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Warum ist die Länge der UTR in der genomischen Sequenz von Gen X zu viel länger als die gleiche Region in den entsprechenden Refseq-mRNA-Sequenzen?

Warum ist die Länge der UTR in der genomischen Sequenz von Gen X zu viel länger als die gleiche Region in den entsprechenden Refseq-mRNA-Sequenzen?



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Ich stöbere im UCSC-Genombrowser und habe festgestellt, dass die UTRs-Länge des KIAA0040-Gens in den genomischen Sequenzen zu viel länger ist als die entsprechende Refseq-mRNA-Sequenz. Tatsächlich beträgt die Gesamtlänge der Refseq-mRNA-Sequenz 4.721 und die Länge ihrer genomischen Sequenz etwa 36.107 bp, von denen die Länge der CDS nur 300 bp beträgt. Wie ist dieses Ereignis zu erklären? Dieses Gen hat 4 Transkriptvarianten und ich weiß etwas darüber, dass UTR mehrere Exons umfassen kann, aber ich bin mir nicht sicher und würde gerne mehr von Ihnen hören.


UTRs sind an der posttranskriptionellen Regulation beteiligt. Siehe die Wikipedia-Artikel zu den 5'- und 3'-UTRs. Alternatives Spleißen von UTRs ermöglicht das Freilegen/Verbergen dieser Regulationsstellen, was dann für die differentielle Regulation in unterschiedlichen Geweben nützlich sein kann.


Die Analyse von 5’-Genregionen zeigt eine außergewöhnliche Konservierung neuartiger nicht-kodierender Sequenzen in einer Vielzahl von Tieren

Das phylogenetische Footprinting ist eine vergleichende Methode, die auf dem Prinzip basiert, dass funktionelle Sequenzelemente im Laufe der Zeit weniger Mutationen erhalten als nicht-funktionelle Sequenzen. Erfolgreiche Vergleiche entfernt verwandter Arten werden daher sehr wichtige Sequenzelemente ergeben, die wahrscheinlich grundlegende biologische Funktionen erfüllen. RNA-regulatorische Elemente sind weniger gut verstanden als diejenigen in DNA. In dieser Studie verwenden wir den aufkommenden Modellorganismus Nasonia vitripennis, einer parasitären Wespe, in einer vergleichenden Analyse gegen 12 Insektengenome, um tief konservierte nicht-kodierende Elemente (CNEs) zu identifizieren, die in großen Insektengruppen konserviert sind, mit einem Fokus auf 5’ UTRs und Promotorsequenzen.

Ergebnisse

Wir berichten über die Identifizierung von 322 CNEs, die in einem breiten Spektrum von Insektenordnungen konserviert sind. Die identifizierten Regionen sind mit regulatorischen und Entwicklungsgenen assoziiert und enthalten kurze Fußabdrücke, die Aspekte ihrer wahrscheinlichen Funktion bei der translationalen Regulation aufdecken. Es wurde festgestellt, dass die ältesten Regionen, die in unserer Analyse identifiziert wurden, alle transkribierte Regionen von Genen überlappen, was eine stärkere Konservierung translationaler regulatorischer Elemente als transkriptionaler Elemente widerspiegelt. Um die Sequenzanalysen auf Nicht-Insektenarten auszudehnen, berichten wir auch über die Entdeckung der beiden ältesten und am weitesten verbreiteten CNEs, die bisher im Tierreich beschrieben wurden (700 MYA). Diese alten konservierten nicht-kodierenden Elemente sind mit den beiden Genen des ribosomalen Stiels verbunden, RPLP1 und RPLP2, und waren sehr wahrscheinlich bei einigen der frühesten Tiere funktionsfähig.

Schlussfolgerungen

Wir berichten über die Identifizierung der bisher am tiefsten konservierten CNEs und mehrerer anderer tief konservierter Elemente, die ausnahmslos Teil von 5'-untranslatierten Regionen von Transkripten sind und in einer Reihe von entscheidenden translationalen Regulationsgenen vorkommen, was die translationale Regulation von translationalen Regulatoren als konserviertes Merkmal von Insektengenomen.


MCB 305 PRÜFUNG 3

Das bicoide Protein ist ein Transkriptionsfaktor, der im frühen Drosophila-Syncytium als anteriores Morphogen fungiert, während das kaudale Protein ein Transkriptionsfaktor ist, der als posteriores Morphogen fungiert. Interessanterweise fungiert das bicoide Protein auch als Senke für das kaudale Morphogen. Wie geht das?

Eine Fliege, die ein Transgen mit GAL4 fusioniert mit einem interessierenden Promotor trägt, wird mit einer Fliege gekreuzt, die ein Transgen mit einem Hitzeschock-Promotor trägt

Eine Fliege, die ein Transgen mit GAL4 fusioniert mit einem interessierenden Promotor trägt, wird mit einer Fliege gekreuzt, die ein Transgen mit einer GAL4-Bindungsstelle in ihrem Promotor trägt.

Eine Fliege, die ein Transgen mit einer GAL4-Bindungsstelle in ihrem Promotor trägt, wird einem Hitzeschock ausgesetzt.

Es ist fest entschlossen, ein drittes Horn zu werden.

Es ist angegeben, ein drittes Horn zu werden

Es ist angegeben, gut zu werden

Versuch: Isolieren Sie die beiden Zellen und züchten Sie sie bis zum Larvenstadium Ergebnis: Die beiden Zellen entwickeln sich jeweils nur zu Teillarven.

Experiment: Isolieren Sie die beiden Zellen und züchten Sie sie bis zum Larvenstadium Ergebnis: Die beiden Zellen entwickeln sich jeweils zu vollständigen, wenn auch kleineren Larven.

Experiment: Den zweizelligen Embryo bis zum Larvenstadium wachsen lassen und dann die Zellen trennen Ergebnis: Jede Zelle ist in der Lage, eine neue, vollständige Larve zu bilden.

Alternatives Spleißen von Introns könnte zur Produktion unterschiedlicher, aber ähnlicher Proteine ​​desselben Gens in zwei Zelltypen führen.

Veränderungen in der DNA-Methylierung und/oder Histon-Modifikation könnten zum "Silencing" einiger Gene in einem Zelltyp führen, aber nicht in einem anderen.

Eine mRNA kann von demselben Gen in zwei verschiedenen Zelltypen exprimiert werden, aber in einem Zelltyp hat die mRNA eine sehr kurze Halbwertszeit, während die mRNA in dem anderen Zelltyp viel länger bestehen kann.

In einem Zelltyp kann ein regulatorisches Protein an die 5'-UTR einer reifen mRNA binden, was deren Translationsfähigkeit verringert, während in einem anderen Zelltyp kein regulatorisches Protein vorhanden ist, sodass die mRNA häufiger translatiert wird, was zu höheren Proteingehalt.

In einem Zelltyp wird ein Satz von drei Aktivatorproteinen exprimiert, was zu hohen Transkriptionsniveaus von einem bestimmten Gen führt, während in einem anderen Zelltyp nur zwei der Aktivatorproteine ​​exprimiert werden, was zu niedrigeren Transkriptionsniveaus dieses Gens führt.


MCB 110

70-‐fach. Mutation von nur O2 oder O3 reduziert die Repression um das 2-fache.
Es gibt mehrere symmetrische Bindungsstellen und es möchte sicherstellen, dass genügend Sequenz vorhanden ist, um es herunterzufahren, wenn es heruntergefahren werden muss
•Die sekundären Operatoren erhöhen die lokale Konzentration des Lac-Repressors (

- Glucose und Lactose vorhanden, cAMP niedrig. Auch wenn wir jetzt den Repressor außer Gefecht gesetzt haben, haben Sie die Pause weggenommen, aber das Gaspedal nicht aufgesetzt. Habe sehr wenig Transkription.

Gen ist "angeschaltet" - Aktiv transkribierte Region (Teil des Chromosoms, der Gene trägt, die in einer bestimmten Zelle transkribiert werden müssen. Muss Platz für die RNA-Polymerase haben, um darin zu sitzen und ihre Sache zu tun.)
1. DNA ist in C-Position nicht methyliert. Bedeutet, dass es sich um stille Regionen des Chromosoms handelt.
2. Noch wichtiger, die Histone-Oktamere (8 Untereinheiten) gibt es Regionen dieser Histone, die nicht strukturiert sind (herumflattern). Strukturen können durch Lys oder Arg usw. modifiziert werden. Modifiziert entweder durch Acetylierung oder Methylierung. Bestimmte Enzyme, die an dieser Modifikation beteiligt sind.
ich. HAT: Histonacetyltransferase. Übertragung der Acetylgruppe auf bestimmte Komponenten der Histon-Gene. Markiert aktive Gene.
3. Müssen die Struktur auflockern. Gehen Sie von einem stark verdichteten, abgeschalteten Chromosom in einen aktiveren losen Zustand über.
Nicht gezeigt: Wenn Sie sich in einem wirklich kompakten Zustand befinden (heterochromatische Regionen nennen), haben Sie nicht nur Histone-Oktamere, sondern auch Histone H1 oder H5, spezialisierte Histone, die als Linker bezeichnet werden und die Struktur weiter verdichten.

TATAA-bindendes Protein. Erkennt die TATAA-Sequenz. In Eukaryoten kommt Sigma am nächsten, da dieses Protein einen Komplex mit RNA Pol bildet (Prä-Initiations-Komplex)

Erste von mehreren Techniken, um herauszufinden, wo eine Region von Interesse für einen Promotor- oder Enhancer-Bindungsfaktor liegen könnte. Eine Sache, die bereits in den 80er Jahren entdeckt wurde, war, dass man, wenn man Chromatin nahm, sehr sanft aus dem Kern herauskam und mit einer geringen Menge DNA, doppelsträngiger spaltender DNA, darauf traf. Es würde das gesamte Genom sprengen, und wo immer die nackte DNA (nicht durch das Nukleosom geschützt) verfügbar war, würde sie schneiden. Grundsätzlich wird das gesamte Chromatin gelesen - jedes Chromosom und überall dort geschnitten, wo es zugänglich ist. Es hat eine Weile gedauert, bis wir herausgefunden haben, dass, wenn man ein solches Experiment durchführt und dann alle Orte, an denen die DNA zugänglich war, genau kartografiert, es tatsächlich ein guter, aber grober Ersatz für die Kartierung aller Orte ist, an denen Transkriptionsfaktoren sein könnten.

Was passiert mit einer dieser Techniken, z. B. ob es sich um die hypersensible Site oder die konservierte Site oder eine andere, Sie wissen, einen Kandidaten oder eine Region handelt, die Sie für wichtig halten.

