyp XX Hermaphrodit, (CF) XX Tiere in voller Länge maskulinisiert sie-1 Transgene und (g) ein WildtypXO männlich. Seitenansichten (BD) und ventrale Ansichten (Eg). (weißer Pfeil) männlicher Fächer (schwarzer Pfeil) männliche Sinnesstrahlen (schwarze Pfeilspitze) männliche Stacheln.

Die Regionen 2 und 3 wiesen im Kontext der Volllängen- sie-1 Gen, und diese Regionen unterstützten eine robustere Bindung als Region 1 (Fig. 5A). SDC-2 lokalisierte sich auf 90% der Arrays mit einem Wildtyp sie-1 Gen. Die Lokalisierung wurde nur geringfügig auf 85% reduziert durch diesie-1(gf) Läsion in Region 1, obwohl diese Läsion die SDC-2-Lokalisierung auf ein Fragment, das nur Region 1 enthält, aufhob. Die verbleibende SDC-Bindung muss über die Regionen 2 und 3 erfolgt sein. Die Randomisierung eines der 15-mer verringerte die SDC-2-Lokalisierung auf 20–40 % und die Randomisierung beider 15-mer verringerte die SDC-2-Lokalisierung auf 10 %. Die SDC-Lokalisierung wurde durch das Aufbrechen von Region 1 auf einem bereits mutierten Transgen für Region 2 oder Region 3 nicht signifikant reduziert, wurde jedoch durch Aufbrechen von Region 1 auf einer Transgenmutante für beide Regionen 2 und 3 leicht reduziert. Die vergleichsweise schwache SDC-Bindungsaffinität für Region 1 im Kontext der vollen Länge sie-1 Transgen stimmt mit der Schwierigkeit überein, Region 1 durch ChIP-Analyse auf dem endogenen Gen nachzuweisen.

Vollständige Unterdrückung von sie-1 erfordert die Teilnahme aller drei DEZA-bindenden Regionen

Korreliert die Stärke der Bindung der DEZA an eine Region mit der Wirksamkeit bei der Unterdrückung von sie-1? Analyse des sexuellen Phänotyps in XX Tiere mit Wildtyp oder modifizierter voller Längesie-1 Transgene zeigten, dass die vollständige Unterdrückung vonsie-1 erforderte die Teilnahme aller drei DEZA-bindenden Regionen. Allerdings leistete Region 1, die schwächste in der SDC-Bindungsaktivität, den größten Einzelbeitrag zur Repression (Abb. 5A–G). Die Regionen 2 und 3 trugen in Abwesenheit von Region 1 zur Repressionsaktivität bei, aber die Repression war weniger wirksam als in Region 1 (Abb. 5A–G). Der Grad der sie-1 Repressionen aus den Regionen 2 und 3 sind möglicherweise eher vergleichbar mit der Repression von x-gebundene Gene, die während der Dosiskompensation auftreten.

Diese Schlussfolgerungen wurden aus den folgenden Beobachtungen gezogen (Abb. 5A–G): XX Tiere mit Wildtyp sie-1Transgene zeigten eine sehr geringe Vermännlichung (−), was auf eine starke Repression hinweist. Mutationen von entweder Region 2 oder 3 verursachten eine schwache Maskulinisierung (+), die mit einer zwischenzeitlichen Unterbrechung der SDC-2-Lokalisierung korreliert war. Mutationen beider Regionen 2 und 3 verursachten eine moderate Maskulinisierung (++), obwohl sie eine starke Unterbrechung der SDC-2-Lokalisierung verursachten. Schließlich verursachte die Mutation der Region 1 eine starke Maskulinisierung (+++), obwohl sie nur eine leichte Reduktion der SDC-Lokalisierung verursachte. Diese Maskulinisierung wurde nicht durch das Aufbrechen nur der Region 2 oder 3 verstärkt, sondern wurde durch das Aufbrechen beider Regionen 2 und 3 verstärkt, was eine schwere Maskulinisierung (++++) verursachte.

Die schwache Bindung von SDC-Proteinen an Region 1 auf einem vollständigensie-1 Transgens die Sorge, dass SDC-Proteine ​​die Repression von Region 1 nicht vermitteln könnten. Daher untersuchten wir die Auswirkungen einer Unterbrechung der SDC-Bindung spezifisch an Region 1 durch Einführung einessdc-3(Tra) Mutation in genotypisch sie-1(−) Tiere in voller Länge tragen sie-1(+) Transgene mit Mutationen in den Regionen 2 und 3. Es wurde eine zwei- bis dreifache Zunahme der Anzahl maskulinisierter Tiere gefunden, was zeigt, dass SDC-Proteine ​​zur Repression von Region 1 in vivo beitragen.

Die Beteiligung der Regionen 2 und 3 an DEZA-vermittelten sie-1Repression in vivo wird durch die Interpretation früherer genetischer Daten im Kontext der SDC-Bindungsdaten weiter verstärkt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die sie-1(gf)-Mutation eliminiert die SDC-Bindung an Region 1, aber nicht an die Regionen 2 und 3, während die sdc-3(Tra)-Mutation reduziert die SDC-Bindung an alle drei Regionen stark. Somit ist der stärkere Vermännlichungsgrad in XX Tiere, die durch diesdc-3(Tra)-Mutation (100% der Mutanten) im Vergleich zu dersie-1(gf) Mutation (30% der Mutanten) muss aus einer Verringerung der SDC-Bindung an die Regionen 2 und 3 resultieren. Daher tragen die Regionen 2 und 3 wesentlich zur SDC-vermittelten Repression des endogenensie-1 Gen, zusammen mit Region 1.


