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Warum wird GTP anstelle von ATP beim Nukleartransport verwendet?

Warum wird GTP anstelle von ATP beim Nukleartransport verwendet?


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Warum wird GTP für den Kerntransport und nicht ATP verwendet, da die ATP-Hydrolyse verwendet wird, um die meisten zellulären energonischen Reaktionen anzutreiben?


Haftungsausschluss

Obwohl diese Frage entweder unklar oder unbeantwortbar (oder beides) zu sein scheint und keine Hinweise auf Forschung seitens des Posters zeigt, habe ich mich entschieden, einen Aspekt davon anzusprechen, um ein allgemeines Konzept hervorzuheben. Dies, obwohl mein Wissen über nukleare Transportprozesse minimal ist.

Kurze Antwort

GTP wird anstelle von ATP für den nuklear-zytoplasmatischen Transport über Importine und Exportine verwendet, da an diesem Prozess eines aus einer großen Familie von 'G-Proteinen' beteiligt ist, die - wie der Name schon sagt - durch die Verwendung von GTP funktionieren. Während ATP im Allgemeinen verwendet wird, um endergonische molekulare Reaktionen anzutreiben, kann die Hydrolyse von GTP in G-Protein-Zyklen als ein Mittel zur Beendigung eines molekularen Prozesses angesehen werden. Ob G-Proteine ​​GTP statt ATP nur zufällig oder aus biologischen Gründen angenommen haben, ist eine Frage der Spekulation.

NTP-Hydrolyse – zum Spaß oder zum Profit?

Es scheint, dass sich die Frage auf proteintransportierende "Importine und Exportine" bezieht, die, wie ich aus dem Wikipedia-Artikel über den Kerntransport erfahren habe, durch das kleine G-Protein Ran reguliert werden. Im Komplex mit GTP erleichtert Ran den Export von Proteinen durch Exportine, ein Prozess, der durch Hydrolyse von GTP zu GDP beendet wird. Die GDP-gebundene Form erleichtert den Import von Proteinen durch Importine, ein Prozess, der durch das Verdrängen des GDP durch GTP beendet wird.

Betrachten wir also die Rolle der Hydrolyse des Nukleotidtriphosphats – hier GTP – ist es eindeutig nicht, thermodynamische Energie für einen endergonischen Prozess wie Muskelkontraktion, Lichterzeugung oder eine chemische Reaktion mit einem +ve ΔG bereitzustellen:

Vielmehr soll es eine Konformationsänderung in einem Protein bewirken, die die Beendigung eines Prozesses ermöglicht. Diese Terminierung erfolgt im Allgemeinen durch die GDP-gebundene Form des G-Proteins (grau), die mit einem anderen Protein (schwarz) interagiert:

Dieses Diagramm ist bewusst einfach gehalten, damit die allgemeinen Merkmale der G-Protein-Wirkung erkennbar sind. Ich denke jedoch, dass es den gleichen Punkt veranschaulicht, der in Berg . gemacht wurde et al. Abschnitt 15.6. Andere Beispiele sind die Signaltransduktion der Hormonwirkung über zyklisches AMP und die Bindung von Aminoacyl-tRNA an das Ribosom.

Warum verwenden G-Proteine ​​GTP?

Diese „Wahl“ von GTP im ursprünglichen G-Protein der Vorfahren könnte reiner Zufall gewesen sein, was sich später in anderen G-Proteinen widerspiegelte, die durch Genduplikation und Divergenz entstanden. Das würde bedeuten, dass es zumindest nicht nachteilig war. Oder da die ältesten G-Proteine ​​vielleicht an der Proteinbiosynthese beteiligt sind – ein Prozess, der noch immer von einem Ribozym katalysiert wird – könnte die Wahl von GTP eine RNA-Basenpaarungs-Interaktion in der „RNA-Welt“ widerspiegeln.

Alternativ könnte man eine biologische Begründung für die Trennung von zwei Arten von energieerfordernden Prozessen vorschlagen – vielleicht durch die Regulierung des Enzyms, das die Umwandlung von ATP zu GTP katalysiert, der Dinukleosid-Phosphat-Kinase. Mir sind jedoch keine Beweise bekannt, die diese Idee stützen.

Hydrolyse von GTP in anderen Zusammenhängen

Wie in einem Kommentar von @Roland erwähnt, gibt es Fälle, in denen GTP verwendet wird, um endergonische Reaktionen (Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase) analog zur Verwendung von ATP zu steuern, aber dies unterscheidet sich stark von der Hydrolyse von GTP in G-Proteinen. Ich glaube nicht, dass dafür eine überzeugende Begründung vorgebracht wurde, noch für die ähnliche außergewöhnliche Verwendung von UTP bei der Glykogensynthese und CTP bei der Phospholipidsynthese. Diese Frage wurde in einem anderen Beitrag diskutiert.


Bücherregal

NCBI-Bücherregal. Ein Service der National Library of Medicine, National Institutes of Health.

Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molekularbiologie der Zelle. 4. Auflage. New York: Garland Science 2002.

  • In Absprache mit dem Verlag ist dieses Buch über die Suchfunktion zugänglich, jedoch nicht durchsuchbar.


