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3.9.1: Endozytose - Biologie

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LERNZIELE

  • Beschreiben Sie Endozytose, einschließlich Phagozytose, Pinozytose und rezeptorvermittelte Endozytose.

Endozytose ist eine Art des aktiven Transports, der Partikel wie große Moleküle, Zellteile und sogar ganze Zellen in eine Zelle bewegt. Es gibt verschiedene Varianten der Endozytose, aber alle haben ein gemeinsames Merkmal: Die Plasmamembran der Zelle stülpt sich ein und bildet eine Tasche um das Zielpartikel. Die Tasche wird abgeschnürt, was dazu führt, dass das Partikel in einem neu gebildeten intrazellulären Vesikel aus der Plasmamembran enthalten ist.

Phagozytose

Phagozytose (der Zustand des „Zellfressens“) ist der Prozess, bei dem große Partikel, wie Zellen oder relativ große Partikel, von einer Zelle aufgenommen werden. Wenn beispielsweise Mikroorganismen in den menschlichen Körper eindringen, entfernt eine Art von weißen Blutkörperchen, die als Neutrophile bezeichnet wird, die Eindringlinge durch diesen Prozess, indem sie den Mikroorganismus umgibt und verschlingt, der dann von den Neutrophilen zerstört wird.

In Vorbereitung auf die Phagozytose wird ein Teil der nach innen gerichteten Oberfläche der Plasmamembran mit einem Protein namens Clathrin beschichtet, das diesen Abschnitt der Membran stabilisiert. Der beschichtete Teil der Membran erstreckt sich dann aus dem Zellkörper und umgibt das Partikel und umschließt es schließlich. Sobald das Vesikel mit dem Partikel in der Zelle eingeschlossen ist, löst sich das Clathrin von der Membran und das Vesikel verschmilzt mit einem Lysosom zum Abbau des Materials im neu gebildeten Kompartiment (Endosom). Wenn zugängliche Nährstoffe aus dem Abbau des vesikulären Inhalts extrahiert wurden, verschmilzt das neu gebildete Endosom mit der Plasmamembran und gibt seinen Inhalt in die extrazelluläre Flüssigkeit ab. Die endosomale Membran wird wieder Teil der Plasmamembran.

Pinozytose

Eine Variante der Endozytose wird Pinozytose genannt. Dies bedeutet wörtlich „Zelltrinken“ und wurde zu einer Zeit benannt, als davon ausgegangen wurde, dass die Zelle absichtlich extrazelluläre Flüssigkeit aufnimmt. In Wirklichkeit ist dies ein Prozess, bei dem Moleküle, einschließlich Wasser, aufgenommen werden, die die Zelle aus der extrazellulären Flüssigkeit benötigt. Pinozytose führt zu einem viel kleineren Vesikel als Phagozytose, und das Vesikel muss nicht mit einem Lysosom verschmelzen.

Die Potozytose, eine Variante der Pinozytose, ist ein Prozess, bei dem ein Beschichtungsprotein namens Caveolin auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran verwendet wird, das eine ähnliche Funktion wie Clathrin ausübt. Die Hohlräume in der Plasmamembran, die die Vakuolen bilden, haben neben Caveolin Membranrezeptoren und Lipid-Rafts. Die bei Caveolae (Singular Caveola) gebildeten Vakuolen oder Vesikel sind kleiner als bei der Pinozytose. Die Potozytose wird verwendet, um kleine Moleküle in die Zelle zu bringen und diese Moleküle durch die Zelle zu transportieren, um sie auf der anderen Seite der Zelle freizusetzen, ein Prozess, der als Transzytose bezeichnet wird.

Rezeptor-vermittelte Endozytose

Eine gezielte Variante der Endozytose, die sogenannte rezeptorvermittelte Endozytose, nutzt Rezeptorproteine ​​in der Plasmamembran, die eine spezifische Bindungsaffinität für bestimmte Substanzen aufweisen. Bei der rezeptorvermittelten Endozytose wird Clathrin wie bei der Phagozytose an die zytoplasmatische Seite der Plasmamembran angelagert. Wenn die Aufnahme einer Verbindung von einer rezeptorvermittelten Endozytose abhängt und das Verfahren unwirksam ist, wird das Material nicht aus den Gewebeflüssigkeiten oder dem Blut entfernt. Stattdessen bleibt es in diesen Flüssigkeiten und erhöht die Konzentration. Einige menschliche Krankheiten werden durch das Versagen der rezeptorvermittelten Endozytose verursacht. Beispielsweise wird die Form von Cholesterin, die als Low-Density-Lipoprotein oder LDL (auch als „schlechtes“ Cholesterin bezeichnet) bezeichnet wird, durch rezeptorvermittelte Endozytose aus dem Blut entfernt. Bei der humangenetischen Erkrankung familiäre Hypercholesterinämie sind die LDL-Rezeptoren defekt oder fehlen ganz. Menschen mit dieser Erkrankung haben einen lebensbedrohlichen Cholesterinspiegel im Blut, da ihre Zellen LDL-Partikel nicht aus ihrem Blut entfernen können.

Obwohl die rezeptorvermittelte Endozytose darauf abzielt, spezifische Substanzen, die normalerweise in der extrazellulären Flüssigkeit vorkommen, in die Zelle zu bringen, können andere Substanzen an derselben Stelle in die Zelle eindringen. Grippeviren, Diphtherie und Cholera-Toxin haben alle Stellen, die mit normalen Rezeptorbindungsstellen kreuzreagieren und in Zellen eindringen.

Wichtige Punkte

  • Die Endozytose besteht aus Phagozytose, Pinozytose und rezeptorvermittelter Endozytose.
  • Bei der Endozytose gelangen Partikel in die Zelle, die zu groß sind, um die Zellmembran passiv zu passieren.
  • Phagozytose ist die Aufnahme großer Nahrungspartikel, während Pinozytose flüssige Partikel aufnimmt.
  • Bei der rezeptorvermittelten Endozytose werden spezielle Rezeptorproteine ​​verwendet, um große Partikel durch die Zellmembran zu transportieren.

Schlüsselbegriffe

  • Endosom: Eine endozytische Vakuole, durch die während der Endozytose internalisierte Moleküle auf dem Weg zu Lysosomen gelangen
  • neutrophile: Eine Zelle, insbesondere ein weißes Blutkörperchen, die fremde Eindringlinge im Blut verzehrt.

Endozytose und Exozytose

Die Bewegung von Makromolekülen wie Proteinen oder Polysacchariden in die oder aus der Zelle wird als . bezeichnet Massentransport. Es gibt zwei Arten von Massentransporten, Exozytose und Endozytose, und beide erfordern den Energieaufwand (ATP).

In Exozytose, Materialien sind exportiert über sekretorische Vesikel aus der Zelle. Dabei verpackt der Golgi-Komplex Makromoleküle in Transportvesikel, die zur Plasmamembran wandern und mit ihr verschmelzen. Diese Fusion führt dazu, dass das Vesikel seinen Inhalt aus der Zelle herausspritzt. Exozytose ist wichtig bei der Ausscheidung von Abfallstoffen aus der Zelle und bei der Sekretion von Zellprodukten wie Verdauungsenzymen oder Hormonen.

Endozytose, andererseits ist der Prozess, durch den sich Materialien bewegen hinein die Zelle. Es gibt drei Arten von Endozytose: Phagozytose, Pinozytose, und rezeptorvermittelte Endozytose. In Phagozytose oder „zelluläres Essen“, die Plasmamembran der Zelle umgibt ein Makromolekül oder sogar ein ganzes Zelle aus der extrazellulären Umgebung und knospen ab, um eine Nahrungsvakuole zu bilden oder Phagosom. Das neu gebildete Phagosom verschmilzt dann mit einem Lysosom, dessen hydrolytische Enzyme die „Nahrung“ im Inneren verdauen.