Klassifizierung und Herkunft von eccDNAs

Das Genom von Eukaryoten besteht aus chromosomaler DNA und extrachromosomalen DNA-Elementen, die physikalisch aus den Chromosomen herausgeschnitten werden 3 . Der Begriff �NA” wird heute verwendet, um das gesamte Spektrum der zirkulären DNA in Eukaryoten zu beschreiben. eccDNAs sind über verschiedene Eukaryoten von Hefe bis Mensch weit verbreitet 12 - 14 . eccDNAs können in Organellen-eccDNAs, wie z ) fünfzehn . Ihre Größen reichen von Hunderten von Basenpaaren (bp) bis zu mehreren Megabasen (Mb). Aufgrund ihrer universellen Existenz und heterogenen Ableitung gelten eccDNAs als Spiegel der genomischen Plastizität und Instabilität.

Tabelle 1

Klassifizierung von eccDNAs in Eukaryoten

Name der eccDNAGrößenbereichBiologische FunktionVerweise
Mitochondriale DNA16 kbAufrechterhaltung der Mitochondrienfunktion134
Doppelminute100 kb-3 MBAls Vehikel für die extrachromosomale Genamplifikation fungieren6, 56
Kleine polydisperse zirkuläre DNA100 bp-10 kbVerbesserung der genomischen Instabilität34
Mikro-DNA100-400 bpHerstellung von miRNAs75
TelomerkreisIntegrale Vielfache von 738 bpWiederherstellung der Telomerlänge135

Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass eccDNAs in eukaryotischen Zellen normalerweise eingestreute Wiederholungssequenzen oder tandemartig wiederholte genomische Sequenzen 16–18 tragen. Daraus kann geschlossen werden, dass tandemly repetitive DNAs besonders anfällig für die Bildung von eccDNA sind 17 . Andererseits leiten sich eccDNAs auch von nicht repetitiver DNA ab. Loon et al. 19 fanden heraus, dass eccDNAs aus HeLa S3-Zellen aus nicht repetitiven DNA-Sequenzen oder DNA-Sequenzen mit geringer Kopienzahl bestanden. Außerdem wurde berichtet, dass einige nicht-repetitive spcDNAs auf beiden Seiten durch direkte Wiederholungen einer mittleren Länge von 9–11 bp 20, 21 begrenzt sind. eccDNAs können sowohl aus kodierenden als auch aus nichtkodierenden Regionen stammen. Zum Beispiel wurden Onkogene und Arzneimittelresistenzgene als vorherrschende Komponenten von DMs identifiziert 22 . Darüber hinaus stammen Mikro-DNAs vorzugsweise von Exons, 5'-nichttranslationalen Regionen (5'-UTR) und CpG-Inseln 23 .


NIPT-Technologietypen

Die für NIPT häufig verwendeten Technologieplattformen sind die Sequenzierung des gesamten Genoms mittels Next-Generation-Sequencing (NGS) oder verschiedene zielgerichtete Methoden. Bei der Suche nach der besten NIPT-Technologie für Ihr Labor sollten Sie die Datengenerierung und -analyse, den Labor-Workflow und die daraus resultierenden klinischen Auswirkungen berücksichtigen.

NIPT und Whole-Genome Sequencing

NIPT unter Verwendung der Ganzgenom-Sequenzierungstechnologie liefert die informativsten NIPT-Ergebnisse 1-7 mit einem umfassenden Überblick über das gesamte Genom. NIPT mit Gesamtgenom-Sequenzierung weist im Vergleich zu gezielter Sequenzierung oder Array-basierten Plattformen durchweg niedrigere Ausfallraten auf 8 .

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-freie Probenvorbereitung, die mit NIPT auf der Grundlage der Ganzgenom-Sequenzierung verwendet wird, verbessert den Labor-Workflow, reduziert die Assay-Komplexität erheblich und verbessert die Durchlaufzeit (TAT) erheblich. Diese Art der NIPT NGS-Technologie kann auch leicht skaliert werden, um den Anforderungen eines wachsenden Labors gerecht zu werden.

NIPT und Whole-Genome Sequencing

Gezielte Ansätze für NIPT

Zu den gezielten Technologien für NIPT gehören Single Nucleotide Polymorphism (SNP)-Analyse, Microarray-Analyse und Rolling-Circle-Amplifikation. Mit gezielten Ansätzen werden nur begrenzte Regionen ausgewählter Chromosomen analysiert.

Diese gezielten Ansätze haben zusätzliche Schritte und verwenden mehr Amplifikationsrunden als Verfahren zur Sequenzierung des gesamten Genoms, was einen komplizierteren Arbeitsablauf einführt.

SNP-Analyse

SNPs sind genetische Variationen zwischen Individuen. Diese Technik bestimmt den Unterschied zwischen Eltern- und Kind-DNA und die relative Dosis der genetischen Variation, um die Kopienzahl abzuleiten. cfDNA wird durch PCR unter Verwendung spezifischer SNP-Targets amplifiziert. Diese Ziele werden sequenziert und die Allelverteilung von Mutter und Kind wird bestimmt. Ein Algorithmus bestimmt Anomalien der erwarteten Allelfrequenzen.

SNP-Analyse

Microarray-Analyse

Bei dieser Art von NIPT wird ein Mikroarray verwendet, bei dem es sich um eine Ansammlung mikroskopischer DNA-Regionen handelt, die an einer festen Oberfläche befestigt sind. cfDNA-Fragmente werden durch PCR amplifiziert, mit einer Fluoreszenzsonde markiert und binden an komplementäre Sequenzen auf dem NIPT-Mikroarray. Both the light intensity and binding position indicate the relative amount of DNA and presence or absence of the target, respectively. Deviations in expected fluorescent counts indicate aneuploidy.

Microarray-Analyse

Rolling Circle Amplification

Rolling circle amplification targets specific cfDNA fragments which bind to a circular template and replicate by a rolling mechanism. The rolling circle replication products are fluorescently labeled and counted. Deviations in expected fluorescent counts indicate aneuploidy.

Rolling Circle Amplification

A Guide to NIPT Technology Options

Learn more about evaluating NIPT options and key considerations when selecting a technology for your lab.