Teil 2: GTPase-Reaktionen und Krankheiten

00:00:00.14 Hallo. Mein Name ist Fred Wittinghofer.
00:00:02.18 Ich bin emeritierter Gruppenleiter am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie in Dortmund, Deutschland.
00:00:11.08 Und das ist mein zweites Seminar
00:00:14.01 und im ersten habe ich dir die molekularen Schalter vorgestellt, die GTP-bindende Proteine ​​oder G-Proteine ​​genannt werden.
00:00:21.15 Und in diesem zweiten Teil werde ich mich mehr auf einen bestimmten Aspekt unserer Forschung konzentrieren, nämlich
00:00:28.20 beschäftigt sich mit dem Mechanismus von GTPase-Reaktionen und wie sie zu verschiedenen Krankheiten führen.
00:00:34.09 Und ich werde mich natürlich hauptsächlich auf Ras-ähnliche Proteine ​​konzentrieren, über die ich in meinem ersten Seminar gesprochen habe.
00:00:42.23 Also noch einmal kurz der mechanistische Zyklus für diese Proteine:
00:00:49.25 Sie kommen in zwei Geschmacksrichtungen, diese Proteine, den GDP-gebundenen und den GTP-gebundenen Zustand.
00:00:55.13 Sie haben Nukleotide sehr fest gebunden.
00:00:58.03 Sie brauchen einen Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, um GDP für GTP . freizusetzen
00:01:03.23 weil in der Zelle mehr GTP als BIP vorhanden ist.
00:01:06.11 Deshalb wird das Protein mit GTP beladen, sobald das BIP ausgeschaltet ist.
00:01:10.06 Sie haben einen Downstream-Effekt in der GTP-gebundenen Form, die mit einigen Partnerproteinen interagiert.
00:01:15.10 Und damit der Schalter wieder ausgeschaltet wird, hast du die GTPase-Reaktion
00:01:20.27 wobei das Protein GTP in GDP und Pi aufspaltet.
00:01:24.29 Und diese Reaktion ist sehr langsam und wird von Proteinen katalysiert, die als GTPase Activating Proteins bezeichnet werden
00:01:31.06, was natürlich das Wichtigste sein wird, über das wir sprechen werden.
00:01:36.24 Wir reden also wirklich über eine wirklich grundlegende biochemische Reaktion
00:01:43.23 nämlich die Hydrolyse von Phosphoanhydriden und sie ähnelt der Hydrolyse von Phosphoestern.
00:01:53.08 Wenn Sie beispielsweise phosphorylierte Proteine ​​haben, die an Threonin, Serin oder Tyrosin phosphoryliert sind,
00:01:57.24 Sie haben einen ähnlichen nukleophilen Angriff auf das Phosphat durch Wasser.
00:02:05.04 Und offensichtlich haben die Leute viel über diese Reaktion gesprochen, weil es eine sehr
00:02:12.15 langsame Reaktion, da die Phosphate stark negativ geladen sind
00:02:19.16 und die Annäherung eines Nukleophils, zum Beispiel eines Wassers, das auch teilweise negativ geladen ist,
00:02:25.06 ist sehr, sehr unbeliebt. Und deshalb ist diese Reaktion normalerweise sehr langsam.
00:02:30.25 Also obwohl die Reaktion Energie liefert,
00:02:33.17 es ist sehr langsam, weil man die sehr hohe Aktivierungsenergie überwinden muss
00:02:38.16, was davon abhängt, was ich Ihnen gerade erzählt habe - die negativen Vorwürfe.
00:02:42.04 Und je höher die Aktivierungsenergie ist, kennst du vielleicht aus deinen biophysikalischen Kursen,
00:02:46.13 dass je höher die Aktivierungsenergie, desto langsamer die Reaktion,
00:02:51.00, da die Reaktionsgeschwindigkeit direkt proportional zur Aktivierungsenergie ist.
00:02:54.18 Die Natur nutzt also Enzyme, um die Übergangszustandsenergie zu senken
00:03:00.27 und beschleunigen dadurch die Reaktion.
00:03:03.15 Und es gibt einen interessanten Artikel, auf den ich meine Schüler die ganze Zeit aufmerksam mache
00:03:07.21 von Francis Westheimer, der vor vielen Jahren einen Artikel geschrieben hat:
00:03:12.01 Warum die Natur Phosphate wählt.
00:03:13.25 Weil Chemiker niemals Phosphat als Abgangsgruppe verwenden
00:03:17.13 aber in der Biologie ist es eine sehr häufige Abgangsgruppe
00:03:21.16 Also, nur wegen diesem Zweck hier, wegen dem, was ich hier gezeigt habe
00:03:26.17 die Phosphoanhydridbindung oder die Phosphoesterbindung ist kinetisch stabil
00:03:32.06 mit anderen Worten, Sie können Ihr ATP oder GTP in Wasser haben und es bleibt für immer oder hydrolysiert sehr langsam.
00:03:39.22 Aber thermodynamisch ist es grundsätzlich instabil.
00:03:43.00 Wenn Sie ein Enzym verwenden, senkt es die Aktivierungsenergie – Sie können diese Reaktion sehr schnell durchführen.
00:03:47.14 Das ist also ein interessanter Artikel, den ich dir empfehlen würde zu lesen.
00:03:50.27 Deshalb ist zum Beispiel die DNA stabil und deshalb ist ATP eine so wunderbare Energiequelle
00:03:57.12, weil es im Prinzip Energie liefert, aber in wässriger Lösung stabil ist.
00:04:03.28 Beginnen wir also zunächst mit Ras und seiner GAP-vermittelten GTPase-Reaktion, denn
00:04:10.25 das ist wirklich das Paradigma für viele Dinge, die danach entwickelt wurden.
00:04:15.24 Das ist also das molekulare Ras. Es ist eine Banddarstellung der Struktur
00:04:21.29 der G-Domäne von Ras.
00:04:24.16 Sie sehen seine Herzform, weil.
00:04:27.17 offensichtlich gefällt es uns sehr gut und wir haben die Struktur in Hiedelberg gelöst.
00:04:32.00 Die Anzeige der Stadt Hiedelberg, Ich hab mein Herz in Hiedelberg verloren
00:04:36.04 das heißt, ich habe mein Herz in Hiedelberg verloren.
00:04:37.27 Aber der wichtigste Grund, warum es herzförmig ist, ist, weil
00:04:41.13 Leute nennen es das schlagende Herz der Signalübertragung.
00:04:44.06 Und damit eines der wichtigsten Moleküle, das reguliert
00:04:48.14 wichtige Signaltransduktionsprozesse wie Wachstum, Differenzierung und manchmal sogar Apoptose.
00:04:54.17 Und Sie wissen wahrscheinlich ein wenig über den Signalübertragungsprozess, weil
00:04:59.07 jedes Lehrbuch hat diese Version, eines der Paradigmen der Signalübertragungskette
00:05:04.01 wobei z. B. ein Wachstumsfaktor an die Zellmembran bindet
00:05:08.27 und bindet an seinen Wachstumsfaktor-Rezeptor RTK (Rezeptor-Tyrosin-Kinase)
00:05:14.22 wobei diese phosphoryliert wird. Es rekrutiert den Tauschfaktor SoS
00:05:19.04, die dann Ras in der GDP-gebundenen Form aktiviert.
00:05:22.16 Und dann interagiert Ras mit der nachgeschalteten Komponente, der Raf-Kinase
00:05:26.15 Dies ist die Startkinase für das sogenannte MAP-Kinase-Modul.
00:05:30.24 Dort aktiviert eine Kinase die nächste nachgeschaltete Kinase, die als MAP-Kinase-Kinase-Kinase bezeichnet wird.
00:05:36.29 MAP-Kinase-Kinase-Kinase aktiviert die MAP-Kinase-Kinase und das aktiviert die MAP-Kinase
00:05:40.28, die dann in den Zellkern gelangt und die Transkription aktiviert.
00:05:45.03 Dies ist also eine sehr vereinfachte Version dessen, was Ras tatsächlich tut.
00:05:48.16 und dies ist die erste, die entdeckt wurde (die erste Signalübertragung).
00:05:54.15 Aber jetzt wird es immer komplizierter.
00:05:57.26 Dies ist noch eine sehr vereinfachte Version, aber sie zeigt es Ihnen bereits
00:06:00.27 Das Wichtigste an der Signalübertragung über Ras ist, dass viele vorgeschaltete Komponenten kommen und Ras aktivieren.
00:06:09.18 Es sind entweder Tyrosinkinase-Rezeptoren oder G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
00:06:13.09 oder T-Zell-Rezeptoren. Alle können Ras aktivieren.
00:06:16.08 Und dann kann Ras stromabwärts viele Komponenten aktivieren, nicht nur Raf-Kinase
00:06:20.18, sondern auch ein Molekül namens Ral GEF, PI(3)-Kinase, PLC-Epsilon und andere.
00:06:26.22 Und sie vermitteln eine Reihe von Signalübertragungsreaktionen
00:06:32.12 die irgendwie irgendwo integriert sind, sagen wir im Nukleus,
00:06:38.00 durch einen Transkriptionsfaktor und initiieren, wenn die Schwelle stimmt, wenn die Anzahl der Reaktionen stimmt,
00:06:46.15 es löst eine zelluläre Reaktion aus, die Proliferation oder Differenzierung oder was auch immer sein kann.
00:06:52.03 Und ich werde auf keinen Aspekt eingehen, weil ich mich auf die Abschaltreaktion konzentrieren möchte.
00:06:57.28 Die Abschaltreaktion ist also wieder das Schema, das Sie jetzt schon oft gesehen haben
00:07:03.25 aber was in Ras passiert ist auch ein Onkogen
00:07:06.26 ein Onkogen, das zwei Arten von Mutationen aufweist, entweder das Glycin 12 ist zu einer anderen Aminosäure mutiert
00:07:13.10 oder Glutamin 61 zu einer anderen Aminosäure mutiert.
00:07:16.21 Und was dies biochemisch bewirkt, ist, dass es die GAP-vermittelte GTPase-Reaktion blockiert.
00:07:23.21 Damit Sie sich vorstellen können, was passiert, haben Sie die Rückkehr in den inaktiven Zustand blockiert
00:07:29.13 und deshalb sammelst du jetzt Ras in der GTP-gebundenen Form.
00:07:33.09 Sie benötigen keine Upstream-Signalisierung mehr, da sich Ras bereits im GTP-gebundenen Zustand befindet.
00:07:39.03 Und jetzt hat es eine Wirkung, die nicht mehr reguliert wird und deshalb zu Krebs führt.
00:07:44.14 Also diese einfachen Mutationen. und deshalb natürlich als Strukturbiochemiker
00:07:49.23 Es ist ein sehr interessantes Projekt, die Frage zu stellen:
00:07:52.00 Wie kann es sein, dass eine einzelne Punktmutation so dramatische Folgen hat?
00:07:58.19 Und es ist auch. offensichtlich, da Ras das häufigste Onkogen ist.
00:08:02.28 Etwa 25% der Menschen, die mit einem Tumor in die Klinik kommen,
00:08:09.07 sie haben eine Ras-Mutation, eine von denen, die ich dir gezeigt habe. Zumindest sind dies die häufigsten.
00:08:15 Uhr Offensichtlich arbeitet also auch jedes Pharmaunternehmen daran, den Ras-Signalweg zu hemmen
00:08:20.29 und Ras-Signalisierung zur Behandlung von Ras-vermittelten Krebsarten.
00:08:25.28 Und es gibt viele Ansätze, die man sich vorstellen kann.
00:08:30.17 Ich habe hier nur ein paar angedeutet. Denken Sie zum Beispiel an Ras. ist farnesyliert
00:08:36.25 am C-terminalen Cystein und es gibt ein Enzym namens Farnesyltransferase, das diese Reaktion vermittelt.
00:08:44.18 Es gibt Farnesyltransferase-Hemmer, die gerade in der Klinik auf ihre Wirksamkeit getestet werden.
00:08:50.00 Man könnte aber auch daran denken, vielleicht die Interaktion mit nachgeschalteten Effektoren zu hemmen.
00:08:54.15 Dies ist zum Beispiel eine von uns ermittelte Struktur: der Komplex zwischen Ras und Raf-Kinase (oder einem Teil der Raf-Kinase).
00:09:00.10 Oder Sie können es sich vorstellen. und daran arbeiten wir noch.
00:09:04.21 Unser Traumansatz ist. Das grundlegende Merkmal von onkogenem Ras ist, dass es GTP nicht hydrolysieren kann.
00:09:12.09 Können wir darüber nachdenken, kleine Moleküle herzustellen, die die GTP-Hydrolyse auf onkogenem Ras induzieren?
00:09:18.21 Dies ist wahrscheinlich ein Traumprojekt und wir arbeiten noch daran, es machbar zu machen.
00:09:25.05 Aber ich werde Ihnen im Rahmen meines Seminarvortrags zeigen, warum wir es immer noch für möglich halten
00:09:32.23 ist, dass die Chemie nicht so schwierig sein sollte.
00:09:36.14 Und ich hoffe, ich kann dich überzeugen und gehst am Ende mit mir mit.
00:09:40.26 Wir sprechen hier also von einem nukleophilen Angriff von Wasser auf das Gammaphosphat von GTP
00:09:49.03 von RasGAP vermittelt und es erzeugt Ras-BIP und Pi. Eine einfache biochemische Reaktion
00:09:56.09 aber wenn es nicht funktioniert, hat es sehr drastische Folgen, nämlich Krebs.
00:10:00.21 Also erst einmal (Und das Bild hast du auch schon einige Male gesehen.
00:10:05.24 Dies ist immer meine Einführungsfolie)
00:10:08.09 sind die beiden am häufigsten mutierten Aminosäuren
00:10:13.16 (beide) in onkogenen Versionen von Ras sind sie sehr nahe am aktiven Zentrum.
00:10:18.07 Sie sehen hier also das Nukleotid: das ist das Gammaphosphat
00:10:22.07 Und Sie sehen, das ist Glutamin 61 und das ist Glycin 12 sind sehr nah am aktiven Zentrum
00:10:28.10 offensichtlich, wie Sie wahrscheinlich vorhergesagt oder gedacht haben,
00:10:32.06 ist, dass sie irgendwie an der GTPase-Reaktion beteiligt sind.
00:10:35.22 Nun zeigen wir Ihnen natürlich, was sie tatsächlich tun und warum die Mutation zu einer Blockade der GTP-Hydrolyse führt.
00:10:43.08 Und Sie können hier auch eine Oberflächendarstellung des aktiven Zentrums von Ras sehen
00:10:49.12 wenn diese GTP. also sitzt es. es ist an die Oberfläche gebunden
00:10:53.26 und Sie sehen, dass das Gamma-Phosphat immer noch von außen zugänglich ist
00:10:57.03 und das wird im Zusammenhang mit dem, worüber ich sprechen werde, wichtig sein
00:11:01.12 und Sie sehen auch, ich habe letztes Mal darüber gesprochen, dass Magnesium wichtig ist.
00:11:05.20 Wenn kein Magnesium in der Nähe ist, haben Sie auch keine GTP-Hydrolysereaktion.
00:11:09.24 Wie immer in einem Säugetiergenom gibt es also nicht nur ein RasGAP, sondern 12 oder 13.
00:11:19.08 Und ich habe hier einige davon angegeben.
00:11:24.06 Und Sie sehen, sie alle enthalten eine bestimmte Domäne von etwa 330 Resten.
00:11:28.09 Dies ist die RasGAP-Domäne, die selbst in der Lage ist, die schnelle GTP-Hydrolysereaktion zu initiieren.
00:11:36.17 Und Sie sehen, dass all diese Proteine ​​aus verschiedenen Domänen bestehen.
00:11:43.03 Und einige sind ähnlich, andere sehr unterschiedlich.
00:11:45.20 Und sie regulieren offensichtlich Ras in verschiedenen Kontexten der Zelle
00:11:50.04 aufgrund ihrer unterschiedlichen Domänen, die sie zusätzlich haben.
00:11:53.15 Und ich werde über einen sprechen, den ersten RasGAP, der von Frank McCormick entdeckt wurde, nämlich P120GAP.
00:12:02.06 Und ich werde später über NF1 sprechen
00:12:05.05, was ein weiteres wichtiges Element für die Tumorbildung ist, da es ein Tumorsuppressorgen ist.
00:12:12.04 Zunächst einmal, und noch einmal, um Sie daran zu erinnern, ist die intrinsische GTP-Hydrolyse sehr langsam.
00:12:17.23 Aber wenn Sie das GTPase-aktivierende Protein hinzufügen, ist es schnell.
00:12:21.08 Also, was ich hier gemacht habe, ist radioaktives GTP (zum Beispiel mit Gamma-Kennzeichnung)
00:12:25.27 und dann messe ich die Produktion von Pi über die Zeit.
00:12:29.26 Sehen Sie, da unten ist diese Reaktion (bei Zimmertemperatur) fast vernachlässigbar.
00:12:35.14 Ohne GAP findet bei Raumtemperatur fast keine Hydrolyse von normalem Ras statt.
00:12:40.12 Und wenn Sie jetzt eine bestimmte Menge RasGAP hinzufügen, sehen Sie, dass es sehr schnell reagiert.
00:12:44.23 Viel viel schneller.
00:12:46.04 Und unter Grenzbedingungen ist es tatsächlich eine 10^5-fache Stimulation dieser Reaktion.
00:12:53.10 So wollen wir es also sehen.
00:12:57.05 Wir wollen analysieren, wie GAP diese schnelle GTP-Hydrolyse-Reaktion vermittelt.
00:13:03.14 Sie fragen sich also zunächst natürlich: Was könnte der Mechanismus der Hydrolyse sein?
00:13:10.11 und welcher Schritt wird von GAP katalysiert?
00:13:14.02 Man kann sich Ras-GTP im Prinzip als schnelles GTP-Hydrolyse-Enzym vorstellen
00:13:20.14, aber es muss durch eine Isomerisierungsreaktion in einen GTPase-kompetenten Zustand gelangen.
00:13:26.15 Und das ist sehr langsam und wird durch GAP katalysiert.
00:13:28.29 Oder Sie könnten denken, dass die eigentliche Spaltungsreaktion von GTP zu GDP Pi
00:13:35.02 ist sehr langsam und wird von GAP katalysiert.
00:13:38.01 Oder man könnte sogar denken, dass das alles noch sehr schnell geht
00:13:41.09, aber die Freisetzung von Pi zum Produkt ist sehr langsam und wird durch GAP katalysiert.
