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Wie verwendet man einen mechanischen Mikrostrainer, um Gewebeproteine ​​​​aus Menschen zu extrahieren?

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Hintergrund:

Es gibt viele Methoden, um Proteine ​​aus menschlichem Gewebe zu extrahieren. Die meisten von ihnen verwenden einen Extraktionspuffer mit variablen Konzentrationen an Detergenzien und Protease-Inhibitoren, um die extrahierten Proteine ​​so gut wie möglich zu erhalten und funktionsfähig zu halten, bis sie von nachgeschalteten Anwendungen analysiert werden, wie z westlicher Fleck, ELISA, etc. Ein Nachteil dieser chemischen Extraktion ist die Wechselwirkung der Pufferkomponenten mit der Antigen-Antikörper-Bindung bei der Analyse. Die Interaktion ist manchmal schwer vorherzusagen, daher ist die Validierung der Probenmatrix notwendig bevor Sie in die eigentliche Analyse gehen, z.B. für ELISA, Spike-and-Recovery, Linearität der Verdünnung sind zwei hierfür bekannte Validierungsassays. Für weitere Informationen zu diesen beiden Assays finden Sie diese Antwort möglicherweise hilfreich. Ein optimaler Weg wäre, eine solche Wechselwirkung zu vermeiden, indem man die Verwendung von Extraktionspuffer vollständig vermeidet und stattdessen mechanische Methoden plus Protease-Inhibitoren verwendet. Ich kenne den Nachteil dieser Methode nicht, aber einer kann sein, dass sie nicht so effektiv ist, um Zytokine aus ihren Vesikeln herauszubekommen, um durch Assay-Analyse zugänglich zu sein.

Fragen:

  1. Wie benutzt man Mikrosieb als mechanischer Ersatz für die Proteinextraktion im menschlichen Magengewebe?
  2. Was sind die Vor- und Nachteile der Verwendung von Mikrosieb?
  3. Wie effektiv ist es, menschliche Zytokine aus Geweben zu messen?

Menschlicher Fettgewebeextrakt induziert Angiogenese und Adipogenese In vitro

Abteilung für Zellbiologie, Medizinische Fakultät, Universität Tampere, Tampere, Finnland.

FICAM, Finnisches Zentrum für Alternativmethoden, Medizinische Fakultät, Universität Tampere, Tampere, Finnland.

Science Center, Universitätskrankenhaus Tampere, Tampere, Finnland.

Abteilung für Zellbiologie, Medizinische Fakultät, Universität Tampere, Tampere, Finnland.

Science Center, Universitätskrankenhaus Tampere, Tampere, Finnland.

Adulte Stammzellen, Institut für Biomedizinische Technologie, Universität Tampere, Tampere, Finnland.

BioMediTech, Tampere, Finnland.

Abteilung für Gastroenterologie und Verdauungstraktchirurgie, Universitätskrankenhaus Tampere, Tampere, Finnland.

Abteilung für Plastische Chirurgie, Universitätskrankenhaus Tampere, Tampere, Finnland.

Science Center, Universitätskrankenhaus Tampere, Tampere, Finnland.

Adulte Stammzellen, Institut für Biomedizinische Technologie, Universität Tampere, Tampere, Finnland.

BioMediTech, Tampere, Finnland.

Abteilung für Zellbiologie, Medizinische Fakultät, Universität Tampere, Tampere, Finnland.

FICAM, Finnisches Zentrum für Alternativmethoden, Medizinische Fakultät, Universität Tampere, Tampere, Finnland.

Abteilung für Klinische Chemie, Universitätskrankenhaus Tampere, Tampere, Finnland.


Optionen zur Proteinextraktion

Lyse auf Waschmittelbasis

Die Detergens-Lyse ist am häufigsten die Methode der Wahl zur Behandlung von Säugerzellen. Zellsuspensionen werden vorsichtig zentrifugiert und in einer Detergens enthaltenden Lyselösung resuspendiert. Die Membranen werden solubilisiert, lysieren die Zellen und setzen ihren Inhalt frei. Anhaftende Zellen wie Fibroblasten können durch Zugabe von Lyselösung direkt auf der Gewebekulturoberfläche solubilisiert oder alternativ zunächst in Gegenwart eines nicht lytischen Puffers mit einem Gummiskalpell von der Oberfläche abgeschabt, zentrifugiert und als Zellsuspensionen behandelt werden . Die Verwendung eines milden, nichtionischen Reinigungsmittels wie Triton** X-100, Nonyl-Phenoxypolyethoxylethanol (NP40) oder eines zwitterionischen Reinigungsmittels wie 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) trägt dazu bei, dass dass die Denaturierung von Zielproteinen auf ein Minimum beschränkt wird.

Einfrieren/Auftauen Lyse

Dieses Verfahren ist auf Suspensionen von Säugetier- oder Bakterienzellen anwendbar. Die Hauptattraktionen der Gefrier-/Auftau-Lyse sind Einfachheit und geringe Kosten. Zellen werden durch die wiederholte Bildung von Eiskristallen aufgeschlossen und das Verfahren wird üblicherweise mit enzymatischer Lyse kombiniert. Die Zellsuspension kann mit flüssigem Stickstoff schnell eingefroren werden. Anschließend wird die Probe aufgetaut und durch Pipettieren oder vorsichtiges Vortexen in Lysepuffer bei Raumtemperatur resuspendiert und der Vorgang mehrmals wiederholt. Zwischen den Zyklen wird die Probe zentrifugiert und der Überstand wird zurückbehalten.

Osmotischer Schock

Dies ist eine sehr schonende Methode, die für die Lyse suspendierter Säuger- oder Bakterienzellen ohne Verwendung eines Detergens ausreichend sein kann. Das oft mit mechanischem Aufbrechen kombinierte Verfahren beruht auf dem Wechsel von hoch- zu niedrig-osmotischem Medium und eignet sich gut für Anwendungen, bei denen das Lysat anschließend in subzelluläre Komponenten fraktioniert werden soll.

Ultraschall

Diese Methode der Proteinextraktion wird am häufigsten bei Zellsuspensionen angewendet. Zellen werden durch hochfrequente Schallwellen (typischerweise 20 bis 50 kHz) über eine in die Probe eingeführte Sonde aufgebrochen. Die Schallwellen erzeugen einen Bereich mit niedrigem Druck, wodurch die

Zellmembranen in der Nähe der Sondenspitze. Zellsuspensionen sollten in kurzen Stößen beschallt werden, um ein Erhitzen zu vermeiden, und die Proben sollten zwischen den Stößen auf Eis gekühlt werden. Dies ist für die Probenvorbereitung im kleinen Maßstab geeignet. Aggregate von Proteinen (Inclusion Bodies) müssen resolubilisiert werden. Obwohl die Ultraschallbehandlung relativ einfach ist, ist sie eine strenge Methode zur Probenvorbereitung, bei der die erzeugte Wärme ständig unter Kontrolle gehalten werden muss und empfindliche Zielmoleküle anfällig für Scherkräfte sein können.

Notiz: Bei Proteinpräparationen kann die Freisetzung von DNA zu hochviskosen und schwer zu verarbeitenden Proben führen. Die Viskosität kann durch Zugabe von DNase verringert werden.

Mechanische Methoden

Proteine ​​können aus Zellen und Geweben unter Verwendung einer Reihe von groben, aber wirksamen Maßnahmen zum "Zerkleinern und Mahlen" extrahiert werden. Zum Beispiel können Zellmembranen durch Flüssigkeitsscherkräfte zerstört werden, wenn die Probe durch einen engen Spalt gedrückt wird: Je enger der Spalt, desto größer die Scherkraft. Dies kann manuell durch Dounce-Homogenisierung oder mechanisch durch Potter-Elvehjem-Homogenisierung erreicht werden. Diese milde Methode eignet sich hervorragend für kleine Volumina und kultivierte Zellen.

Die Homogenisierung von Geweben, die durch Zerhacken oder Zerkleinern in gekühltem Puffer hergestellt wurden, kann unter Verwendung eines Waring-Mischers oder Polytron erreicht werden. Der Polytron unterscheidet sich vom Waring-Mixer dadurch, dass er das Gewebe in einen langen Schaft mit rotierenden Klingen zieht. Es sind Schäfte mit unterschiedlichen Kapazitäten erhältlich, die Probengrößen von nur 1 ml ermöglichen.

Mörser und Stößel: Gewebe oder Zellen werden normalerweise in flüssigem Stickstoff eingefroren und zu einem feinen Pulver gemahlen. Die Zugabe von Aluminiumoxid oder Sand kann das Schleifen unterstützen. Zellwände werden durch mechanische Krafteinwirkung zerstört.

Glasperlenmahlen: Schnelles Rühren von Zellen mit feinen Glasperlen zerstört die Zellwände. Das Mahlen von Kügelchen lysiert die meisten grampositiven und gramnegativen Bakterien, einschließlich Mykobakterien.

Enzymatische Verdauung

Bei der Extraktion von Proteinen aus Bakterien, Hefen oder anderen Organismen mit Zellmembranen, die von einer robusten Schutzstruktur umgeben sind, werden häufig enzymatische Methoden eingesetzt. Die Enzyme lösen Zellwände, Hüllen, Kapseln, Kapside oder andere Strukturen auf, die durch mechanische Verfahren allein nicht leicht abgeschert werden können. Einem enzymatischen Verdau folgt oft eine Homogenisierung, Beschallung oder heftiges Vortexen in einem Lysepuffer. Enzymatische Methoden werden am häufigsten für Bakterien und Hefen verwendet, können aber auch für die Extraktion von Proteinen aus eukaryotischen Zellen verwendet werden, die in Fasergewebe eingebettet sind, wo beispielsweise Kollagenase geeignet sein kann, den Abbau von fibrillärem Kollagen zu verbessern (Tabelle 2).

