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9.8: Elektrophorese - Biologie

9.8: Elektrophorese - Biologie


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Isoelektrische Fokussierung

Proteine ​​variieren stark in ihrer Ladung und folglich in ihren pI-Werten (pH, bei dem ihre Ladung Null ist). Die Trennung von Proteinen durch isoelektrische Fokussierung erfordert die Einrichtung eines pH-Gradienten in einer Acrylamid-Gelmatrix. Die Poren der Matrix sind groß eingestellt, um den Siebeffekt je nach Größe zu reduzieren. Zu fokussierende Moleküle werden mit dem pH-Gradienten auf das Gel aufgebracht und von einem elektrischen Strom durchflossen. Positiv geladene Moleküle bewegen sich zum Beispiel in Richtung der negativen Elektrode, aber da sie einen pH-Gradienten durchlaufen, erreichen sie beim Durchqueren einen Bereich, in dem ihre Ladung Null ist, und an diesem Punkt hören sie auf, sich zu bewegen. Sie werden zu diesem Zeitpunkt weder von der positiven noch von der negativen Elektrode angezogen und werden somit auf ihren pI „fokussiert“. Durch isoelektrische Fokussierung ist es möglich, Proteine ​​zu trennen, deren pI-Werte sich nur um 0,01 Einheiten unterscheiden.

2-D-Gelelektrophorese

Sowohl SDS-PAGE als auch isoelektrische Fokussierung sind leistungsstarke Techniken, aber eine geschickte Kombination der beiden ist ein leistungsstarkes Werkzeug der Proteomik – der Wissenschaft, alle Proteine ​​einer Zelle/eines Gewebes gleichzeitig zu untersuchen. Bei der 2D-Gelelektrophorese wird zunächst ein die Proteine ​​enthaltender Extrakt hergestellt. Man könnte zum Beispiel die Proteine ​​von Lebergewebe untersuchen. Die Leberzellen werden lysiert und alle Proteine ​​werden in einer Probe gesammelt. Als nächstes wird die Probe einer isoelektrischen Fokussierung unterzogen, wie zuvor beschrieben, um die Proteine ​​nach ihren pI-Werten zu trennen. Als nächstes wird, wie auf der vorherigen Seite gezeigt, das isoelektrische Gel, das die getrennten Proteine ​​enthält, um 90º gedreht und auf ein normales Polyacrylamidgel für die SDS-PAGE-Analyse gelegt (um sie nach Größe zu trennen). Die Proteine ​​in der isoelektrischen Gelmatrix werden in das Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und nach Größe getrennt. Das Produkt dieser Analyse ist ein 2D-Gel, in dem Proteine ​​sowohl nach Masse als auch nach Ladung sortiert werden.

Die Stärke der 2D-Gelelektrophorese besteht darin, dass praktisch jedes Protein in einer Zelle getrennt werden kann und auf dem Gel als eindeutiger Fleck erscheint. In der Abbildung entsprechen die Punkte oben links großen positiv geladenen Proteinen, während die unten rechts kleinen negativ geladenen sind. Mit der Hochdurchsatz-Massenspektrometrie-Analyse ist es möglich, jeden Fleck auf einem 2D-Gel zu identifizieren. Dies ist besonders wirkungsvoll, wenn man Proteinprofile zwischen verschiedenen Geweben oder zwischen den Proben desselben Gewebes vergleicht, die mit einem bestimmten Arzneimittel behandelt oder unbehandelt sind. Der Vergleich einer 2D-Trennung eines nicht-krebsartigen Gewebes mit einem krebsartigen Gewebe des gleichen Typs ermöglicht eine schnelle Identifizierung von Proteinen, deren Expressionsniveau sich zwischen ihnen unterscheidet. Informationen wie diese könnten bei der Entwicklung von Behandlungen oder bei der Bestimmung der Mechanismen, durch die der Krebs entstanden ist, nützlich sein.