Grafische Darstellung der Konservierung von DNA-Sequenzen innerhalb einer entsprechenden Region (

6-Kb) in fünf verschiedenen Genomen zeigt eine Region von

Teil 2: Der Trick ist, dass Sie das wieder in die Zelle stecken möchten, die Ihnen wichtig ist. Sie müssen verstehen, nach welchem ​​Zelltyp Sie suchen und untersuchen und welches Gen von Interesse ist. Jetzt führen Sie eine Sammlung von Plasmiden mit verschiedenen Fragmenten Ihrer Enhancer-Promotor-Region ein. Kann in entsprechenden Zelltyp einführen. Dann ist das Reportergen normalerweise ein Enzym, das Sie leicht quantifizieren und messen können. Legen Sie manchmal ein fluoreszierendes Ding darauf, damit Sie die Lichtmenge sehen können, die es erzeugt. Dadurch wird die Aktivität des Reporters gemessen. Mehrere Möglichkeiten, dies zu messen. Eine Möglichkeit besteht darin, die Menge an RNA zu messen, die produziert wird. Eine andere Möglichkeit besteht darin, sich die Proteinmenge anzusehen, die aus dieser RNA stammt. Wir nutzen beide Möglichkeiten.
Dann werden Sie bemerken, dass von diesen Plasmiden das längste aktiv ist und dann eventuell kleinere nicht mehr aktiv sind, weil Sie die wichtige Region weggehackt haben.
Wichtige Kontrolle: Wiederholen Sie das Experiment und legen Sie es in einen anderen Zelltyp und es sollte diese Aktivität nicht haben. Es sei denn, Sie haben das Gen ausgewählt, das zufällig in beiden Zelltypen exprimiert wird, da es in beiden Zelltypen aktiv wird.

(a) Gene multizellulärer Organismen enthalten neben dem/den Kernpromotorelement(en) sowohl promotornahe Elemente als auch Enhancer (zusammen als cis-wirkende Kontrollelemente bezeichnet). cis-wirkende Kontrollelemente sind gebunden
durch trans-wirkende Transkriptionsfaktoren.
(b) Enhancer können aus großer Entfernung wirken. Ferninteraktionen sind
durch Bildung von DNA-Schleifen erreicht.

RNA Pol 2 ist im Nukleoplasma vorhanden. Es ist dasjenige, das an der Transkription aller Proteingene (der gesamten mRNA) sowie einiger nukleärer RNA (RNAs, die den Kern nie verlassen und am Spleißen und anderen Arten der RNA-Verarbeitung beteiligt sind) sowie an Mikro-RNAs beteiligt ist. Sehr empfindlich gegenüber Alpha-Amanitin

Die Transkription kann durch proximale und distale Promotorfaktoren aktiviert oder unterdrückt werden, manchmal wirken sie durch Cofaktoren (Mediator)

Wir haben dieses System vereinfacht untersucht. Anstelle von TFIID verwenden wir TBP, arbeiten aber am TATA-Promotor. Sie benötigen den Rest der Kappen, um an alle Kernpromotorsequenzen zu binden, aber TBP reicht aus, um die Initiation im Kontext einer TATA-Box zu starten.

Wir haben dann diesen Kernpromotor, der an metallisch beschichtete Perlen gebunden ist. Dies ist eine Möglichkeit, die Reinigung ohne Verwendung einer Farbe durchzuführen, da wir sehr kleine Materialien haben. In einem Reagenzglas mit einem sehr kleinen Volumen haben wir DNA und fügen die gewünschten Faktoren hinzu, lassen sie an die DNA binden, dann waschen wir die Perlen, um alles loszuwerden, was nicht bindet. Anschließend gewinnen wir das an die DNA gebundene Protein zurück, indem wir die DNA mit einem Restriktionsenzym abfangen.

Wir bauen dieses komplexe Stück für Stück. Sehen, wohin jeder geht. Wir erhalten Strukturen, während wir voranschreiten und identifizieren, wohin es geht und wie es die DNA beeinflusst usw.

Wir können Strukturen mit Duplex-DNA erhalten. Wir können Strukturen mit Transkriptionsblase erhalten. In diesem Fall haben wir betrogen, indem wir eine Blase mit einer Fehlanpassung erzeugt haben. Dies ermöglicht es uns, eine Nachahmung der Struktur zu erhalten, in der der Komplex die offene Duplex eingreift. Normalerweise würde das mit der ATPase-Aktivität von TFIIH . passieren
Wenn wir diese 2 Strukturen vergleichen und uns nur auf die DNA konzentrieren. Dieser Teil wird von TBP (rot) und von TFIIB (blau) gebunden. Dies ändert sich nicht, da es sehr fest an die DNA bindet.
Dieser Teil der DNA bewegt sich hinein und bildet die Blase. Wir können sogar andere Zustände erzeugen, weil es viele Beta-Transkriptionsblasen erzeugen würde. Komplementäre mRNA und der daran gebundene Komplex würden ITC (initial transcribing complex) erzeugen, wo sich der Pol kurz davor befindet
Da wir es in verschiedenen Zuständen erhalten konnten, können wir sehen, welche Bewegungen sowohl die Proteine ​​als auch die DNA durch diese ersten Schritte des Erhaltens des Duplex und des Öffnens der DNA durchlaufen.


Zusammenfassung

Zellen kontrollieren dynamische Übergänge in Transkriptniveaus, indem sie Transkription, Verarbeitung und/oder Abbau durch eine integrierte Regulierungsstrategie regulieren. Hier kombinieren wir RNA-metabolische Markierung, rRNA-depleted RNA-seq und DRiLL, ein neuartiges Computer-Framework, um die Level-Editing-Sites und die Transkriptions-, Prozessierungs- und Abbauraten jedes Transkripts bei einer Spleißverbindungsauflösung während der LPS-Antwort von . zu quantifizieren Dendritische Zellen der Maus. Vier wichtige regulatorische Strategien, die von RNA-Transkriptionsänderungen dominiert werden, erzeugen die meisten zeitlichen Genexpressionsmuster. Nichtkanonische Strategien, die auch dynamische posttranskriptionelle Regulation verwenden, kontrollieren nur eine Minderheit von Genen, bieten jedoch einzigartige Signalverarbeitungsfunktionen. Wir validieren Tristetraprolin (TTP) als Hauptregulator des RNA-Abbaus in einer nicht-kanonischen Strategie. Die Anwendung von DRiLL auf die Regulation nichtkodierender RNAs und auf die Embryogenese von Zebrafischen zeigt seinen breiten Nutzen. Unsere Studie bietet einen neuen quantitativen Ansatz, um transkriptionelle und posttranskriptionelle Ereignisse zu entdecken, die dynamische Veränderungen der Transkriptspiegel mithilfe von RNA-Sequenzierungsdaten steuern.


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Diskussion

In dieser Arbeit haben wir Transkriptomik und Chromatin-Zugänglichkeitsanalyse angewendet, um systematisch genetische Veränderungen zu untersuchen, die Flossen von Gliedmaßen unterscheiden. Aufgrund der langsamen Sequenzentwicklung und der Embryoverfügbarkeit des Bambushais konnten wir die transkriptionale Regulation von Genen mit hoher Genauigkeit vergleichen und fanden sowohl heterochrone Verschiebungen als auch eine sanduhrförmige Erhaltung der transkriptionalen Regulation zwischen der Flossen- und Gliedmaßenentwicklung. Hier diskutieren wir die Interpretationen, Einschränkungen und Implikationen dieser Ergebnisse.

Unsere Zeitreihen-Transkriptomdaten zeigten, dass eine bemerkenswerte Anzahl von Genen, die in den späten Stadien der Entwicklung der Gliedmaßenknospen der Maus die höchste Expression aufweisen, während der späten Stadien der Entwicklung der Bambushaifischflossen verringert ist (Abbildung 2). Die einfachste Hypothese für diese heterochrone Massenverschiebung ist, dass die späteren Stadien der Gliedmaßenentwicklung die Expression eines oder einiger weniger stromaufwärts gelegener Transkriptionsfaktoren oder Signalmoleküle, die diese Gruppe von Genen kollektiv regulieren, erlangt haben. Interessanterweise beobachteten wir auch eine relativ umfangreiche Expression der stromabwärts gelegenen Ziele des SHH-Signalwegs in den Knospen der Gliedmaßen von Mäusen im Vergleich zu den Knospen der Bambushaifischflossen (Abbildung 3). Da bereits früher über eine SHH-unabhängige Regulation seiner Zielgene durch den GLI3-HOX-Komplex berichtet wurde (Chen et al., 2004), ist die Fehlanpassung zwischen der Peakexpression von Schh und seine Zielgene können durch solche SHH-unabhängigen Regulationsmechanismen verursacht werden, die bei der Entwicklung von Bambushaiflossen fehlen. Angesichts der Tatsache, dass direkte und genetische Interaktionen von GLI3 und HOX einen signifikanten Einfluss auf die Bildung von Autopoden haben, könnte das Auftreten dieser Interaktion eine Schlüsselkomponente der heterochronen Massenverschiebung und des Erwerbs einer autopodenbezogenen Entwicklungsregulation in den Tetrapoden sein. Da wir jedoch nur zwei Arten verglichen haben, ist es ebenso möglich, dass die späten Stadien der Haiflossenentwicklung diese SHH-unabhängige Genregulation verloren haben. Da die evolutionäre Distanz zwischen diesen beiden Arten 400 Millionen Jahre beträgt, ist es alternativ auch möglich, dass jedes dieser Gene seine Expression unabhängig auf die späteren Stadien der Gliedmaßenentwicklung oder auf die frühen Stadien der Haiflossenentwicklung verlagerte. Weitere Taxon-Sampling- und Funktionsanalysen werden den Zusammenhang zwischen der heterochronen Massenverschiebung und der Entstehung des Autopoden aufdecken.

Im Zusammenhang mit den potenziellen Veränderungen der Regulation von SHH-Zielgenen haben wir zuvor durch die Analyse von Katzenhaiflossenknospen vorgeschlagen, dass sich die Expressionsdomänen von Genen, die durch SHH positiv reguliert werden, während des Übergangs von der Flosse zu den Gliedmaßen nach vorne ausgedehnt haben könnten (Onimaru et al. , 2015). Wir spekulierten, dass diese Ausdrucksänderungen mit dem Verlust von pro- und mesopterygialen Elementen zusammenhängen könnten. Kürzlich wurde diese Hypothese teilweise von einer anderen Gruppe unterstützt, die das Genexpressionsmuster der Entwicklung von Lungenfischen und Buntbarschflossen verglich (Woltering et al., 2020), wobei die Flossenknospen von Lungenfischen einen Zwischenzustand zwischen nicht-sarcopterygischen Fischflossen und Tetrapoden-Gliedern aufweisen hinsichtlich der Genexpressionsverteilung entlang der anterior-posterioren Achse. Diese Gruppe betonte insbesondere, dass das Fehlen und Vorhandensein der Dynamik der anterioren Expansion von Hoxd13 Expression korreliert mit dem Unterschied zwischen den metapterygialen Morphologien von Lungenfischen und Tetrapoden (siehe auch Johanson et al., 2007 für einen widersprüchlichen Bericht). Allerdings ist die Bedeutung von Änderungen in Hoxd13 Ausdruck bleibt aus den folgenden zwei Gründen unklar: (a) Hoxd13 Expressionsmuster scheint zwischen den Arten ziemlich unterschiedlich zu sein Hoxd13 Expression wurde in den Flossenknospen des kleinen Rochens, des Kleingefleckten Katzenhais beobachtet und Polyodon (Davis et al., 2007 Freitas et al., 2007 Nakamura et al., 2015), während nicht in denen von Zebrafischen und Buntbarschen (Ahn und Ho, 2008 Woltering et al., 2020) und (b) in Fischflossen, der Ausdrucksbereich von Hoxa13, deren Funktion meist überflüssig ist mit Hoxd13, erstreckt sich in Fischflossenknospen häufig von der vorderen zur hinteren Region wie die Gliedmaßen von Tetrapoden (Davis et al., 2007 Freitas et al., 2007 Nakamura et al., 2016). Daher, während Änderungen in Hoxd13 Expressionsdomäne wahrscheinlich zu einem gewissen Grad an anatomischer Vielfalt beitragen, ihr Einfluss ist im Zusammenhang mit dem Übergang von Flosse zu Gliedmaßen fraglich. Dennoch haben unsere vorherige Studie und Woltering et al. legen häufig nahe, dass die anteriore Expansion von Genexpressionsdomänen wahrscheinlich mit den wesentlichen anatomischen Veränderungen während des Übergangs von Flosse zu Gliedmaßen verbunden ist. Wie oben diskutiert, spekulieren wir, dass die heterochronen Massenverschiebungen, die wir in der vorliegenden Studie beobachtet haben, mit der Zunahme der SHH-unabhängigen Regulation seiner Zielgene zusammenhängen könnten.Ob die anteriore Expansion der SHH-Zielgenexpression mit den heterochronen Massenverschiebungen zusammenhängt, wird daher in Zukunft eine der interessanten Fragen sein.