Explosive Dekompression

Diese Technik wird am häufigsten bei Bakterien, Hefen, Pflanzenzellen oder anderen robusten Proben angewendet. Die Zellen werden mit einem Inertgas wie Stickstoff bei hohem Druck (typischerweise 5500 kPa/800 psi) äquilibriert. Bei Verwendung einer French Press funktioniert dieses Verfahren über einen schnellen Druckabfall, wenn die Probe von einer Kammer mit hohem Druck durch eine Öffnung in eine Kammer mit niedrigem Druck überführt wird. Dies ist eine schnelle und effiziente Methode, die für große Volumina geeignet ist.

Vorgefertigte Lysepuffer und Probenvorbereitungskits

Cytiva bietet eine Reihe von Produkten für die Proteinextraktion aus Säugerzellen, Hefen, Bakterien und tierischen Geweben.

Die Probenschleif-Kit kann verwendet werden, um kleine Gewebe- und Zellproben für die Proteinextraktion aufzubrechen. Bis zu 100 mg Probe pro Röhrchen können in etwa 10 min behandelt werden. Das Kit besteht aus Mikrozentrifugenröhrchen, die jeweils eine kleine Menge Schleifharz in Wasser suspendiert enthalten, und Einweg-Pistillen. Das Röhrchen wird zuerst zentrifugiert, um das Harz zu pelletieren, und das Wasser wird entfernt. Anschließend werden die Extraktionslösung der Wahl und die Probe in das Röhrchen gegeben und mit dem Pistill die Probe gemahlen. Nach dem Zentrifugieren bleiben Zelltrümmer und Mahlharz fest im konischen Boden des Röhrchens und der Überstand lässt sich leicht entfernen

Die illustra™ triplePrep™-Kit ist für die schnelle Isolierung und Reinigung von genomischer DNA, Gesamt-RNA und gesamten denaturierten Proteinen mit hoher Ausbeute aus ungeteilten Proben von tierischen Geweben und Säugerzellen konzipiert. Der Arbeitsablauf reduziert die Gesamtzahl der Schritte und ermöglicht die Vorbereitung aller drei Analyten in weniger als 1 Stunde. Puffer, Säulen und Protokoll gewährleisten eine hohe Wiederfindung bei begrenzten Proben wie Biopsien, archivierten Geweben und Tumoren.

Proteinextraktionspuffer für Säugetiere wurde für die effiziente und schonende Extraktion von biologisch aktiven, löslichen Gesamtproteinen aus kultivierten Säugetierzellen entwickelt. Dieser Puffer basiert auf organischen Puffersubstanzen und kann sowohl für Zellsuspensionen als auch für adhärente Zellen verwendet werden.

Hefeprotein-Extraktionspuffer-Kit ist nützlich für die Extraktion löslicher Proteine ​​aus Hefezellen und ist eine proprietäre Verbesserung der Sphäroplastenpräparation auf Zymolyase-Basis und der Extraktion löslicher Proteine ​​aus Hefezellen. Dieses Kit enthält ein Protokoll zur Herstellung von Sphäroplasten und zur Entfernung des lytischen Enzyms Zymolyase vor der Lyse und Extraktion von Hefeproteinen. Der Puffer basiert auf organischen Puffermitteln mit milden nichtionischen Detergenzien und einer geschützten Kombination verschiedener Salze und Mittel zur Verbesserung der Extraktion und Stabilität von 28-9998-97 AB 19-Proteinen. Ein gebrauchsfertiges Zymolyase-Präparat wird ebenfalls bereitgestellt. Je nach Anwendung können zusätzliche Mittel wie Reduktionsmittel, Chelatbildner und Protease-Inhibitoren zugegeben werden. Das Yeast Protein Extraction Buffer Kit macht die mühsame Glasperlen-Lyse von Hefezellen überflüssig.

Die 2-D-Fraktionierungskit vereinfacht die Analyse komplexer Proteinmischungen durch Reduzierung der Menge und Anzahl der in die Gelmatrix geladenen Proteinspezies. Die Fraktionierung ermöglicht es, Proteingruppen oder Fraktionen aus dem Gesamtproteom zu isolieren. Dies ermöglicht eine verbesserte Auflösung, wenn eine einzelne Fraktion analysiert wird, liefert weniger überfüllte 2-D-Karten, vereinfacht die Analyse und Interpretation und erhöht die Chancen, neue Proteine ​​von diagnostischem oder therapeutischem Interesse zu entdecken. Diese skalierbaren Kits tragen zu einer hohen Probenrückgewinnung bei und sind kompatibel mit nachgeschalteten Trenntechniken wie der 2-D-Gelelektrophorese.

Schutz Ihrer Proben

Protease-Inhibitoren müssen in Lysepuffer eingeschlossen werden, um den Abbau von Proteinen nach der Freisetzung endogener Proteasen während des Prozesses der Zelllyse zu verhindern.

Protease-Inhibitor-Mix: Die Probenvorbereitung erfordert oft die Hemmung der Proteaseaktivität. Cytiva bietet diese einzigartige Kombination aus kompetitiven und nicht-kompetitiven Protease-Inhibitoren, die Proteine ​​während der Reinigung aus tierischem Gewebe, Pflanzengewebe, Hefe und Bakterien vor Proteolyse schützen. Der Cocktail mit Inhibitoren von Serin-, Cystein- und Calpain-Proteasen hemmt effektiv über 95 % der Proteaseaktivität und wurde speziell für die Probenvorbereitung in 2D-Gelelektrophoresestudien entwickelt. Optional kann Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugegeben werden, um Metalloproteasen zu hemmen.

Während es wichtig ist, Proteasen während der Proteinextraktion in einem inaktiven Zustand zu halten (Tisch 3) sollten auch andere potenziell gefährdende Kontaminanten in Betracht gezogen werden. Wenn das Ziel Ihres Western Blots beispielsweise der Nachweis von phosphorylierten Proteinen ist, ist es wichtig, Ihre Probe vor der dephosphorylierenden Wirkung von Phosphatasen zu schützen, die während der Probenvorbereitung in das Lysat freigesetzt werden. Eine Möglichkeit, Ihre Probe zu schützen, besteht darin, Ihrem Lysepuffer einen Phosphatase-Inhibitor wie Natriumvanadat zuzusetzen. Es kann auch erforderlich sein, Ihre Proteine ​​vor unerwünschten Veränderungen wie Acetylierung, Ubiquitinylierung oder Glykosylierung zu schützen.


Mechanische Eigenschaften von Stammzellen können vorhersagen, was sie werden

Stammzellen haben das Potenzial, zu verschiedenen Gewebearten zu werden, aber bestimmte Eigenschaften – Steifigkeit, Viskosität, Größe – sind verräterische Anzeichen dafür, wofür sie optimiert sind. Bildnachweis: Darling Lab/Brown University

Um bessere Heiler zu werden, braucht das Tissue Engineering einen rechtzeitigen und zuverlässigen Weg, um genügend Rohstoffe zu erhalten: Zellen, die entweder bereits das Gewebe sind oder werden können, das sie bauen müssen. In einer neuen Studie zeigen biomedizinische Ingenieure der Brown University, dass die Steifheit, Viskosität und andere mechanische Eigenschaften von adulten Stammzellen, die aus Fett gewonnen werden, wie etwa Fettabsaugungsabfällen, vorhersagen können, ob sie sich in Knochen, Knorpel oder Fett verwandeln.

Diese Erkenntnis könnte zu einem Filter führen, der in der Lage ist, die benötigten Zellen aus einer größeren und vielfältigeren Gewebeprobe zu extrahieren, sagte Eric Darling, leitender Autor der in veröffentlichten Studie Proceedings of the National Academy of Sciences. Stellen Sie sich vor, ein Chirurg verwendet einen solchen Filter, um einem Patienten mit einer Knochenverletzung zunächst Fett zu entnehmen und dann während derselben Operation eine hohe Konzentration an knochenbildenden Stammzellen in die Wundstelle zu injizieren.

In der Veröffentlichung berichten die Forscher, dass die steifsten mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe dazu neigten, zu Knochen zu werden, die größten und weichsten zu Fett und diejenigen, die besonders viskos waren, am ehesten zu Knorpel.

"Die Ergebnisse sind aufregend, weil nicht nur die mechanischen Eigenschaften angeben, welche Abstammungslinie diese Zellen möglicherweise haben könnten, sondern auch das Ausmaß ihrer Differenzierung", sagte Darling, Assistenzprofessor für medizinische Wissenschaften am Institut für Molekulare Pharmakologie, Physiologie. und Biotechnologie und das Zentrum für Biomedizinische Technik der Universität. "Es sagt uns, wie gut sie sein werden, wenn wir sie nach einem bestimmten Gewebetyp unterscheiden."

Wenn Gewebeingenieure beispielsweise extrahiertes Fett nach Zellen durchsuchen, um Knochen zu bilden, können sie die Zellen nach Zellen mit einer bestimmten Steifigkeit oder mehr durchsuchen. Ob es sich bei den Zellen um "undifferenzierte" Stammzellen handelt, die noch keinen Schritt in Richtung eines bestimmten Zelltyps gemacht haben, oder um solche, die bereits Knochenzellen sind, nur diejenigen mit der erforderlichen Steifigkeit würden es schaffen. Dieser Prozess würde zu einer höheren Zellpopulation für die Bildung von neuem Knochengewebe führen.