Agarose-Gelelektrophorese

Agarose-Gelelektrophorese ist eine Gelelektrophoresemethode, die in der Biochemie, Molekularbiologie, Genetik und klinischen Chemie verwendet wird, um eine gemischte Population von Makromolekülen wie DNA oder Proteinen in einer Matrix aus Agarose, einer der beiden Hauptkomponenten von Agar, zu trennen. Die Proteine ​​können nach Ladung und/oder Größe (die isoelektrische fokussierende Agarose-Elektrophorese ist im Wesentlichen größenunabhängig) und die DNA- und RNA-Fragmente nach Länge getrennt werden. [1] Biomoleküle werden getrennt, indem ein elektrisches Feld angelegt wird, um die geladenen Moleküle durch eine Agarose-Matrix zu bewegen, und die Biomoleküle werden nach Größe in der Agarosegel-Matrix getrennt. [2]

Agarosegel ist leicht zu gießen, hat relativ weniger geladene Gruppen und eignet sich besonders für die Trennung von DNA der am häufigsten in Laboratorien anzutreffenden Größenbereiche, was die Popularität seiner Verwendung erklärt. Die abgetrennte DNA kann mit Färbung betrachtet werden, am häufigsten unter UV-Licht, und die DNA-Fragmente können relativ leicht aus dem Gel extrahiert werden. Die meisten verwendeten Agarosegele sind zwischen 0,7–2% in einem geeigneten Elektrophoresepuffer gelöst.


Inhalt

Für eine Aminosäure mit nur einer Amin- und einer Carboxylgruppe kann der pI aus dem Mittelwert der pKas dieses Moleküls berechnet werden. [4]

Der pH-Wert eines elektrophoretischen Gels wird durch den für dieses Gel verwendeten Puffer bestimmt. Wenn der pH-Wert des Puffers über dem pI des getesteten Proteins liegt, wandert das Protein zum positiven Pol (eine negative Ladung wird von einem positiven Pol angezogen). Wenn der pH-Wert des Puffers unter dem pI des laufenden Proteins liegt, wandert das Protein zum negativen Pol des Gels (positive Ladung wird vom negativen Pol angezogen). Wenn das Protein mit einem pH-Wert des Puffers betrieben wird, der gleich dem pI ist, wird es überhaupt nicht wandern. Dies gilt auch für einzelne Aminosäuren.

Beispiele Bearbeiten

In den beiden Beispielen (rechts) wird der isoelektrische Punkt durch die grüne senkrechte Linie dargestellt. In Glycin sind die pK-Werte durch fast 7 Einheiten getrennt. Somit beträgt in der Gasphase die Konzentration der neutralen Spezies Glycin (GlyH) effektiv 100 % der analytischen Glycinkonzentration. [5] Glycin kann am isoelektrischen Punkt als Zwitterion vorliegen, aber die Gleichgewichtskonstante für die Isomerisierungsreaktion in Lösung

Das andere Beispiel, Adenosinmonophosphat, soll verdeutlichen, dass prinzipiell eine dritte Spezies beteiligt sein kann. Tatsächlich ist die Konzentration von (AMP)H3 2+ ist in diesem Fall am isoelektrischen Punkt vernachlässigbar. Wenn der pI größer als der pH ist, hat das Molekül eine positive Ladung.

Es wurden eine Reihe von Algorithmen zum Schätzen isoelektrischer Punkte von Peptiden und Proteinen entwickelt. Die meisten von ihnen verwenden die Henderson-Hasselbalch-Gleichung mit unterschiedlichen pK-Werten. Zum Beispiel wurden innerhalb des von Bjellqvist und Mitarbeitern vorgeschlagenen Modells die pK-Werte zwischen eng verwandten Immobilinen bestimmt, indem dieselbe Probe in überlappenden pH-Gradienten fokussiert wurde. [6] Es wurden auch einige methodische Verbesserungen (insbesondere bei der Bestimmung der pK-Werte für modifizierte Aminosäuren) vorgeschlagen. [7] [8] Fortgeschrittenere Methoden berücksichtigen den Einfluss benachbarter Aminosäuren ±3 Reste von einer geladenen Asparagin- oder Glutaminsäure entfernt, die Auswirkungen auf den freien C-Terminus und wenden einen Korrekturterm auf die entsprechenden pK-Werte an unter Verwendung eines genetischen Algorithmus. [9] Andere neuere Ansätze basieren auf einem Support-Vektor-Maschinen-Algorithmus [10] und pKa-Optimierung gegen experimentell bekannte isoelektrische Protein/Peptid-Punkte. [11]