In Pinozytose oder „zelluläres Trinken“, die Zelle verschlingt Flüssigkeitstropfen, indem sie sich einklemmt und Bläschen bildet, die kleiner sind als die Phagosomen, die bei der Phagozytose gebildet werden. Wie die Phagozytose ist die Pinozytose ein unspezifischer Prozess, bei dem die Zelle alle gelösten Stoffe aufnimmt, die in der Flüssigkeit, die sie umhüllt, gelöst sind.

Im Gegensatz zu Phagozytose und Pinozytose rezeptorvermittelte Endozytose ist ein äußerst selektiver Prozess zum Importieren von Materialien in die Zelle. Diese Spezifität wird vermittelt durch Rezeptorproteine befindet sich auf vertieften Bereichen der Zellmembran, genannt beschichtete Gruben. Die zytosolische Oberfläche beschichteter Pits ist bedeckt von Hüllproteine. Bei der rezeptorvermittelten Endozytose nimmt die Zelle nur dann ein extrazelluläres Molekül auf, wenn es an sein spezifisches Rezeptorprotein auf der Zelloberfläche bindet. Nach der Bindung wird die beschichtete Grube, auf der sich das gebundene Rezeptorprotein befindet, invaginiertoder quetscht sich ein, um ein beschichtetes Vesikel zu bilden. Ähnlich dem Verdauungsprozess bei der unspezifischen Phagozytose verschmilzt dieses beschichtete Vesikel dann mit einem Lysosom, um das eingeschlossene Material zu verdauen und in das Zytosol freizugeben. Säugetierzellen verwenden eine rezeptorvermittelte Endozytose, um Cholesterin in die Zellen aufzunehmen. Cholesterin im Blut wird normalerweise in Lipid-Protein-Komplexen gefunden, die als bezeichnet werden Lipoproteine ​​niedriger Dichte (LDL). LDLs binden an spezifische Rezeptorproteine ​​auf der Zelloberfläche und lösen so deren Aufnahme durch rezeptorvermittelte Endozytose aus.


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Intrazelluläres Trafficking-Netzwerk und Autophagie von PHBHHx-Nanopartikeln und ihre Auswirkungen auf die Wirkstoffabgabe

3-Hydroxybutyrat-co-3-hydroxyhexanoat (PHBHHx), das natürlicherweise durch biologisch abbaubare Polyhydroxyalkanoate erzeugt wird, die von Bakterien synthetisiert werden, ist aufgrund seiner kontrollierbaren physikalischen Eigenschaften, Ungiftigkeit, Umweltfreundlichkeit, Abbaubarkeit und guter Biokompatibilität ein attraktives Material für die Wirkstoffabgabe . Allerdings wurden die Wege des intrazellulären Transportnetzwerks, insbesondere der Autophagiemechanismus von PHBHHx-Nanopartikeln (NPs), selten untersucht. In dieser Arbeit haben wir erfolgreich die von NPs verwendete Lösungsmittelverdrängungsmethode hergestellt und die Autophagiewege und andere intrazelluläre Transportmechanismen basierend auf NPs mit Hilfe von Rab-Proteinen untersucht. Wir fanden heraus, dass NPs hauptsächlich über Clathrin-Endocytose und Caveolin-Endocytose in Zellen internalisiert wurden. Neben den klassischen Signalwegen haben wir zwei neue Wege entdeckt: den Mikropinocytose-Early-Endosom (EEs)-Mikropinocytose-Lysosom-Weg und den EEs-Liposom-Lysosom-Weg. NPs wurden durch Endozytose-Recycling-Vesikel und GLUT4-Exozytose-Vesikel an die Zellen abgegeben. Ähnlich wie andere Nanopartikel induzierten auch NPs intrazelluläre Autophagie und wurden dann über endolysosomale Wege abgebaut. 3-MA und CQ wurden als Autophagie-Inhibitoren verwendet, um den Abbau von NPs durch Lysosomen durch Blockieren endolysosomaler Wege zu verhindern. Tumorvolumen und -gewicht wurden signifikant verringert, wenn Autophagie-Inhibitoren und in NPs verpackte chemische Medikamente gemeinsam verwendet wurden.

Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Figuren

SEM-Charakterisierung von PHBHHx-NPs…

SEM-Charakterisierung von PHBHHx-NPs ( EIN ) DLS-Größenverteilung von PHBHHx…

Konfokale Bilder von Endozytosewegen.…

Konfokale Bilder von Endozytosewegen. In MCF-7-Zellen dringen die NPs in die Zellen ein…

Konfokalmikroskopische Aufnahmen von Endozytose…

Konfokalmikroskopische Aufnahmen von Endozytosewegen. ( EIN ) MCF-7-Zellen wurden transfiziert…

Konfokale Mikroskopie untersucht Autophagie induziert…

Konfokale Mikroskopie untersucht die durch NPs induzierte Autophagie. (A) EGFP-LC3-Zellen wurden mit…

Konfokalmikroskopische Aufnahmen von hemmenden…

Konfokalmikroskopische Aufnahmen zur Hemmung der Autophagie von NPs. ( EIN , B )…

Der Autophagiehemmer CQ erhöhte die…

Der Autophagiehemmer CQ steigerte die tumorsuppressive Wirkung von Medikamenten, indem er die Autophagie hemmte…