"Können wir die Zellpopulationen für Zellen anreichern, die wir verwenden wollen, egal ob es sich um völlig undifferenzierte Zelltypen, teilweise differenziert oder vollständig differenziert handelt?" Liebling sagte. "Es spielt keine Rolle, solange es auf die spezifische Gewebeanwendung ausgerichtet ist."

Darlings Studie, die von den Forschungsassistenten Rafael Gonzaelz-Cruz und Vera Fonseca geleitet wurde, umfasste das Klonen von aus Fett gewonnenen adulten menschlichen Stammzellen in 32 Stammzellpopulationen. Dann stocherten, stießen und maßen sie die Zellen mit einem Rasterkraftmikroskop, um zu messen, wie groß sie waren, wie robust sie unter Druck waren und wie sich die Kraft zwischen ihnen und der freitragenden Sonde des Zielfernrohrs im Laufe der Zeit veränderte. Das Team stellte fest, dass die Zellen ein breites Spektrum an Steifigkeit, Viskosität und Größe aufwiesen.

Nach den Messungen induzierten die Forscher die Zellen chemisch zur Differenzierung und analysierten die Konzentrationen der Schlüsselmetaboliten, die die Zellen einige Wochen später produzierten, während sie reiften. Für jede Population gaben die Metaboliten den relativen Anteil an, der sich in das eine oder andere Gewebe differenzierte. Bevölkerung 28 zum Beispiel reagierte offenbar produktiv auf chemische Hinweise zur Knorpelbildung, nur etwas gut bei der Knochenbildung und schlecht auf Hinweise zur Fettbildung.

Der Schlüsselmoment war, als die Forscher die mechanischen Messungen jeder Zellpopulation mit ihren Metabolitendaten korrelierten. Haben die mechanischen Eigenschaften vorhergesagt, welche Populationen sich am erfolgreichsten in Knochenzellen, Knorpelzellen oder Fettzellen verwandeln würden? Tatsächlich taten sie es. Die steifsten Zellpopulationen produzierten mehr Knochen. Die matschigsten Zellen waren diejenigen, die das meiste Fett produzierten. Diejenigen mit der höchsten Viskosität waren diejenigen, die anscheinend auf Knorpel zusteuern.

Darling und sein Team führten dann eine Sortiersimulation durch, um festzustellen, ob das Filtern einer Probe nach verschiedenen mechanischen Eigenschaften dazu führen könnte, dass eine höhere Konzentration an nützlichen Zellen aus dem Gewebe extrahiert wird. Sie fanden heraus, dass die Ausbeuten mit aktuellen Methoden zur Suche nach molekularen Biomarkern zwar weniger als 1 Prozent betragen, die Ausbeuten basierend auf den mechanischen Eigenschaften jedoch auf 3 Prozent für knochenbildende Zellen, 6 Prozent für Knorpel und 9 Prozent für Fett steigen könnten.

Ermutigt durch die Ergebnisse, die er als grundlegend anerkennt, arbeitet Darlings Gruppe bereits an einer praktischeren Umsetzung der Entdeckung. Immerhin werden Chirurgen keine Rasterkraftmikroskope in den Operationssaal bringen, diese Geräte arbeiten zu langsam, um in angemessener Zeit genügend Zellen zu identifizieren.

"Um dies tatsächlich anzuwenden, brauchen wir eine Art mechanisches Testgerät mit hohem Durchsatz", sagte er. "Dort ist die nächste Stufe. Daran arbeitet mein Labor gerade."

Die Idee nimmt also Gestalt an, wie eine Stammzelle, die danach strebt, Fett, Knochen oder Knorpel zu werden.


Neue Technik „druckt“ Zellen, um vielfältige biologische Umgebungen zu schaffen

University of California, Berkeley, haben Forscher eine neue Technik entwickelt, die Photolithographie und programmierbare DNA verwendet, um schnell zweidimensionale Anordnungen von Zellen und Proteinen zu "drucken", die eine Vielzahl von zellulären Umgebungen im Körper nachahmen. Bildnachweis: (UC Berkeley-Grafik von Olivia Scheideler)

Wie Menschen können Zellen leicht durch Gruppenzwang beeinflusst werden.

Nehmen Sie eine neurale Stammzelle im Gehirn: Ob diese Zelle eine Stammzelle bleibt oder sich zu einer voll ausgebildeten Gehirnzelle ausdifferenziert, wird letztendlich durch eine komplexe Reihe molekularer Botschaften bestimmt, die die Zelle von unzähligen Nachbarn erhält. Das Verständnis dieser Botschaften ist der Schlüssel für Wissenschaftler, die hoffen, diese Stammzellen zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson zu nutzen.

Mit Hilfe der Photolithographie und einer kreativen Nutzung programmierbarer DNA haben Forscher der University of California, Berkeley, eine neue Technik entwickelt, die schnell zweidimensionale Anordnungen von Zellen und Proteinen "drucken" kann, die eine Vielzahl von zellulären Umgebungen im Körper nachahmen – sei es das Hirngewebe, das eine neurale Stammzelle umgibt, die Auskleidung des Darms oder der Leber oder die zelluläre Konfiguration innerhalb eines Tumors.

Diese Technik könnte Wissenschaftlern helfen, ein besseres Verständnis der komplexen Zell-zu-Zell-Nachrichtenübertragung zu entwickeln, die das endgültige Schicksal einer Zelle bestimmt, von der Differenzierung einer neuralen Stammzelle in eine Gehirnzelle zu einer Tumorzelle mit dem Potenzial, zu einer embryonalen Stammzelle zu metastasieren Organzelle.

„Das wirklich Leistungsstarke an dieser Plattform ist, dass Sie in vitro Gewebe erzeugen können, die die räumliche Organisation der Zellen im Körper erfassen, von der Darmschleimhaut Ihres Verdauungstraktes bis hin zu den Anordnungen verschiedener Zelltypen in der Leber“, sagt Olivia Scheideler, die schloss die Forschung als Doktorand in Berkeley ab. "Ich denke, Sie könnten diese Technik anwenden, um jedes Gewebe nachzubilden, in dem Sie untersuchen möchten, wie zelluläre Wechselwirkungen zur Gewebefunktion beitragen."

In einem Papier, das heute in der Zeitschrift erscheint Wissenschaftliche Fortschritte, Scheideler und ihre Mitarbeiter zeigen, dass die neue Technik verwendet werden kann, um komplizierte Muster von bis zu 10 verschiedenen Arten von Zellen oder Proteinen schnell auf eine ebene Oberfläche zu drucken.

„Im Wesentlichen ermöglicht uns diese Technik, verschiedene Arten von Bedingungen in einem Schuss und mit hohem Durchsatz zu mustern“, sagte Lydia Sohn, Kanzler-Professorin für Maschinenbau an der UC Berkeley und Senior-Autorin der Studie. "Es bietet eine ganze Reihe von Optionen für das, was Sie studieren könnten, weil es so flexibel ist. Sie können viele verschiedene Arten von Zellen oder Proteinen mustern."

Gefangen an einem DNA-Tether

Bei der neuen Technik wird jede Zelle oder jedes Protein mit einem kurzen DNA-String an ein Substrat gebunden. Während ähnliche Methoden entwickelt wurden, die angebundene Zellen oder Proteine ​​einzeln anheften, nutzt die neue Technik einen Strukturierungsprozess namens Photolithographie, um jede Art von Zellprotein in einer schnellen Charge zu befestigen oder zu drucken, was den Prozess erheblich beschleunigt.

"Es ist wie beim Farblaserdruck, bei dem man eine Farbe druckt und dann eine andere", sagte Sohn.

Wie bei der Fotografie funktioniert die Fotolithografie, indem eine beschichtete Oberfläche oder ein beschichtetes Substrat einem Lichtmuster ausgesetzt wird, das eine chemische Reaktion auslöst, die die Beschichtung in den beleuchteten Bereichen auflöst und ein Schablonensubstrat hinterlässt. Bei der neuen Technik wird das Substrat dann in Stränge einseitiger DNA gebadet, deren Enden chemisch verändert wurden, um fest an der gelösten Beschichtung zu haften.

Jeder einseitige DNA-Strang ist mit einer spezifischen Sequenz der Nukleotide Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C) programmiert. Einseitige DNA-Stränge mit der komplementären Nukleotidsequenz werden eingebettet oder an Zellen oder Proteine ​​von Interesse angehängt.

Schließlich wird die Oberfläche mit einer Mischung von Zellen oder Proteinen gewaschen, die an die komplementären Stränge der einseitigen DNA angeheftet sind, die sich mit der bereits an der Oberfläche befestigten einseitigen DNA binden, um Doppelhelix-"Tether" zu bilden.

"Alle Zellen und Proteine ​​heften sich aufgrund der DNA-Programmierung genau dort an, wo sie sein sollten", sagte Sohn.

Durch Wiederholen des Vorgangs können bis zu 10 verschiedene Arten von Zellen oder Proteinen in einem beliebigen Muster an die Oberfläche gebunden werden.

Um eine der vielen Anwendungen der Technik zu demonstrieren, nutzten Scheideler und Co-Autor David Schaffer, Hubbard Howe Jr. Distinguished Professor of Biochemical Engineering an der UC Berkeley, die Plattform, um die chemischen Signale zu untersuchen, die neurale Stammzellen dazu veranlassen, sich in reife Zellen zu differenzieren .

"Stammzellen haben in ihre DNA eingebettete Programme, die ihnen sagen, dass sie entweder eine Stammzelle bleiben oder sich in eine reife Zelle differenzieren sollen", sagte Schaffer. „Und sie erhalten viele Informationen darüber, was zu tun ist und welche Programme sie aktivieren sollen, von der Umgebung, von anderen Zellen um sie herum. Wenn wir lernen könnten, wie man Stammzellen dazu bringt, unseren Wünschen nachzukommen, wie man sie in einen bestimmten Zelltyp umwandelt, dann könnten wir die Stammzellen nutzen, um spezialisierte Zelltypen in Massenproduktion zu produzieren, die aufgrund von Krankheiten oder Verletzungen verloren gegangen sind."