Darüber hinaus wurden experimentell gemessene isoelektrische Punkte von Proteinen in die Datenbanken aggregiert. [12] [13] Kürzlich wurde auch eine Datenbank mit isoelektrischen Punkten für alle Proteine ​​entwickelt, die mit den meisten verfügbaren Methoden vorhergesagt wurden. [14]

Die isoelektrischen Punkte (IEP) von Metalloxidkeramiken werden in der Materialwissenschaft in verschiedenen wässrigen Verarbeitungsschritten (Synthese, Modifizierung etc.) umfassend genutzt. In Abwesenheit von chemisorbierten oder physisorbierten Spezies wird allgemein angenommen, dass Partikeloberflächen in wässriger Suspension mit Oberflächen-Hydroxylspezies, M-OH (wobei M ein Metall wie Al, Si usw. ist) bedeckt sind. [15] Bei pH-Werten oberhalb des IEP ist die vorherrschende Oberflächenspezies M-O − , während bei pH-Werten unterhalb des IEP M-OH2 + Arten überwiegen. Im Folgenden sind einige ungefähre Werte gängiger Keramiken aufgeführt: [16] [17]

Material IEP Material IEP Material IEP Material IEP Material IEP Material IEP
WO3 [18] 0.2-0.5 Ta2Ö5 [18] 2.7-3.0 δ-MnO2 1.5 Fe2Ö3 [18] 3.3-6.7 Fe2Ö3 [18] 8.4-8.5 ZnO [18] 8.7-10.3
Sb2Ö5 [18] <0,4-1,9 SnO2 [19] 4-5.5 (7.3) β-MnO2 [20] 7.3 CEO2 [18] 6.7-8.6 α Al2Ö3 8-9 NiO [19] 10-11
V2Ö5 [18] [20] 1-2 (3) ZrO2 [18] 4-11 TiO2 [21] 2.8-3.8 Cr2Ö3 [18] [20] 6.2-8.1 (7) Si3n4 [19] 9 PbO [18] 10.7-11.6
SiO2 [18] 1.7-3.5 MnO2 4-5 Si3n4 6-7 Al2Ö3 7-8 Ja2Ö3 [18] 7.15-8.95 La2Ö3 10
SiC [22] 2-3.5 ITO [23] 6 Fe3Ö4 [18] 6.5-6.8 Tl2O [24] 8 CuO [19] 9.5 MgO [18] 12-13 (9.8-12.7)

Hinweis: Die folgende Liste gibt den isoelektrischen Punkt bei 25 °C für ausgewählte Materialien in Wasser an. Der genaue Wert kann stark variieren, abhängig von Materialfaktoren wie Reinheit und Phase sowie physikalischen Parametern wie Temperatur. Darüber hinaus kann die genaue Messung isoelektrischer Punkte schwierig sein, daher geben viele Quellen oft unterschiedliche Werte für isoelektrische Punkte dieser Materialien an.

Mischoxide können Werte des isoelektrischen Punkts aufweisen, die zwischen denen der entsprechenden reinen Oxide liegen. Ein synthetisch hergestelltes amorphes Alumosilikat (Al2Ö3-SiO2) wurde anfänglich mit einem IEP von 4,5 gemessen (das elektrokinetische Verhalten der Oberfläche wurde von Oberflächen-Si-OH-Spezies dominiert, was den relativ niedrigen IEP-Wert erklärt). [25] Für 3Al . wurden signifikant höhere IEP-Werte (pH 6 bis 8) berichtet2Ö3-2SiO2 Von anderen. [19] Ähnlich auch IEP von Bariumtitanat, BaTiO3 wurde im Bereich von 5-6 berichtet [19], während andere einen Wert von 3 erreichten. [26] Mischungen von Titandioxid (TiO2) und Zirkonoxid (ZrO2) wurden untersucht und haben einen isoelektrischen Punkt zwischen 5,3-6,9, der nichtlinear mit %(ZrO2). [27] Die Oberflächenladung der Mischoxide war mit der Acidität korreliert. Ein höherer Titandioxidgehalt führte zu einer erhöhten Lewis-Acidität, während zirkoniumdioxidreiche Oxide eine Br::onted-Acidität aufwiesen. Die verschiedenen Säurearten führten zu Unterschieden in den Ionenadsorptionsraten und -kapazitäten.