Teil 4: Actin-Assembly in Knospungshefe

00:00:07.21 Hallo.
00:00:08.21 Ich bin David Drubin Ich bin Professor und Co-Vorsitzender an der University of California, Berkeley.
00:00:13.17 Und in diesem vierten Segment möchte ich Ihnen von unseren Studien zur Aktin-Assemblierung erzählen
00:00:18.05 in angehender Hefe.
00:00:19.28 Diese Studien haben sich auf die auftretenden Montage- und Demontageprozesse konzentriert
00:00:25.14 in diesen kortikalen Aktinpflastern, die Orte der Clathrin-vermittelten Endozytose sind.
00:00:33.17 Dies ist wiederum eine Zusammenfassung dieses endozytischen Weges in knospenden Hefen.
00:00:39.14 Und der Internalisierungsschritt, die Einstülpung der Membran und die Bildung eines Vesikels,
00:00:45.06 werden von der Aktin- und Montage getrieben. worauf unmittelbar die Aktin-Demontage folgt.
00:00:51.18 Aktin sammelt sich also zu einem sehr vorhersehbaren Zeitpunkt auf diesem Weg, etwa acht Sekunden lang.
00:00:56.20 Und dann beginnt es sich für die nächsten acht Sekunden zu zerlegen.
00:01:01.04 Da dies auf so vorhersehbare Weise geschieht, fanden wir, dass dies ein sehr guter Prozess ist
00:01:06.28 um die Mechanismen aufzuklären, die an der Regulierung der Versammlung beteiligt sind
00:01:13.10 und Demontage von Aktinfilamenten.
00:01:16.00 Und das ist zufällig ein Arp2/3-vermittelter Aktin-Assembly-Weg.
00:01:21.04 Nun haben eine Reihe von Labors schöne biochemische Studien zum Arp2/3-vermittelten . durchgeführt
00:01:27.17 Aktin-Zusammensetzungsweg, einschließlich der Labors von Pollard und Carlier und anderen.
00:01:34.11 Und dieses Diagramm wurde von Dyche Mullins im Pollard-Labor erstellt. als er im Pollard-Labor war.
00:01:40.16 Und es fasst die Schlüsselereignisse in diesem Prozess wirklich schön zusammen, durch die
00:01:46.25 der Arp2/3-Komplex nukleiert die Aktinfilament-Assemblierung, und dann altern die Filamente mit der Zeit
00:01:55.15 und werden zerlegt, sie werden beim Wachsen gekappt, was für die Krafterzeugung wichtig ist.
00:02:03.04 indem sie Protein verschließen, und dann werden sie wieder zu recycelt. für neue Runden der Aktinmontage
00:02:10.28 vom Arp2/3-Komplex.
00:02:12.28 Und so Studien aus dem Carlier-Labor, die die Motilität von Listerien rekonstruieren, über die ich gesprochen habe
00:02:22.06 in meinem ersten Abschnitt zeigte, dass es hier einige wesentliche Schlüsselschritte gab.
00:02:29.06 Eine davon ist die Demontage des Aktin-Zytoskeletts, die durch Cofilin . vermittelt wird
00:02:34.09 oder manchmal. der manchmal als Aktin-depolarisierender Faktor oder ADF bezeichnet wird.
00:02:39.09 Da ist das Verschließen von Filamenten.
00:02:41.01 Die Filamente müssen kurz bleiben, sonst halten sie den Druckkräften von . nicht stand
00:02:45.13 die Plasmamembran.
00:02:47.01 Und dann ist da natürlich die Keimbildung dieses Netzwerks durch den Arp2/3-Komplex.
00:02:51.13 Und dies waren alle Schritte, die bei der Wiederherstellung der Motilität von Listerien als wesentlich identifiziert wurden.
00:02:58.16 Es gibt auch Schritte, die wichtig sind, wenn man Mutationen in genetischen Organismen vornimmt,
00:03:03.11 zum Beispiel.
00:03:05.00 Und das sind die Schritte, die zum großen Teil meine. Mein Labor hat sich auf die Untersuchung von Aktin konzentriert
00:03:11.25 Montage und Demontage.
00:03:12.25 Also, ich möchte zuerst über den Demontageprozess sprechen.
00:03:17.07 Denken Sie daran, Aktin baut sich als ATP-Aktin zusammen.
00:03:20.09 Wenn die Filamente altern, werden sie schließlich zu ADP-Aktin.
00:03:23.20 Und dann werden sie zu Substraten für die Fragmentierung oder Durchtrennung durch das Protein Cofilin.
00:03:31.00 Vor einiger Zeit hat Anne Moon als Doktorandin in meinem Labor zusammen mit Paul Janmey,
00:03:37.10, als er in Berkeley ein Sabbatical machte, Hefeextrakte fraktionierte und nach Aktivitäten suchte
00:03:43.06, die die Viskosität von Aktinlösungen beeinflussten, und sie reinigten Hefe-Cofilin.
00:03:49.20 Pekka Lappalainen trat dem Labor als Postdoktorand bei und machte Mutationen in Cofilin,
00:03:54.15 und konnte zeigen, dass Cofilin in einer lebenden Zelle für den Umsatz von
00:04:00.11 das Aktin-Zytoskelett.
00:04:02.11 Und schließlich haben wir mit dem Amberg-Labor zusammengearbeitet, als Avi Rodal Doktorand im Labor war,
00:04:06.26 und zeigte, dass ein Protein namens Aip mit Cofilin interagiert, um es zu zerlegen
00:04:12.28 Aktinfilamente.
00:04:14.18 Als Voytek Okreglak also als Doktorand ins Labor kam, wollte er studieren
00:04:20.18 die Funktion von Cofilin im Zusammenhang mit diesem Aktin-vermittelten endozytischen Stoffwechselweg in knospenden Hefen.
00:04:26.27 Und so konnte er Cofilin mit grün fluoreszierendem Protein markieren, was irgendwie bemerkenswert ist
00:04:31.27 weil Cofilin nur ein 14 kD Protein ist.
00:04:35.18 Aber er fand eine interne Schleife, in der er eine GFP-Integration vornehmen konnte, und stellte ein funktionsfähiges Cofilin her.
00:04:43.12 Und so konnte er die Cofilin-Dynamik in lebenden Hefezellen untersuchen.
00:04:46.10 Dies ist also eine Montage einer endozytischen Stelle in diesen Zellen, die markiert wurden
00:04:54.06 also exprimieren sie einen Aktinmarker in Rot und Cofilin in Grün.
00:04:59.03 Und was Sie sehen können, ist, dass sich Aktin an einer endozytischen Stelle ansammelt und dann
00:05:03.10 mit einer Verzögerung von etwa dreieinhalb Sekunden wird Cofilin für diese Seite rekrutiert.
00:05:08.02 Und das stimmt mit der Bindung von Cofilin an ADP-Aktin und nicht-ATP-Aktin überein.
00:05:14.14 Das sieht man auch sehr dramatisch in diesem Kymographen auf der Zelloberfläche,
00:05:18.20 wo wir sehen, dass sich das Aktin am Ende des endozytischen Weges ansammelt, wo es ist.
00:05:22.13 es beginnt sich auf der Oberfläche zu montieren und bewegt sich dann von der Oberfläche in das Innere von
00:05:28.04 die Zelle.
00:05:29.04 Und Cofilin schließt sich dem Aktin erst an, nachdem Aktin und Vesikel zu internalisieren begonnen haben
00:05:34.18 in die Zelle.
00:05:36.28 Und in Voyteks Studien konnte er schön beweisen, dass das Cofilin tatsächlich ist
00:05:42.12 wird von ADP-Aktin angezogen und nicht von ATP-Aktin.
00:05:46.27 Okay, dann wollte er tiefer in die Funktionsweise von Cofilin eintauchen.
00:05:55.15 in Aktin-Demontage und Montage.
00:05:57.04 Und er nutzte eine Beobachtung, die Marko Kaksonen einige Jahre zuvor gemacht hatte,
00:06:02.09 zusammen mit Yidi Sun im Labor, also wenn wir eine Mutante eines Proteins anschauen
00:06:08.06 Sla2 genannt, das an Aktin und Clathrin bindet, finden wir, dass sich Aktinschwänze stabil verbinden
00:06:15.13 mit endozytischen Stellen.
00:06:16.15 Das ist also die Oberfläche einer Hefezelle, und es gibt eine ganze Reihe von Aktinschwänzen
00:06:22.06 auf einer Fläche aufgereiht.
00:06:23.14 Und das. Dadurch entsteht tatsächlich ein Aktin-Netzwerk, das in vielerlei Hinsicht dem Lamellipodium ähnelt
00:06:29.05 einer Säugerzelle, weil Marko einen Laser nehmen und eine Linie an der Oberfläche von bleichen könnte
00:06:35.16 die Hefezelle, und wenn er das tat, hier fließt die Linie von der Oberfläche in die
00:06:41.21 Zellinneres, so wie man es in einer Säugerzelle am Lamellenpodium sehen würde.
00:06:48.03 Und so konnte er die Geschwindigkeit messen, und der Fluss betrug ungefähr 45 Nanometer pro Sekunde.
00:06:53.06 Voytek wollte diese Netzwerke also als System verwenden, um die Funktion von Cofilin zu untersuchen.
00:06:58.22 Und so hat er Cofilin-Mutanten in diesen Hintergrund gesetzt, die diese Aktin-Netzwerke bilden.
00:07:05.13 Und zuerst. Das erste, was er tat, war jedoch, auf sein markiertes Cofilin zu schauen und zu fragen,
00:07:11.21 Wo ist das Cofilin in diesen Netzwerken?