Neurale Stammzellen im Gehirn erhalten regelmäßig widersprüchliche Botschaften von ihren Nachbarn, wie sie sich verhalten sollen, sagte Scheideler. Ein Botenstoff, das FGF-2-Protein, sagt ihnen, dass sie mehr Stammzellen produzieren sollen. Das andere, das Ephrin-B2-Protein, sagt ihnen, dass sie sich in ein reifes Neuron differenzieren sollen.

Scheideler nutzte die neue Technik, um neurale Stammzellen auf Tausende von verschiedenen Anordnungen der beiden Proteine ​​FGF-2 und Ephrin-B2 zu strukturieren, um zu sehen, wie die räumliche Organisation der beiden Signale das endgültige Schicksal der Zellen bestimmt.

Sie fand heraus, dass sich viele Stammzellen zu reifen Neuronen ausdifferenzierten, selbst wenn sie hauptsächlich in Kontakt mit FGF-2 oder „Stammzelle bleiben“, Botenstoffen, standen. Als sie jedoch genauer hinsah, stellte sie fest, dass diese Zellen, die sich differenzierten, eher kleine, fingerartige Fortsätze oder "Neuriten" hatten, die die Ephrin-B2- oder "differenzierenden" Botenstoffe berührten.

„Das Tolle an dieser Musterungstechnologie ist, dass Sie diese kleinen Muster problemlos Hunderte oder Tausende von Malen auf einer Folie reproduzieren können“, sagte Schaffer. "Es ist, als würde man tausend kleine unabhängige Experimente durchführen, von denen jedes ein Probelauf ist, um zu sehen, wie eine Stammzelle auf die Zellen um sie herum hört. Und dann kann man sehr, sehr tiefe Statistiken über die verschiedenen Arten erhalten, wie sie reguliert werden kann." ."


Proteinreinigung: Bedeutung, prinzipielle Strategien, Bewertung und andere Details

Lesen Sie diesen Artikel, um mehr über die Bedeutung, die prinzipiellen Strategien, die Auswahl und Kombination von Aufreinigungstechniken, die Aufreinigung eines markierten Proteins, die Bewertung der Aufreinigungsausbeute, die Konzentration des aufgereinigten Proteins und die Analyse isolierter Proteine ​​zu erfahren.

Einführung:

Die Proteinreinigung ist eine Reihe von Verfahren, die dazu bestimmt sind, einen einzelnen Proteintyp aus einem komplexen Gemisch zu isolieren.

Die Proteinreinigung ist entscheidend für die Charakterisierung der Funktion, Struktur und Wechselwirkungen des interessierenden Proteins. Das Ausgangsmaterial ist üblicherweise ein biologisches Gewebe oder eine mikrobielle Kultur.

Die verschiedenen Schritte im Reinigungsverfahren können das Protein von einer Matrix befreien, die es einschließt, die Protein- und Nicht-Protein-Teile der Mischung trennen und schließlich das gewünschte Protein von allen anderen Proteinen trennen. Die Trennung eines Proteins von allen anderen ist typischerweise der mühsamste Aspekt der Proteinreinigung. Trennschritte nutzen Unterschiede in Proteingröße, physikalisch-chemischen Eigenschaften und Bindungsaffinität.

Die Reinigung kann präparativ oder analytisch erfolgen. Präparative Reinigungen zielen darauf ab, eine relativ große Menge gereinigter Proteine ​​für die spätere Verwendung herzustellen. Beispiele umfassen die Herstellung kommerzieller Produkte wie Enzyme (z. B. Laktase), Nahrungsproteine ​​(z. B. Sojaproteinisolat) und bestimmte Biopharmazeutika (z. B. Insulin).

Die analytische Reinigung erzeugt eine relativ kleine Proteinmenge für eine Vielzahl von Forschungs- oder Analysezwecken, einschließlich Identifizierung, Quantifizierung und Studien der Proteinstruktur, posttranslationalen Modifikationen und Funktion. Zu den ersten gereinigten Proteinen gehörten Urease und Concanavalin-A.

Prinzipielle Strategien:

Die meisten Reinigungsprotokolle erfordern mehr als einen Schritt, um den gewünschten Reinheitsgrad zu erreichen. Jeder Verfahrensschritt führt zu einem gewissen Produktverlust, es wird eine Ausbeute von 80 % in jedem Schritt angenommen, und daher ist es ratsam, so wenige Reinigungsschritte wie möglich durchzuführen. Die Wahl des Ausgangsmaterials ist der Schlüssel zur Gestaltung eines Reinigungsverfahrens.

In einer Pflanze oder einem Tier ist ein bestimmtes Protein normalerweise nicht homogen im ganzen Körper verteilt. Verschiedene Organe oder Gewebe weisen höhere oder niedrigere Konzentrationen des Proteins auf. Die Verwendung nur der Gewebe oder Organe mit der höchsten Konzentration verringert die Volumina, die benötigt werden, um eine gegebene Menge an gereinigtem Protein zu produzieren.

Wenn das Protein in geringer Menge vorhanden ist oder einen hohen Wert hat, können Wissenschaftler rekombinante DNA-Technologie verwenden, um Zellen zu entwickeln, die große Mengen des gewünschten Proteins produzieren (dies wird als Expressionssystem bezeichnet). Die rekombinante Expression ermöglicht es dem Protein, B. mit einem His-Tag markiert werden, um die Reinigung zu erleichtern, was bedeutet, dass die Reinigung in weniger Schritten durchgeführt werden kann. Darüber hinaus beginnt die rekombinante Expression normalerweise mit einem höheren Anteil des gewünschten Proteins als in einer natürlichen Quelle vorhanden ist.

Mit Hintergrundinformationen, Assays und Probenverfahren können die dreiphasigen Reinigungsstrategien in Betracht gezogen werden. Die Reinigung besteht aus drei Phasen des Einfangens, der Zwischenreinigung und des Polierens, jede mit einem bestimmten Ziel. In der Erfassungsphase bestehen die Ziele darin, das Zielverfahren zu isolieren, zu konzentrieren und zu stabilisieren.

Während der Zwischenreinigungsphase besteht das Ziel darin, Hauptverunreinigungen wie andere Proteine, Nukleinsäuren, Endotoxine und Viren zu entfernen. In der Polierphase besteht das Ziel darin, alle Spuren von Verunreinigungen und eng verwandten Substanzen zu entfernen. Daher ist die Auswahl und optimale Kombination von Reinigungstechniken für das Einfangen, die Zwischenreinigung und das Polieren erforderlich, um eine gute Ausbeute und ein reines Produkt zu gewährleisten.

Der abschließende Reinigungsprozess besteht idealerweise aus der Probenvorbereitung, einschließlich Extraktion und Klärung, falls erforderlich, gefolgt von den oben beschriebenen drei Reinigungsphasen. Die Anzahl der Schritte hängt immer von der erforderlichen Reinheit und der beabsichtigten Verwendung des Proteins ab.

Eine analytische Reinigung nutzt im Allgemeinen drei Eigenschaften, um Proteine ​​zu trennen. Erstens können Proteine ​​gemäß ihren isoelektrischen Punkten gereinigt werden, indem sie durch ein pH-graduiertes Gel oder eine Ionenaustauschersäule laufen gelassen werden. Zweitens können Proteine ​​nach ihrer Größe oder ihrem Molekulargewicht durch Größenausschlusschromatographie oder durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)-Analyse getrennt werden.

Proteine ​​werden oft unter Verwendung von 2D-PAGE gereinigt und dann durch Peptid-Massen-Fingerprinting analysiert, um die Proteinidentität festzustellen. Dies ist für wissenschaftliche Zwecke sehr nützlich und die Nachweisgrenzen für Protein sind heutzutage sehr niedrig und Nanogramm Proteinmengen reichen für ihre Analyse aus.

Auswahl und Kombination von Reinigungstechniken:

Ziel dieser Kombination ist es, einen schnellsten Weg zu einem Produkt mit der erforderlichen Reinheit zu entwickeln. Für jede chromatographische Trennung bietet jede unterschiedliche Technik eine andere Leistung in Bezug auf Wiederfindung, Auflösung, Geschwindigkeit und Kapazität. Eine Technik kann so optimiert werden, dass sie sich auf einen dieser Parameter konzentriert, beispielsweise die Auflösung, um das Beste zwischen zwei Parametern wie Geschwindigkeit und Kapazität zu erreichen.

Eine für einen dieser Parameter optimierte Trennung führt zu einem Ergebnis, das sich im Aussehen von denjenigen unterscheidet, die unter Verwendung der gleichen Technik, jedoch mit Fokus auf alternative Parameter, erzeugt wurden. Daher ist es immer vorzuziehen, eine Technik auszuwählen, um die Ziele im Reinigungsschritt zu erreichen.

Die Kapazität in dem gezeigten einfachen Modell repräsentiert die Menge an Zielprotein, die während der Reinigung geladen wurde. In einigen Fällen kann die beladbare Menge eher durch das Volumen (wie bei der Gelfiltration) oder durch ein großes Volumen an Verunreinigungen als durch die Menge an Zielproteinen begrenzt sein.

Schnelligkeit ist am Anfang von größter Bedeutung, wenn Verunreinigungen wie Proteasen so schnell wie möglich entfernt werden müssen. Die Rückgewinnung wird mit fortschreitender Reinigung aufgrund des erhöhten Werts des gereinigten Produkts immer wichtiger. Die Wiederfindung’ wird durch destruktive Prozesse in den Proben und ungünstige Bedingungen auf der Säule beeinflusst.