Die Begriffe isoelektrischer Punkt (IEP) und Ladungsnullpunkt (PZC) werden oft synonym verwendet, obwohl es unter Umständen sinnvoll sein kann, die Unterscheidung zu treffen.

In Systemen, in denen H + /OH − die grenzflächenpotentialbestimmenden Ionen sind, wird der Ladungsnullpunkt durch den pH-Wert angegeben. Der pH-Wert, bei dem die Oberfläche eine neutrale elektrische Nettoladung aufweist, ist der Punkt der Nullladung an der Oberfläche. Elektrokinetische Phänomene messen im Allgemeinen das Zeta-Potential, und ein Null-Zeta-Potential wird als der Punkt der Null-Nettoladung an der Scherebene interpretiert. Dies wird als isoelektrischer Punkt bezeichnet. [28] Somit ist der isoelektrische Punkt der pH-Wert, bei dem das kolloidale Partikel in einem elektrischen Feld stationär bleibt. Es wird erwartet, dass der isoelektrische Punkt etwas anders ist als der Punkt der Nullladung an der Partikeloberfläche, aber dieser Unterschied wird in der Praxis für sogenannte unberührte Oberflächen, d. h. Oberflächen ohne spezifisch adsorbierte positive oder negative Ladungen, oft ignoriert. [15] Unter spezifischer Adsorption wird in diesem Zusammenhang die Adsorption in einer Stern-Schicht oder Chemisorption verstanden. Somit wird der Ladungsnullpunkt an der Oberfläche als gleich dem isoelektrischen Punkt in Abwesenheit einer spezifischen Adsorption an dieser Oberfläche angenommen.

Nach Jolivet [20] wird die Oberfläche in Abwesenheit positiver oder negativer Ladungen am besten durch den Punkt der Nullladung beschrieben. Wenn positive und negative Ladungen in gleichen Mengen vorhanden sind, dann ist dies der isoelektrische Punkt. Somit bezieht sich der PZC auf das Fehlen jeglicher Art von Oberflächenladung, während sich der IEP auf einen Zustand neutraler Nettooberflächenladung bezieht. Der Unterschied zwischen den beiden ist daher die Menge der geladenen Standorte am Punkt der Netto-Null-Gebühr. Jolivet verwendet die intrinsischen Oberflächengleichgewichtskonstanten pK − und pK + um die beiden Bedingungen in Bezug auf die relative Anzahl der belasteten Sites zu definieren:

Für große pK (>4 nach Jolivet), die vorherrschende Spezies ist MOH, während es relativ wenige geladene Spezies gibt - daher ist die PZC relevant. Für kleine Werte von ΔpK, gibt es viele geladene Arten in etwa gleicher Anzahl, man spricht also vom IEP.


Mitgelieferte Reagenzien

Protease-Inhibitor-Mix (100x Lösung), 1 ml.

Erforderlich, aber nicht vorgesehen

Mikrozentrifuge, Vortex-Mischer, Extraktionslösung.

Vorbemerkungen

Protease Inhibitor Mix wird ohne EDTA geliefert, da einige Proteine ​​für ihre biologische Aktivität zweiwertige Kationen wie Ca2+, Mg2+ oder Mn2+ benötigen. Unter solchen Umständen kann die Anwesenheit von EDTA für die Proteinaktivität der Probe schädlich sein.

Proben können in 8 M Harnstoff und 4% CHAPS oder in 7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff und 4% CHAPS extrahiert werden (siehe Lösungen A und B in Anhang I). Alternative nichtionische Detergenzien oder Protease-Inhibitoren können während der Extraktion zugesetzt werden. Trägerampholyte (Pharmalyte, Ampholine oder IPG-Puffer) können für Standardprotokolle in Konzentrationen von bis zu 2% hinzugefügt werden, sollten jedoch nicht während der Proteinextraktion zur Markierung in 2D DIGE hinzugefügt werden.