00:13:47.08 Wenn Sie sich zum Beispiel erinnern, von der Hydrolyse von ATP auf Myosin gehört zu haben,
00:13:53.26 Myosin ist zum Beispiel eine sehr schnelle GTPase, aber die Pi-Freisetzung ist sehr langsam
00:13:59.00 und muss durch Aktin katalysiert werden.
00:14:01.04 Also, mit anderen Worten, was ist der eigentliche Schritt, der in diesem speziellen Fall von GAP katalysiert wird?
00:14:07.10 Und ich sollte sagen, dass es die Spaltungsreaktion selbst ist
00:14:11.12, der Hauptangriffspunkt des GTPase-aktivierenden Proteins
00:14:16.21 und das nur in Gegenwart von GAP die anderen Reaktionen
00:14:20.18 werden zumindest teilweise ratenbegrenzend, zumindest die Pi-Version.
00:14:24.10 Und das zeige ich dir später auch.
00:14:27.29 Und obwohl ich Ihnen das schon einmal gezeigt habe, werde ich es noch einmal wiederholen.
00:14:32.12 Also, was wir in unseren Studien, in denen wir Biochemie mit fluoreszierenden Nukleotiden betreiben, viel verwenden,
00:14:38.20 verwenden wir ein Mant- oder mGDP- oder mGTP-Analog
00:14:42.29, wo Sie auf der Ribose eine fluoreszierende Reportergruppe haben.
00:14:46.24 Das wäre also entweder Desoxy-Ribose oder Ribose und an die Ribose, die du gebunden hast
00:14:52.17 diese Esterbindungen, die Mant-Gruppe, die sehr empfindlich auf die Umgebung reagiert, in der sie sitzt.
00:14:59.19 Und deshalb gibt es immer sehr schöne bauliche Veränderungen, wie ich gleich zeigen werde.
00:15:07.10 Wir haben Stop-Flow verwendet, um schnelle Reaktionen zu messen, weil die GTPase-Reaktion,
00:15:13.29, das ohne GAP langsam ist, wird sehr schnell
00:15:17.15 und um es im Detail zu analysieren, müssen wir die Stop-Flow-Kinetik verwenden.
00:15:21.16 Also, was Sie zum Beispiel tun werden: Sie haben Ras mit dem Label
00:15:25.10 mant-GTP (also die fluoreszierende Version von GTP)
00:15:28.16 und du hast GAP und du hast sie zusammen in eine fluoreszierende Detektionsküvette geschossen
00:15:34.02 und du hast den Stopflow hier oben, um
00:15:37.17 Stellen Sie sicher, dass Sie nur eine bestimmte Menge Flüssigkeit aus diesen beiden Spritzen in Ihre Reaktionskammer geben.
00:15:44.07 Wenn wir also diese beiden Dinge zusammen gedreht haben, sehen wir, dass es da ist
00:15:50.09 eine fluoreszierende Zunahme, wenn Sie Ras-mantGTP verwenden und eine Abnahme.
00:15:54.09 Der Anstieg ist wiederum sehr schnell.
00:15:56.25 Das bedeutet, dass die beiden Proteine ​​einen Komplex bilden.
00:15:58.27 Und dann dissoziiert der Komplex mit der Zeit, weil Neurofibromin nach der Hydrolyse nicht mehr an Ras bindet.
00:16:07.18 Und das alles ist, wie man sieht, nach einer Sekunde vorbei.
00:16:10.09 Also sehr schnelle Phosphotransferreaktion in Gegenwart von sättigenden Mengen an GAP.
00:16:15.07 Und als Kontrolle verwenden wir Ras gebunden an ein Analog, GppNHp,
00:16:21.25 wo du zwischen dem Beta- und dem Gamma-Phosphat eine NH-Gruppe hast
00:16:25.16 die nicht mehr hydrolysiert werden können und jetzt auch einen sehr schnellen Anstieg haben
00:16:30.17 (das ist eine Komplexbildung), aber keine Dissoziation, da diese nicht hydrolysiert werden kann.
00:16:35.05 Das ist also auch der Beweis, dass die Dissoziation auf GTP-Hydrolyse zurückzuführen ist.
00:16:40.21 Man kann also fragen: "Bei dieser Reaktion hier, was auf GAP, was auf GAP zurückbleibt,
00:16:50.01 sind an der Vermittlung dieser schnellen GTP-Hydrolyse-Reaktion beteiligt, dieser 10^5-fachen Stimulation der Reaktion?"
00:16:58.17 Und natürlich haben Sie daran gedacht, welche Reste, welche Aminosäuren den Job machen könnten.
00:17:03.16 Oder ist es mehr als eine Aminosäure?
00:17:05.16 Und als guter Kandidat dachten wir an ein Arginin
00:17:08.16 denn wenn man sich ein anderes G-Protein anschaut, G-alpha-Protein (von den heterotrimeren G-Proteinen)
00:17:15.02 es ist bekannt, dass das aus zwei Domänen besteht
00:17:18.25 also ist diese blaue Domäne die G-Domäne und das rote Zeug hier ist eine spiralförmige Extradomäne.
00:17:24.21 Aber in dieser helikalen Domäne haben Sie ein Arginin, das genau im aktiven Zentrum sitzt
00:17:29.24 und es hat sich gezeigt, dass Arginin für die Reaktion wichtig ist.
00:17:33.29 Und das hat sich in einem sehr alten Experiment gezeigt
00:17:37.20 weil es einen bakteriellen Erreger namens Vibrio cholera gibt, der Cholera induziert
00:17:45.29 und was es bewirkt, ist, dass es dieses Arginin auf diesem G-alpha-Protein modifiziert.
00:17:51.16 Sie haben NAD und das Cholera-Toxin überträgt ADP-Ribose auf
00:17:58.03 ein Arginin von G-alpha, das hier gezeigt wird. Das ist eigentlich aus dem Lehrbuch hier.
00:18:02.26 Das ist also eine sehr alte Reaktion. Es war vor vielen, vielen Jahren analysiert worden.
00:18:07.10 Und es zeigt sich, wenn du diese Reaktion ausführst, wenn du blockierst
00:18:10.16 die GTPase-Reaktion auf G-alpha-Protein, es gibt keine GTP-Hydrolyse mehr
00:18:16.10 und das Protein produziert nun zyklisches AMP,
00:18:19.14 öffnet es Kanäle (cyclische AMP-gesteuerte Ionenkanäle) und dann bekommt man all diese Symptome der Cholera.
00:18:26.19 Die Frage ist also wieder: Wäre Arginin ein guter Kandidat?
00:18:29.29 Also haben wir in allen RasGAPs, die ich dir gezeigt habe, nach konserviertem Arginin gesucht
00:18:33.24 und tatsächlich haben wir mehrere gefunden, die meisten haben keinen Unterschied gemacht.
00:18:38.06 Aber es gab nur ein Arginin, das mutiert das folgende Reaktionsmuster zeigt.
00:18:43.19 Sie haben also wieder in der grünen Version (das ist die Wildtyp-Version)
00:18:47.23 schnelle Zunahme durch Komplexbildung, schnelle Abnahme durch Dissoziation nach GTP-Hydrolyse.
00:18:53.16 Und bei diesen Mutanten hier mutierte Arginin entweder zu Lysin oder Alanin
00:18:58.11 oder zu was du es mutieren möchtest,
00:19:00.03 die Reaktion nimmt wieder zu, aber dann bleibt sie oben, keinerlei Hydrolyse.
00:19:06.13 Oder zumindest unter diesen Umständen bis zu einer Sekunde keine Hydrolyse.
00:19:10.16 Was Ihnen offensichtlich schon sagt, dass dieses Arginin für die Reaktion essentiell sein muss.
00:19:18.02 Soweit so gut. Die Biochemie war klar
00:19:21.09 aber offensichtlich wissen Sie nicht wirklich, was Arginin in diesem Zusammenhang macht.
00:19:24.05 Sie denken, Sie haben eine Idee, dass es in die aktive Site gehen könnte
00:19:28.02 aber auch hier müssen wir warten, bis die Struktur uns wirklich sagt, was sie tut.
00:19:33.21 Zunächst möchte ich Ihnen jedoch ein weiteres wichtiges Konzept zur Analyse von Phosphotransferreaktionen vorstellen.
00:19:40.12 Und das mit Aluminiumfluorid-Komplexen.
00:19:43.02 Sie fragen sich vielleicht, warum so ein anorganisches Molekül wichtig ist
00:19:47.14 aber es stellt sich heraus, dass wenn man sich die Natur des Übergangszustandes ansieht,
00:19:51.20 also wäre GTP von Wasser angegriffen.
00:19:55.18 Du hast einen Übergangszustand, in dem das Phosphat jetzt ein triginales, flaches Ding macht
00:20:00.26 wobei der nukleophile Sauerstoff und der Sauerstoff der Abgangsgruppe auf der anderen Seite
00:20:08.22 sind die axialen Liganden dieses fünffach koordinierten Phosphats
00:20:12.11 und dieser Übergangszustand kann entweder sehr eng sein (was dann als assoziativ bezeichnet wird)
00:20:18.16 oder sehr locker je nach Abstand hier zwischen Phosphat und den beiden axialen Liganden.
00:20:25.26 Und dann haben Sie wieder tetragonales Phosphat (dieses Pi-freie Phosphat).
00:20:32.08 Und es stellt sich heraus, dass Aluminiumfluorid
00:20:36.05 (der Abstand zwischen Aluminium und Fluorid ist sehr ähnlich zu
00:20:39.23 zwischen Phosphat und Sauerstoff und sie sind auch stark elektronennegativ)
00:20:44.26, dass dies eine sehr gute Nachahmung des Übergangszustands der Phosphotransferreaktion ist.
00:20:51.02 Das einzige Problem war, dass während zum Beispiel Kinesin oder Myosin oder
00:20:56.28 viele andere Phosphotransferenzyme verwenden Aluminiumfluorid als Nachahmung des
00:21:02.07 Gamma-Phosphat im Übergangszustand,
00:21:04.17 Ras oder Rho und all diese Ras-ähnlichen Proteine ​​haben das nie gezeigt.
00:21:08.25 Hier sehen Sie das Experiment.
00:21:11.19 Sie nehmen Ras-mantGDP (es hat ein bestimmtes Fluoreszenzemissionsspektrum mit einem Maximum bei etwa 440)
00:21:19.03 und jetzt fügst du den GAP hinzu und mit einem ändert sich überhaupt nichts am Spektrum.
00:21:24.12 Also passiert nichts.
00:21:25.11 Aber wenn Sie jetzt Aluminiumfluorid hinzufügen, sehen Sie, dass Sie jetzt zuerst eine Blauverschiebung bekommen
00:21:31.00 und dann eine Erhöhung der Absorption.
00:21:37.11 Das bedeutet, dass es einen trimeren Komplex zwischen Ras, NF1 und Aluminiumfluorid gibt
00:21:42.07 wo das Aluminiumfluorid in der Gammaphosphat-Bindungsstelle sitzt.
00:21:47.10 Und das war sehr hilfreich.
00:21:48.25 und übrigens, wenn man das jetzt bei onkogenen Mutanten macht
00:21:52.02, von dem wir wissen, dass es GTP nicht hydrolysiert und das gleiche Experiment durchführt,
00:21:55.15 Sehen Sie, in Gegenwart von Aluminiumfluorid und Ras gibt es keine fluoreszierende Veränderung.
00:22:00.06 Und jetzt fügen Sie NF1 hinzu und die Fluoreszenz nimmt nicht zu
00:22:04.12, weil Sie eine Mutation (Q61L) haben, die nicht hydrolysiert.
00:22:08.13 Sie können auch eine Mutation von NF1 nehmen, zum Beispiel mit der Arginin-Mutation,
00:22:13.22 und wieder würde sich nichts ändern.
00:22:16.05 Mit anderen Worten, was diese Experimente uns wieder sagen, ist, dass Ras in einem unvollständigen Phospho-Transfer-Enzym ist.
00:22:22.22 Es braucht die Anwesenheit einer GAP, um wie ein Phospho-Transfer-Enzym auszusehen
00:22:28.05 und wenn es eine Mutation gibt, die die GTPase-Reaktion blockiert, entweder auf Ras oder auf NF1,
00:22:33.22 bekommen wir auch keinen Aluminiumfluoridkomplex.
00:22:37.09 Also natürlich ist das alles schön in Bezug auf Biochemie
00:22:42.00 aber was die GTPase-Reaktion wirklich vermittelt, die schnelle,
00:22:47.22 Wir denken, dass dies nur durch einen Blick auf die Struktur des Ras- und RasGAP-Komplexes verifiziert werden kann.
00:22:55.29 Dies wird hier gezeigt. Das war also das Paradigma für die Analyse dieser Art von Reaktion.
00:23:02.06 Sie sehen also zum Beispiel in Rot Ras und unten in Grün die RasGAP-Domäne (P120 GAP).
00:23:09.13 Und was Sie dann hier sehen. wenn du ganz genau hinschaust
00:23:12.04 Sie sehen, dass ein Rückstand von GAP in das aktive Zentrum gelangt.
00:23:17.14 Das sieht man, wenn es zurückkommt. das siehst du gleich dort.
00:23:21.01 Es gibt einen Argininrest, der in das aktive Zentrum von Ras . zeigt
00:23:26.04 und was es tut, wird auf der nächsten Folie gezeigt.
00:23:29.06 Zunächst einmal zeigt diese Folie, dass das Aluminiumfluorid wirklich das flache Dreieck ist
00:23:34.00, die zwischen der Abgangsgruppe und dem nukleophilen Wasser sitzt.
00:23:38.07 Es gibt also eine Nachahmung des Übergangszustands.
00:23:39.28 Und Sie sehen dann auch, welche Rückstände eine schnelle GTP-Hydrolyse vermitteln.
00:23:45.17 Das wäre also das Phosphat,
00:23:48.14 also denken wir jetzt, wenn wir Aluminiumfluorid wegnehmen und
00:23:52.06 Überlege, wie der wirkliche Übergangszustand aussehen würde
00:23:55.06 du hast das nukleophile Wasser und du hast den Übergangszustand
00:23:58.29 wo sie an das Gammaphosphat gebunden sind
00:24:00.25 und das Glutamin fixiert das Wasser relativ zum Phosphat
00:24:05.07 durch eine Akzeptor- und eine Wasserstoffbrücken-Donor-Wechselwirkung.
00:24:09.17 Und das Arginin (was wir Arginin-Finger nennen) stabilisiert sich zuallererst
00:24:13.29 die Position dieses Glutamins und es liefert auch diese positive Ladung
00:24:18.03 der Aminogruppe, um Ladungen im Gammaphosphat zu neutralisieren.
00:24:22.28 Das sind also die beiden Reste, die für die Reaktion wirklich entscheidend sind
00:24:27.08 Glutamin 61 von Ras und der Argininfinger von RasGAP.
00:24:32.05 Und das erklärt zum Beispiel schon, warum Mutationen von Glutamin 61 im onkogenen Ras
00:24:37.19 die Hydrolysereaktion durcheinander bringen, weil Sie sich vorstellen können, wenn Sie zum Beispiel
00:24:42.09 ein Leucin oder was auch immer hier, wenn man diese Art von Interaktionen hier nicht machen kann.
00:24:47.00 Jede Mutation von Glutamin 61 ist also onkogen, weil es ein direkter katalytischer Rest ist.
00:24:53.16 Die Struktur erklärt also auch, warum Mutationen von Glycin 12 onkogen sind.
00:24:58.22 Und das ist auch hier auf dieser Folie gut zu sehen.
00:25:02.04 Sie haben Glycin 12, das, wenn es zu einem Rest mutiert wird, es zu einem Onkogen macht.
00:25:06.25 Und dann sehen Sie, dass Aluminiumfluorid dieses flache Dreieck ist.
00:25:11.08 Sie sehen dort Glutamin 61 und hier unten den Argininfinger.
00:25:16.09 Und sie sind alle sehr nah beieinander, angezeigt durch diese blauen gestrichelten Linien
00:25:20.04, was darauf hinweist, dass dies fast VanDerWaals-Entfernung ist.
00:25:24.04 Und wenn Sie nun zum Beispiel Glycin zur kleinstmöglichen Aminosäure mutieren,
00:25:28.11 es wäre Alanin, Sie sehen, es würde sofort all diese Reste im aktiven Zentrum durcheinander bringen.
00:25:34.01 Aus sterischen Gründen kann es also keine anderen Rückstände geben
00:25:36.24 im aktiven Zentrum im Übergangszustand außer Glycin.
00:25:43.08 Die Botschaft von all dem war offensichtlich, dass es ein Arginin gibt
00:25:49.00, den wir den Argininfinger nennen, der den Auslöser für die GTPase-Reaktion drückt.
00:25:54.00 Ohne ist es sehr langsam und damit wird es 10^5 mal schneller.
00:26:01.01 Wir haben es auch benutzt. also um auf die frage zurückzukommen: was ist jetzt die ratenbegrenzung im gesamten prozess?
00:26:07.00 Der wichtigste Regulierungsschritt der intrinsischen GTP-Hydrolyse ist also der sehr langsame chemische Schritt, die langsame Hydrolyse.
00:26:14.29 Aber mit einer anderen Technik finden wir das jetzt heraus
00:26:17.25 Es gibt einen weiteren Schritt, der teilweise die Geschwindigkeit begrenzt, und ich werde Ihnen das in einer Minute zeigen.
00:26:23.29 Wir verwenden also zeitaufgelöste Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie.
00:26:28.10 Und damit erreichen wir fast atomare Auflösung.
00:26:33.11 Wir können Atome im aktiven Zentrum auf einer Millisekunden-Zeitskala betrachten.
00:26:37.27 Wenn Sie also ein Infrarotspektrum eines Proteins sehen, das Amid I- und Amid II-Banden aufweist,
00:26:47.20 Das sind keine sehr strukturierten Informationen, da es sich um eine Mischung aus Informationen zu handelt
00:26:54.26 Alpha-Helices, Beta-Sheets und so weiter und man kann nicht viele Details aus einem solchen Bild herausnehmen.
00:27:02.26 Aber wir beobachten, um zu reagieren. Nehmen wir an, ein Protein geht von A nach B
00:27:09.05 beobachten wir das unterschiedliche Spektrum, das zumindest auf dieser Absorptionsskala
00:27:16.19 zeigt keinen großen Unterschied, aber wenn man genauer hinschaut.
00:27:20.15 Sie sehen also, dass die Absorption dort 0,0 beträgt und die Absorption hier unten 0,02 beträgt.