Die Auflösung wird durch die Selektivität der Technik und die Effizienz der chromatographischen Matrix erreicht, um schmale Peaks zu erzeugen. Im Allgemeinen ist eine Auflösung am schwierigsten in den letzten Phasen der Reinigung zu erreichen, in denen das Zielprotein und die Verunreinigungen sehr ähnliche Eigenschaften aufweisen.

Jede Technik bietet ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Kapazität, Geschwindigkeit, Auflösung und Wiederfindung und sollte so ausgewählt werden, dass sie die Ziele jedes Reinigungsschritts erfüllt. Im Allgemeinen kann die Optimierung eines dieser Parameter nur auf Kosten anderer Parameter erreicht werden, und der Reinigungsschritt ist ein Kompromiss.

Die Bedeutung jedes Parameters hängt davon ab, ob ein Reinigungsschritt zum Einfangen, zur Zwischenreinigung oder zum Polieren verwendet wird. Dies steuert die Optimierung kritischer Parameter sowie die Auswahl geeigneter Medien für den Schritt.

Reinigung eines markierten Proteins:

Das Hinzufügen eines Tags zum Protein verleiht dem Protein eine Bindungsaffinität, die es sonst nicht hätte. Normalerweise ist das rekombinante Protein das einzige Protein im Gemisch mit dieser Affinität, das bei der Trennung hilft. Das häufigste Tag ist das Histidin-Tag (His-Tag), das eine Affinität zu Nickel- oder Kobalt-Ionen aufweist. Somit kann durch Immobilisieren von Nickel- oder Kobalt-Ionen auf einem Harz ein Affinitätsträger geschaffen werden, der spezifisch an Histidin-markierte Proteine ​​bindet. Since the protein is the only component with a His-tag, all other proteins will pass through the column, and leave the His-tagged protein bound to the resin.

The protein is released from the column in a process called elution, which in this case involves adding imidazole, to compete with the His-tags for nickel binding, as it has a ring structure similar to histidine. The protein of interest is now the only protein component in the eluted mixture, and can easily be separated from any minor unwanted contaminants by a second step of purification, such as size exclusion chromatography or RP-HPLC.

Another way to tag proteins is to add an antigen peptide to the protein, and then purify the protein on a column containing immobilized antibody. This generates a very specific interaction usually only binding the desired protein. When the tags are not needed anymore, they can be cleaved off by a protease. This often involves engineering a protease cleavage site between the tag and the protein.

Evaluating Purification Yield:

The most general method to monitor the purification process is by running a SDS PAGE, of the different steps. This method only gives a rough measure of the amounts of different proteins in the mixture, and it is not able to distinguish between proteins with similar molecular weight.

If the protein has a distinguishing spectroscopic feature or an enzymatic activity, this property can be used to detect and quantify the specific protein, and thus to select the fractions of the separation, that contains the protein. If antibodies against the protein are available, then western blotting and ELISA can specifically detect and quantify the amount of desired protein. Some proteins function as receptors and can be detected during purification steps by a ligand binding assay, often using a radioactive ligand.

In order to evaluate the process of multistep purification, the amounts of the specific protein have to be compared to the amount of total protein. The latter can be determined by the Bradford total protein assay or by absorbance of light at 280 nm, however some reagents used during the purification process may interfere with the quantification.

For example, imidazole (commonly used for purification of polyhistidine-tagged recombinant proteins) is an amino acid analogue and at low concentrations will interfere with the bicinchoninic acid (BCA) assay for total protein quantification. Impurities in low-grade imidazole will also absorb at 280 nm, resulting in an inaccurate reading of protein concentration from UV absorbance.

Concentration of the Purified Protein:

At the end of protein purification, the protein often has to be concentrated.

Different method exist for this purpose is:

1. Lyophilization:

If the solution does not contain any other soluble component than the protein in question the protein can be lyophilized (dried). This is commonly done after a HPLC run. This simply removes all volatile components leaving the proteins behind.

2. Ultrafiltration:

Ultrafiltration concentrates a protein solution using selective permeable membranes. The function of the membrane is to let the water and small molecules pass through while retaining tin- protein. The solution is forced against the membrane by mechanical pump or gas pressure or centrifugation.

Analysis of Isolated Proteins:

This analysis is done by following techniques:

1. Denaturing-Condition Electrophoresis:

Gel electrophoresis is a common laboratory technique that can be used both as preparative and analytical methods. The principle of electrophoresis relies on the movement of a charged ion in an electric field. In practice, the proteins are denatured in a solution containing a detergent (SDS). In these conditions, the proteins are unfolded and coated with negatively charged detergent molecules. The proteins in SDS-PAGE are separated on the sole basis of their size.

In analytical methods, the protein migrates as bands based on size. Each band can be detected using stains such as Coomassie blue dye or silver stain. Preparative methods to purify large amounts of protein require the extraction of the protein from the electrophoretic gel. This extraction may involve excision of the gel containing a band, or eluting the band directly off the gel as it runs off the end of the gel.

In the context of a purification strategy, denaturing condition electrophoresis provides an improved resolution over size exclusion chromatography, but does not scale to large quantity of proteins in a sample as well as the late chromatography columns.

2. Non-Denaturing-Condition Electrophoresis:

An important non denaturing electrophoretic procedure for isolating bioactive metalloproteins in complex protein mixtures is termed ‘quantitative native continuous polyacrylamide gel electro­phoresis’ (QNC-PAGE).


How to use mechanical microstrainer to extract tissue proteins from human? - Biologie

CALBIOCHEM Calbiochem Inhibitor SourceBook (pdf)

APExBIO Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails (with or without EDTA) for bacterial, fungal and yeast cell extracts
CALBIOCHEM Calbiochem Inhibitor SourceBook (pdf)
G-BIOSCIENCES PhosphataseArrest&trade II is a phosphatase inhibitor cocktail consisting of 5 phosphatase inhibitors that target acid, alkaline and
tyrosine phosphatases. (pdf) (pdf-II)
Phosphatase Inhibitor Cocktail Sets (pdf)
THERMO: Halt&trade Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (pdf)
THERMO: Halt&trade Phosphatase Inhibitor Cocktail. Protects phosphoproteins from serine/threonine phosphatases as well as protein tyrosine
phosphatases (PTPs). The cocktail contains a mixture of four inhibitors of broad specificity, including sodium fluoride, sodium orthovanadate,
sodium pyrophosphate and &beta-glycerophosphate. (pdf)
PROTEINKINASE A comprehensive source of kinase signaling activators, substrates, inhibitors and kinase-related products.
ROCHE PhosSTÖP Phosphatase Inhbitor Cocktail Tablets to inhibit a broad range of phosphatases. (pdf)

Protease Inhibitoren

APExBIO Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails (with or without EDTA) for bacterial, fungal and yeast cell extracts
CALBIOCHEM Calbiochem Inhibitor SourceBook (pdf)
CALBIOCHEM Protease Inhibitor (pdf)
CALBIOCHEM Protease Inhibitor (pdf) (pdf-II)
G-BIOSCIENCES A handbook & selection guide for inhibitors of protease & phosphatases (pdf)
Protease Inhibitor Cocktail Sets (with or without EDTA) for bacterial, fungal and yeast cell extracts (pdf)

THERMO: Halt&trade Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (pdf)
ROCHE Protease Inhibitor Guide (pdf-I) (pdf-II)
ROCHE Universal Protease Substrate (pdf)
SERVA Protease Inhibitors (pdf)
SIGMA Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails (pdf)

CALBIOCHEM Calbiochem Inhibitor SourceBook (pdf)