Wir beobachteten, dass Genexpressionsprofile zwischen den Bambushaiflossenknospen in St. 27.5� und Maus-Vordergliedmaßenknospen bei E10.5 (Abbildung 4). In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis zeigt unsere Chromatin-Zugänglichkeitsanalyse, dass OCRs bei E10.5 dazu neigen, evolutionär konservierte Sequenzen zu enthalten ( 5 ). Während viele Gruppen mit unterschiedlichen Spezies über eine transkriptomische Konservierung in der Mitte der Embryonalentwicklung berichtet haben (z. Durch die Analyse von Histon-Acetylierungsmarkierungen auf mehreren sich entwickelnden Organen in Mausembryonen haben Nord et al., 2013, vorgeschlagene regulatorische Sequenzen, die bei E11.5 aktiv sind, dem höchsten evolutionären Zwang ausgesetzt. Sie verwendeten jedoch in frühen Stadien Stammzelllinien als Ersatz für Organe. Eine andere Studie zeigte, dass Gene, die im Segmentierungsstadium von Zebrafischembryonen exprimiert wurden, dazu neigten, von hochkonservierten nicht-kodierenden Sequenzen umgeben zu sein (Piasecka et al., 2013). Obwohl ihre Ergebnisse mit unserer unten diskutierten vorliegenden Studie übereinstimmen, zeigten sie nicht, dass diese hochkonservierten nicht-kodierenden Sequenzen tatsächlich im Segmentierungsstadium aktiv waren. Zusätzlich zu diesen Studien gibt es eine widersprüchliche Beobachtung, dass frühe und nicht mittlere embryonale Stadien eher durch konservierte OCRs reguliert werden (Uesaka et al., 2019). Daher ist unsere vorliegende Studie die erste, die überzeugend eine klare Korrelation des Erhaltungszustands zwischen Transkriptomdaten und OCRs zeigt. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass während der mittleren Phase der Flossen- und Gliedmaßenentwicklung evolutionäre Einschränkungen des Genregulationsapparates vorhanden sind. Was die sanduhrförmige Konservierung antreibt, ist noch umstritten. Interessanterweise fanden wir, dass stadien- und gewebespezifische OCRs in diesem konservierten Zeitraum angereichert wurden, während dessen eine relativ geringe Anzahl von stadien- und gewebespezifischen Genen exprimiert wurde (Abbildung 6). Diese ziemlich gegensätzlichen Beobachtungen implizieren, dass die Entwicklung der Gliedmaßen im mittleren Stadium um pleiotrope Gene angereichert ist, die von mehreren gewebespezifischen Enhancern, einschließlich gliedmaßenspezifischer, gesteuert werden, und nicht von konstitutiven Promotoren, die oft Housekeeping-Gene regulieren. Daher vermuten wir, dass, zumindest im Fall der Gliedmaßenentwicklung, komplexe regulatorische Sequenzen, die raumzeitliche spezifische Transkriptionskontrollen über pleiotrope Gene ausführen, die Entwicklungsfähigkeit dieser speziellen Phase der Morphogenese einschränken, wahrscheinlich aufgrund der Anfälligkeit komplexer Regulationen für genetische Mutationen.

Zusammenfassend liefert die vorliegende Studie Erkenntnisse über den evolutionären Ursprung der Genregulation, die Flossen von Gliedmaßen unterscheidet. Insbesondere vergleichende Transkriptionsanalysen veranlassten uns zu der Hypothese, dass massenhafte heterochrone Verschiebungen der Genexpression während der Flossen-zu-Gliedmaßen-Evolution aufgetreten sein könnten. Darüber hinaus weisen sowohl Transkriptom- als auch offene Chromatin-Daten auf eine evolutionäre Einschränkung während der Entwicklung der Gliedmaßen im mittleren Stadium hin, die wahrscheinlich auf die Komplexität der Genregulation zurückzuführen ist. Obwohl diese Hypothesen weitere Taxonproben und experimentelle Tests erfordern, eröffnet diese Studie neue Perspektiven für das Verständnis nicht nur der genetischen Grundlagen des Übergangs von Flosse zu Gliedmaßen, sondern auch der allgemeinen Natur der morphologischen Evolution.


Warum ist die Länge der UTR in der genomischen Sequenz von Gen X zu viel länger als die gleiche Region in den entsprechenden Refseq-mRNA-Sequenzen? - Biologie

Was ist für die biologische Lebensdauerverlängerung erforderlich?

1. Den Alterungsprozess verstehen

–20+ Jahre Erfahrung mit Alterungsmechanismen

2. Entwicklung von Manipulationen an Organismen, die den Alterungsprozess verzögern oder umkehren

3.3 Hauptziele: Erhöhung des frühen Überlebens, Erhöhung des späten Überlebens, Verzögerung der Seneszenz

4. Technologien zur Durchführung von Alterungsbehandlungen: Medikamente, Gentherapie, Zelltherapie usw.

  • Strategien für Engineered Negligible Senescence (SENS).
  • Sieben Ursachen des Alterns und ihre möglichen Behandlungsmethoden.
  • Ein "zielorientierter und nicht neugieriger" Ansatz zur Wissenschaft des Alterns.
  • ist der Ansicht, dass die nächste große gesellschaftliche Debatte beginnt, wenn die Alterungsforschung so weit fortgeschritten ist, dass öffentliche Mittel verwendet werden könnten, um die Einführung einer wirksamen Behandlung des Alterns zu beschleunigen;

1. Zellverlust (1955): Einige Gewebe verlieren mit zunehmendem Alter Zellen, wie das Herz und Bereiche des Gehirns. Stammzellforschung und regenerative Medizin liefern bereits vielversprechende Antworten auf die Degeneration durch Zellverlust.

2. Telomere (1978): Wir müssen die telomerbezogenen Mechanismen beseitigen, die zu Krebs führen. de Gray schlägt vor, unsere Telomer-Elongationsgene durch gezielte Gentherapien selektiv nach Gewebetyp zu modifizieren.

3. Mitochondriale DNA (1972): Fügen Sie nukleare Kopien der mitochondrialen Gene hinzu, um sie zu schützen. Andere Strategien zur Manipulation und Reparatur beschädigter mitochondrialer DNA in situ wurden erstmals 2005 demonstriert.

4. Extrazelluläre Vernetzungen (1981): Einige der Proteine ​​außerhalb unserer Zellen, wie die für die Arterienwände und die Hautelastizität lebenswichtigen, werden früh in unserem Leben erzeugt und nie oder nur sehr langsam recycelt. Diese langlebigen Proteine ​​sind anfällig für chemische Reaktionen, die ihre Wirksamkeit beeinträchtigen. Wissenschaftler können nach geeigneten Enzymen oder Verbindungen suchen, um problematische chemische Querverbindungen abzubauen, mit denen ihr Körper nicht umgehen kann.

5. Seneszente Zellen (1965): Bestimmte Klassen von Seneszenzzellen reichern sich dort an, wo sie nicht erwünscht sind, zB in den Gelenken. Im Prinzip könnten wir Immuntherapien nutzen, um unser Immunsystem so zu gestalten, dass es Zellen zerstört, wenn sie altern, und damit damit verbundene Probleme verhindern.

6. Extrazellulärer Müll (1907): Mit zunehmendem Alter sammelt sich Müll, der als Amyloid bekannt ist, außerhalb der Zellen an. Gegenwärtig werden Immuntherapien (Impfstoffe) für Alzheimer entwickelt, eine Erkrankung mit prominenten Amyloid-Plaques, und ähnliche Bemühungen könnten auf andere Klassen von extrazellulärem Junk-Material angewendet werden.

7. Intrazellulärer Junk (1959): Junk-Material sammelt sich in sich nicht teilenden, langlebigen Zellen an, beeinträchtigt die Funktionen und verursacht Schäden. Die Biochemie dieses Mülls ist ziemlich gut verstanden, das Problem liegt in der Entwicklung einer Therapie zum Abbau des unerwünschten Materials. de Gray schlägt vor, in Bodenbakterien nach geeigneten ungiftigen mikrobiellen Enzymen zu suchen, die sicher in menschliche Zellen eingebracht werden könnten.

Vorwärtsgenetik identifiziert Genfunktionen (die fettfrei Gen hier)

Vorwärtsgenetik ist der Ansatz, die für einen Phänotyp verantwortliche genetische Grundlage zu bestimmen. Dies geschah zunächst durch die Verwendung natürlich vorkommender Mutationen oder das Induzieren von Mutanten mit Strahlung, Chemikalien oder Insertionsmutagenese (z. B. transponierbare Elemente). Anschließende Züchtung findet statt, mutierte Individuen werden isoliert und dann wird das Gen kartiert.

Mutierte Phänotypen werden oft beobachtet, lange bevor man weiß, welches Gen dafür verantwortlich ist, was dazu führen kann, dass Gene nach ihrem mutierten Phänotyp benannt werden (z.B. Drosophila rosig Gen, das bei Mutanten nach der Augenfarbe benannt ist).

Reverse Genetik charakterisiert dein Lieblingsgen

Reverse Genetik ist eine Methode, die verwendet wird, um die Funktion eines Gens zu verstehen, indem die phänotypischen Auswirkungen spezifischer gentechnischer Sequenzen analysiert werden.

Wichtige Fragen am Ende dieser Vorlesung

  • Wie können Sie mithilfe von Vorwärts- und Rückwärtsgenetik Schlüsselgene identifizieren, die das Altern regulieren?
  • Was sind die wichtigsten Eigenschaften von Hefe als Modellorganismus?
  • Welche Methode wurde verwendet, um die Hefe-Deletionsbibliothek zu konstruieren?
  • Welche Methoden können verwendet werden, um essentielle Gene in Hefe zu zerstören?

