Information

15.8: Aus Gentechnik und Genveränderung - Biologie

15.8: Aus Gentechnik und Genveränderung - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Indem wir uns auf die Entwicklung von Genen und ihrer Regulation konzentrieren können, haben diese genomischen, transkriptomischen und proteomischen Technologien unser Wissen über die Funktionsweise von Zellen auf molekularer Ebene enorm erweitert. Wir erweitern weiterhin unser Wissen über Krankheitsprozesse und zumindest in einigen Fällen darüber, wie wir Krankheiten behandeln können. Der Einsatz von Technologien zur genetischen Veränderung von Organismen ist trotz bester menschlicher Absichten umstrittener. Einige genetisch veränderte Organismen (GVO) zielen darauf ab, die Nahrungsmittelproduktivität zu erhöhen, um die Welt besser zu ernähren. Die Einführung „nützlicher“ Gene in einige GVO hat Folgendes bewirkt:

  • dürreresistente Pflanzen, um die Reichweite zu erhöhen, in der wichtige Nahrungspflanzen angebaut werden können.
  • schädlingsresistente Pflanzen, um die Abhängigkeit von umweltschädlichen chemischen Pestiziden zu verringern.
  • herbizidresistente Pflanzen, die Chemikalien überleben, die zur Zerstörung schädlicher Pflanzen verwendet werden.

Die Suche nach „verbesserten“ Pflanzen- und Tiersorten geht schon seit der Geschichte. Bauern haben Kühe, Schafe, Hunde und Getreidesorten von Mais bis Weizen gekreuzt, in der Hoffnung, schneller wachsende, größere, widerstandsfähigere (wie auch immer) Sorten zu finden. Es ist die Manipulation der DNA (der Essenz des genetischen Materials selbst), die die Wurzel der Kontroversen ist. Kontroversen spiegeln sich in Meinungen wider, dass GVO-Lebensmittel potenziell gefährlich sind und dass ihr Anbau verboten werden sollte. Der allgemeine Konsens ist jedoch, dass der Versuch, GVO zu verbieten, zu spät ist! Tatsächlich nehmen Sie wahrscheinlich bereits einige GVO-Lebensmittel zu sich, ohne es zu wissen. Die gute Nachricht ist vielleicht, dass nach vielen Jahren GVO-Pflanzen bereits in unserem Nahrungsstrom der aufkommende wissenschaftliche Konsens ist, dass GVO-Lebensmittel nicht schädlicher sind als unmodifizierte Lebensmittel. Die aktuelle Debatte ist, ob Lebensmittel, die GVO-Zutaten enthalten (oder enthalten), als gentechnisch verändert gekennzeichnet werden sollen oder nicht.

In einer seltsamen, aber vielleicht amüsanten Sichtweise auf das Unbehagen, das manche Leute über GVO empfinden, hat ein Start-up-Unternehmen genetisch veränderte Petunien. Wenn sie im Wasser angebaut werden, sind ihre Blüten weiß, aber wenn sie mit Bier „bewässert“ werden, produzieren sie rosa oder lila Blüten, je nachdem, wie viel Bier sie bekommen (siehe Can Beautiful Flowers Change Face?). Nach Angaben des Unternehmens versuchen sie, „das, was sie als die Schönheit der Biotechnologie ansieht, der breiten Öffentlichkeit zugänglich zu machen“ (und vielleicht auch etwas Gewinn?).

In jüngerer Zeit haben wir CRISPR und verwandte Werkzeuge, die Gensequenzen (eigentlich jede DNA) präzise bearbeiten können. Und im Gegensatz zu den alten „Quaken-Medikamenten“ haben diese Werkzeuge das echte Potenzial, Krankheiten zu heilen, krankheitsübertragende Vektoren zu zerstören, Krebs zu heilen, Nutzpflanzen zu verbessern und möglicherweise den Lauf der Evolution zu verändern. Die Geschwindigkeit, mit der man so viel Gutes (oder Böses) erreichen kann, ist wirklich beeindruckend.