  1. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen.
  2. Vor Gebrauch kurz vortexen, da die Lösung in Suspension ist.
  3. Protease-Inhibitor-Mix 1:100 (10 μl/ml) in einem geeigneten Volumen Extraktionspuffer oder Extrakt verdünnen.

Weitere Optionen

  • Wenn eine höhere Wirksamkeit der Protease-Hemmung erforderlich ist, fügen Sie Protease-Inhibitor-Mix in einer Konzentration von 20–30 μl/ml hinzu, um eine 2–3fache Endkonzentration zu erhalten.
  • Zur Hemmung von Metalloproteasen EDTA direkt in ein geeignetes Volumen Extraktionspuffer zugeben oder extrahieren, um eine Endkonzentration von 5 mM EDTA in der Reaktion zu erhalten.

A. Probenvorbereitungslösung (mit Harnstoff) für die 2-D-Elektrophorese

[8 M Harnstoff, 4 % CHAPS, 2 % Pharmalyte- oder IPG-Puffer (Trägerampholyte), 40 mM DTT, 25 ml]


Grundlegende Methoden

Cornel Mülhardt, E.W. Beese M.D., in Molekularbiologie und Genomik, 2007

2.5.1 Herstellung von Plasmid-DNA im kleinen Maßstab

48 oder 96 Minipräparate durchzuführen ist eine sehr nervenaufreibende Angelegenheit. Folglich muss das Verfahren schnell und einfach sein. Hier sind drei Methoden, die sich vor allem in der Art der bakteriellen Lyse unterscheiden. Aufwand und Zeitaufwand sind in jedem Fall nahezu gleich. Die Entscheidung für die eine oder andere Methode ist daher eine Frage der persönlichen Präferenz, hängt aber mitunter auch von der anschließenden Applikation der DNA ab. Wichtig für die Ausbeute und Qualität der DNA sind der Bakterienstamm, Plasmid (niedrige Kopienzahl oder hohe Kopienzahl Plasmid) und Kulturmedium (d. h. minimal nährstoffreich, nährstoffreich oder sehr nährstoffreich) verwendet. Liefert eine Methode unbefriedigende Ergebnisse, sollte eine andere versucht werden. Die Ausbeute für 1,5 ml Kultur beträgt etwa 2 bis 10 µg Plasmid-DNA, wenn es sich um ein High-Copy-Plasmid handelt.

Alkalische Lyse

Die alkalische Lyse ist meine Lieblingsmethode, weil man mit der so präparierten DNA fast alles machen kann. Im Minimaßstab ist es sehr schnell und kann große DNA-Mengen mit ungewöhnlicher Reinheit liefern. Bei sachgemäßer Durchführung kann es effektiv für alle Präparate verwendet werden, die unter Verwendung von Messsäulen durchgeführt werden. Es ist auch die Grundlage für fast alle kommerziellen Plasmid-DNA-Reinigungskits geworden.

Das aus 1,5 ml einer Bakterienkultur gewonnene Pellet wird in 150 µl Lösung I (50 mM Glucose/25 mM Tris/10 mM EDTA) und 150 µl Lösung II (0,2 N NaOH/1% SDS [w/v]) resuspendiert. hinzugefügt. Dieses Präparat wird dann gründlich gemischt und 30 Sekunden inkubiert, bis die Bakterien lysiert sind, was an der leicht schleimigen Konsistenz der Lösung erkennbar ist. Anschließend fügt man 150 µL Lösung III (3 M Kaliumacetat, pH 5,2) hinzu und mischt nochmals gut durch. Die Flüssigkeit wird klar, enthält aber Flocken von Kalium-SDS, die nur schwer löslich sind und ausfallen. Es werden noch zwei Tropfen Chloroform zugegeben, in denen Kalium-SDS besser pelletiert wird. Diese Lösung wird gemischt und 2 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der klare Überstand (ca. 400 µl) wird ohne die SDS-Flakes in ein neues Gefäß gegossen, mit 1 ml Ethanol versetzt, gemischt und die Lösung (15.000 g) 10 bis 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wird getrocknet und in 50 bis 100 µl TE plus 1 bis 2 µl DNase-freier RNase A (10 mg/ml) gelöst.