Genetische Modellorganismen zur Identifizierung alternder Gene und Mechanismen

  • Kurze Lebensdauer, schnell gesammelte Versuchsergebnisse oder über viele Generationen hinweg
  • Leicht zu warten und kostengünstig, weisen weniger komplexe genetische oder physiologische Systeme auf als der Mensch
  • Einfach gentechnisch verändert
  • Gemeinsame evolutionäre Ursprünge von Arten, Genen und biochemischen Pfaden
  • Gemeinschaft von Wissenschaftlern, die sie untersuchen und physische und Informationsressourcen teilen

Generationszeiten der klassischen Modelle

Vergleichende Genomik von Modellorganismen

Die Genomsequenz ist nur der Anfang der Genetikforschung

Funktionen von 12.809 menschlichen Genen sind nicht bekannt (auffällig! enttäuschend?)

  • Einfachster Eukaryote und Pilz Bäckerhefe
  • Kann auf festen oder flüssigen Medien wachsen (108 Zellen/ml)
  • Zellen können haploide oder diploide wachsen
  • Kleine Chromosomen und kompaktes Genom (6000 Gene, 12 Mb DNA, 16 Chromosomen, wenige Introns)
  • Homologe Rekombination ebnete den Weg für Mutantenbibliotheken
  • Genom sequenziert 1998
  • Kurze Generierungszeit: 90 Minuten.
  • Kulturen können eingefroren und auf unbestimmte Zeit bei -80° . gelagert werden
  • Für Robotik geeignet
  • Grundlegende, biomedizinische und industrielle Anwendungen.
  • Erhaltung grundlegender Gene und Funktionen in Eukaryoten

Erstellung eines systematischen genomweiten Satzes von Hefe-Knockout-Stämmen

Das genomweite Knockout-Set umfasst:

Bau der Knockout-Kassette zum Austausch des offenen Leserahmens

  • 18 bp genomische Sequenz unmittelbar stromaufwärts des START-Codons des spezifischen ORF
  • 18 bp Sequenz, die allen Gen-Knockouts gemeinsam ist (U1)
  • 20 bp einzigartige Sequenz (molekularer Barcode TAG 1)
  • 18 bp-Sequenz homolog zur KanMX4-Kassette

  • 18 bp genomische Sequenz unmittelbar stromabwärts des STOP-Codons des spezifischen ORF
  • 17 bp Sequenz, die allen Gen-Knockouts gemeinsam ist (D1)
  • 20 bp einzigartige Sequenz (molekularer Barcode TAG 2)
  • 19 bp Sequenz homolog zur KanMX4-Kassette

Primer ist 18 Basen gemeinsam für alle Knockouts (U1)

Alle hinzugefügten Teile werden während der PCR von kanMX4 gezwungenermaßen mitgeliefert und sind alle im Endprodukt enthalten

18 Bp sind hilfreich, um eine Übereinstimmung im Genom zu finden

Die Durchführung der zweiten Runde pcr erhöht die Homologie

Chromosomale Integration des PCR-Produkts durch homologe Rekombination

Der einzige Zweck der zweiten Runde pcr besteht darin, den flankierenden Teilen des Gens mehr hinzuzufügen

Fügen Sie anfangs nicht mehr zur Grundierung hinzu, da dies zu lang wäre

Bestätigung der Löschung des ORF

Wachsende Kolonien auf Resistenzmedikamenten, Überlebende zeigen diejenigen, die die Deletion haben könnten

Woher wissen Sie, dass das pcr-Produkt an die richtige Stelle gelangt ist?

Erwartete pcr-Größen für pcr-Primer

Du erkennst die Aufnahme über den Größenunterschied

Wenn kanB die Arzneimittelresistenz hat, wird die pcr nur stattfinden, wenn der A-Primer und der b-Primer genau dort sind

Wenn das PCR-Produkt an anderer Stelle integriert ist, erhalten Sie kein PCr der erwarteten Größe

Wenn der b-Primer mit Ihrer Gensequenz übereinstimmt, sind Sie

Methoden zur Untersuchung von Funktionen essentieller Gene

  • Temperaturempfindlicher Promotor
  • Tetracyclin-(wirkstoffinduzierbarer) Promotor
  • Störung der mRNA

1200 essentielle Gene in Hefe, nicht löschbar

Die einzige Möglichkeit, diese zu studieren, besteht darin, sie niederzuschlagen und die Wirkung zu beobachten

Ersetzen Sie den endogenen Promotor, geben Sie den temp sens-Promotor (bzw. temp) ein. Wenn die Temperatur höher ist, sinken die Expressionsspiegel

DIP, fügen Sie einen Wirkstoff hinzu

Verminderte Häufigkeit durch mRNA-Störung (DAmP)

  • Eine gestörte 3’UTR führt aufgrund von Stabilitäts- und Lokalisierungsdefekten der mRNA zu einer reduzierten mRNA

Gen nach dem anderen Gen einfügen

Die Zelle weiß nicht, was sie tun soll

Koloniegröße zur Quantifizierung des Wachstums von Deletionsstämmen

  • Gendeletionsstämme, die im 1536-Format (384-Format in vierfacher Ausfertigung) gezüchtet wurden
  • Jedes Vierfach ist eine andere Gendeletion
  • Können Sie die für das Altern erforderliche Gendeletion finden?

Jung links, jeder Punkt steht für einen anderen Gendeletionsstamm, experimentelle Quads, 4 Stück, alle 4 Punkte einen anderen Gendeletionsstamm

Wie geht es mit dem Altern mit einer bestimmten Gendeletion um?

Viele Stämme, auch mit Gendeletion, kein nennenswerter Effekt auf das Altern

Entsprechende Stelle bei jungen sieht normal aus

Wenn das Gen fehlt, altert die Hefe nicht normal, das Knockout-Gen ist irgendwie am Alterungsprozess beteiligt

Sie müssen keine Barcodes verfolgen, da sich die Hefe in einer organisierten, fast matrixartigen Struktur befindet

Barcode-Sequenzierung zur Quantifizierung des Wachstums von Deletionsstämmen

Benötigen Sie Barcodes, wenn Sie alle Hefemutanten zusammen in einem einzigen Röhrchen züchten

Zwei Röhrchen mit je 1 ml von jedem Deletionsstämme, eines mit einem Medikament behandelt und eines nicht

Alle, die in einer Röhre wachsen, können sie nicht räumlich verfolgen

3 Hefen wachsen in einer Röhre

Jeder hat einen Strichcode, der für jede Gendeletion spezifisch ist

Unterschied zwischen vor- und nachgelagerten Barcode-Gen-spezifisch

Die Herausforderung besteht darin, herauszufinden, ob es Unterschiede in der Fülle von Barcodes gibt, die für Wachstum stehen

Barcodes reihen und addieren, wie oft sie vorkommen, mehr Wachstum = mehr Barcode

2) Jeder wächst in unterschiedlichen Mengen

Kann DNA aus dem Pool reinigen und dann eine PCR durchführen, um die Barcodes mit den Primern zu amplifizieren

Upstream verstärkt mit (U1,U2) DS mit D1,D2

Jetzt nach der PCR können Sie den Unterschied in der Arzneimittelresistenz sehen

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert selektiv DNA-Sequenzen

Original ds fna mit Zielsequenzen

1) Denaturieren zu Einzelsträngen und Anneal-Primern

2) Primer mit Taq DNA Polymerase verlängern

3) Wiederholen Sie die Denaturierung und das Annealing der Primer

4) Dadurch können Sie die Zielsequenz der DNA exponentiell amplifizieren

Erstellung eines systematischen genomweiten Satzes von Hefe-Knockout-Stämmen

Das genomweite Knockout-Set umfasst:

Bau der Knockout-Kassette zum Austausch des offenen Leserahmens

Das Arzneimittelresistenzgen befindet sich auf einem zirkulären Plasmid (Mitte), grün ist die spezifische Region von Interesse

Das Produkt muss aus dem Plasmid geholt werden

Fügen Sie dem Teil des Genoms, den Sie ändern möchten, zusätzliche Bits hinzu

Merkmale von Gen-Gen-(genetischen) Interaktionen

  • Das genetische Interaktionsnetzwerk wird als funktionelle Einheit der Zelle angesehen
  • Die Zellfunktion ist die resultierende Integration des Netzwerks von Netzwerken, die innerhalb der Zelle konzertiert agieren
  • Lokale Netzwerke werden um Gene angereichert, die einen gemeinsamen Phänotyp haben

Sobald Sie über Mutantenbibliotheken verfügen, besteht die Herausforderung darin zu verstehen, wie die Zelle mit Genmutanten als Ganzes funktioniert

Das Interaktionsnetzwerk ist die Grundlage eines Phänotyps

  • Epigenetik ist die erbliche Veränderung des Phänotyps, die nicht von einer Veränderung der DNA-Sequenz begleitet wird. Es ist oft mit Histon-Methylierungsmustern verbunden.
  • Epistase ist, wo man mehr erhält als die Summe der Teile der beitragenden Gene in einem Phänotyp. Die Messung der Epistase zwischen Genen ermöglicht die Charakterisierung funktioneller genetischer Interaktionsnetzwerke, einem wichtigen neuen Bereich der Annotation.

Analyse von paarweisen Mutantenkombinationen zur Abbildung komplexer funktioneller Netzwerke

  • Wie bereits erwähnt, ist das Hefegen-Komplement unterteilt in „essentielle Gene“ (K/O verursacht Unlebensfähigkeit) und „unwesentlich“ (K/O verursacht keine Unsterblichkeit)
  • Einige Mutantenkombinationen verursachen jedoch Doppelmutantenunfähigkeit (= synthetische Letalität)
  • Ssynthetische Letalität (SL) ist ein epistatisch Phänomen, das von allen Arten geteilt wird, und wir können Epistase als Ansatz zum Verständnis komplexer genetischer Interaktionen verwenden
  • Wir können dies tun, indem wir die Epistase genomweit in überlappenden Paaren mutierter Genkombinationen messen

Synthetische Letalität zeigt funktionelle Redundanz

Wenn zwei Gene gelöscht werden und es keine Lebensfähigkeit gibt

Haploid-diploider Lebenszyklus ermöglicht die automatisierte Bildung von Doppelmutanten über das gesamte Genom

  • Man möchte möglicherweise Doppelmutanten aus einer Einzelmutante xxxΔ mit allen anderen Einzelmutanten bilden.
  • Dieser Roboter steckt gegenüberliegende Kolonien vom Paarungstyp übereinander. Kann 96, 384, 1536 oder 6144 Doppelmutanten pro Platte machen.
  • https://www.youtube.com/watch?v=1JabqneqXPE

Synthetic Genetic Array (SGA) zur Identifizierung genetischer Interaktionen

Suchen Sie nach Epistase zwischen Ihrem Gen und allen anderen

Synthetic Genetic Array (SGA): eine Methode zur Konstruktion von Doppelmutanten im gesamten Genom

Meiotische Produkte sind alle möglichen Kombinationen des ursprünglichen diploiden

SGA-Analysen identifizieren interagierende Gene und Signalwege

Zwei grundlegende Arten genetischer Interaktionen

Die Leistung, die Sie erhalten würden, spiegelt das Wachstum wider

Hefe 1 Verdoppelung des pH-Wertes, normales Wachstum

Knockout-Gen A, halbe Wachstumsrate wie wt, dasselbe mit b-Gen

Die Kombination von ab del ergibt dasselbe wie bei beiden, neutrales Ergebnis erwartet

Synth tödlicher a comp für b _-

Positive Interaktion impliziert, dass die beiden Gene auf demselben Weg sind, Deletion verursacht Massenkompensation

Clustering zur Interpretation von SGA-Ergebnissen

Visuelle Darstellung von Ergebnissen aus der realen Welt

Mutanten-Array 4800 x Gene

Abfragen sind unterschiedliche initiale Gendeletionen

Kreuzung von Gendeletion mit mutiertem Array

Kann sehen, dass es einige positive und negative Wechselwirkungen gibt

Zeigt nicht, was die Funktion der Gene ist

Identifizieren Sie Bereiche mit hoher POS-Interaktion, um zu untersuchen, was die interagierenden bekannten Gene sind

Warum manche Menschen eine Krankheit haben, aber manche schlimmer sind

Dies liegt an den anderen interagierenden Genen

4.600 SGA-Analysen identifizieren 5,4 Millionen positive und negative genetische Interaktionen

Duplizierte Gene haben weniger genetische Interaktionen als nicht duplizierte Gene

Gibt es mehr Interaktionen für doppelte Gene?