Integration der Genomik in die öffentliche Gesundheitspolitik und -praxis

Diese Webseite wird zu historischen Zwecken archiviert und wird nicht mehr gepflegt oder aktualisiert.

von Laura M. Beskow, Marta Gwinn und Mark A. Rothstein

Hintergrund

Das Human Genome Project, eine fortlaufende gemeinsame Anstrengung, die Geheimnisse der menschlichen DNA zu enträtseln, hat bei Wissenschaftlern und der Öffentlichkeit hohe Erwartungen geweckt. Schnelle Fortschritte in der Humangenetik und begleitenden Technologien (wie &ldquogen-Chips&rdquo) werden voraussichtlich zu großen neuen Entwicklungen in der Medizin und im Gesundheitswesen führen. Dr. Francis Collins, Direktor des National Human Genome Research Institute, stellt sich eine Zukunft vor, in der Ratschläge zur Krankheitsprävention und -behandlung auf die Genotypen der Patienten zugeschnitten sind, mit einer häufigeren oder früheren medizinischen Überwachung, einer Änderung des Lebensstils oder der Ernährung oder gezielten Drogen Therapie (1). Collins und McKusick sagen voraus, dass die genetische Bewertung individueller Krankheitsrisiken und Reaktionen auf Medikamente bereits im nächsten Jahrzehnt die allgemeine Gesundheitsversorgung erreichen wird (2).

Neben der Aufregung über die Aussicht auf maßgeschneiderte Interventionen gibt es jedoch auch eine gewisse Unsicherheit. Was bedeuten Genentdeckungen&mdashanscheinend täglich&mdashman für die öffentliche Gesundheit? Bis vor kurzem war die Genetik weitgehend auf den Bereich seltener Erkrankungen beschränkt, die durch Mutationen einzelner Gene verursacht werden. Dennoch hat die öffentliche Gesundheitsgemeinschaft genetische Komponenten in einige ihrer Arbeiten einbezogen und bemerkenswerte Erfolge bei der Prävention von Geburtsfehlern, dem Neugeborenenscreening auf angeborene Stoffwechselfehlern und der Entwicklung genetischer Leistungskapazitäten erzielt. Heute erfordern die zunehmenden Erfolge des Humangenomprojekts eine Neubewertung der Rolle der Genomik bei allen Erkrankungen von öffentlichem Interesse. Praktisch alle menschlichen Krankheiten resultieren aus der Wechselwirkung zwischen genetischen Anfälligkeitsfaktoren und der Umwelt, grob definiert, um alle exogenen Faktoren einzuschließen - chemische, physikalische, infektiöse, ernährungsphysiologische, soziale oder verhaltensbedingte. Dieses Konzept der Gen-Umwelt-Interaktion kann helfen zu erklären, warum zum Beispiel einige gesundheitsbewusste Personen mit „akzeptablen&rdquo Cholesterinwerten im Alter von 40 Jahren einen Herzinfarkt erleiden, während andere trotz jahrelangem Rauchens, schlechter Ernährung und Mangel immun gegen Herzkrankheiten zu sein scheinen der Übung. Die Entschlüsselung des komplexen Zusammenspiels zwischen Genen und Umwelt wird zu einem besseren Verständnis der biologischen Grundlagen von Krankheiten und zu neuen Wegen zur Verbesserung der Gesundheit und zur Vorbeugung von Krankheiten führen. (Wir verwenden den Begriff &ldquogenomics&rdquo, um diese erweiterte Sicht auf Gene und Genprodukte innerhalb eines ganzen Systems von Genen und Umweltfaktoren zu bezeichnen.)

Die Erfüllung dieses Versprechens stellt eine ehrgeizige Agenda für die Führung im Bereich der öffentlichen Gesundheit dar. Zwischen den wissenschaftlichen Produkten des Humangenomprojekts und unserer Fähigkeit, genetische Informationen zum Wohle der Gesundheit zu nutzen, besteht eine immense Kluft, und die Überbrückung dieser Kluft erfordert ein breites Spektrum an Aktivitäten im Bereich der öffentlichen Gesundheit. Zum Beispiel