00:07:14.15 Und so konnte er das gesamte Netzwerk einheitlich mit einem Aktin-bindenden Protein markieren.
00:07:19.18 Aber das markierte Cofilin wurde von der Kante entfernt, an der sich neues Aktin ansammelte,
00:07:25.00 und war im älteren Teil des Netzwerks.
00:07:27.00 Und das sieht man in der Zusammenführung, hier, wo das Cofilin im Teil des Aktin-Netzwerks ist
00:07:33.06 das ist das älteste, weg von der Oberfläche, wo ADP-Aktin angereichert ist.
00:07:37.26 Also jetzt, als er Mutationen in Cofilin machte und sie in diesen Hintergrund stellte, der macht
00:07:42.20 diese Schwänze. also ohne. bei Wildtyp-Cofilin verlängerten sich die Schwänze von der Oberfläche
00:07:48.16 der Zelle ein kurzes Stück ins Innere der Zelle, hier und hier.
00:07:54.04 Aber als er die Mutationen in Cofilin machte, begannen sich die Schwänze an der Oberfläche zu sammeln.
00:07:59.24 und sie erstreckten sich über die gesamte Oberfläche bis zum anderen Ende der Zelle.
00:08:03.16 Und hier, in einer Mutterzelle, sammeln sich die Schwänze. verlängern sich ganz
00:08:08.15 von einer Seite der Zelle zur. zum nächsten.
00:08:10.27 Cofilin war also wichtig, um die Aktin-Netzwerke umzudrehen.
00:08:14.27 Und er konnte zeigen, dass die Schwänze hier bei Cofilin-Mutanten extrem lang wurden
00:08:20,13 relativ zu Zellen mit Wildtyp-Cofilin.
00:08:22.26 Und auch die Flussraten durch dieses Netzwerk waren bei der Mutante sehr langsam.
00:08:28.16 als Mutanten in Cofilin hergestellt wurden.
00:08:29.17 Cofilin war also wichtig für den dynamischen Auf- und Abbau von Aktinnetzwerken in lebenden Zellen.
00:08:37.06 Also, wie. Welche Bedeutung hatte Cofilin für diesen endozytischen Stoffwechselweg?
00:08:41.05 Ich hatte früher im zweiten Vortrag dieser Serie gezeigt, dass endozytische Vesikel
00:08:47.10 verschmelzen sehr schnell mit Endosomen, nachdem sie sich gebildet haben, geleitet von Aktinfilamenten.
00:08:54.02 Was Voytek herausgefunden hat ist, dass dieser Schritt bei Cofilin-Defekt wird. wird beeinträchtigt.
00:09:01.00 Er kam zu dem Schluss, dass an diesen endozytischen Stellen ATP-Aktin, hier rot dargestellt,
00:09:07.17 setzt sich zusammen, um die Einstülpung der Membran anzutreiben, das ATP wird zu ADP hydrolysiert,
00:09:12.10 und dann kommt Cofilin und zerlegt das Aktin-Netzwerk.
00:09:16.17 Und dann bleibt das Vesikel ohne Aktin und es kann mit Endosomen fusionieren.
00:09:21.22 Wenn Cofilin mutiert ist, wird das Aktin nicht zerlegt und diese nachgeschalteten Prozesse
00:09:27.03 im Endozytoseweg sind beeinträchtigt.
00:09:29.15 Als Avi Rodal Doktorand in meinem Labor war, wurde wir von David Amberg angesprochen,
00:09:34.08 der eine interessante Beobachtung gemacht hatte.
00:09:36.20 Er fand dieses Protein, das er Aip1 nannte, für Aktin-wechselwirkendes Protein.
00:09:42.00 Er fand es in einem Zwei-Hybrid-Screen als Protein, das an Aktin bindet.
00:09:46.06 Und er fand auch, dass es an Cofilin bindet.
00:09:49.04 Und da wir an Cofilin und Actin arbeiteten, kam er zu uns und fragte, ob wir könnten
00:09:52.22 arbeiten zusammen, um zu versuchen, etwas darüber zu erfahren, was Aip1 tun könnte und ob dies möglich ist
00:09:57.06 mit Cofilin zusammenarbeiten.
00:10:00.01 Also, hier ist ein Test, den Avi gemacht hat.
00:10:03.16 Und in diesem Assay können Sie Aktinfilamente mit Cofilin zusetzen.
00:10:10.11 Und Cofilin wird die Aktinfilamente durchtrennen, aber die Filamente werden immer noch pelletieren
00:10:16.14 in einer Ultrazentrifuge, weil das Aktin in kurze Fragmente zerbrochen wurde, aber sie sind immer noch
00:10:21.08 Oligomere, die pelletieren.
00:10:23.11 Was wirklich interessant war, ist, dass, als Avi Aip1 zu der Reaktion mit Cofilin und Aktin hinzufügte,
00:10:30.03 nun ist das Aktin vollständig in den Überstand übergegangen.
00:10:35.08 Und sie konnte diese Effekte sogar bei niedrigen Stöchiometrien wie 1:10 sehen, und es gab
00:10:40.10 sogar ein Effekt hier bei 1:50-Stufen erkennbar.
00:10:44.00 Aip1 arbeitete also mit Cofilin zusammen, um kurze Aktinfragmente in wahrscheinlich
00:10:53.26 Aktinmonomere, die nicht durch Ultrazentrifugation pelletiert werden konnten.
00:10:57.06 Voytek wollte den Mechanismus der Aip1-Funktion und ihre inneren Funktionen weiter erforschen
00:11:03.28 eine Zelle.
00:11:05.09 Und er machte eine wirklich interessante Beobachtung und überraschend, völlig unerwartet,
00:11:11.05, als er den Phänotyp von Aip1-Zellen analysierte.
00:11:14.21 Denn im Gegensatz zu Cofilin-Mutanten hatte Aip1 eine sehr dramatische Wirkung auf diese biochemischen
00:11:20.05 Assays war der In-vivo-Effekt viel subtiler.
00:11:24.03 Um die Wirkung zu sehen, musste er die Zellen mit Latrunculin A, diesem monomerbindenden Medikament, behandeln.
00:11:29.06 Bemerkenswert war, dass er die Zelle einige Minuten lang mit
00:11:34.13 Latrunculin A, sie könnten immer noch Actin zusammenbauen, okay?
00:11:39.04 Während dieser Zeit verschwanden die Aktinstrukturen insgesamt aus der Zelle, weil die
00:11:44.14 Monomere wurden vom Latrunculin aufgesogen, aber noch einige Minuten nach der Behandlung der Zellen
00:11:50.07 -- das sind endozytische Ereignisse mit einem Hüllprotein, gefolgt von einem Aktinschub --
00:11:55.13 sie traten mehrere Minuten später auf.
00:11:58.22 Wir könnten immer noch einen robusten Aktinaufbau erreichen, um die endozytische Internalisierung voranzutreiben.
00:12:03.13 Wir dachten, wie kann das unter Bedingungen passieren, bei denen Latrunculin A depolymerisiert?
00:12:09.00 die meisten Strukturen in der Zelle und hat die Aktinmonomere aufgesogen?
00:12:13.06 Und so haben wir dazu eine Hypothese aufgestellt.
00:12:15.26 Unsere Hypothese war, dass es einen Weg zum Zusammenbau von Aktin-Oligomeren gibt. Oligomere
00:12:22.17 in der Zelle und dass diese Oligomere gegen die Wirkung von Latrunculin A resistent sind.
00:12:28.04 Also, wie konnte er das zeigen?
00:12:30.01 Es stellte sich also heraus, dass Emil Reisler an der UCLA eine wirklich schöne Technik entwickelt hatte für
00:12:35.18 mit Blick auf Aktin-Oligomere.
00:12:37.23 Er ​​fand heraus, dass man, wenn man ein Cystein an Position 41 in Aktin einführte, hinzufügen könnte
00:12:44.24 eines von mehreren Vernetzungsmitteln und Aktinfilamenten, so dass die Oligomere
00:12:50.11 wurden beibehalten, wenn Sie nicht reduzierende Gele verwenden.
00:12:54.05 Also hat Voytek hier einen biochemischen Assay gemacht, bei dem er diesen Trick verwendet hat.
00:12:59.26 Und er stellte fest, dass er trotz steigender Cofilin-Werte immer noch
00:13:05.19 sehen viele Oligomere in seiner Reaktion mit diesem Vernetzungsmittel.
00:13:12.02 Cofilin reichte also nicht aus, um die Oligomere in Monomere zu zerlegen.
00:13:17.04 Die Zugabe von Aip1 hat jedoch die Anzahl der Oligomere stark reduziert und stark erhöht
00:13:24.02 die Anzahl der Monomere.
00:13:25.14 Also synergiert Aip1 mit Cofilin, wobei Cofilin das Aktin fragmentiert, aber zusammen
00:13:30.20 konnten sie Aktinmonomere herstellen.
00:13:33.15 Auch in einer lebenden Zelle, als Voytek diese Variante von Aktin exprimierte, konnte er zeigen
00:13:40.14, dass der Monomerpool aufgebraucht und der Oligomerpool in Aip1-Null-Mutanten erhöht wurde.
00:13:48.00 Und so schlossen wir aus diesen Studien. im Allgemeinen denken wir an den Montageprozess
00:13:52.15 als ausschließlich durch monomeres Aktin auftretend, aber es ist seit einiger Zeit bekannt
00:13:59.02 können die Aktin-Oligomere in vitro anlagern.
00:14:01.10 Und was Voytek gezeigt hat. Es gibt zwei Dinge: Zum einen ist Aip1 für die Konvertierung zuständig
00:14:06.06 kurze Aktinfragmente in Aktinmonomere und zweitens, dass Aktinoligomere robust
00:14:12.28 versammeln sich in einer lebenden Zelle.