Weniger Interaktionen, da immer das Duplikat zum Ausgleich vorhanden ist

Genetische Interaktionen können auch Interaktionen zwischen zellulären Prozessen identifizieren

Bestimmte Interaktionen haben eine funktionale Grundlage

Farben repräsentieren Funktionen

Vergrößerungen der Funktionskarte lösen genetische Interaktionen innerhalb und zwischen zellulären Prozessen

Verteilung positiver und negativer genetischer Interaktionen über das Genom

Positive und negative genetische Interaktionen auf Basis einer definierten Konfidenzschwelle (|ε| > 0.08, P < 0,05) (7, 8). Die Verteilung des genetischen Interaktionsnetzwerkgrades für negative (rot) und positive (grün) Interaktionen mit Abfragegenen.

Was ist chemische Genetik?

  • Wir haben diskutiert, wie Kombinationen genetischer Knockout-Mutationen verwendet werden, um genetische Interaktionen auf genomischer Ebene zu messen.
  • Wir können auch Verbindungen verwenden, um die Genfunktion direkt zu beeinflussen, bei denen aktive Chemikalien spezifisch an ein Genproteinprodukt binden, wodurch seine Funktion reduziert oder ausgeschaltet wird.
  • Auf diese Weise können wir die Verbindung als „Mutation“ betrachten, die in vielerlei Hinsicht „genetisch“ wirkt.
  • Koloniegröße oder Strichcode-Häufigkeit messen

Chemische Genetik kann gegenüber Mutationen in Bezug auf Spezifität und Zeit Vorteile bei der Störung der Genexpression haben

Verbindungen wirken reversibel und können in ihrer mutationsbedingten K/O-Allelwirkung titriert werden Mutationen sind im Allgemeinen nicht reversibel und können nicht titriert werden

Bei der reinen genetischen Analyse ist die Reversibilität von Mutationen auf bedingte Mutationen beschränkt (z. B. Temperatur, arzneimittelinduzierbarer Promotor)

Essentielle Genmutationen können umfassend mit Verbindungen untersucht werden

Verbindungen wirken schnell und können titriert werden

Geninteraktion bei Deletion keine Möglichkeit zur Titration

Kann ein Medikament verwenden, um das Gen zu hemmen, und unterschiedliche Konzentrationen führen zu einem Knockdown

Chemische Genomanalysen in Hefe können viele Dinge für den Menschen tun

  • Bestimmen Sie genaue Mechanismen der Arzneimittelwirkung, indem Sie das Hauptarzneimittel-Target sowie Nebenwirkungen außerhalb des Ziels identifizieren, einschließlich der potenziell vorteilhaften (für die Wiederverwendung zugelassener Arzneimittel) und/oder schädlich (die zu unerwünschten Nebenwirkungen führen)
  • Identifizieren Sie neuartige, "nicht bekämpfbare" Targets, um den Anteil des Genoms zu erweitern, der für chemotherapeutische Interventionen genutzt werden kann
  • Identifizieren Sie neuartige, spezifische chemische Sonden, die als schnelle, reversible molekularbiologische Werkzeuge verwendet werden können, um wesentliche biologische Funktionen abzufragen und die Architektur des Stoffwechselwegs aufzuklären
  • Übersetzen Sie Hefegenom-weite Assays in Säugerzellen

Haben Sie eine Vorstellung vom Ziel

Computer stellt das Ziel dar

Sie wissen nicht, welche Medikamente das Proteinziel hemmen könnten

Biochemischer Assay oder gwas-Screening-Target gegen Millionen von Targets

Könnte herausfinden, welches Medikament an dieses Ziel bindet

Dann können Sie Wirkmechanismusstudien durchführen

Von diesen verwenden Computer, um zu zeigen, was das Ziel dieser Drogen ist

Die Essenz der chemischen Genetik besteht darin, dass die Chemikalie eine genetische Mutation nachahmt

Mit chemischer Genetik ahmt Chemikalie eine Mutation nach

Wenn Gen x wird die Zelle am Leben sein

Wenn Sie Arzneimittel zur Hemmung verwenden

Verbindung x in chemischer Genetikstudie

Interaktion zwischen x 3 567

Nimm Gen a x mit Deletions-Array

Kann sehen, welche Gene mit 3567 interagieren

Arzneimittelinduzierte Haploinsuffizienz

2D hierechisches Clustering

Clusterergebnisse basierend auf Medikamentenprofilen

Ähnlichkeiten in der Wirkstoffklasse beginnen ein ähnliches genetisches Profil zu haben

Kann verwendet werden, um anzuzeigen, was Ihr Medikament bewirken könnte

Barcode-Sequenzierung (Bar-Seq):
Was sind die Strichcodes?

Das h und das h ergänzen sich

HIP-HOP in Hefe zur Identifizierung primärer und sekundärer Wirkstoffziele

  • haploichMangel Profiling (HÜFTE) basiert auf der "arzneimittelinduzierten Haploinsuffizienz". Arzneimittelinduzierte Haploinsuffizienz ist die beobachtete Wachstumsempfindlichkeit in Gegenwart eines Arzneimittels eines diploiden Hefestamms, der heterozygot für das Gen ist, das das Arzneimittelziel codiert (Naturgenetik, 21, 1999).
  • HOP (Homozygote Löschung Profiling)-Assay wird verwendet, um spezifische Gene zu identifizieren, die als Puffer für den Wirkstoff-Zielweg dienen.

Hüfte: Finden Sie heraus, an welches Medikament das Protein auch bindet

Wenn das Medikament das Gen hemmt

Hüpfen. Kann nur nicht essentielle Gene betrachten

ID-Gene, die das Wirkstoffziel unterscheiden

Kompetitiver gepoolter Barcode-Quantifizierungs-(Wachstums-)Assay

Diese Methode ist für HH gleich, nur andere Bibliotheken

Verschiedene Mutanten wachsen auf

Die einzige Möglichkeit, die Fülle zu messen, besteht darin, den Barcode zu sequenzieren

Welche Gene sind bei der Arzneimittelantwort aktiv oder erforderlich

Kompetitiver gepoolter Barcode-Quantifizierungs-(Wachstums-)Assay

Eine vollständige Sammlung von heterozygoten oder homozygoten Deletionsstämmen wird gepoolt, in Gegenwart der Verbindung gezüchtet und als Funktion der Zeit Proben entnommen.

In jeden Stamm eingebaute molekulare Strichcodes ermöglichen eine quantitative Analyse der relativen Stammhäufigkeit, entweder durch Hybridisierung an Oligonukleotid-Arrays oder durch Next Generation Sequencing.

Das Ergebnis ist eine Liste von Genen, die nach ihrer Bedeutung für Wachstum und Überleben geordnet sind, eine quantitative Metrik, die als "Fitness" bezeichnet wird.

Stämme, die am empfindlichsten auf Arzneimittel reagieren, tragen häufig Deletionen in Genen, die das Arzneimittelziel codieren.

HIP-HOP-Analysen identifizieren Funktionen für fast alle Gene

3.500 Verbindungen wurden in Hefe HIP-HOP . gescreent

Nützlich zum Abgleich mit Medikamentendatenbanken

Die HIP von Fluconazol identifizierte das erwartete primäre Ziel (ERG11) und die HOP identifizierte Gene stromabwärts von ERG11

Der am wenigsten wachsende Stamm sollte in diesem Fall eine heterozygote Mutation von erg 11 aufweisen

Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H)-Screenings werden oft unter Verwendung einer heterologen Expression in Hefe durchgeführt

Y2H-Protein-Protein-Wechselwirkungen

Eine Hefe 2 h ist eine genomweite Methode, bei der das gesamte Genom untersucht wird, um Proteininteraktionen zu finden

Ihr Protein wird als Köder (Am Haken) bezeichnet. Alles, was Sie tun, ist, es hineinzugeben und es allen Proteinen in einer Tube auszusetzen

Auf der Suche nach menschlichen Interaktionen im Kontext einer Hefezelle

Synthetisches System bei der Suche nach menschlichen Interaktionen

Fav pro fusioniert mit einer Hälfte einer Dan-Bindungsdomäne und dann gibt es ein weiteres interagierendes Protein, das mit der Aktivierungsdomäne fusioniert ist

DBD ohne Aktivierungsdomäne nutzlos

Aktiviert keine Reporter, die es erlauben, für die Interaktion auszuwählen

Wenn man die Fähigkeit meldet, req-Aminosäuren zu produzieren, wachsen Sie es auf, testen Sie, fav pro fusioniert mit db, mischen Sie es mit jedem anderen Protein, das an die Aktivierungsdomäne fusioniert ist

Wachsen Sie Hefezellen auf einer Platte, nur die überlebenden sind die mit dbd/ab interagierenden Zellen, die eine Reporterwirkung ermöglichen

Im Röhrchen mit allen anderen Proteinen mischen, die jeweils mit dem komplementären dbd . fusioniert sind

Wenn dbd-Werbung die Reporter in der Lage sind, auf Medien zu wachsen, würden sie normalerweise nicht wachsen

Diese Methode funktioniert nicht für Membranproteine

Hefe wächst auf ungewöhnlichen Selektionsmedien

Setzen Sie die Zellen einer Vielzahl von Medikamenten aus

Finden Sie heraus, welches Medikament die Wechselwirkung unterbricht

Nützlich, wenn das Medikament eine bekannte Funktion hat

Nicht sicher, welcher Pfad Interaktion ist

Variation, bei der das Medikament mit dem Lieblingsprotein fusioniert ist

Welches andere Protein könnte dieses Medikament binden?

Dann würde TR aktiviert, was die Auswahl des Wachstums ermöglicht

Das Y3H-System basiert auf dem gleichen Prinzip wie ein Hefe-Zwei-Hybrid – nämlich dass die DNA-Bindungsdomäne und die Transkriptionsaktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors getrennt und exprimiert werden können, sich aber dennoch zu einer funktionellen Transkriptionseinheit assoziieren, wenn sie werden in enge körperliche Nähe gebracht in vivo. Das ursprüngliche Y2H nutzt dies, um zu messen Protein-Eiweiß Wechselwirkungen, und die Technik wurde auch für eine Reihe anderer Anwendungen modifiziert, z.B. Messung Protein-DNA Wechselwirkungen (Hefe-One-Hybrid) und Messung membrangebundenes Protein Wechselwirkungen (Split-Ubiquitin-Hefe-Zwei-Hybrid).