00:27:25.14, also sehen wir sehr kleine, aber sehr reproduzierbare Änderungen
00:27:29.21 im Verlauf der Reaktion, wenn A zu B geht.
00:27:33.02 Und wir sehen negative Spitzen, die bedeuten, dass A verschwindet, und wir sehen positive Spitzen, wenn B auftaucht.
00:27:40.22 So können wir Dinge beobachten, die verloren gehen und Dinge, die auftauchen
00:27:43.29 im Verlauf der Reaktion und wir können diese per FTIR verfolgen.
00:27:49.25 Und wenn ja. Also müssen wir zuerst die Reaktion zu einem bestimmten Zeitpunkt auslösen
00:27:56.25, um strukturelle Veränderungen der zweiten Zeitskala zu beobachten.
00:28:03.04 Und dafür verwenden wir wieder ein anderes Analog
00:28:07.00 und das andere Analog ist eingesperrtes GTP, das von Roger Goody entwickelt wurde
00:28:10.22 der ein Kollege von mir im Institut ist.
00:28:14.05 Und diese eingesperrte GTP wird auf dem Gammaphosphat durch die sogenannte Käfiggruppe blockiert.
00:28:20.22 Es erlaubt also keine Hydrolyse, aber jetzt kannst du mit einem Lichtblitz diese Käfiggruppe abspalten
00:28:26.21 und jetzt haben Sie Ras-GTP, das dann zu GDP und Pi hydrolysieren kann.
00:28:31.19 Wenn Sie das mit Ras ohne GAP machen,
00:28:39.11 Sie sehen, dass Sie einen haben. Sie sehen zum Beispiel die Absorption.
00:28:44.22 Also jede Absorption, die Sie vom Infrarot kennen, zeigt eine atomare Schwingung in den Bindungen.
00:28:51.09 Sie sehen zum Beispiel Vibrationen für die
00:28:53.15 Alpha, Beta, Gamma, die gegen Ende abnehmen und nach 2 Stunden, 5 Minuten Null werden.
00:29:00.29 Also das Differenzspektrum (subtrahiere das Endspektrum vom Startspektrum)
00:29:06.16 und dann sieht man nur die Veränderungen, die während der Reaktion auftreten.
00:29:11.23 Und das ist ganz normal. Es gibt einen einzigen exponentiellen Zerfall, wenn Ras GTP hydrolysiert.
00:29:18.21 Keine große Sache.
00:29:20.15 Aber interessant ist, dass wenn man die GAP-vermittelte Reaktion analysiert
00:29:24.26, weil Sie jetzt keinen einzigen exponentiellen Zerfall sehen, sondern plötzlich Zwischenstufen erscheinen.
00:29:30.14 Sie sehen Gipfel, die auf- und absteigen und der wichtigste ist
00:29:35.04, angezeigt durch diese Nummer 1113. Dies ist die Häufigkeit für diese spezielle Änderung.
00:29:39.28 Also muss man natürlich analysieren, was jede Band macht, wozu sie gehört.
00:29:47.06 Also, was machen wir der Reihe nach. Wir haben diese Techniken entwickelt
00:29:52.17 oder unsere Kollegen an der Uni Bochum, mit denen wir zusammenarbeiten
00:29:56.03 Sie haben Techniken entwickelt, um herauszufinden, was jede Bandbreite ist,
00:30:01.01 was ist jede Frequenz. Extinktionsänderung. woran liegt es.
00:30:03.28 Zum Beispiel stellen Sie für GTP fest, dass eine Absorptionsänderung bevorsteht
00:30:10.13 eine Geschwindigkeitskonstante k2. k1 ist also die Photoisomerisierung, k2 ist eine Reaktion und k3 ist die nächste.
00:30:17.18 Und wenn Sie das tun, erhalten Sie mit k3 eine Zunahme und eine Abnahme.
00:30:21.12 Und dann gibt es noch eine Zwischenstufe, die um 1113 Uhr ansteht.
00:30:26.12 Es kommt mit k2 und zerfällt mit k3.
00:30:30.01 Mit k3 kommt kostenloses Pi. Aus all dem können wir natürlich schließen
00:30:35.18 dass es hier ein Pi-Intermediat mit dieser Absorptionsfrequenz gibt, 1113 cm^-1
00:30:44.02, das mit der Geschwindigkeitskonstanten k2 erscheint und mit einer Geschwindigkeitskonstanten k3 abklingt.
00:30:50.03 Mit anderen Worten, die Veröffentlichung von Pi wird jetzt sichtbar.
00:30:54.25 Wir sehen also Hydrolyse, wenn dieser Pi-Peak auftaucht.
00:30:58.21 Und wir sehen den Verfall, wenn er verschwindet.
00:31:01.01 Und das sehen Sie hier zum Beispiel in Echtzeit.
00:31:03.25 Die Absorption ändert sich also mit der Geschwindigkeitskonstanten k2. das Schema siehst du hier:
00:31:09.05 Ras, wenn es im eingeschalteten Zustand ist, geht in den Pi-Zustand über und Sie sehen, dass es ein proteingebundenes Pi gibt
00:31:17.13 das kommt und die Pi-Band geht im Laufe der Reaktion runter.
00:31:21.20 Und das wird mehrmals wiederholt.
00:31:23.07 Und Sie auch, damit ein Arginin-Finger in die Reaktionskammer ein- und ausgeht.
00:31:30.00 Damit wir nicht nur Proteinbanden folgen können,
00:31:32.16 können wir die Phosphatbanden mit atomarer Auflösung im Millisekundenbereich verfolgen.
00:31:40.26 Und das sagt uns jetzt alle zusammen, das ist die Botschaft von all dem,
00:31:46.01 dass Sie zwar eine hohe Aktivierungsenergie für die intrinsische Hydrolysereaktion von 92 kJ/mol . haben
00:31:54.01 du trennst jetzt die Reaktion in zwei Teilreaktionen,
00:31:57.16 die eine geringere Aktivierungsenergie haben und deshalb so viel schneller machen.
00:32:01.08 Sie haben also die erste Aktivierungsenergie für die Spaltungsreaktion. was zu Ras-BIP-Pi führt.
00:32:08.03 Und Sie haben den zweiten Schritt, in dem Sie die Veröffentlichung von Pi haben und jetzt haben Sie das Produkt.
00:32:12.14 Das ist also wieder ein allgemeines Thema der Enzymologie
00:32:15.12 dass eine enzymkatalysierte Reaktion die Aktivierungsenergie senkt
00:32:20.00 nicht nur eine Reaktion absenken, sondern auch in Teilschritte unterteilen
00:32:24.28 von denen jeder eine andere Aktivierungsenergie hat.
00:32:29.22 Und hier sehen Sie, dass diese Aktivierungsenergie 59 kcal/mol und 66 beträgt, was bedeutet
00:32:36.04 dass dies etwas höher ist und deshalb der teilweise geschwindigkeitsbegrenzende Schritt der Gesamtreaktion ist.
00:32:45.12 Also lass mich dir jetzt geben. das war also Ras und wie es zur Tumorbildung führt
00:32:50.14 und wir haben im Detail analysiert, wie das auch auf biophysikalischer Ebene funktioniert
00:32:55.02 aber lassen Sie mich jetzt darauf zurückkommen, warum bestimmte GTPase-Reaktionen, wenn sie nicht funktionieren,
00:33:03.00 wie sie zu verschiedenen Arten von Krankheiten führen.
00:33:05.20 Neurofibromatose ist eine davon.
00:33:07.27 Ich habe Ihnen bereits gezeigt, dass Neurofibromin, das Genprodukt des Gens, ein Ras GAP ist.
00:33:15.09 Und es gibt eine Krankheit namens Neurofibromatose Typ I. Es ist das, was die Leute Kaffee-au-lait-Flecken auf der Haut haben,
00:33:22.21 manchmal kleine Tumoren auf der Haut, die manchmal ziemlich groß und sehr entstellend sein können
00:33:28.16, die durch eine Mutation oder Deletion des Neurofibromatose-Gens verursacht werden.
00:33:35.21 Und als wir zum Beispiel am Mechanismus der GTP-Hydrolyse von GAP und NF1 arbeiteten,
00:33:43.00 kam ein Kollege von der Charite-Klinik in Berlin zu uns und sagte uns, dass er das hatte
00:33:48.03 eine Patientin, die im Alter von 35 Jahren verstirbt und sie hat drei dort oben angegebene Söhne
00:33:55.20 die auch die Krankheit haben. Und er analysierte das Blut des Patienten und dann den Tumor selbst.
00:34:04.22 Er hat herausgefunden, dass es eine Mutation in der Sequenz von Neurofibrobromin gibt
00:34:11.29 wo das Arginin zu Prolin mutiert ist. Sie sehen, dass dort unten Arginin zu Prolin mutiert ist.
00:34:17.13 Und das würde ich dir natürlich nicht sagen, wenn es nicht das katalytische Arginin wäre.
00:34:21.19 Es stellt sich also heraus, dass sie eine Mutation im katalytischen Arginin haben
00:34:25.23 und wenn du jetzt die GTPase-Reaktion machst, die ich dir vorher gezeigt habe,
00:34:30.09 Sie sehen, mit normalem NF1 haben Sie hier die blaue Kurve,
00:34:37.17 bedeutet eine Zunahme der Fluoreszenz und eine Abnahme mit Hydrolyse
00:34:43.03 und jetzt, wenn du diese Mutation von R zu P nimmst, hast du eine Zunahme, was eine komplexe Bildung bedeutet
00:34:48.03 aber keine Hydrolyse und es gibt einen anderen Patienten, den wir inzwischen analysiert haben
00:34:53.16 wieder Arginin zu allem anderen, Q in diesem speziellen Fall,
00:34:58.09 führt zu einer Blockierung seiner Fähigkeit, GTP auf Ras zu hydrolysieren.
00:35:02.17 Die Mutation des essentiellen Arginins führt also zur Krankheit Neurofibromatose.
00:35:08.16 Außerdem sollte ich darauf hinweisen, dass es viele andere Mutationen in Neurofibromin gibt
00:35:13.22, die auch die Krankheit verursachen, die bei vielen verschiedenen Patienten phänotypisch sehr unterschiedlich ist.
00:35:20.26 Lassen Sie mich Ihnen nun ein anderes System vorstellen, das ist
00:35:24.06 interessant sowohl aus biochemischer Sicht als auch aus Sicht einer anderen Krankheit
00:35:29.11 zu dem ich zu gegebener Zeit kommen werde.
00:35:33.03 Ich werde also über ein Molekül namens Rap sprechen, das offensichtlich ein verwandtes RasGAP hat.
00:35:40.16 Und Rap ist ein enges Homolog von Ras und der Name leitet sich von ab
00:35:44.05 die Tatsache, dass es sehr homolog zu Ras ist, weil Rap für Ras Proximate steht.
00:35:49.07 Obwohl es als enges Homolog von Ras galt, macht es etwas ganz anderes.
00:35:55.14 Es hat offensichtlich den gleichen Zyklus zwischen BIP und GTP. Es funktioniert also als molekularer Schalter.
00:36:02.00 Aber es hat nicht mit Proliferation wie Ras oder Differenzierung zu tun, sondern eher
00:36:06.10 Es ist an der Integrinaktivierung oder der Thrombozytenaktivierung oder anderen Dingen beteiligt.
00:36:11.19 Die Biologie von Rap ist also völlig anders.
00:36:14.17 Warum die Biochemie so interessant ist, ist, dass Rap das einzige Homolog ist
00:36:22.12 oder das einzige Mitglied der Ras-Superfamilie, das kein Glutamin in der Position hat
00:36:27.18, wobei Glutamin 61 von Ras an der GTP-Hydrolyse beteiligt ist.
00:36:33.01 Es fehlt also der Rückstand, den wir für die absolut entscheidende GTP-Hydrolyse hielten, und hier ist er nicht da.
00:36:39.18 Und natürlich stellt sich die Frage, warum das so ist und wie RapGAP
00:36:42.25 Dann arbeite an diesem System und wie stimuliert es die Reaktion.
00:36:48.29 Lassen Sie mich Ihnen also zunächst die RapGAPs vorstellen.
00:36:52.24 Hier sind fünf von ihnen angegeben, aber es gibt noch mehr im menschlichen Genom
00:36:57.23, aber diese fünf RapGAPs enthalten alle eine hochhomologe Domäne
00:37:04.02 was hier durch die hellblaue und die dunkelblaue Färbung angezeigt wird
00:37:08.09 wo das hellblaue Zeug etwas anders ist als das dunkelblaue.
00:37:12.05 Und ich werde das erklären, wenn wir uns die Struktur ansehen.
00:37:13.21 Auch hier ist die Domänenorganisation all dieser fünf RapGAPs etwas anders.
00:37:17.25 Das bedeutet, dass sie ihre Arbeit wahrscheinlich in einem anderen biologischen Kontext erledigen.
00:37:23.04 Der Grund, warum es auch interessant ist, ist, dass die dunkelblaue Homologieregion ist
00:37:28.10 auch in einem Protein namens Tuberin konserviert
00:37:30.17, was für eine Krankheit steht, über die ich am Ende sprechen werde.
00:37:34.03 Deshalb war es auch interessant, sich diese Reaktion anzusehen.
00:37:37.06 Und der dritte Grund, warum es interessant ist, sich diese Reaktion anzusehen, wird auf der nächsten Folie angezeigt.
00:37:42.19 Aber bevor Sie das tun, lassen Sie mich Ihnen zuerst zeigen, dass wir wieder einen Stopped-Flow-Fluoreszenz-Assay machen.
00:37:48.23 Wir haben ein System entwickelt, mit dem wir diese Reaktion biochemisch betrachten können
00:37:53.12 und analysieren Mutationen und Reaktionsgeschwindigkeit und so weiter.
00:37:58.13 Also hier haben wir wieder Rap-GTP, das mit RapGAP interagiert
00:38:03.20 Sie erhalten einen großen, schnellen Fluoreszenzanstieg, der auf die Komplexbildung zurückzuführen ist
00:38:07.28 und eine Abnahme aufgrund von GTP-Hydrolyse und Dissoziation des Produkts.
00:38:12.25 Und nach einer Sekunde ist alles wieder vorbei.
00:38:16.03 während die ganze Reaktion ohne RapGAP Stunden dauern würde.
00:38:19.25 Mit anderen Worten, wir haben wieder 10^5 Stimulation der Reaktion.
00:38:23.15 Das ist aber auch biochemisch und mechanistisch ein interessantes System,
00:38:29.09 ist, dass es eine Reihe von konservierten Argininen in RapGAPs gibt und offensichtlich
00:38:35.00 wir dachten, dass einer von ihnen daran beteiligt sein würde, dem System einen Argininfinger zur Verfügung zu stellen.
00:38:39.06 Tatsächlich haben wir sie alle zu Alanin mutiert
00:38:42.06 und keiner von ihnen hat einen dramatischen Einfluss auf die Aktivität, wie man hier sehen kann.
00:38:48.02 Die schlimmste Reaktion liegt also immer noch bei 0,5/Sekunde.
00:38:52.02 Mit anderen Worten, es gibt keinen dramatischen Effekt, wenn Sie eines der Arginine mutieren
00:38:55.29, was es unwahrscheinlich macht, dass ein Argininfinger an der Reaktion beteiligt ist.
00:39:00.23 Also die beiden Reste, intrinsisches Glutamin und der Argininfinger in trans
00:39:09.04 das ist Ras und Rho und andere machen die wichtige Katalyse nicht hier in diesem System.
00:39:17.05 Das heißt, die Chemie muss ganz anders sein.
00:39:21.15 Also haben wir uns noch einmal die FTIR des Systems angesehen und
00:39:26.07 es zeigt im Grunde die gleichen Merkmale, obwohl ihre Strukturen etwas anders sind.
00:39:31.16 Die grundlegenden Merkmale sind, dass es ein Pi-Zwischenprodukt gibt, dessen Abnahme die Geschwindigkeit begrenzt
00:39:37.23 für die Reaktion und obwohl sie chemisch etwas anders ist,
00:39:41.27 wie die verschiedenen Absorptionsspektren zeigen, ist es tatsächlich ein kinetisch wichtigstes Zwischenprodukt.
00:39:50.11 Aber was war interessant, und wir fanden in diesem speziellen Fall, im Fall RapGAP,
00:39:56.10 und wurde inzwischen auch in anderen Systemen gefunden,
00:39:58.27 ist, dass die GTPase-Reaktion reversibel ist,
00:40:01.29, was irgendwie verrückt klingt, weil es eine Abwärtsreaktion ist.
00:40:05.06 Wenn Sie GDP und Pi und das gesamte System nehmen, würden Sie niemals GTP erstellen.
00:40:09.22 Aber was passiert, wenn Sie die Reaktion analysieren, indem Sie
00:40:13.05 unter Verwendung von O18-Wasser anstelle von normalem Wasser, was durch diesen schwarzen Punkt angezeigt wird,
00:40:17.23 Sie würden erwarten, dass Sie bei der Reaktion Hydrolyse bekommen und dann GDP und Pi
00:40:23.27, bei dem ein Phosphat als O18-Sauerstoff gekennzeichnet ist, und ein Sauerstoff, der als O18-Sauerstoff gekennzeichnet ist.
00:40:30.12 Aber anstatt einen Pi mit einem O18-Sauerstoff zu bekommen, bekommt man einen Pi mit zwei O18-Sauerstoff,
00:40:36.24 mit drei O18-Sauerstoffen und mit vier O18-Sauerstoffen, wie hier durch eine Massenspektroskopie analysiert.
00:40:42.11 Sie sehen, wo Sie all diese vier Produkte bekommen, analysiert durch Massenspektroskopie.
00:40:49.27 Also, wie passiert das?
00:40:51.09 Es passiert also, weil du auf dem Protein dieses langlebige Zwischenprodukt hast
00:40:56.00 mit GDP und Pi, sitzen in der aktiven Site, bevor Sie in ein Produkt einsteigen, das auch kann
00:41:03.10 Führen Sie eine Rückreaktion durch, um GTP mit einem Sauerstoff jetzt auf dem Gammaphosphat herzustellen.
00:41:08.15 Reagiert es nun erneut mit O18-Wasser, wird ein zweites O18 in das Produkt eingearbeitet.
00:41:15.27 Und wenn es noch einmal passiert, ein drittes und ein viertes.
00:41:18.16 Obwohl die Gesamtreaktion bergab geht,