00:14:15.17 Als nächstes wollten wir also diese Kappenaktivität untersuchen, die auftritt, nachdem Filamente nukleiert wurden
00:14:22.01 durch den Arp2/3-Komplex, der ihre Dehnung steuert.
00:14:26.17 Und Sie werden sich erinnern, dass die Kappung für die Bewegung von Listerien wichtig und wesentlich war.
00:14:31.20 Und als Alphee Michelot als Postdoc ins Labor kam, konnte er zeigen. er konnte
00:14:37.11, um Bewegungen vom Typ Listeria zu erzeugen, indem das Hefe-WASP-Protein auf Mikrokügelchen aufgebracht wird
00:14:43.11 und Einführen dieser in einen konzentrierten Hefeextrakt.
00:14:46.18 Diese Kugeln würden dann Aktinschwänze zusammenbauen, die sie durch den Extrakt treiben würden.
00:14:51.04 Nun hatten wir also ein System, in dem wir Genetik und Biochemie kombinieren konnten, um
00:14:56.26 studieren Mechanismen wie Filament Capping.
00:15:00.17 Und so gab es eine Art Rätsel über das Capping von Protein, nämlich dass das Capping von Protein war
00:15:06.11 als wesentlich für Prozesse bei der Wiederherstellung von Systemen wie dem Carlier-Listeria-System herausgestellt
00:15:14.02 aus reinen Komponenten.
00:15:15.17 Capping-Protein, Cofilin und Arp2/3 waren die wesentlichen Komponenten.
00:15:22.04 Okay?
00:15:23.23 Betrachtet man aber bewegliche Prozesse in der ganzen Komplexität einer Zelle oder in Auszügen,
00:15:32.04 gab es oft sehr subtile effekte.
00:15:33.24 Und das trifft auf Hefezellen zu.
00:15:35.15 Wenn wir das Capping-Protein ausschalten, erfolgt überraschenderweise der Aktinaufbau sehr robust und die Endozytose
00:15:42.02 kommt immer noch dieser Akt vor. sehr aktinabhängiger Prozess.
00:15:46.18 Also, was war los?
00:15:48.28 Und wieder hier, dies zeigt die Ergebnisse aus dem Carlier-Labor, wo das Capping von Proteinen
00:15:53.18 war eines der essentiellen Proteine ​​in ihrem rekonstituierten System.
00:15:59.02 Also haben wir eine Hypothese aufgestellt.
00:16:00.23 Und wir vermuteten, dass es in der vollen Komplexität des Zytoplasmas wahrscheinlich
00:16:06.11 mehrere Funktionen, die das Wachstum von Aktinfilamenten steuern.
00:16:09.17 Und wir dachten, Hefe wäre das ideale System, um nach diesen alternativen Mechanismen zu suchen,
00:16:16.11 weil man einen sogenannten synthetischen letalen Screen machen kann, bei dem man eine Mutation in einem Gen macht
00:16:21.25 und wenn es Gene gibt, die redundante oder überlappende Funktionen bereitstellen, können Sie diese finden
00:16:27.00 wenn du die Doppelmutanten machst.
00:16:29.01 Also haben wir uns mit Constanzo und Boone in Toronto getroffen und dort angefangen.
00:16:34.22 Das Captain-Protein ist ein Heterodimer aus Cap1 und Cap2.
00:16:40.00 Und mit Hilfe des Boone-Labors eine genetische Untersuchung durchgeführt und die Mutanten gefunden
00:16:45.03 in der Mitte, hier, das waren alle. hatten synthetische Phänotypen mit Mutanten des Capping-Proteins.
00:16:50.19 Und das waren alles Kandidaten für neue Faktoren, die die Filamentdehnung steuern.
00:16:55.16 Und hier war unser Freund Aip1 sowie abp1, ein Gen, das wir vor einigen Jahren im Labor gefunden hatten.
00:17:02.24 Und es stellt sich heraus, dass Abp1 einen Komplex mit Aim3 bildet und Aip1 mit Cofilin assoziiert.
00:17:09.18 Also, als wir den In-vitro-Assay von Alphee verwendeten, eine einzelne Mutante in einem dieser Proteine, einschließlich
00:17:16.15 Capping-Protein, Aim3, Abp1, hatte keinen Einfluss auf die Fähigkeit, Aktinschwänze zu bilden, die
00:17:22.09 würde Perlen durch die treiben. durch den Hefeextrakt.
00:17:25.09 Hier haben wir das Aktin fluoreszierend markiert, damit wir die sich bewegenden Schwänze sehen können
00:17:29.23 die Perlen.
00:17:30.27 Aber Mutanten in Proteinen, die genetisch als redundant impliziert wurden, verursachten eine vollständige
00:17:36.23 Verlust der Fähigkeit, diese Schwänze zu bilden und die Perlen durch den Extrakt zu treiben,
00:17:42.21, was ein Beweis für eine Redundanz in diesen Dehnungsregulierungsmechanismen war.
00:17:49.04 Also, als wir uns angesehen haben, wo sich Aip1 und das Capping-Protein in den Netzwerken befinden, die wir bilden können
00:17:55.20 in Hefezellen, diese Aktinnetzwerke, die sich an der Oberfläche der Zelle ansammeln
00:18:00.22 und dann in das Innere der Zelle fließen, fanden wir, als wir Aip1 mit GFP markierten, dass Aip1 war
00:18:07.22 in Richtung des älteren Teils des aktiven Netzwerks verschoben und das, als wir Capping-Protein markierten,
00:18:14.14 Capping-Protein befand sich im neueren Teil des Netzwerks.
00:18:18.28 Und das machte Sinn, weil das Capping-Protein die Filamente so bedeckte, wie sie es begannen.
00:18:24.06 kurz nach dem Zusammenbau und Aip1 arbeitete mit Cofilin, um Filamente zu verschließen
00:18:29.16 nachdem sie durchtrennt wurden, um zu verhindern, dass sie die Anordnung von glühen oder nukleieren
00:18:34.04 neue Filamente.
00:18:35.12 Was wir aus diesen Experimenten schließen, die sowohl Genetik als auch Biochemie kombinieren,
00:18:41.21 ist, dass es in einer normalen Wildtyp-Zelle mindestens drei Mechanismen zur Kontrolle gibt
00:18:47.00 das Wachstum von Aktinfilamenten.
00:18:48.09 Hier gibt es Capping-Protein, gelb dargestellt.
00:18:50.22 Es gibt dieses Abp1-Protein, das mit Aim3 funktioniert, in Lila.
00:18:55.22 Und dann ist da noch Aip1 in Grün.
00:18:58.22 Und dass Aip1 und das Capping-Protein verschiedene Teile des Netzwerks besetzen.
00:19:02.22 Wenn wir eines dieser Proteine ​​eliminieren, können die anderen Proteine ​​eingreifen und bereitstellen
00:19:08.04 genug Capping-Aktivität, um das Netzwerk zu kontrollieren.
00:19:11.06 Aber wenn wir bestimmte paarweise Kombinationen machen, bricht das ganze Netzwerk wegen der
00:19:16.13 Fähigkeit. weil die Zellen nicht mehr die Fähigkeit haben, das zu kontrollieren. die Versammlung
00:19:22.02 ihres Actin-Netzwerks.
00:19:24.24 Okay, also zurück zu diesem Diagramm von Mullins und Pollard, dem.
00:19:33.28 Der letzte Schritt, auf den sich unser Labor konzentriert hat, ist die Keimbildung dieser Aktinnetzwerke, okay?,
00:19:40.06 beim Arp2/3-Komplex.
00:19:43.14 Wenn wir uns also unser Diagramm ansehen, das die jahrelange Arbeit zur Erarbeitung dieser Endozytose zusammenfasst
00:19:49.26 Pathway in knospender Hefe haben wir eine Reihe verschiedener Module identifiziert, die ihre Leistung erbringen
00:19:54.27 verschiedene Funktionen zu verschiedenen Zeiten und Positionen in diesen endozytischen Ereignissen.
00:19:59.28 Und eines dieser Module nennen wir das WASP/Myosin-Modul, weil es die Hefe WASP enthält,
00:20:05.10 namens Las17 und enthält ein Typ-1-Myosin sowie ein halbes Dutzend zusätzliche Proteine.
00:20:11.24 Und das sind die Proteine, die den Zusammenbau von Aktinfilamenten bilden und Kräfte erzeugen
00:20:18.02 auf denen. auf diesen Aktinfilamenten.
00:20:20.16 Wir haben uns also sehr für ein paar Fragen interessiert.
00:20:24.22 Wissen Sie, wie die Aktin-Zusammensetzung Kräfte erzeugt, die zur Einstülpung genutzt werden?
00:20:29.04 die Membran?
00:20:30.04 Welche Aktivitäten sind notwendig?
00:20:31.24 Und warum ist dieser ganze Weg dann so komplex?
00:20:34.27 Warum braucht man so viele Proteine, um ein Vesikel herzustellen?
00:20:37.25 And so we thought a good place to start was looking in this WASP/myosin module,
00:20:41.23 which has many proteins that were all. all had multiple domains.
00:20:46.08 And could we find out, what are the essential functions that are being carried out by this.
00:20:51.17 this WASP/myosin module?
00:20:53.24 And so, evidence that this really is a valid. that it's really valid to call this a module
00:21:01.13 comes from work from Rong Li, when her postdoc Soulard was able to purify the most of the