A Guide to NIPT Technology Options

Comparison of NIPT Technology Types

How is NIPT Data Generated?

Purified cfDNA fragments are labelled with universal sequencing adapters to create a library. The library is amplified through bridge amplification (PCR-free) or PCR.

The sample libraries are sequenced using single or paired-end sequencing.

SNPs on chromosomes of interest are amplified by PCR and sequenced from cfDNA isolated from the plasma of pregnant women.

Probes designed to match specific sequences of the genome are synthesized onto specific areas on the microarray.

Targeted cfDNA fragments are amplified by PCR, tagged with a fluorescent probe, and bind to complimentary sequences on the microarray.

Target cfDNA fragments hybridize to probes designed to form circular complexes.

The DNA circles are copied thousands of times to generate rolling circle products.

How is NIPT Data Analyzed?

An over or under representation of sequenced reads based on expected distribution indicates aneuploidy.

An altered ratio of target alleles compared with expected ratios indicates aneuploidy.

An over or under representation of fluorescent counts compared with a reference genome indicates aneuploidy.

An over or under representation of fluorescent counts compared with a reference genome indicates aneuploidy.

What are the Clinical Considerations of NIPT?

All chromosomes are evaluated.

Only select chromosomes are evaluated.

Only select chromosomes are evaluated.

Only select chromosomes are evaluated.

What are the NIPT Lab Workflow Implications?

A PCR-free workflow eliminates the need for pre- and post-PCR lab space, allowing steps to be performed in a single area.

This workflow requires less hands-on time, faster TAT, and is less prone to contamination since PCR amplification is not employed.

PCR involves a more complicated workflow, significantly longer TAT, and necessitates pre- and post-PCR workspace considerations.

PCR involves a more complicated workflow, significantly longer TAT, and necessitates pre- and post-PCR workspace considerations.

There is reduced risk for contamination since PCR is not employed however, this method results in a long TAT.

Zusätzliche Ressourcen

The Science Behind NIPT

See how this NIPT workflow detects aneuploidy in three simple steps.

Noninvasive Prenatal Testing and NIPT

Dr. Wapner, Vice Chair of Research in Obstetrics and Gynecology for Columbia University, shares his perspective on prenatal screening and NIPT.

NIPT Delivers Relief to Expectant Mother

Whole-genome sequencing provides results when another test was inconclusive.

NIPT: Effective Screening for the General Pregnancy Population

Glenn Palomaki, PhD, discusses the clinical validity and utility of offering NIPT as a primary screen in the general pregnancy population.

Verweise
  1. Illumina Inc. VeriSeq™ NIPT Solution v2 Package Insert. 2020
  2. Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med. 201113(11):913-920
  3. Ryan A, Hunkapiller N, Banjevic M, et al.Validation of an Enhanced Version of a Single-Nucleotide Polymorphism-Based Noninvasive Prenatal Test for Detection of Fetal Aneuploidies. Fetal Diagn Ther. 201640(3):219-223.
  4. Stokowski R, Wang E, White K, et al. Clinical performance of non-invasive prenatal testing (NIPT) using targeted cell-free DNA analysis in maternal plasma with microarrays or next generation sequencing (NGS) is consistent across multiple controlled clinical studies. Prenat Diagn. 2015doi: 10.1002/pd.4686.
  5. Jones KJ, Wang E, Bogard P, et al. Targeted cell-free DNA analysis with microarray quantitation for assessment of fetal sex and sex chromosome aneuploidy risk. Ultrasound Obstet Gynecol. 201851(2):275-276.
  6. Taneja PA, Snyder HL, de Feo E, et al. Noninvasive prenatal testing in the general obstetric population: clinical performance and counseling considerations in over 85,000 cases. Prenat Diagn. 2016 doi:10.1002/pd.4766.
  7. McCullough RM, Almasri EA, Guan X, et al. Non-invasive prenatal chromosomal aneuploidy testing--clinical experience: 100,000 clinical samples.
  8. Data on file. Illumina, Inc. November 2018.
Nur für Forschungszwecke

Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren, außer wie ausdrücklich angegeben.

Innovative Technologien

Unser Ziel bei Illumina ist es, innovative Technologien auf die Analyse genetischer Variation und Funktion anzuwenden und damit Studien möglich zu machen, die noch vor wenigen Jahren undenkbar waren. Für uns ist es geschäftskritisch, innovative, flexible und skalierbare Lösungen zu liefern, um die Bedürfnisse unserer Kunden zu erfüllen. Als globales Unternehmen, das großen Wert auf kollaborative Interaktionen, schnelle Bereitstellung von Lösungen und höchste Qualität legt, sind wir bestrebt, diese Herausforderung zu meistern. Die innovativen Sequenzierungs- und Array-Technologien von Illumina treiben bahnbrechende Fortschritte in der Life-Science-Forschung, der translationalen und Verbrauchergenomik sowie der Molekulardiagnostik voran.


Extrachromosomal DNA

Although most DNA is contained within a cell’s chromosomes, many cells have additional molecules of DNA outside the chromosomes, called extrachromosomal DNA, that are also part of its genome. The genomes of eukaryotic cells would also include the chromosomes from any organelles such as mitochondria and/or chloroplasts that these cells maintain (Figure 3). The maintenance of circular chromosomes in these organelles is a vestige of their prokaryotic origins and supports the endosymbiotische Theorie (see Foundations of Modern Cell Theory). In some cases, genomes of certain DNA viruses can also be maintained independently in host cells during latent viral infection. In these cases, these viruses are another form of extrachromosomal DNA. For example, the human papillomavirus (HPV) may be maintained in infected cells in this way.

Figure 3. The genome of a eukaryotic cell consists of the chromosome housed in the nucleus, and extrachromosomal DNA found in the mitochondria (all cells) and chloroplasts (plants and algae).