BIORAD Affi-Prep® Polymyxin Matrix - Removal of endotoxin molecules from biological and aqueous solutions by
affinity chromatography (pdf)
BioDtech EndoBind-R&trade is a DADPA-agaroseconjugated S1 peptide affinity chromatography column. It has been used to remove
endotoxin from water, buffers, and cell culture media. Under optimized conditions, it may also be used to produce endotoxin-free
protein solutions with high recovery. Additionally, the S1 peptide is highly resistant to a wide range of pH&rsquos and ionic strengths
making it suitable for many applications in which traditional chromatography methods, such as ion exchangers, affinity ultrafiltration,
and immunoaffinity matrices are not applicable (pdf)
CAP CODE Pyrochrome® Chromogenic Endotoxin Testing. Can achieve a maximum sensitivity of 0.001 EU/mL (pdf-I) (pdf-II)
CHISSO Cellufine® ET clean for endotoxin removal. The Cellufine ETclean is poly(&epsilon-lysine) immobilized Cellufine® (cellulose spherical
beads). The beads bind and remove endotoxin from your sample solution. The poly(&epsilon-lysine) is a microbial poly(amino acid) that
consist of 30-35 lysine residues produced by Streptomyces albulus. Operating Guidelines: CIP for endotoxin free columns.
Alkali solution and require time for endotoxin free. (pdf)
(1) To reduce endotoxin from a sample solution containing acidic protein with pI 4.0-6.5, you can use Cellufine ET clean-S beads
with a small pore size at pH 5-7 and NaCl concentration of 0.1-0.4 M.
(2) To reduce endotoxin from a sample solution containing neutral or basic protein with pI 7.0-10.5, you can use Cellufine
ET clean-L beads with a large pore size at pH 7-9 and NaCl concentration of 0.1-0.4 M
G-Bioscience EndotoxinOUT&trade.. (pdf)
GENSCRIPT The ToxinEraserTM Endotoxin Removal Resin utilizes immobilized polymixin B to bind and remove pyrogens from solution.
The polymixins are a family of antibiotics that contain a cationic cyclopeptide with a fatty acid chain. Polymixin B neutralizes the
biological activity of endotoxins by binding to the lipid A portion of bacterial lipopolysaccharide. (pdf)
GENSCRIPT ToxinSensorTM Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit. A quantitative In vitro end-point endotoxin test. The method utilizes
a modified Limulus Amebocyte Lysate and a synthetic color producing substrate to detect endotoxin chromogenically. The kit has a
minimum endotoxin detection limit of 0.005 EU/ml and a measurable concentration range of 0.005 to 1 EU/ml.
Requires a color spectrophotometer (pdf) (pdf FAQs)
GENSCRIPT ToxinSensorTM Gel Clot Endotoxin Assay Kit is designed as a simple and sensitive in vitro end-product endotoxin test.
Limulus Amebocyte Lysate supplied in the kit needs to be reconstituted with LAL Reagent Water and then mixed in equal parts with
the solution being tested. After incubation, and in the presence of endotoxin, gelation occurs in the absence of endotoxin, gelation
does not occur. Requires a 37 °C water bath, and the visible gel formation is present in final results (pdf) (pdf FAQs)
HYGLOS EndoLISA® new method for efficient and reliable determination of endotoxin (LPS) levels (alternative to LAL). Benutze einen
lipopolysaccharide (LPS) specific phage-derived protein. Measurement range: 0.05 - 500 EU/ml. pH range: 4 - 9.
No interference in high salt conditions e.g. NaCl, GdnHCl (pdf-I) (pdf-II)
HYGLOS Endo Trap Endotoxin Removal System (pdf-1) (pdf-2) (pdf-3)
HYGLOS EndoTrap® blue and EndoTrap® red. EndoTrap is an affinity matrix for the efficient removal of bacterial endotoxins from solutions.
(pdf-I) (pdf-II) (pdf-III)
Application protocol for a FPLC/HPLC automayed system (pdf)
HYGLOS Endotoxin removal methods - advantages & disadvantages (attachment)
MILLIPORE Matrex Cellufine Sulfate - For concentration, purification and depyrogenation of Virus, Viral/Microbial Antigen,
Heparin binding proteins (pdf)
NORGEN Endotoxin Removal Kit. Designed for the rapid removal of endotoxins from purified DNA. (pdf) (pdf Mini)
PALL Protein Sample Preparation and Analysis Application Manual: 2.6 Endotoxin Removal (pdf2)
ProMetic BioSciences EtoxiClear&trade: A new adsorbent for the efficient removal of endotoxin from biopharmaceuticals (pdf) (pdf-brochure) (pdf-poster)
THERMO: Detoxi-Gel Endotoxin Removing gel : immobilized polymixin B (pdf)
THERMO: Pierce® High-Capacity Endotoxin Removal Resin. Porous cellulose beads that have been surface modified with covalently attached,
modified &epsilon-poly-L-lysine (pdf)
THERMO: The Thermo Scientific Pierce LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit is an efficient, quantitative endpoint assay for the detection
of gram-negative bacterial endotoxins. Bacterial endotoxin catalyzes the activation of a proenzyme in the modified Limulus Amebocyte Lysate
(LAL). The activated proenzyme then catalyzes the splitting of P-Nitroaniline (pNA) from the colorless substrate, Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA
the activation rate is proportional to the sample endotoxin concentration. After stopping the reaction, the released pNA is photometrically
measured at 405-410nm. The correlation between absorbance and endotoxin concentration is linear in the 0.1-1.0EU/mL range. The developed
color intensity is proportional to the amount of endotoxin present in the sample and can be calculated using a standard curve. (pdf)
VIVASCIENCE Removal of endotoxin from monoclonal antibodies using Vivapure&trade centrifugal ion exchange membrane devices (pdf)

Y. Aida and M. Pabst Removal of endotoxin from protein solutions by phase separation using Triton X-114
Journal of lmmunological Methods, 132 (1990) 191-195
(pdf)
Anspach, Friedrich Birger Review : Endotoxin removal by affinity sorbents J. Biochem. Biophys. Methods 49 (2001) 665&ndash681 (pdf)
T. Zimmerman et al. Simultaneous metal chelate affinity purification and endotoxin clearance of recombinant antibody fragments
Journal of Immunological Methods 314 (2006) 67&ndash73 (pdf)
Z. Chen et al. Efficient production of recombinant IL-21 proteins for pre-clinical studies by a two-step dilution refolding method Int Immunopharmacol (2013), http://dx.doi.org/10.1016/j.intimp.2013.02.017 (pdf)
Rodrigo Vazquez-Lombardi et. al: Transient expression of human antibodies in mammalian cells
Nature Protocols | VOL.13 NO.1 | 2018 | 99 Published online 14 December 2017 doi:10.1038/nprot.2017.126 (pdf)
David Koziel et. al: Broad application and optimization of a single wash-step for integrated endotoxin depletion during protein purification
Journal of Chromatography B 1091 (2018) 101&ndash107 (pdf)

Detergents
ANATRACE How to purify a membrane protein-Technical bulletin (pdf)
ANATRACE Structure of Detergents (pdf)
ANATRACE Detergent Properties List (pdf)
ANATRACE Detergents and their use in membrane protein science. Handbook that introduce the researcher to the physical and chemical
properties of detergents and describe how these properties relate to detergent function. (pdf) (pdf-II)
ANATRACE Amphipol A8-35 Amphipathic surfactant for maintaining solubilized membrane proteins in detergent-free solutions. Serve as
stabilizers of membrane proteins in aqueous solutions. Amphipols can substitute out the detergents used to extract membrane proteins,
keeping them soluble in detergent-free aqueous solution while stabilizing them biochemically.
Applications: Stabilization of native membrane protein structure. Facilitating membrane protein folding /refolding. NMR, etc (pdf)
ANATRACE Neopentyl Glycol (NG) class detergents are revolutionary new amphiphiles which have already shown great utility in membrane
protein studies. NG class detergents are a more effective detergent for extracting and solubilizing/ stabilizing proteins, and are particularly
beneficial in crystallization due to his revolutionary new architecture that allows the molecule to pack densely when forming a micelle,
producing exceptionally low critical micelle concentrations and extreme water solubility (pdf)
Naturmethoden: "Maltose&ndashneopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization, stabilization and crystallization of membrane proteins &rdquo
by groups from Jean-Luc Popot, Brian Kobilka, and Samuel H. Gellman labs (pdf)
ANATRACE Application References (pdf)
CALBIOCHEM Biological Detergents. Guide for solubilization of membrane proteins and selecting tools for detergent removal (pdf)
CALBIOCHEM A guide to the properties and uses of detergents in Biology and Biochemistry (pdf-I) (pdf-II)
CALBIOCHEM Table of detergents and buffers (pdf-I) (pdf-II)
G-BIOSCIENCES A Handbook & Selection Guide to Detergents & Detergent Removal . Dye solubilization assay for CMC determination (pdf)
G-BIOSCIENCES Optimizer blueBALLS&trade. A simple product and method to determine the optimal detergent concentration. Glass balls
that have been coated with a hydrophobic blue dye that has the same properties as membrane proteins. The solubilization of the dye
only occurs when micelles have been formed. (pdf)
GEBA SDS removing buffer designed for removing bound-SDS from protein sample using ProteoConD kit. (pdf)
GE Healthcare Membrane Protein Purification Kit. Efficient detergent screening of histidine-tagged membrane proteins. Small aliquots of cell
membranes are solubilized in different detergents followed by rapid purification using His Mag Sepharose&trade Ni. The purification step
is performed directly after solubilization using the same detergent. Analysis and evaluation can be performed by a number of methods
such as Western blot, gel filtration, or light scattering. (pdf)
JENA BIOSCIENCE JB Screen Detergents cover all detergents that have been successfully used for the crystallization of membrane proteins.
(pdf-1) (pdf-2) (pdf-3)
MILLIPORE Detergent Removal with Amicon® Microcon® and Centricon® Centrifugal Devices (pdf)
Percentage Removal of different detergents after one spin
NORGEN ProteoSpin&trade Detergent Clean-Up Kit. Provides a fast and simple procedure for the removal of SDS, Triton® X-100 and other detergents
from acidic or basic protein samples. It is designed to remove all types of detergents in protein solutions either in their free form or bound form,
as when complexed with the protein. Purification is based on spin column chromatography using Norgen&rsquos proprietary resin as the separation
matrix . (pdf Micro) (pdf Maxi)
PALL SDR HyperD® Detergent Removal and Solvent removal (e.g. Tri-n-Butyl Phosphate &ndash or TnBP). Stable in acid, polar organic
and oxidizing solutions. (pdf-I) (pdf-II)
PALL Protein Sample Preparation and Analysis Application Manual : 2.3 Detergent Removal (pdf2)
THERMO: Extracti-Gel D Detergent Removing gel (pdf)
THERMO: Remove detergent from protein samples (pdf)
Overview of Removal Methods. General Detergent Properties. Appropriate Methods of Removal for Specific Detergents
SIGMA Detergents. Detergent Properties and Applications. Detergent Types and Selection. Detergent Selection Table. BioUltra Detergents
(pdf - see pg 13)
SIGMA Cyclodextrins (pdf - see pg 32)
SIGMA Antifoams (pdf - see pg 33)
SIGMA Detergent Removal (pdf - see pg 35
SIGMA Detergents Properties and Applications (pdf)
SIGMA Table of detergents (pdf)

Proteases sensitivity to Detergents

James M. Vergis, Michael C. Wiener (2011) The variable detergent sensitivity of proteases that are utilized for recombinant protein affinity tag removal
Protein Expression and Purification 78 : 139&ndash142 (pdf)