00:21:08.08 proteins in this module as a complex.
00:21:11.05 And so, Eric Lewellyn and Ross Pedersen and. and others in my lab got together and decided
00:21:18.02 to see if they could distill down the activities of all the proteins in this module and
00:21:23.00 find what are the essential activities for endocytosis.
00:21:26.10 And so, they made deletion mutations of whole genes, they deleted domains of proteins,
00:21:31.16 they made an artificial fusion protein, which is shown here.
00:21:35.15 What they found is that all you needed to drive this actin-mediated endocytic event
00:21:42.10 were a couple domains from a type 1 myosin, and a couple domains from the yeast WASP protein.
00:21:50.08 And that was sufficient.
00:21:52.08 This protein, this artificial synthetic protein, could replace all of the other proteins in
00:21:57.00 the module and make productive endocytic vesicles.
00:22:00.11 So, what are the activities, then, that are contained in this module?
00:22:04.08 There are four activities and they're shown here.
00:22:08.03 One activity is the so-called nucleation promoting factor activity, the ability to activate
00:22:14.03 the Arp2/3 complex.
00:22:15.08 That is absolutely essential to nucleate actin filaments for productive endocytic events.
00:22:20.11 The second is a myosin motor activity.
00:22:23.01 A myosin motor activity is essential for productive endocytic events.
00:22:27.05 You also need a so-called TH1 domain that binds to acidic phospholipids.
00:22:33.05 Finally, a proline-rich domain was needed in this synthetic molecule, because that proline-rich domain
00:22:40.23 is required to recruit this molecule to the endocytic site.
00:22:46.20 And that was very interesting to us, the need for proline-rich domain to concentrate the.
00:22:52.20 this machinery for assembling actin and making forces on actin at the endocytic sites,
00:22:59.08 because work from Michael Rosen's lab had shown that proline-rich motifs can interact in a mult.
00:23:06.09 when they're in a multivalent state with SH3 domains in a multivalent state to make
00:23:12.06 liquid droplets in solution, okay?, in biochemical studies.
00:23:16.16 And we wondered whether something like this might be occurring during the endocytic pathway
00:23:22.01 of yeast.
00:23:23.01 In fact, if you look at the proteins in the WASP/myosin module, and upstream from it,
00:23:29.04 many of these proteins -- there's a huge enrichment -- have SH3 domains and proline-rich domains,
00:23:35.15 and they're multivalent.
00:23:37.02 They have many of these -- multiple SH3 domains, multiple proline-rich domains.
00:23:41.09 And so we hypothesized that some kind of condensation reaction in the living cell is responsible
00:23:48.02 for distilling down and concentrating this machinery in the WASP/myosin complex and
00:23:54.19 bringing it to the endocytic site to nucleate this burst of actin assembly.
00:23:59.26 And so, some years ago, we found a master regulator of endocytosis in yeast.
00:24:05.22 There's a protein kinase called Prk1.
00:24:08.18 What happens is there's a burst of actin assembly at the plasma membrane, the actin recruits
00:24:13.17 this kinase, and the kinase feeds back and turns off actin assembly.
00:24:20.17 We made a so-called analog-sensitive allele of Prk1 kinase using a technology that
00:24:26.14 Kevan Shokat at UCSF developed.
00:24:28.17 And so that gave us a chemical switch, where we could turn on and off the kinase.
00:24:32.02 And so, remember, this kinase causes the actin nucleation to stop.
00:24:37.21 And so when we inhibit the kinase, the actin nuclea. the new actin sites can be assembled
00:24:43.06 that they can't be disassembled.
00:24:45.18 And so here we've done that, and we've added this inhibitor right now.
00:24:50.04 And now, what happens is new sites assemble but they can't disassemble.
00:24:53.19 And what happens is they start to all collect together and fuse with each other, with a
00:24:59.00 behavior that looks very much like liquid droplets.
00:25:01.13 There was another big fusion event.
00:25:03.15 Now, if we take a cell where we've treated it with the inhibitor and allowed these
00:25:08.04 large droplet-like structures to form -- made from actin and actin binding proteins --
00:25:13.22 and now we wash out the inhibitor, what we find is that immediately this structure dissolves.
00:25:19.22 Again, behavior that looks like a liquid droplet.
00:25:22.28 So, trying to explore this network, Yidi Sun, a specialist in the lab who's been involved
00:25:29.14 in many of the studies I've talked about today, decided to dissect this network of SH3/proline-rich
00:25:35.04 motif interactions.
00:25:37.10 And she looked through it and used literature and used her evidence from her own studies,
00:25:43.02 and was able to find that there were two sites that she could perturb in this very complex
00:25:49.02 network that would dissociate the endocytic machinery from the actin assembly machinery.
00:25:55.10 And these cuts prevented the type-1 myosin and the WASP protein from being recruited
00:26:00.14 to endocytic sites.
00:26:01.27 Interestingly, all of these proteins have homologues in mammalian cells.
00:26:06.26 And the ones -- Pan1 and Sla1 -- that are responsible for recruiting the actin machinery
00:26:11.18 to endocytic sites, in these cells, have a homologue called intersectin in mammalian cells.
00:26:17.15 So, we think the principles that were learned from Yidi's studies are likely to apply
00:26:20.18 in mammalian cells.
00:26:21.21 So, what happens when you snip these two specific interactions?
00:26:26.24 What happens is really fascinating.
00:26:29.09 The endocytic sites assemble on the surface of the yeast cell, shown in green,
00:26:34.01 but the actin, now shown in red, is completely uncoupled from the endocytic sites.
00:26:38.15 It still assembles, but it assembles on these internal rocket tail-like structures that
00:26:42.24 look a lot like these Listeria that swim around inside the cell.
00:26:46.13 So, Lis. so, Yidi was able to uncouple actin assembly from the formation of the endocytic sites.
00:26:52.09 She was able to restore this by artificially recruiting these WASP or myosin proteins
00:26:58.10 back to the endocytic site.
00:27:00.15 Now, what's really interesting here is that in a wild-type cell the WASP protein accumulates
00:27:08.10 over time -- the fluorescence intensity monitors the accumulation of WASP --
00:27:13.02 but while WASP is accumulating there's no actin assembly.
00:27:16.17 It's not until you get to a certain level, when suddenly there's a burst of actin assembly.
00:27:22.13 It seems to occur in sort of an all-or-nothing or switch-like manner.
00:27:26.10 When Yidi made the mutation, so WASP no longer gets recruited to the site, and then put in
00:27:30.18 an artificial way of recruiting it, again, you needed WASP to rise to a certain level,
00:27:36.03 you needed more -- which wasn't surprising, because it had lost its multivalency --
00:27:40.20 before, again, there was this sudden burst of actin assembly.
00:27:44.01 And so, from this, what we think is that this. that there may be a phase transition involving
00:27:50.04 these multivalent linker proteins that concentrate the WASP and the myosin together
00:27:57.07 at these endocytic sites, and that only when the concentration gets high enough is there a burst of
00:28:02.27 actin assembly.
00:28:03.27 And so, for these studies I went through a lot of work that covered a lot of former members.
00:28:11.06 current and former members of lab, and they are all listed here.
00:28:15.10 And that's the last of my four segments.