Besides chromosomes, some prokaryotes also have smaller loops of DNA called Plasmide that may contain one or a few genes not essential for normal growth (see Figure 1 in Unique Characteristics of Prokaryotic Cells). Bacteria can exchange these plasmids with other bacteria in a process known as horizontaler Gentransfer (HGT). The exchange of genetic material on plasmids sometimes provides microbes with new genes beneficial for growth and survival under special conditions. In some cases, genes obtained from plasmids may have clinical implications, encoding virulence factors that give a microbe the ability to cause disease or make a microbe resistant to certain antibiotics. Plasmids are also used heavily in genetic engineering and biotechnology as a way to move genes from one cell to another. The role of plasmids in horizontal gene transfer and biotechnology will be discussed further in Mechanisms of Microbial Genetics and Modern Applications of Microbial Genetics.

Denk darüber nach

Lethal Plasmids

Maria, a 20-year-old anthropology student from Texas, recently became ill in the African nation of Botswana, where she was conducting research as part of a study-abroad program. Maria’s research was focused on traditional African methods of tanning hides for the production of leather. Over a period of three weeks, she visited a tannery daily for several hours to observe and participate in the tanning process. One day, after returning from the tannery, Maria developed a fever, chills, and a headache, along with chest pain, muscle aches, nausea, and other flu-like symptoms. Initially, she was not concerned, but when her fever spiked and she began to cough up blood, her African host family became alarmed and rushed her to the hospital, where her condition continued to worsen.

After learning about her recent work at the tannery, the physician suspected that Maria had been exposed to Milzbrand. He ordered a chest X-ray, a blood sample, and a spinal tap, and immediately started her on a course of intravenous penicillin. Unfortunately, lab tests confirmed the physician’s presumptive diagnosis. Maria’s chest X-ray exhibited pleural effusion, the accumulation of fluid in the space between the pleural membranes, and a Gram stain of her blood revealed the presence of gram-positive, rod-shaped bacteria in short chains, consistent with Bacillus anthracis. Blood and bacteria were also shown to be present in her cerebrospinal fluid, indicating that the infection had progressed to meningitis. Despite supportive treatment and aggressive antibiotic therapy, Maria slipped into an unresponsive state and died three days later.

Anthrax is a disease caused by the introduction of endospores from the gram-positive bacterium B. anthrazit into the body. Once infected, patients typically develop meningitis, often with fatal results. In Maria’s case, she inhaled the endospores while handling the hides of animals that had been infected.

Das Genom von B. anthrazit illustrates how small structural differences can lead to major differences in virulence. In 2003, the genomes of B. anthrazit und Bacillus cereus, a similar but less pathogenic bacterium of the same genus, were sequenced and compared. [4] Researchers discovered that the 16S rRNA gene sequences of these bacteria are more than 99% identical, meaning that they are actually members of the same species despite their traditional classification as separate species. Although their chromosomal sequences also revealed a great deal of similarity, several virulence factors of B. anthrazit were found to be encoded on two large plasmids not found in B. cereus. The plasmid pX01 encodes a three-part toxin that suppresses the host immune system, whereas the plasmid pX02 encodes a capsular polysaccharide that further protects the bacterium from the host immune system (Figure 4). Schon seit B. cereus lacks these plasmids, it does not produce these virulence factors, and although it is still pathogenic, it is typically associated with mild cases of diarrhea from which the body can quickly recover. Unfortunately for Maria, the presence of these toxin-encoding plasmids in B. anthrazit gives it its lethal virulence.

Figure 4. Genome sequencing of Bacillus anthracis and its close relative B. cereus reveals that the pathogenicity of B. anthrazit is due to the maintenance of two plasmids, pX01 and pX02, which encode virulence factors.

  • What do you think would happen to the pathogenicity of B. anthrazit if it lost one or both of its plasmids?

Clinical Focus: Aamir, Resolution

Within 24 hours, the results of the diagnostic test analysis of Aamir’s stool sample revealed that it was positive for heat-labile enterotoxin (LT), heat-stabile enterotoxin (ST), und colonization factor (CF), confirming the hospital physician’s suspicion of ETEC. During a follow-up with Aamir’s family physician, this physician noted that Aamir’s symptoms were not resolving quickly and he was experiencing discomfort that was preventing him from returning to classes. The family physician prescribed Aamir a course of ciprofloxacin to resolve his symptoms. Fortunately, the ciprofloxacin resolved Aamir’s symptoms within a few days.

Aamir likely got his infection from ingesting contaminated food or water. Emerging industrialized countries like Mexico are still developing sanitation practices that prevent the contamination of water with fecal material. Travelers in such countries should avoid the ingestion of undercooked foods, especially meats, seafood, vegetables, and unpasteurized dairy products. They should also avoid use of water that has not been treated this includes drinking water, ice cubes, and even water used for brushing teeth. Using bottled water for these purposes is a good alternative. Good hygiene (handwashing) can also aid the prevention of an ETEC infection. Aamir had not been careful about his food or water consumption, which led to his illness.

Aamir’s symptoms were very similar to those of Cholera, caused by the gram-negative bacterium Vibrio cholerae, which also produces a toxin similar to ST and LT. At some point in the evolutionary history of ETEC, a nonpathogenic strain of E coli similar to those typically found in the gut may have acquired the genes encoding the ST and LT toxins from V. cholerae. The fact that the genes encoding those toxins are encoded on extrachromosomal plasmids in ETEC supports the idea that these genes were acquired by E coli and are likely maintained in bacterial populations through horizontal gene transfer.


EINLEITUNG

Sowohl Drosophila und C. elegans, global silencing mechanisms appear to play a crucial role in the specification and maintenance of germ line tissue (Wylie, 1999). In C. elegans, these silencing mechanisms can be studied using transgene arrays containing a GFP reporter gene under the control of a promoter normally expressed in all cells (Kelly et al., 1997). The transgene arrays are strongly silenced in germ cells but are reactivated in the soma of each generation. Silencing in the germline can be partially prevented by increasing the ‘complexity’ of the transgene arrays formed in vivo through the co-injection of excess amounts of random, linear genomic fragments (Kelly et al., 1997).