00:41:22.12 auf das Enzym bekommen Sie eine Rückreaktion.
00:41:24.15 Und du kannst es nie bekommen, wenn Pi veröffentlicht ist
00:41:28.21 weil dann die Aktivierungsenergie für die Rückreaktion zu hoch ist.
00:41:33.18 Also haben wir auch die Struktur von RapGAP gelöst.
00:41:37.06 Dies ist eine Zwei-Domain-Struktur, wobei eine Domain, die Sie jetzt links sehen,
00:41:44.07 ist die katalytische Domäne – die dunkelblaue Region im Homologiediagramm, das ich dir gezeigt habe
00:41:49.01 und das hellblaue Zeug ist die Dimerisierungsdomäne, die für die Katalyse nicht wichtig ist
00:41:53.08 aber ist da, um das Protein zu dimerisieren
00:41:56.18 aus irgendeinem Grund, den wir wirklich nicht kennen.
00:42:00.13 Bei der Analyse der katalytischen Domäne fragen Sie sich natürlich:
00:42:03.10 Was sind die konservierten Reste und welche davon spielen eine wichtige Rolle in der Katalyse?
00:42:08.04 Die violette Helix, die ich hier angedeutet habe, ist die am höchsten konservierte Region.
00:42:12.00 Es ist also wahrscheinlich, dass Reste dieser Helix irgendwie an der Katalyse beteiligt sind.
00:42:18.05 Und tatsächlich kann man viele davon mutieren und man sieht gewisse Effekte.
00:42:21.12 Aber der dramatischste Effekt tritt ein, wenn du mutierst
00:42:25.01 N290, also ein Asparagin, sitzt auf dieser katalytischen Helix.
00:42:29.08 Wenn Sie das mutieren, erhalten Sie das folgende Ergebnis.
00:42:33.00 Wir nennen es übrigens den Asn-Daumen, um den Arginin-Finger zu verändern.
00:42:39.03 Es ist also ein Asn-Daumen und Sie werden gleich sehen, warum wir ihn Asn-Daumen nennen.
00:42:44.26 Wenn Sie sich also zunächst die Mutation ansehen, von der ich gesprochen habe,
00:42:48.27 Wenn Sie also die N290A-Mutation nehmen und die Reaktion analysieren, indem Sie erneut
00:42:55.09 dieser fluoreszierende Stopped-Flow-Assay, sehen Sie, dass Wildtyp einen Komplex bildet
00:43:00.25 und zerfällt dann in Produkt,
00:43:02.26 die Mutation macht hier einen Komplex, dieser ist übrigens noch enger als im Wildtyp-Fall,
00:43:09.15 aber es gibt absolut keine Hydrolyse.
00:43:11.07 Die Reaktion geht weiter und weiter. Es bleibt dort oben und geht nie unter.
00:43:14.21 Wenn Sie dagegen eine Mutation wie H287 zu Alanin vornehmen,
00:43:20.22 Sie sehen, dass es keine Komplexbildung gibt, weil die Fluoreszenz hier unten bleibt.
00:43:24.04 Diese Reaktion ist also tot, weil sie nicht binden kann
00:43:27.08 aber die rote Reaktion ist in Ordnung, weil wir denken, dass dies der wichtige katalytische Rückstand ist.
00:43:32.12 Wir denken, dass wir nur die Biochemie betrachten.
00:43:35.15 Um zu wissen, was es tut, müssen wir natürlich wieder die Struktur lösen,
00:43:38.26 was wir getan haben. Dies ist der Rap-RapGAP-Komplex.
00:43:43.15 Und du siehst hier das rote und das grüne Zeug ist RapGAP und das blaue Zeug ist Rap.
00:43:49.20 Und Sie sehen GTP. Aber was man auch sieht, wenn man es im Detail betrachtet,
00:43:54.02 ist, dass es wieder etwas gibt, das von der roten katalytischen Domäne von RapGAP
00:43:59.06 in das aktive Zentrum und das ist ein Asparagin.
00:44:01.17 Offensichtlich ist es der Asparagin, über den ich gesprochen habe.
00:44:04.20, die in die aktive Seite von Rap stößt. Deshalb nennen wir es den Asn-Thumb
00:44:08.28 in Bezug auf den Arginin-Finger in den anderen Systemen.
00:44:12.27 Und wenn man sich genau anschaut, was an der aktiven Stelle passiert,
00:44:17.02 und wenn Sie es mit drei anderen Strukturen des Ras-Proteins und ihren verwandten GAPs vergleichen,
00:44:26.19 Ran und RanGAP, Ras und RasGAP und Rho und RhoGAP,
00:44:31.18 wobei Rho und RhoGAP von Rittinger et al. und die anderen Strukturen sind von uns,
00:44:35.14 Sie sehen, dass die anderen drei, diese drei Strukturen hier,
00:44:40.12 haben ein Glutamin, das zum katalytischen Wasser zeigt,
00:44:44.29 welches das hier angegebene Gammaphosphat angreift,
00:44:47.09 das ist das Aluminiumfluorid,
00:44:50.01 ein Übergangszustand, der das übertragene Gammaphosphat nachahmt.
00:44:54.08 Und die rote Struktur hier hat statt des Glutamins 61 ein Threonin
00:45:00.19, die vom aktiven Zentrum wegzeigt, hat nichts mit Katalyse zu tun.
00:45:04.01 Stattdessen sieht man, dass die violette Helix hier dieses Asparagin einfügt
00:45:09.19 in das aktive Zentrum genau dort, wo die anderen das Glutamin haben.
00:45:14.23 Also die Unterschiede hier: Die drei anderen Strukturen haben ein Glutamin, das in cis
00:45:19.29 und Rap und RapGAP haben ein Asparagin in Trans
00:45:23.17, die das gleiche tut, nämlich das katalytische Wasser zu stabilisieren.
00:45:30.04 Und wenn man sich die Oberfläche des Proteins anschaut,
00:45:34.01 Dies ist die Rap-Oberfläche, die als Oberflächendarstellung angezeigt wird,
00:45:39.07 und dazu kommt nur noch die Helix von RapGAP.
00:45:43.09 Es sitzt auf der Oberfläche und fügt dieses Asparagin in das aktive Zentrum ein.
00:45:48.13 Das Gammaphosphat ragt also aus diesem Loch heraus.
00:45:50.08 Und alles, was RapGAP wirklich tut, ist, dass es dieses Asn auf der Helix hat, es bringt es in die aktive Seite,
00:45:57.17 und das allein scheint zumindest im chemischen Sinne
00:46:03.03 verantwortlich für die Stimulierung der GTPase-Reaktion um das 10^5-fache
00:46:07.10, denn wenn du das Ding mutierst, bindet es immer noch gut, aber es gibt absolut keine Hydrolyse.
00:46:11.22 Das lässt uns noch einmal über die Zukunft der Entwicklung von Anti-Ras-Medikamenten nachdenken.
00:46:18.02 Wenn man nur einen solchen Rest in das aktive Zentrum einfügt,
00:46:22.11 aus chemischer Sicht sollte es machbar sein,
00:46:24.24 aber wir müssen natürlich Moleküle entwickeln, die richtig binden
00:46:28.12 auf die Oberfläche, was nicht so einfach ist und wir denken immer noch, dass wir es schaffen könnten.
00:46:35.15 Dies ist noch einmal darauf zurückzukommen.
00:46:38.00 Als Ansatz für das Ziel von Anti-Krebs-Medikamenten
00:46:42.03 suchen wir nach Molekülen, die die Hydrolyse von onkogenem Ras induzieren.
00:46:46.20 Und von dem, was wir bei RapGAP beobachtet haben, denken wir, dass wir hoffen, dass es möglich ist.
00:46:54.26 Und der dritte Grund für die Arbeit mit dem Rap-RapGAP-System ist das
00:47:03.05 es hängt mit einer Krankheit namens Tuberöse Sklerose zusammen, einem gutartigen Tumor.
00:47:06.19 Menschen kommen mit Hamartomen in vielen Organen ins Haus.
00:47:09.16 Aber das offensichtlichste Merkmal und woher der Name kommt, ist das
00:47:14.07 Menschen haben, wenn sie eine NMR des Gehirns machen, sie haben
00:47:16.29 diese sklerotischen, knollenartigen Dinge im Gehirn, die man im NMR des Gehirns sieht.
00:47:24.17 Die Leute haben Mutationen in zwei Proteinen namens Tuberin und Hamartin.
00:47:30.22 Und Tuberin hat, wie ich dir zuvor gezeigt habe, eine hohe Homologie
00:47:34.22 zu RapGAP in dieser dunkelblauen Region, das bedeutet die katalytische Region.
00:47:39.07 Und wenn Sie jetzt zum Beispiel schauen, wo Patientenmutationen bei Tuberöse Sklerose,
00:47:44.23 in Tuberin, wo sie vorkommen.
00:47:47.00 Und dies ist ein Alignment verschiedener RapGAP-Sequenzen und sie stimmen mit der Tuberin-Sequenz überein.
00:47:53.27 Sie sehen, dass die am höchsten konservierte Region wieder
00:47:57.09 dieses Ding hier (das rote Zeug), wo du die katalytische Helix hast.
00:48:01.08 Und eine der Mutationen bei einem Patienten mit Tuberöser Sklerose
00:48:04.22 (und viele haben tatsächlich diese Mutation) ist eingeschaltet
00:48:07.06 dieses Asparagin, von dem wir wissen, dass es der wichtige katalytische Rückstand ist.
00:48:11.08 Dies ist also eine andere Version von dem, was wir zuvor gesehen haben
00:48:14.21 Bei der Krankheit Tuberöse Sklerose ist ein wichtiger Katalysatorrest mutiert.
00:48:21.19 Also lass mich dir in den letzten fünf Minuten einfach eine andere Krankheit geben,
00:48:25.22 nur um sicherzustellen, dass es nicht nur das Ras- und Rap-System ist,
00:48:28.28, dass es viele Krankheiten gibt, bei denen die Unfähigkeit, GTP zu hydrolysieren, zu sehr vielen verschiedenen Krankheiten führt.
00:48:35.07 Das ist also Retinitis pigmentosa.
00:48:38.28 Menschen haben Pigmente auf der Netzhaut. Daher kommt der Name.
00:48:42.28 Und sie verlieren das Sehvermögen, sie verlieren das periphere Sehvermögen.
00:48:47.00 Dies ist also eine normale Person, die dieses Gebäude sieht und dies ist ein Patient mit der Krankheit
00:48:52.15, der immer mehr seine periphere Sicht verliert.
00:48:56.00 Und verliert dann das volle Sehvermögen, nachdem sich die Krankheit vollständig entwickelt hat.
00:49:01.19 Und es gibt eine Reihe von Genen, die bei Retinitis pigmentosa mutiert sind
00:49:06.12 die heißen RP12x und was auch immer.
00:49:09.28 Und es gibt ein Formular namens RP2.
00:49:13.03 Es ist eine X-chromosomale Krankheit, bei der Menschen Mutationen in vielen Punktmutationen in einem Protein haben.
00:49:21.16 Wir haben die Struktur des Proteins bestimmt, das so aussieht.
00:49:24.24 Dies ist eine Beta-Helix-Domäne und dies ist eine andere Domäne.
00:49:27.20 Und Sie sehen viele der Mutationen, die Sie dann analysieren.
00:49:31.06 Sie finden heraus, dass die meisten Mutationen
00:49:37.16 bestimmen oder vermasseln wahrscheinlich die Struktur, weil sie drinnen sind
00:49:41.24 der hydrophobe Kern des Proteins und das könnte man sich vorstellen
00:49:45.04 sie tun nichts an der Katalyse oder der Interaktion dieses Proteins.
00:49:50.19 Aber es gibt ein paar Mutationen, die hier angegeben sind, zum Beispiel,
00:49:54.01 E138G oder R118 zu H, K oder C. Diese Rückstände zeigen also in Lösung.
00:50:03.27 Man sollte also meinen, dass sie etwas Wichtiges für die Interaktion des Proteins tun
00:50:08.20 oder in etwas - dass sie an dem beteiligt sind, was diese Proteine ​​normalerweise tun.
00:50:14.20 Also haben wir wieder die Struktur des Komplexes zwischen Arl3 gelöst.
00:50:19.13 Wir wussten also, dass RP2 mit Arl3 interagiert, einem anderen Ras-ähnlichen Protein.
00:50:24.26 Es heißt Arl, weil es ein Arf-verwandtes Protein ist.
00:50:28.04 Und wir haben die Struktur davon gelöst. Sie sehen also, dass dieses Zeug hier das RP2 in Lila ist.
00:50:37.25 Und Sie sehen in Grün Arl3 in einer GTP-gebundenen Form.
00:50:41.25 Und was du dann siehst, wenn du nochmal ganz genau hinsiehst,
00:50:44.26 Sie sehen, dass hier ein Rest von RP2 vorhanden ist, der in das aktive Zentrum der Arl weist.
00:50:52.10 Man wusste also nicht, was RP2 macht, aber als wir die Struktur gelöst haben,
00:50:55.17 wir konnten sofort sehen, dass es nach einer Lücke riecht, weil
00:50:59.18 Es setzt einen Arginin-Finger in das aktive Zentrum des anderen Proteins.
00:51:05.08 Und wenn Sie sich die aktive Site im Detail ansehen, sehen Sie, dass dies wieder das BIP ist.
00:51:10.28 das ist Aluminiumfluorid, das ist Glutamin von Arl3,
00:51:15.14 und dies sind drei Reste von RP2--Q116, R118, E138.
00:51:21.26 Und offensichtlich sind all diese Rückstände bei Retinitis pigmentosa mutiert.
00:51:27.15 Und Sie können sehen, dass das Arginin dasselbe tut, was Sie jetzt schon oft gesehen haben.
00:51:32.22 Und es wird durch diese anderen Reste und alle drei Reste stabilisiert, wenn sie mutiert sind,
00:51:38.10 bringt die GAP-Aktivität von RP2 durcheinander.
00:51:41.26 Hier hat uns die Struktur also wirklich gesagt, was das Protein macht.
00:51:44.19 Es gab keine Ahnung von der Funktion und die Struktur sagte uns genau, dass dies eine Lücke für Arl3 ist.
00:51:53.17 Lassen Sie mich nun zu den Schlussfolgerungen aus dem kommen, was ich Ihnen erzählt habe.
00:52:00.12 Zuallererst vielleicht Schlussfolgerungen über Ras selbst, weil es das wichtigste Onkogen ist.
00:52:06.14 Es ist ein unvollständiges Enzym, es kann GTP nicht sehr schnell hydrolysieren.
00:52:11.09 Aber dann kommt RasGAP, das den Schalter II und das Glutamin 61 stabilisiert,
00:52:16.10, welches das wichtige strukturelle katalytische Element ist und auch einen Argininfinger in das aktive Zentrum liefert.
00:52:23.04 Sie haben eine Gln1-Mutation – jede Mutation von Glutamin 61 ist ein Onkogen
00:52:28.29 weil es dann den katalytischen Rückstand (das System) verfehlt.
00:52:33.00 Sie haben Glycin-Mutanten, die sterisch beeinträchtigt sind, um die GTP-Hydrolyse durchzuführen.
00:52:38.21 Es gibt keine Möglichkeit, dass der Arginin-Finger
00:52:42.06 kann bei einer Mutation von Glycin 12 in die richtige Position gehen.
00:52:46.04 Ich habe Ihnen auch gezeigt, dass es ein stark gebundenes GDP-Pi-Zwischenprodukt gibt.
00:52:50.02 Und diese Pi-Version im System wird ratenbegrenzend.
00:52:54.28 Ohne GAP hingegen ist die chemische Spaltungsreaktion der geschwindigkeitsbestimmende Schritt.
00:53:00.23 Die zweite Schlussfolgerung – allgemeiner zur Ras-Superfamilie.
00:53:05.01 Ras-Proteine ​​sind alle unvollständige Enzyme.
00:53:07.20 Sie alle hydrolysieren GTP sehr, sehr langsam.
00:53:09.27 Sie haben verwandte GAPs.
00:53:12.02 Also jedes der Unterfamilienproteine ​​und manchmal sogar Proteine ​​innerhalb der Unterfamilie,
00:53:16.24 haben eine spezifische verwandte GAP, die für die schnelle GTP-Hydrolyse, für die Katalyse, benötigt wird.
00:53:22.17 Einige GAPs liefern einen Argininfinger
00:53:25.02 und ich habe dir jetzt viele verschiedene Beispiele gezeigt - Ras und Ran und Rho.
00:53:30.15 RabGAPs liefern ein Agrinin und ein Gln.
00:53:34.23 Einige GAPs bieten einen Asn-Daumen.
00:53:37.00 Ich habe dir das Beispiel von RapGAP gezeigt und Tuberin macht wahrscheinlich dasselbe.
00:53:41.03 Pi-Release ist sehr oft geschwindigkeitsbegrenzend.
00:53:44.10 Und was noch wichtiger ist, und das ist meine Botschaft für das ganze Gespräch,
00:53:47.19 ist, dass die gestörte GTPase-Reaktion an einer Reihe von Krankheiten beteiligt ist:
00:53:53.24 Krebs, Neurofibromatose, tuberöse Sklerose,
00:53:58.03 Retinitis pigmentosa und viele mehr, über die ich noch nicht gesprochen habe.
00:54:01.07 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit. Aber ich würde.
00:54:03.00 Bevor ich aufhöre, möchte ich zuerst den Leuten danken, die die Arbeit gemacht haben.
00:54:07.18 Die älteste Geschichte, von der ich dir erzählt habe, ist die von Ras und RasGAP.
00:54:11.22, die von drei Postdocs im Labor durchgeführt wurde, Reza Ahmadian, Klaus Scheffzek und Robert Mittal.
00:54:17.23 Die RapGAP-Geschichte wurde von den Studenten Oli Daumke, Astrid Kramer,
00:54:23.14 Partha Chakrabarti und Andrea Scrima.
00:54:26.18 Und die RP2-Geschichte stammt von Stefan Veltel und Karin Kuhnel.
00:54:32.04 Und viele der Filme, die ich dir gezeigt habe, stammen von Ingrid Vetter
00:54:36.20, der auch mein Kristallographie-Labor leitet.
00:54:38.15 Und sie war bei fast allen Projekten sehr, sehr hilfreich.
00:54:42.13 Und das haben wir. auf der FTIR haben wir Kooperationen mit
00:54:46.03 unsere Kollegen von der Uni Bochum Klaus Gerwert und Carsten Kotting.
00:54:51.03 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.
00:54:52.10