Mohanty A. et.al. (2003) Inhibition of tobacco etch virus protease activity by detergents. Protein Expression and Purification 27: 109&ndash114 (pdf)

Cell Penetration

ABBIOTEC Lipodin-Pro TM is a protein transfection reagent, for transporting biologically active peptides and proteins directly into living cells.
Is a lipid-based formulation that is added to the protein of interest minutes before cell delivery. Within few hours, protein activity can be observed
in living or fixed cells. Ideal for monitoring kinetics of biological activities in established cell lines and primary cells, including neurons. No chemical
ligation or crosslinking. Serum compatible, no cytotoxicity and biodegradable. Up to 95% efficiency in less than 5 hours. (pdf)
ABBIOTEC Lipodin-Ab TM is a reagent optimized for Antibody delivery into living cells. A lipid-based formulation that is added to the antibody
solution minutes before cell delivery. Within few hours, antibody staining can be observed in living or fixed cells. I deal for staining intracellular proteins
without fixation in established cell lines and primary cells, including neurons. No need for cell fixation protocol. Serum compatible, no cytotoxicity and
biodegradable. Deliver functionally active antibody within hours. Up to 95% efficiency. (pdf)
ACTIVE MOTIVE Chariot&trade is a revolutionary delivery reagent that quickly and efficiently transports biologically active proteins, peptides and antibodies
directly into cells. The typical delivery efficiency is 60-95%. Less than two hours after delivery, live cells can be assayed to determine the effects of the
introduced material, without the need for fixing. This makes Chariot an ideal tool for functional studies, including delivering inhibitory proteins, labeling
organelles, screening peptide libraries and studying protein half-lives & transient complementation. (pdf)
JENA BIOSCIENCE &ldquoProtein Transduction Domains&rdquo (PTDs) or &ldquoCell penetrating peptides&rdquo (CPPs) used to internalize peptides, proteins,
oligonucleotides, nucleic acids, modified nucleic acids like PNAs or morpholino oligonucleotides and plasmids. CPPs were successfully
tested on a large number of different cells including mammalian cells and plant cells, cell cultures and primary cells intracellular
delivery into nerve cells and for penetration of the blood-brain barrier. (pdf-I) (pdf-II)
JBS-Proteoducin: Cocktail developed for internalization of peptides and proteins into living cells
JBS-Nucleoducin: Internalization of mono- and olgonucleotides into live cells
The amphiphilic CPPs MPG , MPG and CAD-2 are designed for formation of non-covalent complexes with peptides, proteins,
plasmids and nucleic acids and their mimics. They strongly differs in their polarities.
Penetratin and HIV-Tat are classical CPPs that are widely used for forming conjugates or fusion proteins

Concentration / Ultrafiltration / Dialysis / Desalting Columns

Protein concentration by ultrafiltration and buffer solubility screen
AmiKa Corp Produce a unique range of products for microdialysis of small (10 to 5000 microlitres) sample volumes (proteins, peptides, nucleic acids
and other biomolecules), electroelution, electrodialysis, electro-concentration, Coomassie Blue removal, and quantitative protein determination
BioToolomics: SuperSpinTM Desaltor (pdf)
G-Bioscience Sample Preparation - Lysis - Fractionation - Clean-Up & Concentration - Handbook & Selection Guide (pdf)
G-Bioscience The Column PROTEIN- Concentrate Kit has been specifically developed for concentration of those proteins that cannot be
concentrated either by precipitation or other techniques. The kit is based on a proprietary Protein Binding Resin that binds and immobilizes
any protein in low salt buffer between pH 2-12 (capacity

0.5mg protein/ml Protein Binding Resin). The immobilized protein is spin-eluted
in a small volume of specifically formulated elution buffer, giving several fold effective concentration. This kit is suitable for concentration of
a total of 4mg protein in either single or multiple procedures. (pdf)
G-Bioscience The OrgoSol PROTEIN Concentration&trade kit is based on precipitation of protein in a proprietary combination of organic
solvents. The kit has been specifically developed for efficient precipitation of protein solution with a minimal disruption to the protein
structure and thus maintaining biological activity of most proteins. This kit is therefore suitable for concentration of protein solutions
where maintaining biological activity is essential. (pdf)
G-Bioscience Tube-O-DIALYZER&trade (pdf)
GEBA Maxi GeBAflex-tube Gel Extraction and Dialysis Kit (3 ml) Handbook. Applications: Extraction of proteins, RNA, DNA or oligonucleotides
from polyacrylamide, agrose or any gel matrix in any running buffer dialysis or buffer exchange of volumes between 0.1-3 ml
and preparation of protein samples for MALDI-MS. (pdf-I) (pdf-II)
GE Healthcare Selecting. Hollow fiber. Cartriges and Systems (pdf)
GE Healthcare Membrane separations: range of options (pdf)
GE Healthcare PD-10 Desalting Columns, PD MidiTrap G-25, PD MiniTrap G-25, PD SpinTrap G-25, and PD MultiTrap G-25.
Prepacked, single-use columns and 96-well filter plates for a wide range of applications including desalting, buffer exchange, and the
removal of low-molecular weight compounds. Centrifugation protocol with all gravity columns. (pdf)
GE Healthcare PD 10 Desalting columns (pdf)
GE Healthcare PD SpinTrap G-25 (pdf)
GE Healthcare Vivaspin 500, 2, 6 and 20. Vivaspin Concentrators are disposable ultrafiltration devices for the concentration of biological samples (pdf)
MERCK D-Tube&trade Dialyzers D-Tube&trade Mini, Midi, Maxi and Mega (pdf pg 29-30)
Amicon® Ultra Centrifugal Filters (pdf pg 31-42)
MILLIPORE - AMICON: Protein Purification, Concentration and Dialysis (pdf) (pdf-II)
MILLIPORE Stirred Ultrafiltration Cells Models 8003, 8010, 8050, 8200, 8400. User Guide. Millipore stirred ultrafiltration cells are designed for
rapid concentration or purification of macromolecular solutions in volumes from 3 to 400 mL (pdf)
MILLIPORE Solvent Resistant Stirred Cells for Ultrafiltration and Filtration Applications (pdf)
MILLIPORE Model 2000 High-performance Ultrafiltration Cell. The 2000 series of internally stirred ultrafiltration cells are designed for rapid
concentration or purification of macromolecular solutions in volumes up to 2000 ml. (pdf)
MILLIPORE - AMICON ( Ultrafiltration) Centrifuge Filter Devices (pdf)
MILLIPORE Detergent Removal with Amicon® Microcon® and Centricon® Centrifugal Devices (pdf)
Percentage Removal of different detergents after one spin
MILLIPORE Membrane-based Tangential Flow Filtration (TFF). Membrane-based Tangential Flow Filtration (TFF) unit operations are used
for clarifying, concentrating, and purifying proteins. This technical brief is a practical introduction to protein processing using tangential
flow filtration. It is intended to help scientists and engineers achieve their protein processing objectives by discussing how the choice
of key components and operating parameters will affect process performance. (pdf)
MILLIPORE Ultrafiltration Membranes for Macromolecule Processing . This guide provides an introduction to Millipore&rsquos family of Ultrafiltration
Membranes and an overview of the key criteria and product characteristics to consider when selecting an UF membrane (pdf)
NORGEN ProteoSpin&trade CBED (Concentration, Buffer Exchange and Desalting) Kit. The simultaneous removal of salts while concentrating a dilute
protein solution makes the kit a convenient method for preparing proteins before running many downstream applications such as SDS-PAGE
and isoelectric focusing. Purification is based on spin column chromatography using Norgen&rsquos proprietary resin as the separation matrix. Diese
large columns are frequently used to prepare protein samples for structural analysis where larger amounts of protein are needed, such as
X-ray crystallography, NMR spectroscopy and other applications. The ProteoSpin&trade CBED Maxi Kit comes with solutions for concentrating
and desalting both acidic and basic proteins. (pdf for Micro) (pdf for Maxi)
NOVAGEN D-Tube&trade Dialyzers and D-Tube Electroelution Kit . Easy-to-handle dialyzers in a capped centrifuge tube format with dialysis membrane
windows for buffer exchange and removal of solutes. The disposable, single-use tubes require no syringes, centrifuge, or laborious steps
to manipulate small sample volumes. Available with molecular weight cut-offs from 3.5 to 14 kDa and are designed with three volume
capacities: mini (10&ndash250 ml), midi (50&ndash800 ml), and maxi (100&ndash3000 ml). The membrane is ultra-clean, EDTA-treated regenerated
cellulose, sulfur- and heavy metal-free. (pdf)
NOVAGEN D-Tube96 Dialyzer . The membrane is ultra clean, EDTA-treated regenerated cellulose, sulfur- and heavy metal-free and available in
molecular weight cutoffs of 6-8 kDa or 12-14 kDa. The D-Tube Dialyzers Mini have a capacity of 10-250 &mul and are ideal for small
Proben. (pdf)
PALL Protein Sample Preparation and Analysis Application Manual :
2.4 Concentration, Desalting, and Buffer Exchange (pdf2)
4.4 Buffer Exchange, Desalting, and Concentration (pdf4)
6.2 Optional Pre-Treatment to Improve Recovery of Samples from Ultrafiltration Spin Filters (pdf6)
6.4 General Filtration Procedures for AcroPrep&trade and AcroWell&trade Filter Plates (pdf6)
PALL Centrifugal Devices for Ultrafiltration & Microfiltration. A full range of precise, high-performance products to rapidly process volumes from
50 µL to 60 mL. (pdf-I) (pdf-II) (pdf-III)
PALL Trisacryl® GF05 M, LS Size Exclusion Chromatography Sorbents. Designed for desalting and for the separation of small molecules.
40-80 &mum for M grade & 80-160 &mum for LS grade for fractionation at high flow with low pressure, designed for industrial scale. (pdf)
PALL Products for Sterile Filtration, Clarification and Separation in the Laboratory. Technologies for Complex Lab Bioprocessing (pdf)
THERMO: iCON&trade Concentrator 7 ml/9K, 7 ml/20K, 20ml ml/9K and 20mlml/20K . Disposable ultrafiltration centrifugal devices for concentration
and diafiltration/buffer exchange of biological samples such as enzymes, antibodies or DNA. (pdf-I) (pdf-II)
THERMO: Protein desalting Spin Columns (pdf)
THERMO: Zeba&trade 96-well Desalt Spin Plates contain a resin that offers high-performance desalting and protein recovery characteristics for
multiple sample processing. Sample volumes from 20 to 100 &mul can be processed with > 95% retention of salts and other small
molecules (< 1,000 Da) and exceptional protein recovery. (pdf)
THERMO: Zeba&trade Micro Desalt Spin Columns (pdf)
THERMO: High-Performance Dialysis and Desalting Brochure: Slide-A-Lyzer® MINI Dialysis Units iCON&trade Protein Concentrators
SnakeSkin® Dialysis Tubing and Desalting Columns (pdf-I) (pdf-II)
THERMO: Dyalisis Cassettes (pdf)
PIERCE MINI Dyalisis Unit (pdf)
SARTORIUS Diatomaceous Earth Filtration
High&ndashCell-Density Clarification By Single-Use Diatomaceous Earth Filtration (pdf)
Innovative Single-Use Concepts for Clarification of High-Density Mammalian Cell Cultures (pdf)
SARTORIUS (Ultrafiltration) Centrifugal Units - Centrisart Units. Spiral Flow Filtration Cells (10-100ml) (pdf)
SPECTRUM LABORATORIES Float-A-Lyzer® &bull DispoDialyzer® &bull Micro DispoDialyzer® Dialysis Membranes with Different Molecular
Weight Cut-offs (pdf) (pdf-II)
Tangential flow membrane for Biomedical Separation
THE NEST GROUP Ultra-filtration, Dialysis, Spin Columns or 96 Well Plates for Salt Removal - Buffer Exchange
Salt Removal - Buffer Exchange MicroDialysis, Equilibrium Dialysis, and Electroelution. Single-Sided Biodialyzer, Double-Sided
Biodialyzer, Disposable Dialyzers, Equilibrium Dialysis and Membranes and Electroelution (pdf)
Equilibrium dialysis (pdf)
96-Well DispoDIALYZER&trade- Samples from 25&mul to 300&mul. Range of membrane MWCO&rsquos available: 1K, 2K, 5K, 10K,
and 25K Daltons (pdf)
Micro DispoDialyzer&trade - Samples from 5&mul to 100&mul and Macro Fast DispoDIALYZER&trade - Samples from 1ml to 10ml (pdf )
VIVASCIENCE Ultrafiltration Products Catalogue (pdf-I) (pdf-II) (pdf-III)
Vivaspin® Turbo 15 ultrafiltration spin columns (pdf)
VIVASCIENCE Vivapure® C18 Micro spin columns. Innovative membrane-based devices for concentration, purification and desalting of peptides
prior to analysis by mass spectrometry. (pdf-I) (pdf-II) (pdf-III)
VIVASCIENCE Concentration of Peptides with Vivaspin 500 Ultrafiltration Devices (pdf)