  • Forschung im Bereich der öffentlichen Gesundheit ist erforderlich, um Informationen über Gene und DNA-Sequenzen in Wissen über die genetische Anfälligkeit für Krankheiten und die Wechselwirkungen zwischen diesen Anfälligkeiten und veränderbaren Risikofaktoren zu übersetzen.
  • Die öffentliche Gesundheitsgemeinschaft muss bei der Formulierung von Richtlinien helfen, die die sichere und angemessene Nutzung genetischer Informationen fördern.
  • Fachkräfte des öffentlichen Gesundheitswesens müssen mit anderen Gesundheitssektoren zusammenarbeiten, um sicherzustellen, dass gültige Gentests verfügbar und zugänglich sind, insbesondere in unterversorgten Bevölkerungsgruppen, und um sicherzustellen, dass die Menschen Zugang zu bewährten Interventionen haben.
  • Die öffentliche Gesundheit spielt eine wichtige Rolle bei der Förderung der Kommunikation und Aufklärung über Genomik unter allen Interessengruppen, einschließlich der Angehörigen der Gesundheitsberufe, der allgemeinen Patientenwissenschaftler, der politischen Entscheidungsträger und des Personals der Pharma-, Biotechnologie- und Versicherungsbranche.
  • Die öffentliche Gesundheit spielt auch eine entscheidende Rolle bei der Bewertung der Auswirkungen und der Kosteneffizienz der Integration der Genomik in Gesundheitsförderungs- und Krankheitspräventionsprogramme.

Neugeborenenscreening oder allgemeiner obligatorisches Massenscreening ist ein Paradigma für die Integration der Genomik in die öffentliche Gesundheit. Eine andere ist obligatorisch Angebot von Gentests, wie beispielsweise Gesetze in Kalifornien (§125050-125110), die vorschreiben, dass alle schwangeren Frauen (vor einem bestimmten Zeitpunkt der Schwangerschaft) Informationen über pränatale Screenings auf Geburtsfehler des Fötus erhalten. Bei häufigen, komplexen Krankheiten erhöhen die beteiligten Gen-Umwelt-Interaktionen jedoch in den meisten Fällen das Krankheitsrisiko einer Person, sagen jedoch nicht definitiv vorher, ob sie die Krankheit hat oder bekommen wird. Ebenso können Umweltinterventionen, die auf dem Genotyp basieren, dazu beitragen, das Risiko zu verringern, aber nicht unbedingt die Krankheit zu verhindern oder zu behandeln. Daher könnte anstelle eines obligatorischen Screenings ein anderes Paradigma für die Integration der Genomik in die öffentliche Gesundheit dem von Dr. Collins vorgeschlagenen ähneln, das darin besteht, Einzelpersonen wer will es wissen mit Informationen über ihre persönliche genetische Anfälligkeit, zusammen mit maßgeschneiderten Ratschlägen zur Risikominderung. Die Pharmakogenomik, die Wissenschaft des Verständnisses der Korrelation zwischen der genetischen Ausstattung eines Individuums und seiner Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung, stellt eine weitere potenziell weit verbreitete Anwendung von DNA-basierten Tests dar. Während Programme wie das Neugeborenen-Screening weiterhin eine wichtige und wertvolle Aktivität im Bereich der öffentlichen Gesundheit sein werden, könnten andere Modelle für zukünftige Präventionsprogramme mit Genomik existieren, insbesondere solche, die sich auf häufige, komplexe Krankheiten konzentrieren.

Die Integration der Genomik in Forschung, Politik und Praxis im Bereich der öffentlichen Gesundheit wirft viele der gleichen rechtlichen Fragen auf, die in diesem Buch diskutiert werden. Obwohl die Hinzufügung einer genetischen Komponente zu diesen Aktivitäten nicht unbedingt die grundlegenden rechtlichen Überlegungen ändert, investiert die Gesellschaft enorme Macht in das Konzept der Genetik. Falsche Vorstellungen von genetischem Determinismus (die Zukunft einer Person wird durch ihre genetische Ausstattung definiert und festgelegt) und genetischer Reduktionismus (alle Merkmale, Gesundheitsprobleme und Verhaltensweisen sind auf die Genetik zurückzuführen) haben erhebliche negative Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit und die Präventionsbotschaften (3). Darüber hinaus tragen die Genetik und ihre Anwendungen im Namen der &ldquoöffentlichen Gesundheit&rdquo die historische Verantwortung der Eugenik, einer Bewegung, die Rassenhygienegesetze in Nazi-Deutschland sowie Zwangssterilisation, Anti-Mischungsgesetze und restriktive Einwanderungspolitik in den Vereinigten Staaten und im ganzen Land umfasste Welt (4). Frühe Erfahrungen mit dem Screening von Erwachsenen auf Sichelzellanämie weisen ebenfalls auf Probleme hin, denen man sich bei der Anwendung genetischen Wissens stellen muss (5). Diese Programme wurden manchmal ohne angemessene Aufklärung, Zustimmung und Nachsorge angeboten, und infolgedessen erlitten die identifizierten Träger (und die kein Risiko für die Entwicklung der Krankheit hatten) Stigmatisierung und Diskriminierung (6).