  • Teil 1: GTP-bindende Proteine ​​als molekulare Schalter

Phosphorylierung auf Substratebene

Der Prozess der Phosphorylierung auf Substratebene ist konzeptionell einfach. In der Praxis ist es jedoch komplex, weil bestimmte Personen chemische Reaktionen muss sein katalysiert von einer bestimmten Person Enzyme produzieren ATP.

Abbildungslegende: Bei Substrat-Level-Phosphorylierung eine spezifische Enzym, anders als die ATP-Synthase beteiligt an Chemiosmose, katalysiert das Phosphorylierung von ADP generieren ATP. Es gibt zwei Enzyme verknüpft mit Glykolyse wo solche Reaktionen stattfinden &ndash Phosphoglyceratkinase und Pyruvatkinase &ndash und eine, die mit dem verbunden ist Krebs Zyklus, Succinyl-Coenzym-A-Synthase. Bei letzterem ist es GTP eher, als ATP das wird sofort produziert, obwohl die GTP wird dann umgewandelt in ATP.

Beispiele für die Phosphorylierung auf Substratebene sind die Entfernung anorganischer Phosphate aus 1,3-Biphosphoglycerat oder Phosphoenolpyruvat Formen 3-Phosphoglycerat oder Pyruvat, bzw. sowie ATP. Diese Phosphorylierungsschritte auf Substratebene sind in Glykolyse, und eine Phosphorylierung auf Substratebene wird auch in der Der Zitronensäurezyklus von Kreb.

Die Phosphorylierung auf Substratebene ist einfach eine enzymatisch katalysierte chemische Reaktion, wenn auch eine , die ATP liefert . Im Gegensatz dazu ist Phosphorylierung das geschieht über chemiosmotische Prozesse wie das, was beschrieben wird als oxidative Phosphorylierung. Letzteres ist ein Prozess, bei dem ATP Produktion ist viel individueller molekular Spieler, darunter ein Elektronentransportkette, die Generation von a Protonenbewegungskraft (was eine intakte erfordert lipiddoppelschicht und verbunden zellular Kompartimentierung), und ein Komplex Enzym bekannt als ATP-Synthase.


Inhalt

Tubulin- und Mikrotubuli-vermittelte Prozesse, wie die Zellbewegung, wurden von frühen Mikroskopikern wie Leeuwenhoek (1677) beobachtet. Die faserige Natur von Flagellen und anderen Strukturen wurde jedoch zwei Jahrhunderte später mit verbesserten Lichtmikroskopen entdeckt und im 20. Jahrhundert mit dem Elektronenmikroskop und biochemischen Studien bestätigt. [8]

Mikrotubulus-In-vitro-Assays für Motorproteine ​​wie Dynein und Kinesin werden erforscht, indem ein Mikrotubulus fluoreszenzmarkiert wird und entweder der Mikrotubulus oder die Motorproteine ​​auf einem Objektträger fixiert werden und dann der Objektträger mit videounterstützter Mikroskopie visualisiert wird, um die Reise der Mikrotubulus-Motorproteine ​​aufzuzeichnen. Dies ermöglicht die Bewegung der Motorproteine ​​entlang des Mikrotubulus oder die Bewegung des Mikrotubulus über die Motorproteine. [9] Folglich können einige Mikrotubuli-Prozesse durch Kymographen bestimmt werden. [10]

Bei Eukaryoten sind Mikrotubuli lange Hohlzylinder aus polymerisierten α- und β-Tubulin-Dimeren. [12] Der Innenraum der hohlen Mikrotubuli-Zylinder wird als Lumen bezeichnet. Die α- und β-Tubulin-Untereinheiten sind auf Aminosäureebene identisch und haben jeweils ein Molekulargewicht von etwa 50 kDa. [13]

Diese α/β-Tubulin-Dimere polymerisieren Ende-an-Ende zu linearen Protofilamenten, die sich seitlich zu einem einzigen Mikrotubulus assoziieren, der dann durch Zugabe weiterer α/β-Tubulin-Dimere verlängert werden kann. Typischerweise werden Mikrotubuli durch die parallele Assoziation von dreizehn Protofilamenten gebildet, obwohl Mikrotubuli, die aus weniger oder mehr Protofilamenten bestehen, bei verschiedenen Arten beobachtet wurden [14] sowie in vitro. [15]

Mikrotubuli haben eine ausgeprägte Polarität, die für ihre biologische Funktion entscheidend ist. Tubulin polymerisiert Ende an Ende, wobei die &bgr;-Untereinheiten eines Tubulin-Dimers die &agr;-Untereinheiten des nächsten Dimers kontaktieren. Daher werden in einem Protofilament an einem Ende die α-Untereinheiten freigelegt, während am anderen Ende die β-Untereinheiten freigelegt werden. Diese Enden werden als (–)- bzw. (+)-Enden bezeichnet. Die Protofilamente bündeln sich parallel mit gleicher Polarität, so dass in einem Mikrotubulus ein Ende, das (+)-Ende, nur β-Untereinheiten exponiert sind, während das andere Ende, das (−)-Ende, nur α . hat -Untereinheiten ausgesetzt. Während die Mikrotubuli-Elongation sowohl am (+)- als auch am (–)-Ende auftreten kann, ist sie am (+)-Ende deutlich schneller. [16]

Die seitliche Assoziation der Protofilamente erzeugt eine pseudohelikale Struktur, wobei eine Windung der Helix 13 Tubulindimere enthält, von denen jedes aus einem anderen Protofilament stammt. In der gebräuchlichsten "13-3"-Architektur interagiert das 13. Tubulin-Dimer mit dem nächsten Tubulin-Dimer mit einem vertikalen Versatz von 3 Tubulin-Monomeren aufgrund der Helicität der Kurve. Es gibt andere alternative Architekturen wie 11-3, 12-3, 14-3, 15-4 oder 16-4, die viel seltener erkannt wurden. [17] Mikrotubuli können sich auch in andere Formen wie helikale Filamente verwandeln, die in Protistenorganismen wie Foraminiferen beobachtet werden. [18] Es gibt zwei verschiedene Arten von Wechselwirkungen, die zwischen den Untereinheiten der lateralen Protofilamente innerhalb des Mikrotubulus auftreten können, die als A-Typ- und B-Typ-Gitter bezeichnet werden. Im A-Typ-Gitter treten die seitlichen Assoziationen von Protofilamenten zwischen benachbarten α- und β-Tubulin-Untereinheiten auf (d. h. eine α-Tubulin-Untereinheit aus einem Protofilament interagiert mit einer β-Tubulin-Untereinheit aus einem benachbarten Protofilament). Im B-Typ-Gitter wechselwirken die α- und β-Tubulin-Untereinheiten von einem Protofilament mit den α- und β-Tubulin-Untereinheiten von einem benachbarten Protofilament. Experimentelle Studien haben gezeigt, dass das B-Typ-Gitter die primäre Anordnung innerhalb von Mikrotubuli ist. In den meisten Mikrotubuli gibt es jedoch eine Naht, in der Tubulin-Untereinheiten α-β interagieren. [19]

Einige Arten von Prosthecobacter enthalten auch Mikrotubuli. Die Struktur dieser bakteriellen Mikrotubuli ähnelt der von eukaryontischen Mikrotubuli und besteht aus einer hohlen Röhre von Protofilamenten, die aus Heterodimeren von Bakterientubulin A (BtubA) und Bakterientubulin B (BtubB) zusammengesetzt sind. Sowohl BtubA als auch BtubB teilen Merkmale von sowohl α- als auch β-Tubulin. Im Gegensatz zu eukaryotischen Mikrotubuli benötigen bakterielle Mikrotubuli keine Chaperone, um sich zu falten. [20] Im Gegensatz zu den 13 Protofilamenten eukaryontischer Mikrotubuli bestehen bakterielle Mikrotubuli nur aus fünf. [21]

Mikrotubuli sind Teil des Zytoskeletts, eines strukturellen Netzwerks im Zytoplasma der Zelle. Zu den Aufgaben des Mikrotubulus-Zytoskeletts gehören mechanische Unterstützung, Organisation des Zytoplasmas, Transport, Motilität und Chromosomentrennung. In sich entwickelnden Neuronen werden Mikrotubuli als Neurotubuli bezeichnet [22] und sie können die Dynamik von Aktin, einem weiteren Bestandteil des Zytoskeletts, modulieren. [23] Ein Mikrotubulus kann wachsen und schrumpfen, um Kraft zu erzeugen, und es gibt Motorproteine, die es ermöglichen, Organellen und andere zelluläre Komponenten entlang eines Mikrotubulus zu transportieren. Diese Kombination von Rollen macht Mikrotubuli für die Organisation und Bewegung intrazellulärer Bestandteile wichtig.