Germline silencing of transgene arrays requires the action of the MES proteins (maternal effect sterility), MES-2, -3, -4, and -6 (Kelly and Fire, 1998). Two of the mes genes, mes-2 und mes-6, encode worm homologs of the Drosophila Polycomb Group proteins, Enhancer of Zeste and Extra Sex Combs, respectively (Holdeman et al., 1998 Korf et al., 1998). The Polycomb Group proteins maintain transcriptional repression of developmentally regulated genes through their ability to modulate chromatin conformation (Kennison, 1995). In addition, MES-2 and MES-4 each contain a SET domain, a conserved feature of many chromatin-interacting proteins. Defects in the mes factors cause sterility, owing to germ cell degeneration, and alleviate silencing of transgene arrays in the germline. Similar phenotypes can also result from depletion of a histone H1 isoform, H1.1 (Jedrusik and Schulze, 2001). Gene silencing through the regulation of chromatin conformation is therefore likely to be an essential component of germline maintenance, but the endogenous targets of this regulation are poorly understood. Severity of the germ cell degeneration in mes mutant animals increases with X-chromosome dose (Garvin et al., 1998), suggesting that some of the gene targets of MES-induced silencing reside on the X chromosome.

Global gene expression analysis has also suggested that the X chromosome is a possible target of silencing in the C. elegans germline. Microarray analyses have identified 1416 germline-enriched genes in C. elegans, which were classified into three distinct groups: sperm-enriched, oocyte-enriched and germline-intrinsic genes (defined as genes expressed similarly in the germline regardless of the gamete being made) (Reinke et al., 2000). Strikingly, sperm-enriched and germline-intrinsic genes are almost completely absent from the X chromosome. By contrast, oocyte-enriched genes are present on the X chromosome at a similar frequency to those found on autosomes. C. elegans XO males make only sperm and thus would not require expression of oocyte-enriched genes, whereas XX hermaphrodites first produce sperm as L4 larvae and then become strictly oogenic as adults (Schedl, 1997 Hubbard and Greenstein, 2000). The X chromosome in male germlines may therefore be regulated differently from autosomes in a manner that prohibits the presence of the sperm-enriched and germline-intrinsic genes. Another possibility is that these classes of genes are absent from the X chromosome for some unknown reason, but that the X chromosome is otherwise competent for gene expression.

In support of the first possibility, the distinction of the male X chromosome from the autosomes in the germline of C. elegans is reminiscent of sex chromatin formation in other species that bear non-equivalent sex chromosomes (heterogametic: XO or XY). During the pachytene stage of C. elegans meiosis in males, the single (and thus unpaired) X chromosome adopts a highly compact morphology analogous to that seen in mammalian spermatocytes (Goldstein, 1982). In the heterogametic sex of diverse species, the male X chromosome in the pachytene stage of meiotic prophase is found in a visually distinct structure called the XY- or sex-body that is transcriptionally inactive (Handel and Hunt, 1992). McKee and Handel (McKee and Handel, 1993) proposed that the condensation of sex chromatin in XY and XO male germlines, and by consequence the transcriptional inactivation of these chromosomes, prevents harmful recombination events between non-equivalent X and Y chromosomes, and prevents loss of a single chromosome lacking a pairing partner in XO animals. In C. elegans, both the exclusion of sperm-enriched and germline-intrinsic genes from the X chromosome, and the condensed structure of the X chromosome in the XO male germline suggest that the X chromosome in the male germ line may be targeted for silencing.

If the male X chromosome is silenced in the germline, then one expectation is that it should have a chromatin conformation consistent with decreased transcriptional activity. Chromatin structure can be regulated via differential modification of nucleosomal histone N termini ‘tails’, which includes acetylation, methylation, phosphorylation and ubiquitination (Strahl and Allis, 2000 Turner, 2000). Combinations of these modifications are proposed to comprise a ‘histone code’ that determines regional structural properties of chromatin (Strahl and Allis, 2000). The acetylation of lysine residues in the N termini of histones H3 and H4, as well as methylation of lysine 4 in histone H3, generally correlate with a transcriptionally active state. By contrast, methylation of lysine 9 in histone H3 correlates with transcriptional silencing and constitutive heterochromatin formation, and is required for binding of the heterochromatin protein HP1 (Strahl and Allis, 2000 Jenuwein, 2001). Some proteins containing a SET domain are histone methyltransferases that can methylate lysine 9 in histone H3 (Jenuwein, 2001 Jenuwein and Allis, 2001). The general scheme of a ‘histone code’ has probably undergone specific adaptations in different organisms, but overall remains strongly conserved.

We have used probes specific for histone modifications to study the chromatin organization of the X chromosome in germ cells of C. elegans males and hermaphrodites. Both germline-silenced and germline-expressing transgene arrays were used to monitor how the histone modification patterns on these large, extrachromosomal arrays correlate with expression competence. The spectrum of histone modifications on transgene arrays illustrate a consistent correlation with the expression competence of the array in early meiotic germ cells. Moreover, we present evidence that, relative to autosomes, the histones on the X chromosome in male germ cells show a marked reduction in modifications that correlate with transcriptional activation and are enriched in a modification that is associated with heterochromatin.

Strikingly, the X chromosomes in oogenic hermaphrodite germ cells also appear silenced in early meiotic prophase as assessed by their histone modification pattern. Oocyte-enriched genes on the X chromosomes are, on average, expressed at levels significantly lower than oocyte-enriched genes on autosomes. Transcription of several X-linked oocyte genes was only detected in very late meiotic prophase I in the female germline of hermaphrodites.