Lieblingsproteinmembran gebunden

Genprodukt befindet sich in der Membran

Obwohl Protein-Protein-Interaktionen my2h . benötigen

Hat eine Aktivierungsdomäne

Klebt am c-Terminus der Ubiquitis

Bibliothek von thos fusioniert mit n Termini

Wenn sie zusammenkommen, bilden sie eine Aktivierung

Die tf aktiviert die Reporter im Zellkern

Wie fusionieren Sie den C-Terminus von Ubiquitin (Cub) mit Ihrem Lieblingsprotein?

Durch den Einsatz von Fusionsproteinen

Benötigt die Bildung der beiden Hälften von Ubiquitin, um eine funktionelle Ubiquitin-aktivierende Protease und weiter den Reporter zu bilden

Zusammenfassung Hybridsysteme

Proteinfragment-Komplementationsassay (PCA) weist PPIs über Arzneimittelresistenz nach

Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) erkennt PPIs über Fluoreszenz

Genomweite Analyse von Protein-Protein-Interaktionen mit BiFC

Jeder Stamm hat den n-Terminus von VN, der mit einem anderen Protein fusioniert ist

Ex vivo isolieren Sie einige Zellen eines Patienten genetisch mit Crispr und vermehren Sie diese Zellen in einer Schale

Geben Sie die gm-Zellen an den Patienten zurück

Eckpunkte zu diesem Vortrag

  • Der natürliche Prozess von RNAi
  • Die Labormethode von RNAi
  • Der natürliche Prozess von CRISPR
  • Die Labormethode von CRISPR

Reverse Genetik bei Würmern führte zur Entdeckung der RNA-Interferenz (RNAi)

RNAi ist ein RNA-abhängiger Gen-Silencing-Prozess, der durch den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) gesteuert wird.

Wird bei Würmern erreicht, indem man sie in dsRNA badet oder ihnen Bakterien füttert, die dsRNA exprimieren

Andrew Fire und Craig Mellow: Nobelpreis 2006 für RNAi-Entdeckung

Ausgezeichnete Animationen finden Sie unter http://www.nature.com/nrg/multimedia/rnai/animation/index.html

Die Entdeckung von RNAi war zufällig und wurde optimiert

Einführung fehlerhafter Sequenzen mit 3’-Überhängen in das Genom

Die Zelle reagiert mit reduzierter Genexpression

Das Stück DNA mit dem passenden Match

Die mRNA wird gespalten, was zu einer geringeren Genexpression führt

RNAi-Therapiemechanismus

Clustered regular-interspaced short palindromic repeats (CRISPR) ist eine Methode zur Bearbeitung von Genomen

Die Spezifität von DSBs und die Reparatur der DSBs werden die Genom-Editierung bestimmen

Crispr begann mit der Art und Weise, wie Bakterien sich daran erinnern, dass sie durch Viren geschädigt wurden

Virusseq verursacht ds-Bruch bei Bakterien

Bakterien erinnern sich an die Sequenz des Virus

Die Genom-Editierung durch CRISPR wird durch die Reparatur von Doppelstrangbrüchen bestimmt

Schwesterchromatid nur in der S- oder G2-Zellzyklusphase vorhanden

Die jüngste Geschichte von CRISPR

Natürlich vorkommende CRISPR-Systeme in Bakterien haben sich als Mittel entwickelt, um Viren abzutöten

Das konstruierte CRISPR-Cas-System nutzt eine Fusion der crRNA- und tracrRNA-Sequenz

gRNA-gerichtete Cas9-Nuklease kann Indel-Mutationen, spezifische Sequenzersetzungen oder große Deletionen/genomische Umlagerungen (z. B. Inversionen, Translokationen) induzieren.

Cas9-Nuklease erzeugt DSBs an DNA-Zielstellen mit Komplementarität zum 5′-Ende einer gRNA über die RuvC- und HNH-Nuklease-Domänen

Gg seq tritt alle 12 – 20 bp . auf

Solange die pam seq vorhanden ist, ist sie die Markierung für die Stelle, an der die Schnittstelle sein kann

Mutation der RuvC-Nukleasedomäne spaltet nur den DNA-Strang, der von der gRNA erkannt wird

Mutation der HNH-Nuklease-Domäne spaltet nur den DNA-Strang, der nicht mit der gRNA . interagiert

gRNA-gerichtetes dCas9 (inaktives Cas9) kann an Aktivierungsdomänen, Effektordomänen oder Fluoreszenz-Tags fusioniert werden

Zentrales Dogma: Vom Genotyp zum Phänotyp

Die Zahl steht für das Codon in der Sequenz

War eine Glu-Mutation auf Aminosäure 48, jetzt ist es Valin

Purine unterscheiden sich strukturell von Pyrimidinen

Schwerer als der Übergang

Verantwortlich für die meisten mendelschen Erkrankungen

Die Veränderung der ersten Aminosäure bewirkt eine Veränderung der Aminosäure

Mit Crispr müssen Sie eine grna entwerfen, die in der Reihenfolge schneidet

Verwenden Sie die mutierte Form von cas 9 ss break

Spender-DNA mit korrekter Sequenz dient als Vorlage

Zufälliges Stoppcodon zur Sequenz hinzugefügt, Genprodukt anhalten

Wechsel innerhalb derselben Unterfamilie von Aminosäuren

Insertion verursacht Verschiebung in allen Tripletts

Die kodierte Aminosäure ist jetzt komplett anders

DNA-Schadenstheorie des Alterns

Bis zu 500.000 DNA-Modifikationsereignisse pro Zelle und Tag

Hauptquellen für DNA-Schäden

Depurination, Desaminierung und Thymindimere sind Hauptquellen für DNA-Schäden

Verlust einer Aminogruppen-Deaminierung

Unabhängiges Thymin wird zu einem Dimer

Depurination ist der Verlust einer Purinbase

Desaminierung ist der Verlust einer Aminogruppe

Thymindimere sind mutagen und verstärken die Desaminierung von Cytosin

Mismatch-Mutationen, die durch Nicht-Watson-Crick-Basenpaarung verursacht werden

Mutationen aufgrund von Looping-Out-Fehlern während der DNA-Replikation

Mutationen durch fehlerhafte DNA-Replikation

Das Schleifen des nacheilenden Strangs geht voraus, damit die Polymerase das Templat replizieren kann

Fehler beim Loop-Out können zum Einfügen oder Löschen einer Basis führen

Loop-out auf neuem Strang wird eine Einfügung sein

Schleife aus Vorlage einer Basislöschung

Salpetersäureinduzierte Mutagenese zur Untersuchung von DNA-Schäden

Die Verwendung von hno2 führt dazu, dass sich cg-Anleihen in ta-Anleihen ändern

Hydroxylamin-induzierte Mutagenese zur Untersuchung von DNA-Schäden

Wenn Sie ein Gen auf einem Plasmid haben

Welche AA ist wichtig für den Phänotyp

Sie wissen, dass die Cytosine umgewandelt werden

Suchen Sie nach Funktionsänderungen, die aus einer Mutation resultieren

Methylmethansulfonat (MMS)-induzierte Mutagenese zur Untersuchung von DNA-Schäden

Additionsmutation mit Interkalationsmittel

Keine Spezifität für eine Base findet einfach ihren Weg an eine zufällige Stelle in der Sequenz

Deletionsmutation mit interkalierendem Agens

Wenn nicht repariert, endet die Löschung

Vier wichtige Reparaturmechanismen bei Alterung und altersbedingten Krankheiten

Spezifität der DNA-Reparatur und -Schäden

Basenexzisionsreparatur von desaminierter und oxidierter DNA

Eine DNA-Glykosylase erkennt eine beschädigte Base und spaltet zwischen der Base und der Desoxyribose im Rückgrat.

Eine AP-Endonuklease spaltet das Phosphodiester-Rückgrat nahe der AP-Stelle.

DNA-Polymerase I initiiert die Reparatursynthese aus dem freien 3’-OH am Einschnitt, entfernt einen Teil des beschädigten Strangs (mit seiner 5’®3’-Exonuklease-Aktivität) und ersetzt ihn durch unbeschädigte DNA.

Der nach der Dissoziation der DNA-Polymerase I verbleibende Nick wird durch DNA-Ligase versiegelt.

Nukleotidexzisionsreparatur von Thymindimeren

Zwei Exzisionsnukleasen binden DNA an der Stelle des Dimers (Läsion).

Einer spaltet die 5'-Seite und der andere spaltet die 3'-Seite der Läsion.

Helicase entfernt das DNA-Segment.

DNA-Polymerase füllt die Lücke

DNA-Ligase versiegelt den Nick.

Ein Vergleich von BE- und NE-Reparatur und

Methyl-gerichtete Mismatch-Reparatur

Muts induziert Faltung, bildet einen Komplex mit muth und mutl

Zwei Rekombinationsmechanismen reparieren Doppelstrangbrüche

Mitochondriale Dysfunktion und die Theorie der freien Radikale des Alterns

95 % der Energie der Zellen wird in Mitochondrien hergestellt

Der meiste Sauerstoff wird in Mitochondrien verwertet

Da Mitochondrien während der Atmung ATP erzeugen, entweichen einige der Elektronen, die durch Trägerproteine ​​des Elektronentransportsystems gehen, und reagieren mit Sauerstoffmolekülen, um ROS . zu produzieren

Die mitochondriale Theorie der freien Radikale des Alterns (Denham Harman, 1956)

  • Große Tiere verbrauchen weniger Sauerstoff (und geben weniger freie Radikale aus) pro Körpermasseeinheit als kleine Tiere und leben länger.
  • Insekten verbrauchen beim Fliegen viel mehr Sauerstoff als im Ruhezustand und ruhende Insekten leben länger.
  • Nach und nach häufen sich kleine Schäden an und tragen zur Verschlechterung von Geweben und Organen (Alterung) bei.
  • …..Kann Seneszenz durch ROS-Anwendung auf Zellen induziert werden?

Bildung freier Radikale auf vielfältige Weise

Oxidativen Stress:
Ungleichgewicht Produktion/Ausfall

  • Freie Radikale sind normale Produkte des aeroben Stoffwechsels, die unabhängig existieren können (daher „frei“), die ein oder mehrere ungepaarte Elektron enthalten und daher hochreaktiv sind.
  • Einmal produziert, vermehren sie sich, wenn sie nicht durch Antioxidantien oder andere Radikalfänger neutralisiert werden.
  • Vorherrschende freie Radikale sind:

ROS kann Membranen (Zelllyse), Proteine ​​(Funktionsverlust) und DNA (Mutationen) schädigen… und mitochondriale DNA-Schäden können nicht repariert werden

Genetische Wege zur Bekämpfung der Theorie der freien Radikale des Alterns

  • Freie Radikale bleiben nicht unkontrolliert. Der Körper verfügt über ein vielschichtiges Abwehrsystem, das auf die schädlichen Radikale reagiert und diese entgiftet.
  • Verteidigungen umfassen:

–Natürliche Antioxidantien im Körper, wie Bilirubin.

–Enzyme wie Superoxiddismutase (SOD), Katalase und Glutathionperoxidase.

– Diätetische Antioxidantien wie Beta-Carotin und die Vitamine C und E.