Wenn nur eine schnelle und schmutzige Zubereitung erforderlich ist, können Sie die Lösung an dieser Stelle für den Restriktionsverdau verwenden. Wenn die DNA unbedingt sauber sein muss, inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, damit die RNase Zeit zum Arbeiten hat, und führen Sie dann eine Phenol-Chloroform-Extraktion einschließlich Fällung mit Alkohol durch.

Das DNA-Pellet ist nach der ersten Fällung gut sichtbar, aber Sie sollten sich nicht täuschen lassen, denn dieses Präzipitat besteht zu mehr als 90% aus RNA, Proteinen und Salzen. Dennoch ist die Pelletgröße im Allgemeinen proportional zur DNA-Menge und gibt Aufschluss über die Plasmidausbeute. Nach Abbau mit RNase und Phenol-Chloroform-Extraktion ist sie erheblich geringer, da die Konzentration der RNA stark reduziert wurde.

Vorschläge: Anstelle von Lösung I können Sie auch TE-Lösung oder im Extremfall einfach Wasser verwenden. Solution II altert sehr schnell und sollte idealerweise frisch zubereitet werden, ist aber bis zu 4 Wochen haltbar. Lösung III ist eine 3 M Kaliumacetatlösung mit einem pH-Wert von 5,2, die bei diesem pH-Wert weit mehr Acetat oder Essigsäure als Kalium enthält. Der einfachste Ansatz besteht darin, 60 ml 5 M Kaliumacetat, 11,5 ml Essigsäure in Reagensqualität und 28,5 ml H . zu mischen2O. Anstelle von Lösung III können Sie 3 M Natriumacetat bei einem pH-Wert von 4,8 verwenden.

Nach der ersten Fällung ist die DNA überraschend rein und nukleasenarm und kann problemlos über Nacht oder sogar übers Wochenende bei 4°C (39°F) gelagert werden. Sie können die RNase zu Beginn statt am Ende in Lösung I geben (5 bis 10 µL RNase A [10mg/mL]) und sollten vor der ersten Fällung mit Ethanol zunächst eine Inkubationszeit von 10 Minuten nutzen in diesem Fall sind die Pellets jedoch kleiner.

Eine schöne Alternative wird in der Methode von Good und Nazar (1997) demonstriert. Die Bakterien werden mit einem zur Hälfte abgebrochenen Zahnstocher von der Agarplatte abgekratzt, etwa 1 cm vom Ende entfernt und mit Hilfe einer Pinzette zu einer Art Golfschläger geformt, ein Werkzeug, das sich auch gut zum Resuspendieren eignet die Bakterien in Lösung I später. Die alkalische Lyse wird mit Plasmid-DNA und anschließend mit Polyethylenglykol 8000 aufgefüllt (siehe Abschnitt 2.3.2).


9.8: Elektrophorese - Biologie

Wenn Sie Gelelektrophorese verwenden, um die Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen der beiden Verdächtigen zu bestimmen, welche, wenn beide, mit der RFLP des am Tatort gefundenen Blutes übereinstimmen?

Wird das Blut der beiden Verdächtigen mittels DNA-Fingerabdruck untersucht, dann stimmt eines der RFLPs mit dem am Tatort gefundenen Blut überein (sofern einer der Verdächtigen tatsächlich schuldig ist), da jede Person (mit Ausnahme von identischen) Zwillinge) hat ihre eigene eindeutige DNA-Sequenz, die durch die Trennung von RFLPs durch Gelelektrophorese angezeigt würde.

Unabhängige Variable: DNA im Blut

Abhängige Variable: Migrationsdistanz der Fragmente

Kontrollen: Gel, Färbemittel, Puffer, Bedingungen

1 0,8% Agarosegel, auf Geltablett

TBE-Laufpuffer I X, 350 ml

Heißwasserbad oder Mikrowelle

1. Laden Sie 10 Mikroliter jeder DNA-Probe in die entsprechende Spur. Schieben Sie die Abdeckung auf die Elektrophoresekammer und stellen Sie sicher, dass alles trocken ist.