We also demonstrate that three types of unpaired autosomal sequences are competent to express genes and display activating chromatin modifications: extrachromosomal transgene arrays containing interspersed genomic DNA, unpaired autosomal duplications and the autosomal portions of X:autosome translocations. Each has histone modification patterns more similar to autosomes than to the X chromosome throughout meiosis. These results show that pairing is probably not required for gene expression during meiosis, and suggest that chromatin on autosomes may be refractory to germline silencing. We also show that silencing of the X chromosome is a conserved feature in nematode species with divergent modes of reproduction, and thus does not appear to be a consequence of hermaphroditism.


What's the difference between a free chromosome fragment and an extrachromosomal array? - Biologie

Am Ende dieses Abschnitts können Sie Folgendes tun:

  • List the different steps in prokaryotic transcription
  • Discuss the role of promoters in prokaryotic transcription
  • Describe how and when transcription is terminated

The prokaryotes, which include Bacteria and Archaea, are mostly single-celled organisms that, by definition, lack membrane-bound nuclei and other organelles. A bacterial chromosome is a closed circle that, unlike eukaryotic chromosomes, is not organized around histone proteins. The central region of the cell in which prokaryotic DNA resides is called the nucleoid region. In addition, prokaryotes often have abundant plasmids, which are shorter, circular DNA molecules that may only contain one or a few genes. Plasmids can be transferred independently of the bacterial chromosome during cell division and often carry traits such as those involved with antibiotic resistance.

Die Transkription in Prokaryoten (und in Eukaryoten) erfordert, dass sich die DNA-Doppelhelix im Bereich der mRNA-Synthese teilweise entwindet. Der Abwickelbereich wird als Transkriptionsblase bezeichnet. Transcription always proceeds from the same DNA strand for each gene, which is called the template strand. The mRNA product is complementary to the template strand and is almost identical to the other DNA strand, called the nontemplate strand, or the coding strand. The only nucleotide difference is that in mRNA, all of the T nucleotides are replaced with U nucleotides ((Figure)). In einer RNA-Doppelhelix kann A U über zwei Wasserstoffbrücken binden, genau wie bei der A-T-Paarung in einer DNA-Doppelhelix.

Abbildung 1. Messenger RNA is a copy of protein-coding information in the coding strand of DNA, with the substitution of U in the RNA for T in the coding sequence. However, new RNA nucleotides base pair with the nucleotides of the template strand. RNA is synthesized in its 5′-3′ direction, using the enzyme RNA polymerase. As the template is read, the DNA unwinds ahead of the polymerase and then rewinds behind it.

Das Nukleotidpaar in der DNA-Doppelhelix, das der Stelle entspricht, von der das erste 5′ mRNA-Nukleotid transkribiert wird, wird als +1-Stelle oder Initiationsstelle bezeichnet. Nucleotides preceding the initiation site are denoted with a “-” and are designated upstream nucleotides. Conversely, nucleotides following the initiation site are denoted with “+” numbering and are called downstream nucleotides.

Einleitung der Transkription in Prokaryoten

Prokaryonten haben keine membranumschlossenen Kerne. Daher können die Prozesse der Transkription, Translation und des mRNA-Abbaus alle gleichzeitig ablaufen. The intracellular level of a bacterial protein can quickly be amplified by multiple transcription and translation events that occur concurrently on the same DNA template. Prokaryotic genomes are very compact, and prokaryotic transcripts often cover more than one gene or cistron (a coding sequence for a single protein). Polycistronic mRNAs are then translated to produce more than one kind of protein.

Unsere Diskussion hier wird die Transkription veranschaulichen, indem wir diesen Prozess in beschreiben Escherichia coli, a well-studied eubacterial species. Obwohl einige Unterschiede zwischen der Transkription in E coli und Transkription in Archaeen, ein Verständnis von E coli Die Transkription kann auf praktisch alle Bakterienarten angewendet werden.

Prokaryotische RNA-Polymerase

Prokaryoten verwenden dieselbe RNA-Polymerase, um alle ihre Gene zu transkribieren. In E coli, besteht die Polymerase aus fünf Polypeptid-Untereinheiten, von denen zwei identisch sind. Vier dieser Untereinheiten, bezeichnet als α, α, β, und β‘, comprise the polymerase core enzyme. Diese Untereinheiten bauen sich jedes Mal zusammen, wenn ein Gen transkribiert wird, und zerlegen sich, sobald die Transkription abgeschlossen ist. Jede Untereinheit hat eine einzigartige Rolle die beiden α-Untereinheiten sind notwendig, um die Polymerase auf der DNA aufzubauen β-subunit binds to the ribonucleoside triphosphate that will become part of the nascent mRNA molecule and the β‘ subunit binds the DNA template strand. Die fünfte Untereinheit, σ, ist nur an der Transkriptionsinitiation beteiligt. Es verleiht eine Transkriptionsspezifität, so dass die Polymerase beginnt, mRNA von einer geeigneten Initiationsstelle zu synthetisieren. Ohne σ, würde das Kernenzym von zufälligen Stellen transkribieren und mRNA-Moleküle produzieren, die Protein-Kauderwelsch spezifizierten. Die aus allen fünf Untereinheiten bestehende Polymerase wird Holoenzym genannt.

Prokaryontische Promotoren

A promoter is a DNA sequence onto which the transcription machinery, including RNA polymerase, binds and initiates transcription. In den meisten Fällen existieren Promotoren stromaufwärts der Gene, die sie regulieren. Die spezifische Sequenz eines Promotors ist sehr wichtig, da sie bestimmt, ob das entsprechende Gen ständig, gelegentlich oder selten transkribiert wird. Although promoters vary among prokaryotic genomes, a few elements are evolutionarily conserved in many species. At the -10 and -35 regions upstream of the initiation site, there are two promoter consensus sequences, or regions that are similar across all promoters and across various bacterial species ((Figure)). The -10 sequence, called the -10 region, has the consensus sequence TATAAT. The -35 sequence has the consensus sequence TTGACA. These consensus sequences are recognized and bound by σ. Sobald diese Interaktion erfolgt ist, binden die Untereinheiten des Kernenzyms an die Stelle. Die A–T-reiche -10-Region erleichtert das Abwickeln der DNA-Matrize, und es werden mehrere Phosphodiester-Bindungen hergestellt. Die Initiationsphase der Transkription endet mit der Produktion von abortiven Transkripten, bei denen es sich um Polymere von ungefähr 10 Nukleotiden handelt, die hergestellt und freigesetzt werden.