Die Organisation der Mikrotubuli in der Zelle ist zelltypspezifisch. In Epithelien sind die Minus-Enden des Mikrotubulus-Polymers nahe der Stelle des Zell-Zell-Kontakts verankert und entlang der apikal-basalen Achse organisiert. Nach der Nukleation werden die Minus-Enden freigesetzt und dann durch Faktoren wie Ninein und PLEKHA7 in der Peripherie wieder verankert. [24] Auf diese Weise können sie den Transport von Proteinen, Vesikel und Organellen entlang der apikal-basalen Achse der Zelle erleichtern. In Fibroblasten und anderen mesenchymalen Zelltypen sind Mikrotubuli am Zentrosom verankert und strahlen mit ihren Plus-Enden nach außen in Richtung der Zellperipherie (wie in der ersten Abbildung gezeigt). In diesen Zellen spielen die Mikrotubuli eine wichtige Rolle bei der Zellmigration. Darüber hinaus wird die Polarität der Mikrotubuli von Motorproteinen beeinflusst, die viele Komponenten der Zelle organisieren, einschließlich des endoplasmatischen Retikulums und des Golgi-Apparats.

Nukleation Bearbeiten

Nukleation ist das Ereignis, das die Bildung von Mikrotubuli aus dem Tubulin-Dimer initiiert. Mikrotubuli werden typischerweise durch Organellen, die Mikrotubuli-organisierende Zentren (MTOCs) genannt werden, nukleiert und organisiert. Das MTOC enthält eine andere Art von Tubulin, -Tubulin, das sich von den α- und β-Untereinheiten der Mikrotubuli selbst unterscheidet. Das γ-Tubulin verbindet sich mit mehreren anderen assoziierten Proteinen, um eine Sicherungsscheiben-ähnliche Struktur zu bilden, die als "γ-Tubulin-Ring-Komplex" (γ-TuRC) bekannt ist. Dieser Komplex fungiert als Matrize für α/β-Tubulin-Dimere, um die Polymerisation zu beginnen. [25]

Das Zentrosom ist das primäre MTOC der meisten Zelltypen. Mikrotubuli können jedoch auch von anderen Stellen aus nukleiert werden. Zilien und Geißeln haben beispielsweise MTOCs an ihrer Basis, die als Basalkörperchen bezeichnet werden. Darüber hinaus legen Arbeiten der Kaverina-Gruppe in Vanderbilt und anderen nahe, dass der Golgi-Apparat als wichtige Plattform für die Keimbildung von Mikrotubuli dienen kann. [26] Da die Nukleation aus dem Zentrosom von Natur aus symmetrisch ist, kann die Golgi-assoziierte Mikrotubuli-Nukleation der Zelle ermöglichen, eine Asymmetrie im Mikrotubulus-Netzwerk aufzubauen. In neueren Studien identifizierte die Vale-Gruppe an der UCSF den Proteinkomplex Augmin als kritischen Faktor für die zentrosomabhängige, spindelbasierte Mikrotubuli-Erzeugung. Es hat sich gezeigt, dass es mit γ-TuRC interagiert und die Mikrotubulusdichte um den Ursprung der mitotischen Spindel erhöht. [27]

Einige Zelltypen, wie Pflanzenzellen, enthalten keine gut definierten MTOCs. In diesen Zellen werden Mikrotubuli von diskreten Stellen im Zytoplasma nukleiert. Andere Zelltypen, wie Trypanosomatiden-Parasiten, haben ein MTOC, das jedoch dauerhaft an der Basis eines Flagellums gefunden wird. Hier erfolgt die Nukleation von Mikrotubuli für strukturelle Rollen und für die Erzeugung der mitotischen Spindel nicht von einem kanonischen zentriolenähnlichen MTOC.

Polymerisation Bearbeiten

Nach dem anfänglichen Keimbildungsereignis müssen dem wachsenden Polymer Tubulinmonomere zugesetzt werden. Der Vorgang des Hinzufügens oder Entfernens von Monomeren hängt von der Konzentration der αβ-Tubulin-Dimere in Lösung in Bezug auf die kritische Konzentration ab, die die stationäre Konzentration der Dimere ist, bei der am Ende des Mikrotubulus keine Netto- oder Demontage mehr stattfindet . Wenn die Dimerkonzentration höher als die kritische Konzentration ist, wird der Mikrotubulus polymerisieren und wachsen. Wenn die Konzentration unter der kritischen Konzentration liegt, nimmt die Länge des Mikrotubulus ab. [28]

Dynamische Instabilität Bearbeiten

Dynamische Instabilität bezieht sich auf die Koexistenz von Montage und Demontage an den Enden eines Mikrotubulus. Der Mikrotubulus kann in dieser Region dynamisch zwischen Wachstums- und Schrumpfphase wechseln. [29] Tubulindimere können zwei GTP-Moleküle binden, von denen eines nach dem Zusammenbau hydrolysiert werden kann. Während der Polymerisation befinden sich die Tubulindimere im GTP-gebundenen Zustand. [12] Das an α-Tubulin gebundene GTP ist stabil und spielt in diesem gebundenen Zustand eine strukturelle Funktion. Das an β-Tubulin gebundene GTP kann jedoch kurz nach dem Zusammenbau zu GDP hydrolysiert werden. Die Assemblierungseigenschaften von GDP-Tubulin unterscheiden sich von denen von GTP-Tubulin, da GDP-Tubulin anfälliger für Depolymerisation ist. [30] Eine GDP-gebundene Tubulin-Untereinheit an der Spitze eines Mikrotubulus neigt dazu, abzufallen, obwohl ein GDP-gebundenes Tubulin in der Mitte eines Mikrotubulus nicht spontan aus dem Polymer herausspringen kann. Da Tubulin im GTP-gebundenen Zustand an das Ende des Mikrotubulus addiert, wird vorgeschlagen, dass an der Spitze des Mikrotubulus eine Kappe aus GTP-gebundenem Tubulin existiert, die es vor dem Zerlegen schützt. Wenn die Hydrolyse die Spitze des Mikrotubulus einholt, beginnt eine schnelle Depolymerisation und Schrumpfung. Dieser Wechsel von Wachstum zu Schrumpfung wird als Katastrophe bezeichnet. GTP-gebundenes Tubulin kann wieder an die Spitze des Mikrotubulus angelagert werden, wodurch eine neue Kappe entsteht und der Mikrotubulus vor Schrumpfung geschützt wird. Dies wird als "Rettung" bezeichnet. [31]

Modell "Suchen und Erfassen" Bearbeiten

1986 schlugen Marc Kirschner und Tim Mitchison vor, dass Mikrotubuli ihre dynamischen Eigenschaften des Wachstums und der Schrumpfung an ihren positiven Enden nutzen, um den dreidimensionalen Raum der Zelle zu untersuchen. Plus-Enden, die auf Kinetochore oder Polaritätsorte treffen, werden eingefangen und zeigen kein Wachstum oder Schrumpfen mehr. Im Gegensatz zu normalen dynamischen Mikrotubuli, die eine Halbwertszeit von 5–10 Minuten haben, können die eingefangenen Mikrotubuli Stunden dauern. Diese Idee ist allgemein als "Suchen und Erfassen"-Modell bekannt. [32] Tatsächlich hat die Arbeit seither diese Idee weitgehend bestätigt. Am Kinetochor wurde gezeigt, dass eine Vielzahl von Komplexen Mikrotubuli (+)-Enden einfangen. [33] Darüber hinaus wurde auch eine (+)-Endkappen-Aktivität für Interphase-Mikrotubuli beschrieben.[34] Diese spätere Aktivität wird durch Formine, [35] das adenomatöse Polyposis-coli-Protein und EB1, [36] ein Protein, das entlang der wachsenden Plus-Enden von Mikrotubuli verläuft, vermittelt.

Posttranslationale Modifikationen Bearbeiten

Obwohl die meisten Mikrotubuli eine Halbwertszeit von 5–10 Minuten haben, können bestimmte Mikrotubuli über Stunden stabil bleiben. [34] Diese stabilisierten Mikrotubuli akkumulieren posttranslationale Modifikationen an ihren Tubulin-Untereinheiten durch die Wirkung von Mikrotubuli-gebundenen Enzymen. [37] [38] Sobald die Mikrotubuli jedoch depolymerisiert sind, werden die meisten dieser Modifikationen durch lösliche Enzyme schnell rückgängig gemacht. Da die meisten Modifikationsreaktionen langsam sind, während ihre Rückreaktionen schnell sind, wird modifiziertes Tubulin nur auf langlebigen stabilen Mikrotubuli nachgewiesen. Die meisten dieser Modifikationen treten an der C-terminalen Region von Alpha-Tubulin auf. Diese Region, die reich an negativ geladenem Glutamat ist, bildet relativ unstrukturierte Schwänze, die aus dem Mikrotubulus herausragen und Kontakte mit Motoren bilden. Daher wird angenommen, dass Tubulinmodifikationen die Interaktion von Motoren mit dem Mikrotubulus regulieren. Da diese stabilen modifizierten Mikrotubuli typischerweise auf den Ort der Zellpolarität in Interphase-Zellen ausgerichtet sind, bietet diese Untergruppe der modifizierten Mikrotubuli einen spezialisierten Weg, der dabei hilft, Vesikel in diese polarisierten Zonen zu transportieren. Zu diesen Modifikationen gehören:

    : die Entfernung des C-terminalen Tyrosins aus Alpha-Tubulin. Diese Reaktion legt ein Glutamat am neuen C-Terminus frei. Daher werden Mikrotubuli, die diese Modifikation akkumulieren, oft als Glu-Mikrotubuli bezeichnet. Obwohl die Tubulin-Carboxypeptidase noch identifiziert werden muss, ist die Tubulin-Tyrosin-Ligase (TTL) bekannt. [39]
  • Delta2: die Entfernung der letzten beiden Reste vom C-Terminus von Alpha-Tubulin. [40] Im Gegensatz zur Detyrosierung gilt diese Reaktion als irreversibel und wurde nur in Neuronen dokumentiert. : die Addition einer Acetylgruppe an Lysin 40 von Alpha-Tubulin. Diese Modifikation erfolgt an einem Lysin, das nur vom Inneren des Mikrotubulus zugänglich ist, und es bleibt unklar, wie Enzyme auf den Lysinrest zugreifen. Die Natur der Tubulin-Acetyltransferase bleibt umstritten, aber es wurde festgestellt, dass bei Säugern die Haupt-Acetyltransferase ATAT1 ist. [41] Es ist jedoch bekannt, dass die Rückreaktion von HDAC6 katalysiert wird. [42] : die Addition eines Glutamat-Polymers (typischerweise 4-6 Reste lang [43] ) an die Gamma-Carboxyl-Gruppe von einem von fünf Glutamaten, die nahe dem Ende von Alpha-Tubulin gefunden werden. Mit TTL verwandte Enzyme fügen das anfänglich verzweigte Glutamat (TTL4,5 und 7) hinzu, während andere Enzyme, die zur gleichen Familie gehören, die Polyglutamatkette verlängern (TTL6,11 und 13). [38] : die Addition eines Glycin-Polymers (2-10 Reste lang) an die Gamma-Carboxylgruppe eines von fünf Glutamaten, die nahe dem Ende von Beta-Tubulin gefunden werden. TTL3 und 8 fügen das anfängliche Verzweigungsglycin hinzu, während TTL10 die Polyglycinkette verlängert. [38]

Tubulinbindende Medikamente und chemische Wirkungen Bearbeiten

Eine Vielzahl von Medikamenten ist in der Lage, an Tubulin zu binden und dessen Aufbaueigenschaften zu verändern. Diese Medikamente können eine Wirkung bei intrazellulären Konzentrationen haben, die viel niedriger sind als die von Tubulin. Diese Störung der Mikrotubuli-Dynamik kann den Zellzyklus einer Zelle stoppen und zum programmierten Zelltod oder zur Apoptose führen. Es gibt jedoch Daten, die darauf hindeuten, dass die Interferenz der Mikrotubuli-Dynamik nicht ausreicht, um die Zellen in der Mitose zu blockieren. [44] Diese Studien haben gezeigt, dass die Unterdrückung der Dynamik bei Konzentrationen auftritt, die niedriger sind als die, die zur Blockierung der Mitose erforderlich sind. Es hat sich gezeigt, dass die Unterdrückung der Mikrotubuli-Dynamik durch Tubulinmutationen oder durch medikamentöse Behandlung die Zellmigration hemmt. [45] Sowohl Mikrotubuli-Stabilisatoren als auch -Destabilisatoren können die Mikrotubuli-Dynamik unterdrücken.

Zu den Medikamenten, die die Dynamik der Mikrotubuli verändern können, gehören:

  • Die krebsbekämpfenden Taxan-Arzneimittel (Paclitaxel (Taxol) und Docetaxel) blockieren die dynamische Instabilität, indem sie GDP-gebundenes Tubulin im Mikrotubulus stabilisieren. Selbst wenn die Hydrolyse von GTP die Spitze des Mikrotubulus erreicht, findet daher keine Depolymerisation statt und der Mikrotubulus schrumpft nicht.

Taxane (allein oder in Kombination mit Platinderivaten (Carboplatine) oder Gemcitabin) werden gegen Mamma- und gynäkologische Malignome, Plattenepithelkarzinome (Kopf-Hals-Karzinome, einige Lungenkarzinome) etc. eingesetzt.

  • Die Epothilone, z.B. Ixabepilon, wirken ähnlich wie die Taxane.
  • Vinorelbin, Nocodazol, Vincristin und Colchicin haben den gegenteiligen Effekt und blockieren die Polymerisation von Tubulin zu Mikrotubuli. bindet an das (+) wachsende Ende der Mikrotubuli. Eribulin entfaltet seine krebshemmenden Wirkungen, indem es nach längerer und irreversibler mitotischer Blockade die Apoptose von Krebszellen auslöst.