2. Verbinden Sie das rote Patchkabel mit dem roten Elektrodenanschluss des Netzteils und das schwarze Patchkabel mit dem schwarzen Elektrodenanschluss. Stecken Sie das Netzteil ein und stellen Sie es auf 75 Volt ein, dann schalten Sie es ein.

3. Beobachten Sie die Migration der Probe entlang des Gels und schalten Sie das Gerät aus, wenn der Ladefarbstoff bis zur Hälfte des Gelendes abgelaufen ist.

4. Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophoresekammer und legen Sie es in die Färbeschale. Gießen Sie 100 ml verdünnte Färbung in die Schale. Warten Sie 10-20 Minuten.

5. Entfärben Sie das Gel, indem Sie destilliertes Wasser oder Leitungswasser in die Färbeschale geben. Warten Sie über Nacht, bis die Entfärbung stattfindet.

6. Betrachten Sie das Gel vor einem hellen Hintergrund und analysieren Sie die von den DNA-Banden zurückgelegte Strecke. Zeichnen Sie Ihre Messungen auf und zeichnen Sie sie auf dem halblogarithmischen Millimeterpapier.

7. Bestimmen Sie anhand der Ergebnisse des DNA-Fingerabdrucks, welcher Verdächtige schuldig ist.

Fragment Migrierte Entfernung (mm) Länge (bp)
1 18 23109
2 24 9416
3 27.5 6557
4 33 4361
5 45 2328
6 48 2027
7 75 564

Fragment Migrierte Entfernung (mm) Länge (bp)
1 21 10200
2 32 5300
3 33 5000
4 34 4850
5 36.5 4100
6 48 1950
7 49 1800
8 54 1300
9 57 1100
10 66 620
11 68 550
12 74 370

Fragment Migrierte Entfernung (mm) Länge (bp)
1 21.5 1050
2 27 7000
3 30 6100
4 31 5800
5 33 5000
6 36 4200

Fragment Migrierte Entfernung (mm) Länge (bp)
1 21 10200
2 32 5300
3 33 5000
4 34 4850
5 36.5 4100
6 48 1950
7 49 1800
8 54 1300
9 57 1100
10 66 620
11 68 550
12 74 370

Es ist zu erkennen, dass der DNA-Fingerabdruck des Tatorts genau mit dem von Verdächtiger 2 übereinstimmt.

Der Gelelektrophoresetest ermöglicht die Bestimmung eines DNA-Fingerabdrucks durch Trennung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen. Das Gel zeigt die Entfernung an, die jedes Fragment von der Zelle zurücklegt, wodurch für jedes Individuum ein einzigartiges Muster entsteht. Dieser Test wurde verwendet, um festzustellen, welcher der beiden Verdächtigen schuldig war. Das am Tatort gefundene Blut wurde getestet und zeigte ein eigenes Muster, und jedes Blut der Verdächtigen erzeugte sein eigenes Muster. Bei der Untersuchung der drei Proben und der Verwendung des DNA-Markers zur Bestimmung der Anzahl der Basenpaare wurde festgestellt, dass der DNA-Fingerabdruck von Verdächtiger 2 mit dem Fingerabdruck des am Tatort gefundenen Blutes übereinstimmte. Daraus kann geschlossen werden, dass Verdächtiger 2 die Straftat begangen hat.

1. Vergleichen Sie die auf jeder Bahn des Gels gebildeten Bandenmuster. Glauben Sie, dass die drei getesteten DNA-Proben gleich sind? Erklären. Wie können Sie weiter überprüfen, ob eine der getesteten DNA-Proben gleich ist oder nicht?

Verdächtiger 2 und die Tatortmuster sind gleich. Sie haben die gleichen Abstände vom Well, was sie als identisch bestätigt, und damit auch die gleichen Basenpaarlängen.

2. Welcher der beiden Verdächtigen ist Ihrer Meinung nach der wahre Einbrecher? Erkläre deine Antwort.

Verdächtiger 2, da seine Basenpaarlängen denen des am Tatort gefundenen Blutes entsprechen.