Figur 2. The σ subunit of prokaryotic RNA polymerase recognizes consensus sequences found in the promoter region upstream of the transcription start site. Die σ-Untereinheit dissoziiert von der Polymerase, nachdem die Transkription initiiert wurde.

Link zum Lernen

View this MolecularMovies animation to see the first part of transcription and the base sequence repetition of the TATA box.

Elongation and Termination in Prokaryotes

The transcription elongation phase begins with the release of the σ Untereinheit von der Polymerase. Die Dissoziation von σ allows the core enzyme to proceed along the DNA template, synthesizing mRNA in the 5′ to 3′ direction at a rate of approximately 40 nucleotides per second. Bei fortschreitender Elongation wird die DNA vor dem Kernenzym kontinuierlich abgewickelt und dahinter wieder aufgewickelt. Die Basenpaarung zwischen DNA und RNA ist nicht stabil genug, um die Stabilität der mRNA-Synthesekomponenten aufrechtzuerhalten. Stattdessen fungiert die RNA-Polymerase als stabiler Linker zwischen der DNA-Matrize und den naszierenden RNA-Strängen, um sicherzustellen, dass die Elongation nicht vorzeitig unterbrochen wird.

Prokaryotic Termination Signals

Once a gene is transcribed, the prokaryotic polymerase needs to be instructed to dissociate from the DNA template and liberate the newly made mRNA. Abhängig vom zu transkribierenden Gen gibt es zwei Arten von Terminationssignalen. Einer ist proteinbasiert und der andere ist RNA-basiert. Rho-dependent termination is controlled by the rho protein, which tracks along behind the polymerase on the growing mRNA chain. Gegen Ende des Gens trifft die Polymerase auf eine Reihe von G-Nukleotiden auf der DNA-Matrize und sie bleibt stehen. Dadurch kollidiert das Rho-Protein mit der Polymerase. Die Interaktion mit Rho setzt die mRNA aus der Transkriptionsblase frei.

Rho-independent termination is controlled by specific sequences in the DNA template strand. Wenn sich die Polymerase dem Ende des zu transkribierenden Gens nähert, trifft sie auf eine Region, die reich an C-G-Nukleotiden ist. Die mRNA faltet sich in sich selbst zurück und die komplementären C-G-Nukleotide binden aneinander. The result is a stable hairpin that causes the polymerase to stall as soon as it begins to transcribe a region rich in A–T nucleotides. Die komplementäre U–A-Region des mRNA-Transkripts bildet nur eine schwache Wechselwirkung mit der Template-DNA. Dies, gekoppelt mit der blockierten Polymerase, induziert genügend Instabilität, damit das Kernenzym abbrechen und das neue mRNA-Transkript freisetzen kann.

Upon termination, the process of transcription is complete. By the time termination occurs, the prokaryotic transcript would already have been used to begin synthesis of numerous copies of the encoded protein because these processes can occur concurrently. The unification of transcription, translation, and even mRNA degradation is possible because all of these processes occur in the same 5′ to 3′ direction, and because there is no membranous compartmentalization in the prokaryotic cell ((Figure)). In contrast, the presence of a nucleus in eukaryotic cells precludes simultaneous transcription and translation.

Figur 3. Mehrere Polymerasen können ein einzelnes bakterielles Gen transkribieren, während zahlreiche Ribosomen gleichzeitig die mRNA-Transkripte in Polypeptide übersetzen. Auf diese Weise kann ein bestimmtes Protein in der Bakterienzelle schnell eine hohe Konzentration erreichen.

Link zum Lernen

Visit this BioStudio animation to see the process of prokaryotic transcription.

Abschnittszusammenfassung

In prokaryotes, mRNA synthesis is initiated at a promoter sequence on the DNA template comprising two consensus sequences that recruit RNA polymerase. The prokaryotic polymerase consists of a core enzyme of four protein subunits and a σ protein that assists only with initiation. Elongation synthesizes mRNA in the 5′ to 3′ direction at a rate of 40 nucleotides per second. Termination liberates the mRNA and occurs either by rho protein interaction or by the formation of an mRNA hairpin.

Rezensionsfragen

Which subunit of the E coli polymerase confers specificity to transcription?


Repression of HR

Recently, it has become clear that telomeres also need to be protected from inappropriate homologous recombination. There are three types of HR that have detrimental outcomes at chromosome ends. The first is homologous recombination between sister telomeres, referred to as Telomere Sister Chromatid Exchange (T-SCE). T-SCEs could be detrimental to cells if the exchanged sequences are not equal in length. One sister telomere could become lengthened at the expense of the other. The exchange between sister telomeres can be detected by chromosome-orientation fluorescent in situ hybridization (CO-FISH) (for review, see Bailey et al. 2004). In the CO-FISH method, newly synthesized DNA is degraded and the remaining parental strands are detected with single-stranded probes. At telomeres, one parental strand is composed of 5′-TTAGGG-3′ repeats and the other has only 5′-CCCTAA-3′ sequences, allowing the two strands to be distinguished in metaphase chromosomes. After semiconservative replication, each chromatid in a metaphase chromosome will have a G-strand signal at one end and a C-strand signal at the other. A chromatid end displaying both C-strand and G-strand signals indicates that a T-SCE event has occurred at this end. In normal mouse and human cells, T-SCE is not frequent, but ALT cells, which maintain their telomeres by a recombination pathway, have very frequent T-SCE (Bailey et al. 2004 Bechter et al. 2004 Londono-Vallejo et al. 2004). The difference may be that T-SCEs are normally repressed and that ALT cells have loosened their control of HR at telomeres, allowing them to maintain their telomeres and therefore to survive (for review, see Neumann and Reddel 2002).