  • Part 1: Introduction: Actin, Endocytosis and the Early Days of Yeast Cell Biology

Inhalt

Although receptors and their ligands can be brought into the cell through a few mechanisms (e.g. caveolin and lipid raft), clathrin-mediated endocytosis remains the best studied. Clathrin-mediated endocytosis of many receptor types begins with the cargo ligands in the luminal compartment of the vesicle binding to receptors on the cell membrane. The cargo ligand and receptor will then recruit adaptor proteins and clathrin triskelions to the outside membrane of the cell around where budding will form. Budding of the plasma membrane then occurs, forming a clathrin-coated pit. [1] Other receptors can nucleate a clathrin-coated pit allowing formation around the receptor. A mature pit will be cleaved from the plasma membrane through the use of membrane-binding and fission proteins such as dynamin (as well as other BAR domain proteins), [2] forming a clathrin-coated vesicle that then uncoats and typically fuses to a sorting endosome. Once fused, the endocytosed cargo (receptor and/or ligand) can then be sorted to lysosomal, recycling, or other trafficking pathways. [1]

The function of receptor-mediated endocytosis is diverse. It is widely used for the specific uptake of certain substances required by the cell (examples include LDL via the LDL receptor or iron via transferrin). The role of receptor-mediated endocytosis is well recognized up take downregulation of transmembrane signal transduction but can also promote sustained signal transduction. [3] The activated receptor becomes internalised and is transported to late endosomes and lysosomes for degradation. However, receptor-mediated endocytosis is also actively implicated in transducing signals from the cell periphery to the nucleus. This became apparent when it was found that the association and formation of specific signaling complexes via clathrin-mediated endocytosis is required for the effective signaling of hormones (e.g. EGF). Additionally it has been proposed that the directed transport of active signaling complexes to the nucleus might be required to enable signaling, due to the fact that random diffusion is too slow, [4] and mechanisms permanently downregulating incoming signals are strong enough to shut down signaling completely without additional signal-transducing mechanisms. [5]

Using fluorescent or EM visible dyes to tag specific molecules in living cells, it is possible to follow the internalization of cargo molecules and the evolution of a clathrin-coated pit by fluorescence microscopy and immuno electron microscopy. [6] [7]

Since the process is non-specific, the ligand can be a carrier for larger molecules. If the target cell has a known specific pinocytotic receptor, drugs can be attached and will be internalized.

To achieve internalisation of nanoparticles into cells, such as T cells, antibodies can be used to target the nanoparticles to specific receptors on the cell surface (such as CCR5). [8] This is one method of improving drug delivery to immune cells.


Long-Range Membrane Properties

3.1.3 Caveolae

Caveolae are complex plasma membrane structures whose properties appear to place them between coated pits and lipid rafts ( Chapter 8 ). They are small (50–100 nm) invaginated membrane structures that superficially resemble coated pits ( Fig. 11.9 , [32] ). In fact, in 1955, Yamada [33] proposed the descriptive name “caveolae” which is Latin for little caves. Caveolae were first described by the electron microscopist George Palade in 1953 and are abundant in many vertebrate cell types, especially endothelial cells and adipocytes where they may account for 30–70% of the total plasma membrane surface area. Caveolae however, are not a universal feature of all cells as they are totally absent in neurons. Like lipid rafts, caveolae are partially characterized by being enriched in sphingolipids and cholesterol and also participate in signal transduction processes [34,35] . In fact caveolae are often described as being “invaginated lipid rafts” that differ primarily by the presence of a family of marker proteins called caveolins. But, similar to coated pits, caveolae may also play a role in endocytosis.

Figure 11.9 . Transmission electron micrographs of endothelial caveolae.


Supplementary Information

(RTKs). A family of plasma membrane proteins (

60 genes in humans) that function as high affinity binding sites for growth factors and cytokines and transduce signals intracellularly through their intrinsic tyrosine kinase activity.

G protein-coupled receptors

(GPCRs). A vast family of plasma membrane receptors (more than 800 genes in humans) characterized by seven transmembrane regions. They transduce signals through a variety of modes, among which the best characterized is the coupling with heterotrimeric G proteins.

A family of proteins that act as multifunctional scaffolding proteins, regulating the trafficking and signalling of transmembrane receptors, particularly of GPCRs. They are involved in receptor desensitization, endocytosis and ubiquitylation. They can also function as positive effectors of GPCRs through their scaffolding abilities. The arrestin family comprises visual arrestins, β-arrestins (non-visual arrestins) and α-arrestins.

The three members of the human AKT serine-threonine protein kinase family are often referred to as protein kinase Bα (PKBα), PKBβ and PKBγ. These proteins are phosphorylated by phosphoinositide 3-kinase (PI3K). AKT–PI3K forms a key component of many signalling pathways that involves the binding of membrane-bound ligands such as RTKs.

Epsin family of endocytic adaptor proteins

A family of endocytic proteins composed of three paralogs: EPN1, EPN2 and EPN3, characterized by the presence of an epsin N-terminal homology domain involved in phosphoinositide binding at the plasma membrane, ubiquitin binding motifs and motifs that bind to clathrin, AP2 and other endocytic proteins. They are involved in both clathrin-mediated endocytosis, where they play a role in clathrin-coat assembly and cargo recruitment, and in the non-clathrin endocytosis of epidermal growth factor receptor.

(EMT). A process, of great relevance in embryogenesis, through which epithelial cells lose polarity and cell–cell adhesion contacts (sessile state) to acquire characteristics of migratory mesenchymal-like cells. In physiology, typically, after migrating, these cells re-acquire an epithelial phenotype through the opposite process of mesenchymal–epithelial transition.

Type I transmembrane proteins belonging to the tumour necrosis factor/nerve growth factor superfamily. They are activated upon binding to various agonists (such as FASLG, TNFA or TRAIL). They typically trigger the so-called apoptotic extrinsic pathway, yet they can also activate multiple alternative signalling pathways with opposing outcomes (survival/proliferation versus cell death) depending on the cell context.

Small flask-shaped invaginations of the plasma membrane (50–80 nm) that can be morphologically identified by the presence of coat-like proteins (caveolins) and that are particularly abundant in tissues involved in lipid homeostasis or subjected to mechanical challenges like adipocytes, muscle cells and endothelial cells.

A protein involved in the formation of focal adhesions that links surface structures (integrins) to the actin cytoskeleton (through binding to F-actin).