3. A) Erkläre, warum sie das . platziert hat ÖkoR I Restriktionsenzym wie sie es tat.

Die Studentin platzierte die Restriktionsenzymstelle wie sie es tat, weil ÖkoR I erkennt GAATTC, die Nukleotidsequenz, die direkt vor der Schnittstelle gesehen wird.

B) Erklären Sie, wie der Schüler die Hind III Restriktionsenzymstelle in dieser Position, basierend auf den Ergebnissen ihres Gels.

Der Student konnte die . hinzufügen Hind III-Restriktionsenzym an diese Stelle, weil es die Nukleotidsequenz AAGCTT erkennt, die das Muster direkt vor der Schnittstelle ist. Die Schnitte von ÖkoR Ich würde mich nicht in diesen Schnitt einmischen, der von den gemacht wurde Hind III Restriktionsenzym.

4. Aus verschiedenen Bakterienarten werden verschiedene Restriktionsenzyme isoliert. Welchen Vorteil haben Bakterien Ihrer Meinung nach, wenn sie Restriktionsenzyme haben?

Durch Restriktionsenzyme können Bakterien vor eindringenden Viren geschützt werden. Die Restriktionsenzyme zerschneiden fremde DNA, während die Wirts-DNA durch das Modifikationsenzym geschützt wird.

5. In Ihrem Labor haben Sie Ihre DNA-Proben auf einem 0,8% Agarosegel laufen lassen. Würden Sie die gleichen Ergebnisse erzielen, wenn Sie Ihre Proben auf einem Agarosegel mit einem höheren Prozentsatz laufen ließen? Warum oder warum nicht?

Nein, die Ergebnisse wären nicht die gleichen. Ein höherer Prozentsatz an Agarosegel würde dazu führen, dass sich kleinere Poren im Gel entwickeln. In diesem Fall würden sich die DNA-Fragmente nicht richtig orientieren.

6. Sagen Sie voraus, was passieren würde, wenn Sie Ihr Gel in die Elektrophoresekammer mit den Vertiefungen mit der DNA neben der roten Elektrode statt der schwarzen platzieren.

Die Fragmente würden wahrscheinlich in die entgegengesetzte Richtung wandern und könnten sich daher nicht sehr weit bewegen, da sie im Gel gefangen wären.

7. Wenn Sie ein Restriktionsenzym haben, das ein DNA-Stück an zwei Erkennungsstellen schneidet, wie viele DNA-Fragmente würden Sie auf einem Gel sehen?

Auf einem Gel wären 3 DNA-Fragmente zu sehen.

8. Hind III erkennt eine Sequenz von sechs Nukleotiden (AAGCTT) als Schnittstelle. Wie groß ist die Wahrscheinlichkeit, dass diese Sequenz in einer zufälligen DNA-Kette auftritt?

Die Chancen stehen 1 zu 2048.

10. Unten ist eine Liste der Komponenten, die an der Gelelektrophorese beteiligt sind. Beschreiben Sie kurz den Zweck jeder Komponente.

Agarosegel - bietet ein Medium, durch das DNA-Fragmente wandern

FSME-Puffer - leitet Strom von einer Elektrode zur anderen

Elektrophoresekammer - hält das Gel, den Puffer, die DNA-Proben

Netzteil - liefert den Strom

DNA-Proben - enthalten die DNA-Fragmente, die Sie mit Agarosegelelektrophorese nach Größe trennen möchten

DNA-Färbung - ermöglicht das Sehen der Fragmente

12. Sie haben Elektrophorese verwendet, um DNA-Fingerabdrücke durchzuführen und einen schuldigen Verdächtigen zu identifizieren, der an einer strafrechtlichen Untersuchung beteiligt ist. Erforschen Sie eine andere Anwendung der Elektrophorese und beschreiben Sie kurz die Vorteile dieser Technologie.

Elektrophorese ist in der Welt der Genetik und des Klonens sehr nützlich. Es verschafft den Genetikern ein klareres Bild der DNA und hilft, sie für das Klonen und die Gentechnik vorzubereiten.


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