A second HR reaction that threatens telomeres is referred to as t-loop HR (Wang et al. 2004) (Fig. 5). T-loops are at risk for resolution by Holliday junction (HJ) resolvases because an HJ could be formed if the 5′ end of the telomere base pairs with the displacement loop (D loop). Branch migration in the direction of the centromere could generate a double HJ and resolution of this structure with crossover would delete the whole loop segment, leaving a drastically shortened telomere at the chromosome end. T-loop HR was discovered through a separation of function mutant of TRF2, TRF2 ΔB , which protects telomeres from NHEJ but induces sudden telomere truncations. These deletions are dependent on two proteins implicated in HR, the Mre11 recombination repair complex and XRCC3, a Rad51 paralog associated with HJ resolution activity. Cells expressing TRF2 ΔB also contain extrachromosomal telomeric DNA that is circular. On two-dimensional gels, these circles show a broad size distribution consistent with their representing the loop part of the t-loops. How the N terminus of TRF2 represses t-loop HR has not been established. As unperturbed cells contain small amounts of circular telomeric DNA, suppression of the t-loop HR reaction at telomeres may be incomplete. The control of t-loop HR appears to be further relaxed in ALT cells, which contain abundant telomeric circles (Cesare and Griffith 2004 Wang et al. 2004). As T-SCE and t-loop HR are similar reactions (one taking place in cis, the other in trans), their prevalence in ALT cells may be due to loss of a repressor that controls both.

There may be a third type of HR with detrimental outcomes—the recombination between a telomere and interstitial telomeric DNA. Chromosome internal telomeric DNA is not frequent in human cells, but in many other vertebrates, such sequences are abundant throughout the chromosomes. Recombination between telomeres and these elements could generate terminal deletions, extrachromosomal fragments, inversions, and translocations. This type of recombination appears to take place in mouse cells lacking ERCC1, which generate large extrachromosomal elements that contain a single stretch of telomeric DNA, presumably at a chromosome internal site (Zhu et al. 2003). These elements, referred to as Telomeric DNA-containing Double Minute chromosomes (TDMs) could be formed by recombination between a telomere and interstitial telomeric DNA on the same chromosome. Perhaps shelterin carries ERCC1/XPF is on its “tool-belt” to prevent inappropriate recombination events.


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Present address: The Institute for Genomic Research, 9712 Medical Center Drive, Rockville, Maryland, 20850, USA

L. Eichinger, J. A. Pachebat, G. Glöckner, M.-A. Rajandream and R. Sucgang: *These authors contributed equally to this work

Mitgliedschaften

Center for Biochemistry and Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne, Joseph-Stelzmann-Str. 52, 50931, Cologne, Germany

L. Eichinger, J. A. Pachebat, B. Tunggal, F. Rivero, P. Farbrother & A. A. Noegel

Laboratory of Molecular Biology, MRC Centre, CB2 2QH, Cambridge, UK

J. A. Pachebat, S. Kummerfeld, M. Madera, B. A. Konfortov, A. T. Bankier, M. Madan Babu, A. Wardroper, R. R. Kay & P. H. Dear

Genome Analysis, Institute for Molecular Biotechnology, Beutenbergstr. 11, D-07745, Jena, Germany

G. Glöckner, K. Szafranski, R. Lehmann, M. Felder, A. Rosenthal & M. Platzer

The Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SA, UK

M.-A. Rajandream, M. Berriman, N. Hamlin, R. Davies, D. Saunders, P. Davis, A. Kerhornou, N. Hall, N. Bason, C. Churcher, J. Cooper, A. Cronin, I. Goodhead, T. Mourier, A. Pain, D. Harper, H. Hauser, K. James, D. Johnson, A. Knights, K. Mungall, K. Oliver, C. Price, M. A. Quail, E. Rabbinowitsch, M. Sanders, S. Sharp, M. Simmonds, S. Spiegler, A. Tivey, B. White, D. Walker, J. Woodward & B. Barrell

Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, USA

R. Sucgang, J. Song, G. Chen, X. Nie, L. Hemphill, B. Desany, M. Lu, R. Lindsay, J. Ma & A. Kuspa

Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, USA

Q. Xu, E. Sodergren, N. van Driessche, G. Shaulsky, G. Weinstock, R. Gibbs & A. Kuspa

Graduate Program in Structural and Computational Biology and Molecular Biophysics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, USA

Human Genome Sequencing Center, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, USA

E. Sodergren, D. Muzny, M. Quiles, H. Loulseged, J. Hernandez, D. Steffen, G. Weinstock & R. Gibbs

Section of Cell and Developmental Biology, Division of Biology, University of California, La Jolla, California, 92093, San Diego, USA

R. Olsen, C. Anjard & W. F. Loomis

dictyBase, Center for Genetic Medicine, Northwestern University, 303 E Chicago Ave, Chicago, Illinois, 60611, USA

P. Gaudet, P. Fey, K. Pilcher, E. Just & R. L. Chisholm

Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki, 305-8572, Japan

T. Morio, H. Urushihara & Y. Tanaka

Adolf-Butenandt-Institute/Cell Biology, Ludwig-Maximilians-University, 80336, Munich, Germany

Biochemistry Department, University of Cambridge, Cambridge, CB2 1QW, UK

Division of Biological Sciences, Graduate School of Science, Hokkaido University, 060-0810, Sapporo, Japan

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Department of Medical Genome Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, Minato, Tokyo, 108-8639, Japan

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