Frühere Kommentatoren haben sich mit ethischen, rechtlichen und sozialen Fragen im Zusammenhang mit Gentests befasst (7,8) und mit Genforschung (9,10). Dieses Kapitel konzentriert sich auf ausgewählte Rechtsfragen, die sich bei der Integration der Genomik in die öffentliche Gesundheitspolitik und -praxis ergeben.

Justizbehörden

Das Versprechen genetischer Informationen wird durch mehrere Bedenken hinsichtlich ihres Missbrauchs gemildert, und diese Bedenken waren Gegenstand einer Vielzahl von gesetzgeberischen Aktivitäten. Die National Conference of State Legislatures bietet eine regelmäßig aktualisierte Zusammenstellung der genetischen Gesetze der Bundesstaaten in Bezug auf eine Reihe von Themen wie Adoption, Gentechnik und Klonen, Strafrecht und Forensik, Beschäftigung, Versicherung, Forschung und medizinische Tests, Vaterschaft und Datenschutz (11). Hier heben wir exemplarisch zwei Kategorien solcher Gesetzgebungsaktivitäten hervor: solche, die auf genetische Diskriminierung in der Beschäftigung abzielen, und solche, die die Krankenversicherung auf Landes- und Bundesebene betreffen. Bedenken hinsichtlich der Diskriminierung im Versicherungs- und Beschäftigungsbereich können von besonderer Bedeutung für die öffentliche Gesundheit sein, da die Angst vor Diskriminierung Einzelpersonen davon abhalten kann, genetische Beratung oder Tests in Anspruch zu nehmen, die ihrer Gesundheit nützen könnten, oder an wertvoller genetischer Forschung teilzunehmen (12).

Landesebene

Im Jahr 2000 befragte die American Management Association 2.133 Personalmanager zu arbeitsmedizinischen Untersuchungen von Mitarbeitern. Wenn ihnen eine spezifische Definition von Gentests vorgelegt wurde, antworteten nur sieben (0,3%) der Befragten, dass ihre Unternehmen solche Tests durchgeführt haben (13). Deutlich größere Anteile gaben an, die Anfälligkeit für Gefährdungen am Arbeitsplatz zu testen und eine Familienanamnese zu erstellen (15,8% bzw. 18,1%).

Über die Hälfte der Bundesstaaten hat Gesetze erlassen, die genetische Diskriminierung bei der Beschäftigung verbieten (11). All dies verbietet die Diskriminierung aufgrund von genetischen Testergebnissen und alle verbieten die genetische Diskriminierung bei der Einstellung, Entlassung oder Beschäftigungsbedingungen. Einige umfassen auch Informationen über Gentests, Familienanamnese oder vererbte Merkmale. Zum Beispiel verbietet North Carolina (§95-28.1A) die Diskriminierung am Arbeitsplatz „da die Person„ Gentests oder Beratungsdienste angefordert hat, oder auf der Grundlage genetischer Informationen, die über die Person oder ein Familienmitglied der Person&rdquo erhalten wurden.&rdquo Das Gesetz definiert &ldquogenetische Informationen&ldquo als &ldquoInformationen über Gene, Genprodukte oder ererbte Merkmale, die von einer Person oder einem Familienmitglied stammen können.&rdquo Viele dieser Gesetze verbieten es Arbeitgebern auch, genetische Informationen anzufordern oder zu verlangen, genetische Tests durchzuführen oder genetische Informationen zu erhalten. In New York (§296.19(a)) ist es zum Beispiel für Arbeitgeber ungesetzlich, 1) direkt oder indirekt einen Gentest an eine Person als Bedingung oder Beschäftigung anzufordern, zu verlangen oder zu verabreichen oder 2) zu kaufen oder auf andere Weise die Ergebnisse oder die Interpretation der genetischen Testergebnisse einer Person zu erlangen oder mit einer Person eine Vereinbarung über die Durchführung eines genetischen Tests oder die Bereitstellung von genetischen Testergebnissen zu treffen.