Summary and future perspective

In this focus review, we focused on structural proteins and broadly outlined them in terms of their definitions, properties, and syntheses as well as their potential as materials and quantification techniques. As mentioned at the beginning of this review, although structural proteins such as silk and elastin are used as structural materials in nature, they have not been put into practical use as bulk-scale structural materials for human use. The challenges of using proteins and polypeptides as structural materials are multifaceted and include their material design, synthesis, purification, and processing. In the future, the author hopes that more scientists will enter this field and establish innovative techniques for molecular design, synthesis, material design, and processing to achieve structural proteins with optimal physical and biological properties.


Mapping the brain, cell by cell

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MIT chemical engineers and neuroscientists have devised a new way to preserve biological tissue, allowing them to visualize proteins, DNA, and other molecules within cells, and to map the connections between neurons.

The researchers showed that they could use this method, known as SHIELD, to trace the connections between neurons in a part of the brain that helps control movement and other neurons throughout the brain.

“Using our technique, for the first time, we were able to map the connectivity of these neurons at single-cell resolution,” says Kwanghun Chung, an assistant professor of chemical engineering and a member of MIT’s Institute for Medical Engineering and Science and Picower Institute for Learning and Memory. “We can get all this multiscale, multidimensional information from the same tissue in a fully integrated manner because with SHIELD we can protect all this information.”

Chung is the senior author of the paper, which appears in the Dec. 17 issue of Natur Biotechnologie. The paper’s lead authors are MIT postdocs Young-Gyun Park, Chang Ho Sohn, and Ritchie Chen.

Chung is now leading a team of researchers from several institutions that recently received a National Institutes of Health grant to use this technique to produce three-dimensional maps of the entire human brain. “We will be working with the Matthew Frosch group at MGH, the Van Wedeen group at MGH, the Sebastian Seung group at Princeton, and the Laura Brattain group at MIT Lincoln Lab to generate the most comprehensive brain map yet,” he says.

Preserving information

Brain tissue is very delicate and cannot be easily studied unless steps are taken to preserve the tissue from damage. Chung and other researchers have previously developed techniques that allow them to preserve certain molecular components of brain tissue for research, including proteins or messenger RNA, which reveals which genes are turned on.

However, Chung says, “there is no good method that can preserve everything.”

Chung and his colleagues hypothesized that they might be able to better preserve tissue using molecules called polyepoxides — reactive organic molecules that are often used to produce glues. They tested several commercially available polyepoxides and discovered one that had distinctive structural traits that made it ideally suited for their purposes.

The epoxide they chose has a flexible backbone and five branches, each of which can bind to certain amino acids (the building blocks of proteins), as well as other molecules such as DNA and RNA. The flexible backbone allows the epoxides to bind to several spots along the target molecules, and to form cross-links with nearby biomolecules. This renders individual biomolecules and the entire tissue structure very stable and resistant to damage from heat, acid, or other harmful agents. SHIELD also protects key properties of biomolecules, such as protein fluorescence and antigenicity.

To protect large-scale brain tissues and clinical samples, the researchers combined SHIELD with SWITCH, another technique they developed to control chemical reaction speed. They first use the SWITCH-OFF buffer, which halts chemical reactions, to give the epoxides time to diffuse through the entire tissue. When the researchers move the sample to SWITCH-ON condition, the epoxides begin to bind to nearby molecules.

To speed up the clearing and labeling process of SHIELD-protected tissue, the researchers also applied a randomly changing electric field, which they have previously shown increases the transport rate of the molecules. In this paper, they showed that the entire process from preservation to labeling of biopsy tissue could be performed in just four hours.

“We found that this SHIELD coating keeps proteins stable against harsh stressors,” Chung says. “Because we can preserve all the information that we want, and we can extract it at multiple stages, we can better understand the functions of biological components, including neural circuits.”

Once the tissue is preserved, the researchers can label a variety of different targets, including proteins and mRNA produced by the cells. They can also apply techniques such as MAP, which Chung developed in 2016, to expand the tissue and image it at different size scales.

In this paper, the researchers worked with Byungkook Lim’s group at the University of California at San Diego to use SHIELD to map a brain circuit that begins in the globus pallidus externa (GPe), part of the brain’s basal ganglia. This region, which is involved in motor control and other behaviors, is one of the targets of deep brain stimulation — a type of electrical stimulation sometimes used to treat Parkinson’s disease. In the mouse brain, Chung and his colleagues were able to trace the connections between neurons in the GPe and in other parts of the brain, and to count the number of putative synaptic connections between these neurons.

Better biopsies

The speed of SHIELD tissue processing means that it also holds promise for performing rapid, more informative biopsies of patient tissue samples, Chung says. Current methods require embedding tissue samples with paraffin, slicing them, and then applying stains that can reveal cell and tissue abnormalities.

“The current way of doing tissue diagnosis hasn’t changed in many decades, and the process takes days or weeks,” Chung says. “Using our technique, we can rapidly process intact biopsy samples and immuno-label them with really specific, clinically relevant antibodies, and then image the whole thing at high resolution, in three dimensions. And everything can be done in four hours.”

In this paper, the researchers showed that they could label mouse kidney tumor with an antibody that targets proliferating cancer cells.

“The stabilization and preservation of biological information within tissue samples is essential in experiments for optical microscopy,” says Liqun Luo, a professor of biology at Stanford University, who was not involved in the research. “The achievement of SHIELD is not a large advance in just one category, but rather marked improvements across the board, in preserving proteins, transcripts, and tissue structure, as samples are processed through the harsh techniques prescribed by today's best labeling and imaging protocols.”

The MIT team hopes to make this technology widely available and has already distributed it to more than 50 labs around the world. The research was funded by the Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface, the Searle Scholars Program, the Packard Award in Science and Engineering, the NARSAD Young Investigator Award, the McKnight Foundation Technology Award, the JPB Foundation, and NCSOFT Cultural Foundation, and the National Institutes of Health.


Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.

C.-M.M. and C.P. contributed equally to this work. C.-M.M. and C.P. conceived, executed, and analyzed results of experiments. A.M.W. aided with cell culture maintenance. M.A. and J.A.Z. did the XµCT experiments and their subsequent image analysis. R.M.O. conceived and directed research on the paper. The manuscript was written and edited by C.-M.M., C.P., and R.M.O.

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