Cell-to-matrix adhesion structures involved in the transmission and regulation of signals between the extracellular matrix and the intracellular environment. They are large and dynamic protein complexes established through integrins (which bind to the extracellular matrix), vinculin, F-actin and several regulatory components (up to 100 different proteins, according to the state of the cell). Focal adhesions have roles in signal transduction, cell motility, cell cycle regulation and several other cellular phenotypes. They represent one of the main sensors/effectors in cellular mechanosensing.

A class of proteins that bind specifically to β-galactoside sugars such as N-acetyl-lactosamine. Galectins are secreted in the extracellular space, where they encounter galactose-containing glycoproteins and glycolipids. The binding of galectins to glycosylated proteins, such as CD44 and α5β1 integrin, triggers galectin oligomerization, which allows their interaction with glycosphingolipids and the generation of plasma membrane curvature, leading to the formation of clathrin-independent endocytic carriers.

During angiogenesis, new vessels that sprout from existing ones are guided by a leader cell that drives the extension of the sprout and senses the environment for guidance cues.

Signalling mediated by the activation of the extracellular signal-regulated kinases (ERKs, also called mitogen-activated protein kinases or MAPKs). This signalling is mediated by the sequential activation of the small GTPase RAS and a cascade of kinases (RAF, MEK and ERK1,2) that transduce a signal from a receptor, located on the cell surface or on endosomes, to regulate a number of fundamental biological functions, including cell proliferation, differentiation and migration.

A family of serine/threonine protein kinases that includes six members in mammals. They serve as targets for the small GTPases CDC42 and RAC and have been implicated in a wide range of biological activities.

A lipid phosphatase (phosphatidylinositol 3,4,5 triphosphate 3-phosphatase). It catalyses the conversion of PI(3,4,5)P3 to PI(4,5)P2, thereby antagonizing the action of PI3K and the activation of AKT. It represents one of the most frequently lost tumour suppressors in human cancers.

AMP-activated protein kinase or 5’ adenosine monophosphate-activated protein kinase. It is a heterotrimeric protein complex endowed with serine/threonine kinase activity that regulates the energy metabolism, mostly acting on glucose and fatty acid metabolism.

A member of RHO subfamily of small GTPases that plays a central role in controlling the activity of protein complexes that are necessary to remodel the actin cytoskeleton during migration.

A member of a class of MAPKs that are responsive to stress stimuli, such as cytokines, ultraviolet irradiation, heat shock and osmotic shock, and are involved in cell differentiation, apoptosis and autophagy.

JNK (or c-Jun N-terminal Kinase) is a member of a family of protein kinases, which play a central role in stress signalling pathways implicated in gene expression, neuronal plasticity, regeneration, cell death and regulation of cellular senescence.

A subfamily of small GTPases that includes more than 70 members in mammals and regulates several key steps of membrane trafficking, including vesicle formation, vesicle movement along actin and tubulin networks, and membrane fusion.

This term broadly defines a vast group of proteins (frequently unrelated) that all possess Guanine Nucleotide Exchange Factor activity, that is, the ability to convert G proteins from an inactive GDP-bound to an active GTP-bound form.

Jammed epithelial monolayers

The dynamics of epithelia has been described in terms of jamming transitions. During this transition, collective motion ceases, cells can no longer exchange neighbours, and monolayers become static and rigid, displaying a behaviour similar to that of ensembles of dense and packed inactive particles such as coffee in a chute or sand in a pile.

Central region of the thin cytoplasmic bridge that connects cells at the end of cytokinesis. It consists mostly of microtubules, together with various other types of proteins (400–500). It functions as a platform to mediate abscission, the process of severing the intercellular bridge. It is also endowed with numerous other functions, including the determination of cell fate and asymmetric post-abscission signal transduction.

A key component of a pentameric actin nucleation promoting complex that acts downstream of the GTPase RAC and is necessary for activating the Arp2/3 complex for the generation of branched actin networks.

A cell-to-cell junction formed by a multiprotein complex. This type of junction is established through homotypic interactions between adhesion molecules (occludins, claudins, JAMs) present on the surface of abutting cells. Tight junctions mark the border between the apical and the basolateral surfaces in epithelial cells and control the formation of functionally distinct apical domains. They are also present in endothelial cells and astrocytes and establish the blood–brain barrier. One of their major function is to seal the epithelia by preventing the leakage of water and small molecular weight solutes.

A seven-subunit complex that, upon activation, promotes the branched elongation of the actin network by binding to the side of mother filaments.

A multiprotein complex composed of three members originally identified in Drosophila melanogaster, Crumbs, Pals1 and PatJ. This complex plays a key role in specifying the apical plasma membrane domain of epithelial cells and in controlling cell shape in both invertebrates and vertebrates.

A process in which molecules are transported across cellular barriers. It involves the endocytosis of molecules (typically plasma membrane proteins or extracellular molecules captured through interaction with surface receptors) at one side of the cell and their vesicle-mediated transport to another side, where they are released through exocytosis. It contributes to the establishment of apical–basal cell polarity by transferring transmembrane proteins between distinct plasma membrane domains. It is involved in many other processes, for instance, in the crossing of the blood–brain barrier.

An octameric protein complex involved in vesicle trafficking, specifically in the tethering and spatial targeting of vesicles to the plasma membrane prior to vesicle fusion.

A 36-kDa calcium-dependent, phospholipid-binding protein that functions in promoting the exocytosis of intracellular proteins to the extracellular space.

CDC42 apical polarity complex

CDC42 is a highly conserved RHO-family GTPase that regulates cell polarity in many eukaryotes. It directly interacts with PAR6 and regulates, through this protein, the activity of the atypical protein kinase C (aPKC).

BAR domains are banana-shaped protein domains capable of sensing membrane curvature by binding preferentially to positively curved membranes and named after three proteins in which they were originally identified: BIN1 (bridging interactor 1), AMPH (amphiphysin) and Rvs167 (the yeast homolog of amphiphysin). In contrast to the banana-shaped BAR domains, the I-BAR (which stand for inverse BAR) domain is a zeppelin-shaped structure with convex geometry, thus generating negative membrane curvature.

Cadherin-based cell-to-cell junctions present in epithelial and endothelial cells, frequently in a more basal position with respect to tight junctions.

A process in which the volume of a closed system does not change. It is synonym of isovolumetric.

In Drosophila melanogaster, the ventral part of the embryo that forms during gastrulation and gives rise to the segmented trunk of the animal (gnathal, thoracic, abdominal segments). It includes the mesoderm, ventral ectoderm and dorsal epidermis but excludes the dorsal-most tissue of the embryo, the amnioserosa.

In Drosophila melanogaster, a short-lived extraembryonic tissue with a critical role in dorsal closure and other early developmental morphogenetic events.

A cluster of cells that migrate from the anterior tip of the Drosophila melanogaster egg chamber to the border of the oocyte at stage 9 of oogenesis. These cells perform a stereotypical collective migration on the intervening nurse cells and reach the oocyte. They are required for the formation of the micropyle, the eggshell structure through which sperm enters the egg.

Thin membrane protrusion present at the leading edge of migrating cells, mostly constituted by a flat network of actin.

A process characterizing filamentous multimeric protein structures within the cell and mostly used in reference to filamentous actin (F-actin). When actin subunits (G-actin) are constantly added at one end of the filament and removed from the opposite one, the net effect is the treadmilling of the filament which is used, for instance, to generate motion. The term is also used, more generally, for other biological processes in which the treadmilling of molecules or organelles occurs.

A temporary group of cells established during vertebrate development, which forms after gastrulation at the border between the neural plate and the surrounding ectoderm. After closure of the neural tube (due to the folding of the neural plate into itself), the neural crest runs along the roof plate of the neural tube. At this stage, neural crest cells undergo EMT and migrate to the periphery, where they give origin to various cell lineages.

An abnormal accumulation of fluid in the abdominal cavity frequently caused by liver disease or cirrhosis, cancers (specifically ovarian and colon cancer), and heart failure.


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