Neunundzwanzig Staaten verbieten es Krankenversicherern, genetische Informationen zur Feststellung der Versicherungsfähigkeit zu suchen, zu verlangen oder zu verwenden, und 38 Staaten verbieten die Bewertung, Kündigung oder Ablehnung einer Versicherung auf der Grundlage genetischer Informationen (11). Das Gesetz von Maryland (Insect27-909) verbietet Versicherern, gemeinnützigen Gesundheitsdiensten und Organisationen zur Erhaltung der Gesundheit, 1) einen Gentest, die Ergebnisse eines Gentests, genetische Informationen oder einen Antrag auf genetische Dienste abzulehnen , eine Krankenversicherungspolice oder einen Krankenversicherungsvertrag abzulehnen, einzuschränken, zu stornieren, die Verlängerung zu verweigern, die Tarife zu erhöhen, die Bedingungen oder einen anderen Vertrag zu beeinträchtigen und 2) einen Gentest oder die Ergebnisse eines Gentests anzufordern oder zu verlangen, oder genetische Informationen für die Entscheidung, ob Krankenversicherungsschutz ausgestellt oder verlängert werden soll. Staatliche Krankenversicherungsgesetze werden durch den Employee Retirement Income Security Act (ERISA) (29 U.S.C. Kap. 18) insoweit vorweggenommen, als sie versuchen, arbeitgeberbasierte Gruppenkrankenversicherungen zu regulieren. Daher besteht der Hauptwert der staatlichen Gesetze darin, Diskriminierung in der individuellen Krankenversicherung zu verbieten.

Halle und Reich (14) hat kürzlich untersucht, ob diese Art von Gesetzen das Ausmaß der genetischen Diskriminierung durch Krankenkassen verringern. Aus Daten, die an mehreren Standorten gesammelt wurden, fanden sie fast keine gut dokumentierten Fälle, in denen Krankenkassen entweder vor oder nach Inkrafttreten dieser Gesetze oder in Staaten mit oder ohne diese Gesetze präsymptomatische genetische Testergebnisse in ihren Versicherungsentscheidungen verlangten oder verwendeten. Sie kamen jedoch zu dem Schluss, dass solche Gesetze es weniger wahrscheinlich gemacht haben, dass Versicherer genetische Informationen in Zukunft verwenden werden, und dass, obwohl Versicherer und Agenten die Gesetze nur vage kennen, die Gesetze die Branchennormen und Einstellungen zur Legitimität der Verwendung geprägt haben diese Information. Die Autoren stellten auch fest, dass die Fälle von nachteiligen Folgen der Krankenversicherung, die sie aufdeckten, die Zahlung für genetische Dienstleistungen (z. Die Zahlung für genetische Dienstleistungen ist eine wichtige Zugangsbarriere, die die Gesetze zur genetischen Diskriminierung nicht adressieren.

Bundesebene

Obwohl in den letzten zehn Jahren eine Reihe von Gesetzentwürfen vorgelegt wurden, wurde noch kein Bundesgesetz verabschiedet, das sich direkt auf genetische Diskriminierung im individuellen Versicherungsschutz oder in der Beschäftigung bezieht. Der 107. Kongress (2001&ndash02) brachte mehrere solcher Gesetzentwürfe (z. B. H.R.602, S.318) ein, die Krankenkassen und Versicherern die Diskriminierung aufgrund geschützter genetischer Informationen verbieten und auch Diskriminierung aufgrund geschützter genetischer Informationen rechtswidrig machen würden. Diese Gesetzentwürfe definieren &ldquogeschützte genetische Informationen&rdquo als 1) Informationen über genetische Tests einer Person, 2) Informationen über genetische Tests von Familienmitgliedern der Person oder 3) Informationen über das Auftreten einer Krankheit oder Störung bei Familienmitgliedern.

Abgesehen von spezifischen Rechtsvorschriften gelten jedoch für die Genetik andere bundesstaatliche Antidiskriminierungsgesetze. Diese beinhalten:

  • Eine von Präsident Clinton im Februar 2000 unterzeichnete Durchführungsverordnung zum Verbot der Diskriminierung im Bundesarbeitsverhältnis auf der Grundlage genetischer Informationen (15).
  • Der Americans with Disabilities Act von 1990 (ADA) (Pub. L. 101-336), der Personen umfasst, die eine körperliche oder geistige Beeinträchtigung haben, die eine wichtige Lebensaktivität erheblich einschränkt, eine solche Beeinträchtigung haben oder als eine solche Beeinträchtigung haben. Die Equal Opportunity Employment Commission (EOEC) hat eine Interpretation der ADA herausgegeben, die besagt, dass Einrichtungen, die Personen auf der Grundlage genetischer Informationen diskriminieren, diese Personen als Personen mit Beeinträchtigungen betrachten (16). Diese Auslegung ist für die Gerichte jedoch nicht bindend, und die spätere Rechtsprechung lässt Zweifel an ihrer Durchsetzung aufkommen. In Sutton gegen United Airlines, Inc. (17) entschied der Oberste Gerichtshof, dass bei der Bestimmung des Schweregrades einer Beeinträchtigung gemäß dem ADA die Erkrankung in ihrem abgeschwächten Zustand berücksichtigt werden muss, beispielsweise mit Brillen oder Medikamenten. Bezeichnenderweise argumentierte das Gericht, dass der Kongress beabsichtigte, die Berichterstattung der ADA auf die 43 Millionen Amerikaner zu beschränken, die nach Schätzungen des Kongresses schwere Behinderungen haben. Nach Ansicht des Gerichts würde die Abdeckung bei Einbeziehung von Personen mit „geminderten&rdquo Beeinträchtigungen diese Zahl bei weitem übersteigen. Wenn eine ähnliche Argumentation auf asymptomatische Personen mit genetisch erhöhtem Krankheitsrisiko angewendet würde, wäre die Schlussfolgerung, dass sie ebenfalls nicht unter die ADA fallen. Im Jahr 2001 hat die EOEC ihre erste gerichtliche Klage gegen den Einsatz von Gentests am Arbeitsplatz beigelegt, als eine US-amerikanische Eisenbahngesellschaft zustimmte, keine Gentests von Mitarbeitern mehr zu verlangen, die Ansprüche auf Karpaltunnelsyndrom geltend machen (18).
  • Der Health Insurance Portability and Accountability Act von 1996 (HIPAA) (Pub. L. 104-191) verbietet arbeitgeberbasierten Gruppenkrankenversicherungen, jeden gesundheitsstatusbezogenen Faktor, einschließlich genetischer Informationen, als Grundlage für die Verweigerung oder Einschränkung der Anspruchsberechtigung zu verwenden Versicherungsschutz oder um einer Person mehr Versicherungsschutz in Rechnung zu stellen (siehe Kapitel 8). HIPAA begrenzt auch Ausschlüsse für Vorerkrankungen und legt ausdrücklich fest, dass genetische Informationen ohne aktuelle Diagnose nicht als Vorerkrankung gelten.

Eine zentrale Frage bei der Ausarbeitung von gesetzgeberischen Ansätzen, die den angemessenen Einsatz von Genomik fördern, ist, ob genetische Informationen separat oder als Teil von Maßnahmen behandelt werden sollten, die Gesundheitsinformationen breiter ansprechen sollen. Diese Kontroverse hat wichtige Auswirkungen auf die Integration der Genomik in die Aktivitäten zur Überwachung der öffentlichen Gesundheit.

Genetischer Außergewöhnlichkeit

Die Herausforderung bei der Definition des Begriffs &ldquogenetisch&rdquo ist eine der konzeptionellen Schwierigkeiten, die sich aus dem genetischen Exzeptionalismus und der Praxis ergeben, genetische Informationen anders zu behandeln als andere Arten von Gesundheitsinformationen und ihnen besondere Privatsphäre und Sicherheit zu gewähren.Theoretisch könnte alles, von den Ergebnissen eines DNA-Tests bis hin zu Routinebeobachtungen zu Geschlecht, Augenfarbe und Blutgruppe, als genetische Information klassifiziert werden. Enge gesetzliche Definitionen (z. B. „Ergebnisse der DNA-Analyse&rdquo) können die gewünschten politischen Ziele, wie den Schutz von Personen vor genetischer Diskriminierung, möglicherweise nicht erreichen, da sie beispielsweise nicht auf die Familienanamnese zutreffen. Andererseits können breite Definitionen (z. B. &ldquoInformationen über Gene, Genprodukte oder vererbte Merkmale&rdquo) wichtige medizinische und öffentliche Gesundheitsaktivitäten behindern. Gostin und Hodge (19).