Was ist die genetische Grundlage der ROS-vermittelten Alterung (zB durch Behandlung mit Wasserstoffperoxid)?

Häufige Verwendungen von Überexpression

  • Hypermorph: eine Mutation, die einen Gewinn einer Wildtyp-Funktion verursacht (z. B. Hyperaktivität oder unregulierte Aktivität gegenüber einem normalen Ziel).
  • Neomorph: eine Mutation, die zu einer abnormalen Funktion führt (z. B. ein Enzym, das auf ein neues Substrat abzielt, ein DNA-bindendes Protein mit veränderter Bindungsspezifität, Fehllokalisierung eines Proteins, Aktivierung eines nicht verwandten Signalwegs).
  • Hypomorph: eine Mutation, die eine Mutation mit teilweisem Funktionsverlust verursacht, die zu einer verringerten Aktivität führt

Verlängert SOD-Deletion oder -Überexpression die Lebensdauer?

Superoxidansammlung, möchte den Sauerstoff begrenzen

Prüfung der Antioxidans-Hypothese mit transgenen Modellorganismen

Drosophila: Überexpression von SOD und Katalase zusammen verbesserte die Lebensdauer um 30-40% und verringerte oxidative Schäden.

  1. elegans: hohe Toleranz gegenüber ROS und verlängerte Lebensdauer. Eine dieser Mutanten (Alter-1) zeigt auch eine verstärkte Expression von SOD und Katalase.

Identifizierung evolutionär konservierter Gene, die das Altern und Telomere regulieren

Eckpunkte zu diesem Vortrag

  • Replikative Lebensdauer (RLS)
  • Extrachromosomale rDNA-Kreise
  • Sir2-Deletion vs. Überexpression
  • Bildung extrachromosomaler rDNA-Kreise
  • Chronologische Lebensdauer (CLS)
  • Genomische Screens zur Identifizierung von CLS-Alterungsgenen
  • DNA- und Aminosäuresequenzanalysen von Hefegenen zur Identifizierung menschlicher Orthologe

Hefe-Seneszenz dauert typischerweise 20 Generationen

Kann Tochterzelle machen, identisch

2 Stunden können eine weitere Zelle machen

Zählen Sie, wie viele Töchter die Mutterzelle machen kann

Wenn eine Gendeletion vorliegt, die sich auf nur eine Tochterzellteilung beschränkt

Sie wissen, dass das fehlende Gen für eine normale Zellteilung benötigt wird

Replikationslebensdauer in Hefe

  • Replikationspotential einzelner Zellen
  • Modelliert Säugerzellen, die in Kultur eine feste Anzahl von Populationsverdopplungen durchlaufen
  • Gesamtzahl der Zellteilungen (Tochterzellen) wird bewertet
  • Statistische Analyse über 40 Mutterzellen zur Bestimmung des durchschnittlichen RLS eines bestimmten Genotyps und/oder Zustands
  • Konservierte RLS-Wege umfassen Sir2-(Sirtuin)-Beeinträchtigung und Kalorienrestriktion

Chronologische Lebensdauer in Hefe

  • Überleben einer Population in der postmitotischen, sich nicht teilenden Phase
  • Modelliert die Alterung postmitotischer Gewebe (z. B. Säugerzellen, die sich nicht teilen, wie z. B. Neuronen)
  • Hefezellen in Flüssigkeit erreichen eine maximale Zelldichte (postdiauxische Phase) und überleben dann je nach Genotyp und Umgebung (z. B. Nährstoffe) unterschiedlich lange
  • Konservierte CLS-Wege umfassen Autophagie und Kalorienrestriktion

Bei chronologisch alternden Hefen häufen sich Schäden in sich nicht teilenden Zellen an. Im externen Medium reichert sich zunächst Ethanol an und wird in Essigsäure umgewandelt, die eine apoptoseähnliche Reaktion und den Zelltod induziert. Auch innerhalb der chronologisch alternden Zelle sammeln sich geschädigte Mitochondrien und oxidierte Proteine ​​an und tragen wahrscheinlich zur chronologischen Seneszenz bei.

Bei replikativ alternden Hefezellen wird der Schaden asymmetrisch von der Mutterzelle vererbt und von der Tochterzelle entfernt. Kerne extrachromosomale ribosomale DNA-Kreise, zytoplasmatische oxidierte Proteine ​​und beschädigte Mitochondrien tragen zur replikativen Seneszenz bei. Bei sehr alten Mutterzellen bricht die Asymmetrie zusammen und die Tochterzelle kann genügend Schaden erben, um vorzeitig zu altern.


C. Deskriptive statistische Methoden

    • Faktorenanalyse mit Rotationen
    • Kanonische Korrelation
    • Hauptkomponentenanalyse für quantitative Variablen.
    • Hauptkomponentenanalyse für qualitative Daten.
    • Hierarchische und dynamische Clustering-Methoden zur Erstellung von Baumstrukturen, Dendrogrammen oder Phenogrammen.
    • Einfache und multiple Korrespondenzanalyse mit einer Kontingenztabelle als Eingabe oder kategorialen Rohdaten.

    Spezifische Anweisungen und Computerprogramme zum Durchführen der obigen Berechnungen können von Firmen bezogen werden wie: SAS/STAT Software, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA BMDP Statistical Software, BMDP Statistical Software Inc., Los Angeles, CA, USA SYSTAT-Software, SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA StatXact & LogXact, CYTEL Software Corporation, Cambridge, Massachusetts, USA.


    Erweiterte Daten Abbildung 1 Expression und subzelluläre Lokalisation von ausgeknockten lncRNAs und mRNAs.

    ein, Expression von lncRNAs und mRNAs in F1 129/Castaneus weibliche mES-Zellen, angegeben in Fragmenten pro Kilobase pro Million (FPKM) in Ganzzellpoly(A) + RNA-seq. Die kumulative Fraktion ist für alle in mES-Zellen exprimierten mRNAs aufgetragen. Große Punkte stellen Transkripte dar, deren Promotoren wir in dieser Studie entfernt haben. LncRNAs und mRNAs umfassen einen >20-fachen Bereich von Häufigkeitsniveaus. B, Relative subzelluläre Lokalisation von lncRNAs und mRNAs. Wir sequenzierten poly(A) + RNA aus Chromatin, löslichen Kern- und zytoplasmatischen Fraktionen (siehe Methoden) und zeichneten die relative Häufigkeit von reifen Transkripten in jeder Fraktion auf. Wir wählten lncRNAs aus, die im Vergleich zu den meisten mRNAs eine in Richtung der Kernfraktionen verzerrte Lokalisation zeigten. Zum Vergleich haben wir 1.000 zufällig ausgewählte mRNAs (hellgrau) aufgetragen.

    Erweiterte Daten Abbildung 2 Erzeugung von Knockout-Klonen und Messung der allelspezifischen RNA-Expression.

    ein, Übersicht Knockout und Messprotokoll. B, Verteilung der allelischen Expressionsverhältnisse (Anzahl der informativen Reads, die auf das 129S1-Allel abgebildet werden, dividiert durch die Anzahl, die entweder auf das 129S1- oder das Castaneus Allel) über aktive Gene in mES-Zellen. C, Streudiagramm der allelischen Expressionsverhältnisse für Gene mit RPKM ≥ 2, die mehr als 100 Allel-informative Reads in allen Bibliotheken aufweisen. Allelische Expressionsverhältnisse sind in den RNA-Sequenzierungsdaten vor und nach der Hybridselektion (HS) konsistent. D, e, Allelische Expressionsverhältnisse, gemessen mit zwei unabhängigen Methoden für Blustr (D) und Sfmbt2 (e) Expression in 15 klonalen Zelllinien mit genetischen Modifikationen im Blustr Ort. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert von zwei technischen ddPCR-Replikaten (x Achse) und der Wert aus einem technischen Replikat der RNA-Seq (ja Achse). F, Beispiellocus, der die Hybridselektionsstrategie und die RNA-seq-Bedeckung für Zelllinien mit dem angegebenen Genotyp für die Deletion des zeigt Bendr Promoter. Die ja Achsenskalen stellen normalisierte Lesezahlen dar und sind für alle Hybridauswahlspuren gleich. Das absolute Expressionsniveau für jedes gegebene Gen variiert während dieser Arbeit zwischen klonalen Zelllinien, wir betrachten stattdessen das relative Expressionsniveau zwischen den beiden Allelen in heterozygoten Knockout-Zellen. Für ähnliche Diagramme jedes untersuchten Gens siehe http://pubs.broadinstitute.org/neighboring-genes/.

    Erweiterte Daten Abbildung 3 Read-through-Transkription bei Meg3 und Snhg3 Orte.

    ein, Snhg3 Promotor-Knockout reduziert die Konzentrationen von Rcc1 mRNA um 23%. Die Sequenzierung von Chromatin-assoziierter RNA zeigt jedoch, dass die Transkription über das annotierte 3′-Ende von . hinausgeht Snhg3 in den stromabwärts Rcc1 Gen (siehe Methoden). Diese Read-Through-Transkription erzeugt ein Fusionstranskript, das Exons von beiden enthält Snhg3 und Rcc1, sowie intergene RNA. Wir stellen fest, dass dieses Fusionstranskript auch im syntenischen humanen Locus als alternative Isoform von . annotiert ist RCC1. Balken, relative Poly(A) + RNA-Expression auf modifizierten versus unmodifizierten Allelen. Fehlerbalken, 95 % Konfidenzintervall für den Mittelwert (n ≥ 2 Allele, siehe ergänzende Tabelle 1). B, Meg3 Promotor-Knockout eliminiert die Expression nicht nur von Meg3 aber auch von zwei zusätzlichen lncRNAs, die stromabwärts in einer Tandem-Orientierung kodiert sind (Rian und Mirg). Obwohl diese drei lncRNAs als separate Gene annotiert sind, scheinen sie von einem einzigen Transkript abzustammen, das durch die Meg3 Promoter. Dies steht im Einklang mit dem Vorhandensein von kontinuierlicher Chromatin-assoziierter RNA im gesamten Locus und einem Fehlen von CAGE-Reads an den 5′-Enden von Rian und Mirg3.

    Erweiterte Daten Abbildung 4 Promotor-Knockouts für fünf intergene lncRNAs beeinflussen die Expression eines benachbarten Gens.

    Bedeutung (z-Score) der allelspezifischen Expressionsverhältnisse bei allen Genen innerhalb von 1 Mb von jedem der fünf lncRNA-Loci. Jeder Punkt repräsentiert einen anderen heterozygoten Promotor-Knockout-Klon für ein gegebenes Gen. Punkte werden nur für Gene gezeigt, die ausreichend stark exprimiert sind, um die allelspezifische Expression zu beurteilen (siehe Methoden). Die ja Achse ist auf –10 bis +10 Standardabweichungen vom Mittelwert begrenzt. Schwarz, Knock-out lncRNA blau, Gen mit signifikanter allelspezifischer Veränderung der Genexpression (FDR < 10%). Von unabhängigen Klonen wird nicht erwartet, dass sie denselben Signifikanzwert aufweisen (z-Score), teilweise weil die Lesetiefe zwischen den Samples unterschiedlich ist.

    Erweiterte Daten Abbildung 5 Promotor-Knockouts für vier mRNAs beeinflussen die Expression eines benachbarten Gens.