Es wurde berichtet, dass die Expression von β3-Tubulin die zellulären Antworten auf die arzneimittelinduzierte Unterdrückung der Mikrotubuli-Dynamik verändert. Im Allgemeinen wird die Dynamik normalerweise durch niedrige, subtoxische Konzentrationen von Mikrotubuli-Medikamenten unterdrückt, die auch die Zellmigration hemmen. Der Einbau von β3-Tubulin in Mikrotubuli erhöht jedoch die Wirkstoffkonzentration, die benötigt wird, um die Dynamik zu unterdrücken und die Zellmigration zu hemmen. Somit sind Tumoren, die β3-Tubulin exprimieren, nicht nur resistent gegen die zytotoxischen Wirkungen von auf Mikrotubuli gerichteten Arzneimitteln, sondern auch gegen ihre Fähigkeit, Tumormetastasen zu unterdrücken. Darüber hinaus wirkt die Expression von β3-Tubulin auch der Fähigkeit dieser Arzneimittel entgegen, die Angiogenese zu hemmen, was normalerweise ein weiterer wichtiger Aspekt ihrer Wirkung ist. [ Zitat benötigt ]

Mikrotubuli-Polymere sind äußerst empfindlich gegenüber verschiedenen Umwelteinflüssen. Sehr geringe Mengen an freiem Calcium können Mikrotubuli destabilisieren, was frühe Forscher daran hinderte, das Polymer in vitro zu untersuchen. [12] Kalte Temperaturen verursachen auch eine schnelle Depolymerisation von Mikrotubuli. Im Gegensatz dazu fördert schweres Wasser die Polymerstabilität der Mikrotubuli. [46]

Mikrotubuli-assoziierte Proteine ​​(MAPs) Bearbeiten

Es hat sich gezeigt, dass MAPs eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Mikrotubuli-Dynamik spielen in-vivo. Die Geschwindigkeiten der Mikrotubuli-Polymerisation, Depolymerisation und Katastrophe variieren je nachdem, welche Mikrotubuli-assoziierten Proteine ​​(MAPs) vorhanden sind. Die ursprünglich identifizierten MAPs aus Hirngewebe lassen sich anhand ihres Molekulargewichts in zwei Gruppen einteilen. Diese erste Klasse umfasst MAPs mit einem Molekulargewicht unter 55-62 kDa und werden als τ (tau) Proteine ​​bezeichnet. In-vitro, Tau-Proteine ​​haben gezeigt, dass sie Mikrotubuli direkt binden, die Nukleation fördern und den Abbau verhindern und die Bildung von parallelen Arrays induzieren. [47] Darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass Tau-Proteine ​​Mikrotubuli in Axonen stabilisieren und mit der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht werden. [48] ​​Die zweite Klasse besteht aus MAPs mit einem Molekulargewicht von 200-1000 kDa, von denen es vier bekannte Typen gibt: MAP-1, MAP-2, MAP-3 und MAP-4. MAP-1-Proteine ​​bestehen aus einem Satz von drei verschiedenen Proteinen: A, B und C. Das C-Protein spielt eine wichtige Rolle beim retrograden Transport von Vesikel und wird auch als zytoplasmatisches Dynein bezeichnet. MAP-2-Proteine ​​befinden sich in den Dendriten und im Körper von Neuronen, wo sie mit anderen Zytoskelett-Filamenten binden. Die MAP-4-Proteine ​​kommen in den meisten Zellen vor und stabilisieren Mikrotubuli. Neben MAPs, die eine stabilisierende Wirkung auf die Mikrotubuli-Struktur haben, können andere MAPs eine destabilisierende Wirkung haben, indem sie entweder die Mikrotubuli spalten oder eine Depolymerisation induzieren. Es wurde beobachtet, dass drei Proteine ​​namens Katanin, Spastin und Fidgetin die Anzahl und Länge der Mikrotubuli über ihre destabilisierenden Aktivitäten regulieren. Darüber hinaus wird vorhergesagt, dass KIAA1211L in den Mikrotubuli lokalisiert ist. [49]

Plus-End-Tracking-Proteine ​​(+TIPs) Bearbeiten

Plus-End-Tracking-Proteine ​​sind MAP-Proteine, die an die Spitzen wachsender Mikrotubuli binden und eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Mikrotubuli-Dynamik spielen. Es wurde beispielsweise beobachtet, dass +TIPs während der Mitose an den Interaktionen von Mikrotubuli mit Chromosomen beteiligt sind. Die erste MAP, die als +TIP identifiziert wurde, war CLIP170 (zytoplasmatisches Linkerprotein), von dem gezeigt wurde, dass es bei Rettungsereignissen durch Mikrotubuli-Depolymerisation eine Rolle spielt. Zusätzliche Beispiele für +TIPs umfassen EB1, EB2, EB3, p150Glued, Dynamitin, Lis1, CLIP115, CLASP1 und CLASP2. [ Zitat benötigt ]


Transkription

Transkription ist der erste Teil des zentralen Dogmas der Molekularbiologie: DNA &rarr-RNA. Es ist die Übertragung von genetischen Anweisungen in DNA auf mRNA. Die Transkription erfolgt im Zellkern. Während der Transkription wird ein mRNA-Strang hergestellt, der komplementär zu einem DNA-Strang ist, der als Gen bezeichnet wird. Ein Gen kann leicht anhand der DNA-Sequenz identifiziert werden. Ein Gen enthält die drei grundlegenden Regionen, Promotor, kodierende Sequenz (Leserahmen) und Terminator. Es gibt mehrere Teile eines Gens, die in Abbildung (PageIndex<3>) dargestellt sind.

Abbildung (PageIndex<3>): Die Hauptkomponenten eines Gens. 1 .

Schritte der Transkription

Die Transkription erfolgt in drei Schritten, genannt Initiation, Elongation und Termination. Die Schritte sind in Abbildung (PageIndex<4>) dargestellt.

  1. Die Initiation ist der Beginn der Transkription. Es tritt auf, wenn das Enzym RNA-Polymerase an eine Region eines Gens namens bindet Promoter. Dies signalisiert der DNA, sich zu entspannen, damit das Enzym die Basen in einem der DNA-Stränge "lesen" kann. Das Enzym ist bereit, einen mRNA-Strang mit einer komplementären Basensequenz herzustellen. Der Promotor ist nicht Teil der resultierenden mRNA
  2. Elongation ist die Addition von Nukleotiden an den mRNA-Strang.
  3. Termination ist das Ende der Transkription. Wenn die RNA-Polymerase den Terminator transkribiert, löst er sich von der DNA. Der mRNA-Strang ist nach diesem Schritt vollständig. Abbildung (PageIndex<4>): Die Transkription erfolgt in den drei Schritten - Initiierung, Elongation und Beendigung

Verarbeitung von mRNA

In Eukaryoten ist die neue mRNA noch nicht zur Translation bereit. In diesem Stadium wird es als Prä-mRNA bezeichnet und muss weitere Verarbeitungsschritte durchlaufen, bevor es den Zellkern als reife mRNA verlässt. Die Verarbeitung kann das Hinzufügen einer 5'-Kappe, Spleißen, Editieren und 3'-Polyadenylierungs-(Poly-A)-Schwanz umfassen. Diese Prozesse verändern die mRNA auf verschiedene Weise. Solche Modifikationen ermöglichen die Verwendung eines einzelnen Gens, um mehr als ein Protein herzustellen. Siehe Abbildung (PageIndex<5>), wie Sie unten lesen:

  • 5' cap schützt mRNA im Zytoplasma und hilft bei der Anlagerung von mRNA an das Ribosom zur Translation.
  • Beim Spleißen werden Introns aus der proteinkodierenden Sequenz der mRNA entfernt. Introns sind Regionen, die nicht für das Protein kodieren. Die verbleibende mRNA besteht nur aus Regionen namens Exons die das Protein codieren.
  • Die Bearbeitung verändert einige der Nukleotide in der mRNA. Zum Beispiel hat ein menschliches Protein namens APOB, das beim Transport von Lipiden im Blut hilft, aufgrund der Bearbeitung zwei verschiedene Formen. Eine Form ist kleiner als die andere, weil die Bearbeitung ein früheres Stoppsignal in der mRNA hinzufügt.
  • Die Polyadenylierung fügt der mRNA eine „ldquotail&rdquo hinzu. Der Schwanz besteht aus einer Reihe von As (Adeninbasen). Es signalisiert das Ende der mRNA. Es ist auch am Export von mRNA aus dem Zellkern beteiligt und schützt mRNA vor Enzymen, die sie abbauen könnten.

Was sind die Merkmale von ATP, die dazu führen, dass es als 'universelle Währung' der Zelle bezeichnet wird?

Adenosintriphosphat (kurz ATP) wird verwendet, um die Energie für viele Zellfunktionen bereitzustellen – sowohl von tierischen als auch pflanzlichen Zellen – da Zellen ihre Energie nicht direkt aus Zuckern wie Glukose beziehen können. ATP wird während der Atmung gebildet, wenn die aus der aufgenommenen Glukose freigesetzte Energie die Anlagerung eines anorganischen Phosphatmoleküls an ein Molekül Adenosindiphosphat (ADP) antreibt, dafür ist das Enzym ATP-Synthase verantwortlich. ATP selbst ist ein kleines, lösliches Molekül, das leicht abgebaut und durch die Zelle transportiert werden kann. Zu den vielen Aufgaben, für die ATP verwendet wird, gehören die Transportarbeit von bewegten Substanzen, wie z. B. Ionen, durch Zellmembranen beim aktiven Transport und auch innerhalb der Prozesse der Muskelkontraktion und des Zellwachstums und der Zellteilung. Darüber hinaus ist ATP bei Bedarf in den Zellen leicht verfügbar, da Speicher in überschaubaren Mengen freigesetzt werden, was bedeutet, dass keine Energie verschwendet wird. Die energiehaltige Phosphatbindung wird leicht abgebaut, um die darin enthaltene Energie freizusetzen. Außerdem sind ATP-Moleküle nicht fettlöslich und können daher die Zellmembran nicht passieren, so dass die Zelle immer eine unmittelbare Energiequelle hat. Schließlich kann ATP als gute Energiequelle angesehen werden, da es die Fähigkeit besitzt, eine Phosphatgruppe und damit Energie auf andere Moleküle zu übertragen.


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Abstrakt

In den letzten zwei Jahren wurde deutlich, dass es einen unerwarteten Zusammenhang zwischen der Struktur und Dynamik des Kernporenkomplexes, dem nukleozytoplasmatischen Transport und der Chromosomensegregation gibt. Darüber hinaus hat eine tomographische dreidimensionale Rekonstruktion nativer Kernporenkomplexe, die in dickem amorphem Eis konserviert sind, eine Reihe neuer struktureller Merkmale dieser supramolekularen Maschine enthüllt. Diese Daten werden zusammen mit einigen der elementaren physikalischen Prinzipien, die dem nukleozytoplasmatischen Transport zugrunde liegen, in diesem Aufsatz diskutiert.


Ergebnisse der Glykolyse

Ein Glucosemolekül produziert während der Glykolyse vier ATP-, zwei NADH- und zwei Pyruvatmoleküle.

Lernziele

Beschreiben Sie die Energie, die aus einem Glukosemolekül gewonnen wird, das die Glykolyse durchläuft

Die zentralen Thesen

Wichtige Punkte

  • Obwohl in der zweiten Hälfte vier ATP-Moleküle produziert werden, beträgt der Nettogewinn der Glykolyse nur zwei ATP, da in der ersten Hälfte der Glykolyse zwei ATP-Moleküle verwendet werden.
  • Enzyme, die die Reaktionen katalysieren, die ATP produzieren, sind geschwindigkeitsbestimmende Schritte der Glykolyse und müssen in ausreichenden Mengen vorhanden sein, damit die Glykolyse die Produktion von vier ATP-, zwei NADH- und zwei Pyruvatmolekülen für jedes Glucosemolekül, das in den Stoffwechselweg eintritt, vervollständigt.
  • Rote Blutkörperchen benötigen zum Überleben die Glykolyse als einzige ATP-Quelle, da sie keine Mitochondrien besitzen.
  • Krebszellen und Stammzellen nutzen auch die Glykolyse als Hauptquelle für ATP (ein Prozess, der als aerobe Glykolyse oder Warburg-Effekt bekannt ist).

Schlüsselbegriffe

  • Pyruvat: jedes Salz oder Ester der Brenztraubensäure das Endprodukt der Glykolyse vor Eintritt in den TCA-Zyklus

Ergebnisse der Glykolyse

Die Glykolyse beginnt mit einem Molekül Glukose und endet mit zwei Pyruvat-Molekülen (Brenztraubensäure), insgesamt vier ATP-Molekülen und zwei Molekülen NADH. Zwei ATP-Moleküle wurden in der ersten Hälfte des Weges verwendet, um den Sechs-Kohlenstoff-Ring für die Spaltung vorzubereiten, so dass die Zelle einen Nettogewinn von zwei ATP-Molekülen und 2 NADH-Molekülen für ihre Verwendung hat. Wenn die Zelle die Pyruvatmoleküle nicht weiter abbauen kann (über den Zitronensäurezyklus oder den Krebszyklus), wird sie nur zwei ATP-Moleküle aus einem Glukosemolekül gewinnen.

Die Glykolyse produziert 2 ATP-, 2 NADH- und 2 Pyruvatmoleküle: Die Glykolyse oder der aerobe katabole Abbau von Glukose produziert Energie in Form von ATP, NADH und Pyruvat, das selbst in den Zitronensäurezyklus eintritt, um mehr Energie zu produzieren.

Reife rote Blutkörperchen von Säugetieren haben keine Mitochondrien und sind nicht in der Lage, aerob zu atmen, den Prozess, bei dem Organismen Energie in Gegenwart von Sauerstoff umwandeln. Stattdessen ist die Glykolyse ihre einzige Quelle für ATP. Wenn die Glykolyse unterbrochen wird, verlieren die roten Blutkörperchen daher ihre Fähigkeit, ihre Natrium-Kalium-Pumpen aufrechtzuerhalten, die ATP benötigen, um zu funktionieren, und sterben schließlich ab. Da zum Beispiel die zweite Hälfte der Glykolyse (die die Energiemoleküle produziert) in Abwesenheit von NAD+ verlangsamt oder stoppt, wenn NAD+ nicht verfügbar ist, werden rote Blutkörperchen nicht in der Lage sein, eine ausreichende Menge an ATP zu produzieren, um zu überleben.

Außerdem wird der letzte Schritt der Glykolyse nicht stattfinden, wenn Pyruvatkinase, das Enzym, das die Bildung von Pyruvat katalysiert, nicht in ausreichenden Mengen verfügbar ist. In dieser Situation wird der gesamte Glykolyseweg weiterlaufen, aber in der zweiten Hälfte werden nur zwei ATP-Moleküle hergestellt (statt der üblichen vier ATP-Moleküle). Somit ist Pyruvatkinase ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym für die Glykolyse.


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