    Bedeutung (z-Score) der allelspezifischen Expressionsverhältnisse bei allen Genen innerhalb von 1 Mb von jedem der vier mRNA-Loci. Jeder Punkt repräsentiert einen anderen heterozygoten Promotor-Knockout-Klon für ein gegebenes Gen. Punkte werden nur für Gene gezeigt, die ausreichend stark exprimiert sind, um die allelspezifische Expression zu beurteilen (siehe Methoden). Die ja Achse ist auf –10 bis +10 Standardabweichungen vom Mittelwert begrenzt. Schwarz, Knock-out lncRNA blau, Gen mit signifikanter allelspezifischer Veränderung der Genexpression (FDR < 10%). Von unabhängigen Klonen wird nicht erwartet, dass sie denselben Signifikanzwert aufweisen (z-Score), teilweise weil die Lesetiefe zwischen den Samples unterschiedlich ist.

    Erweiterte Daten Abbildung 6 Sezierende Mechanismen, wie Genorte einen Nachbarn regulieren.

    ein, Drei Kategorien möglicher Mechanismen, durch die ein Gen-Locus die Expression eines Nachbarn regulieren könnte. B, Wir verwendeten zwei Strategien, um pAS stromabwärts von Genpromotoren einzufügen. In der ersten Strategie inserierten wir ein 49-bp-synthetisches pAS (spA) unter Verwendung eines einzelsträngigen DNA-Oligo mit 75-bp-Homologiearmen (siehe Methoden). C, In der zweiten pAS-Insertionsstrategie klonierten wir ein Donorplasmid, das eine Selektionskassette und drei verschiedene pAS-Sequenzen enthält (siehe Methoden). Homologiearme von 300–800 bp wurden verwendet, um die Kassette zu integrieren. Nachdem wir Klone mit erfolgreichen Insertionen isoliert hatten, verwendeten wir eine zweite Transfektionsrunde, um die Selektionskassette zu entfernen, wobei drei Tandem-pASs zurückblieben. EFS, Elongationsfaktor-1-Promotor Puro, Puromycin-Resistenzgen (pac) HSV-tk, Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase.

    Erweiterte Daten 7 Promotoren von lncRNAs und mRNAs haben Enhancer-ähnliche Funktionen.

    ein, Allel-spezifisches GRO-seq-Signal für Klone mit den angegebenen Modifikationen am Bendr Ort. Es werden nur Reads gezeigt, die einem der beiden Allele spezifisch zugeordnet sind. Die ja Die Achsenskalierung stellt die normalisierte Leseanzahl dar und ist für alle Spuren gleich. B, Allel-spezifische poly(A) + RNA-Expression für genetische Modifikationen am linc1405, Snhg17, Gpr19, und Slc30a9 Orte. Balken, durchschnittliche RNA-Expression auf modifizierten im Vergleich zu unmodifizierten (Wildtyp-)Allelen. Fehlerbalken, 95 % Konfidenzintervall für den Mittelwert (n ≥ 2 Allele, siehe ergänzende Tabelle 1). Graue Pfeile zeigen die Entfernung vom anvisierten Locus-Promotor zum betroffenen Nachbargen an. Wir weisen darauf hin, dass aufgrund ihres Standorts die Snhg17 und Gpr19 pAS-Insertionen ermöglichen wahrscheinlich ein substantielleres Spleißen und Transkription für diese Loci cis-regulatorische Funktion. C, Anwesenheit (grau) oder Abwesenheit (weiß) von verschiedenen Chromatinmarkierungen und Transkriptionsfaktoren in mES-Zellen in einem 1,5-kb-Fenster, das auf dem TSS jedes Zielgens zentriert ist. D, Abstand von jedem ausgeknockten Gen zu seinem benachbarten Zielgen (x Achse) gegen das Ausmaß des Effekts auf die Expression des Nachbargens (Prozent im Vergleich zum Wildtyp, ja Achse). Blaue Gene stellen diejenigen dar, die im Haupttext diskutiert wurden, graue Gene werden in der ergänzenden Anmerkung 5 behandelt. e, Nähebasierte Kontakte zwischen den linc1405 und Eomes Orte. Die ja Achse zeigt die Anreicherung in einem sequenzierungsbasierten Proximity-Assay, in dem wir Antisense-Oligos zum Einfangen verwendet haben linc1405 DNA und jede interagierende, vernetzte proximale DNA (siehe Methoden). TAD-Annotationen stammen aus Hi-C-Experimenten in mES-Zellen (siehe Methoden). Blauer Pfeil, fokaler Kontakt zwischen den linc1405 und Eomes Orte.

    Erweiterte Daten Abbildung 8 Charakterisierung genetischer Veränderungen im Blustr Ort.

    ein, Allel-spezifisches GRO-seq-Signal für Klone mit den angegebenen Modifikationen am Blustr Ort. Es werden nur Reads gezeigt, die spezifisch auf eines der beiden Allele abbilden. Die ja Achsenskala stellt die normalisierte Leseanzahl dar und ist für alle Spuren gleich und wird an der angegebenen Stelle fünffach vergrößert, um die Lesevorgänge im Sfmbt2 Ort. B, Quantifizierung des Allel-spezifischen GRO-seq-Signals im Sfmbt2 Locus auf Allelen, die wie angegeben modifiziert wurden. TSS, Region einschließlich der beiden alternativen TSS von Sfmbt2 und 2 kb stromabwärts gelegener Genkörper, Region, die den Rest des enthält Sfmbt2 Genlocuspausenindex, Verhältnis von TSS zu Genkörper. Gestrichelte graue Linien zeigen die 95%-Konfidenzintervalle für den Mittelwert von acht Wildtyp-Klonen. Riegel, n = 8 für Wildtyp und n = 1 für andere. C, Schema des 5′ Endes des Blustr Locus und Genotypen von zwei Knockout-Klonen. Die 5′-Spleißstelle befindet sich 78 bp stromabwärts der Blustr Transkriptionsstartstelle (in diesem Panel, Blustr wird von links nach rechts transkribiert). Eines der Allele aus den beiden Klonen enthält eine Oligo-Insertion, die durch homologe Rekombination vermittelt wird, die restlichen drei Allele enthalten Insertionen oder Deletionen, die aus einer nicht-homologen Endverbindungsreparatur von sgRNA-vermittelten Doppelstrangbrüchen resultieren, von denen einige auch die 5' Spleißstelle. Balkendiagramme zeigen die allelspezifische RNA-Expression für Knockout-Klone und Kontrollklone (n = 18 für +/-, 1 für andere). Fehlerbalken, 95 % Konfidenzintervall für den Mittelwert. D, Schema der beobachteten Spleißstrukturen von Blustr RNA-Transkripte in poly(A) + RNA-Sequenzierung der Exon-Deletionsklone. Jede Löschung entfernt eine Region einschließlich

    50–200 bp auf beiden Seiten des Exons, wodurch sowohl das Exon als auch seine Spleißstellen entfernt werden. Die Exon-4-Deletion entfernt das endogene pAS, was zu neuen Isoformen des lncRNA-Transkripts führt, die stromabwärts in zwei kryptische Spleißakzeptoren spleißen. e, GRO-seq, H3K4me3 ChIP–seq und Chromatin-Zugänglichkeit (ATAC-seq FPKM) an der Blustr und Sfmbt2 Promotoren in Zelllinien mit den angegebenen Genotypen. Die Deletion der ersten 5′-Spleißstelle führt zu einer signifikanten Verringerung der H3K4me3, der RNA-Polymerase-Belegung und der Chromatin-Zugänglichkeit an der Blustr Promotor, sowie H3K4me3- und RNA-Polymerase-Belegung (aber keine Zugänglichkeit) an der Sfmbt2 Promoter. F, H3K27me3 ChIP–seq am Blustr und Sfmbt2 Loci in Zelllinien mit den angegebenen Genotypen. Löschung der Blustr Promotor oder 5′-Spleißstelle führt zur Ausbreitung der repressionsassoziierten H3K27me3-Modifikation über a

    Erweiterte Daten Abbildung 9 Mechanismen für Cross-Talk zwischen benachbarten lncRNAs und mRNAs.

    Vorgeschlagene Mechanismen basierend auf pAS-Insertionsexperimenten und anderen genetischen Manipulationen (siehe Text). Zu den vorgeschlagenen Mechanismen von lncRNAs, die mit Dolchen markiert sind, siehe Ergänzende Anmerkung 5.

    Erweiterte Daten Abbildung 10 Klassifikation von lncRNAs basierend auf Konservierung und Promotorposition.

    ein, Klassifizierung von 307 lncRNAs, die in mES-Zellen exprimiert werden. „Konservierte“ Transkripte sind solche, die signifikante Hinweise auf eine Cap-Analyse von Genexpressionsdaten (CAGE) und/oder poly(A) + RNA in syntenischen Loci zeigen (siehe Methoden). Divergent, innerhalb von 500 bp eines mRNA-TSS beginnend, auf dem ERV-Gegenstrang, endogenes retrovirales repetitives Element (siehe ergänzende Anmerkung 9). Das Boxplot zeigt die Konservierung der Promotoren von Untergruppen von lncRNAs auf Sequenzebene, die in mES-Zellen exprimiert werden. Zufällige intergenische Regionen werden durch den GC-Gehalt an lncRNA-Promotoren angepasst. Ein positiver SiPhy-Score weist auf eine evolutionäre Einschränkung der funktionellen Sequenzen hin. Die orangefarbene Kategorie entspricht mausspezifischen lncRNAs, die sich anscheinend aus Vorfahren regulatorischen Elementen (REs) entwickelt haben, und entsprechen Sequenzen, die Beweise für eine DNase-I-Überempfindlichkeit in menschlichen embryonalen Stammzellen zeigen. Die Signifikanz wird im Vergleich zu zufälligen intergenischen Regionen unter Verwendung eines Mann-Whitney . berechnet U-Prüfung. ***P < 0,001. Box stellt das erste und dritte Quartil dar. Die Mittellinie stellt die Median-Whisker dar, die Daten innerhalb des 1,5-fachen des Interquartilbereichs darstellen. B, Chromatin- und RNA-Daten für 11 mäusespezifische lncRNAs, die sich anscheinend aus regulatorischen Elementen der Vorfahren entwickelt haben. In der Maus zeigen diese Elemente Hinweise auf CAGE-, H3K4me3- und DNase-I-Überempfindlichkeit, die mit ihrer Rolle als Promotoren übereinstimmen. Die syntenischen Sequenzen beim Menschen zeigen keinen Hinweis auf CAGE, sind aber dennoch DNase I-überempfindlich und werden häufig durch H3K4me1 und/oder CTCF markiert. C, Modell für die Evolution von lncRNAs aus bereits bestehenden Enhancern, die oft eine schwache bidirektionale Transkription initiieren. Gespleißte Transkripte können durch das Auftreten von Spleißsignalen und den Verlust von Polyadenylierungssignalen neutral erscheinen. In einigen Fällen können Transkription, Spleißen oder andere RNA-Prozessierungsmechanismen Rückkopplungen bewirken und zur cis-regulatorische Funktion des Promotors, der als Nebenprodukt eine lncRNA produziert.


    Schau das Video: Untranslated regions: how 5 and 3 UTRs regulate transcription and translation (September 2022).