Michigan schuf 1997 die Michigan Commission on Genetic Privacy and Progress, um den Gouverneur und die Legislative in spezifischen Fragen der Genetik zu beraten. In seinem Abschlussbericht (20) empfahl die Kommission, dass alle Rechtsvorschriften die Genetik im Zusammenhang mit medizinischen Fragen als Ganzes berücksichtigen sollten, und daher sollte der Schutz der Privatsphäre alle vertraulichen medizinischen Informationen umfassen. Außerdem wurde empfohlen, die Gesetzgebung auf Bereiche zu beschränken, in denen professionelle Standards und Ethikkodizes nicht ausreichen, um das öffentliche Wohl und die Rechte des Einzelnen zu schützen, und Gesetze zu vermeiden, die nützliche Gentests und Forschung in unangemessener Weise verbieten oder behindern.

Als Reaktion auf diesen Bericht verabschiedete Michigan eine Reihe von Gesetzen, die sich mit Fragen wie der Einwilligung nach Aufklärung vor der Durchführung eines Gentests (§333.17020) sowie der genetischen Diskriminierung in Beschäftigung (§37.1201) und Versicherung (§500.3407b) befassten. . In diesen Gesetzen ist &ldquogenetischer Test&rdquo definiert als „Analyse menschlicher DNA, RNA, Chromosomen und jener Proteine ​​und Metaboliten, die verwendet werden, um erbliche oder somatische krankheitsbezogene Genotypen oder Karyotypen für klinische Zwecke nachzuweisen&rdquo und &ldquogenetische Informationen&rdquo sind definiert als &ldquoInformationen über eine Gen, Genprodukt oder ererbtes Merkmal, das aus einem Gentest abgeleitet wurde.&rdquo Diese Definitionen ähneln denen anderer Expertengruppen (8,21). Michigan hat jedoch keine Gesetze, die einen besonderen Datenschutz für genetische Informationen gewähren, über Gesetze hinaus, die bereits die Interaktion zwischen Arzt und Patient, die Vertraulichkeit der Forschung und den allgemeinen medizinischen Datenschutz abdecken. Es sieht auch keine Eigentumsrechte an genetischen Proben oder Informationen vor, obwohl Patienten das Recht auf Zugang zu medizinischen Informationen haben.

Öffentliche Gesundheitsüberwachung

Eine der Hauptaufgaben der öffentlichen Gesundheit ist die Überwachung der öffentlichen Gesundheit. Durch das Sammeln und Analysieren von Informationen über Krankheitsausbrüche können Epidemiologen die wahrscheinliche Ursache nachteiliger gesundheitlicher Ereignisse bestimmen und den Weg für Prävention und Frühintervention aufzeigen. Da immer mehr über die Beziehung zwischen genetischen und umweltbedingten Faktoren bei der Ätiologie komplexer Erkrankungen bekannt wird, kann es im Rahmen einer umfassenden Überwachung der öffentlichen Gesundheit wichtig sein, genetische Informationen von exponierten und betroffenen Bevölkerungsgruppen zu erhalten. Unabhängig davon, ob die Hinzufügung genetischer Informationen zu Überwachungsaktivitäten qualitativ oder nur quantitativ unterschiedlich angesehen wird, stellt sich die Frage, ob es für staatliche Stellen rechtmäßig ist, die Erhebung dieser neuen Informationen zu verlangen.

Rechtliche Anfechtungen gegen die staatliche Erhebung von Gesundheitsinformationen beinhalten in der Regel verfassungsrechtliche Ansprüche wie illegale Durchsuchungen und Beschlagnahmen, gleichen Schutz und ordnungsgemäße Verfahren (siehe Kapitel 7). Nach all diesen Verfassungstheorien wägen die Gerichte das öffentliche Interesse an der Erlangung der Gesundheitsinformationen gegen das individuelle Interesse an der Verhinderung der Offenlegung ab. Ein wichtiger Aspekt ist der mögliche Schaden für den Einzelnen, der aus der Offenlegung privater Informationen resultieren könnte. &ldquoObwohl das tatsächliche Risiko eines direkt durch Überwachung verursachten sozialen Schadens gering ist, können wahrgenommene Risiken (und höhere tatsächliche Bedrohungen, die in anderen Umgebungen auftreten) einen Kontext schaffen, in dem die Datenerhebung im Bereich der öffentlichen Gesundheit politisch problematisch ist oder von den Subjekten abgelehnt wird&ldquo (22). Die Angst der Öffentlichkeit vor der Offenlegung von Gesundheitsinformationen zu verringern, ist ein ungenaues Unterfangen, aber die folgenden Maßnahmen würden zweifellos helfen:

  1. Verabschiedung strenger Gesundheitsschutzgesetze, die die Verwendung der Informationen auf Zwecke der öffentlichen Gesundheit beschränken, die Aufzeichnungen vor unberechtigtem Zugriff durch Unbefugte schützen, vorsehen, dass die Informationen in der am wenigsten identifizierbaren Form im Einklang mit öffentlichen Gesundheitszwecken aufbewahrt und verwendet werden müssen, und strenge Strafen bei Verstößen
  2. Aufklärung der Öffentlichkeit über die Existenz und Bereitstellung solcher Gesundheitsschutzgesetze und
  3. Verabschiedung von Gesetzen, die unangemessene gesundheitliche Diskriminierung durch private und öffentliche Einrichtungen verbieten.
Überlegungen zur Praxis

Das öffentliche Gesundheitswesen spielt eine wichtige Rolle bei der Umsetzung genetischer Entdeckungen in Möglichkeiten zur Verbesserung der Gesundheit und zur Vorbeugung von Krankheiten auf eine Weise, die den Nutzen der Nutzung genetischer Informationen maximiert, die Risiken minimiert und die Gesundheitsressourcen schont. Recht und Politik in Bezug auf Programme und Strategien im Bereich der öffentlichen Gesundheit, Humanressourcen, wissenschaftliche und technische Erwägungen sowie Verbraucher- und Finanzinteressen werden bei der Wahrnehmung dieser Rolle wichtige Instrumente sein. Neugeborenenscreening, Berufszulassung und Beaufsichtigung von Gentests sind Beispiele für Bereiche, in denen sich Rechtsanwendung und Genomik bereits überschneiden.

Neugeborenenscreening

Das Neugeborenen-Screening auf genetische Störungen begann in den 1960er Jahren, ermöglicht durch eine neue Technologie zur Entnahme von Blutproben und einen einfachen, kostengünstigen Labortest zum Screening auf Phenylketonurie (PKU). Da das PKU-Screening nur langsam Teil der medizinischen Routine wurde, drängten Kinderanwälte auf eine staatliche Gesetzgebung, die schließlich in allen 50 Bundesstaaten und im District of Columbia zu einem Neugeborenen-Screening führte (23). Landesweite Screening-Programme wurden ohne eine vollständige Bewertung der Validität des Screening-Tests oder des Nutzens der diätetischen Intervention zur Vorbeugung einer geistigen Behinderung bei Kindern mit PKU gestartet. Nichtsdestotrotz wird das Neugeborenen-Screening auf PKU heute allgemein als Erfolg im Bereich der öffentlichen Gesundheit anerkannt.

Fast alle der 4 Millionen Säuglinge, die jedes Jahr in den Vereinigten Staaten geboren werden, werden auf PKU und zwei bis zehn andere Erkrankungen untersucht. Die staatlichen Gesundheitsämter sind für die Durchführung von Neugeborenen-Screenings gemäß den staatlichen Gesetzen oder Vorschriften verantwortlich. Da es keine bundesstaatlichen Richtlinien gibt, haben sich die Anzahl und Art der durchgeführten Screening-Tests von Staat zu Staat und im Laufe der Zeit geändert, da Tests hinzugefügt und von staatlichen Labor-Screening-Panels abgezogen wurden (24). Dieser Mangel an Einheitlichkeit und das Aufkommen neuer Siebtechnologien (25,26) veranlasste die Bundesverwaltung für Gesundheitsressourcen und -dienste, die American Academy of Pediatrics zu ersuchen, eine Task Force für das Screening von Neugeborenen zu bilden. Im August 2000 veröffentlichte die Task Force Empfehlungen, die Bundes- und Landesbeamte, Gesundheitsdienstleister und Interessenvertretungen aufforderten, zusammenzuarbeiten, um aktuelle Richtlinien für Neugeborenen-Screening-Programme zu entwickeln und dabei wichtige ethische, rechtliche und soziale Fragen anzugehen (27,28). Zu diesen Themen gehören die Einwilligung nach Aufklärung, die Vertraulichkeit von Screening-Ergebnissen, die Verwendung von Restblutproben für Forschungszwecke und die Notwendigkeit eines stärkeren öffentlichen und professionellen Bewusstseins für die Kapazitäten und Grenzen von Neugeborenen-Screening-Programmen.

Die staatlichen Richtlinien zur Zustimmung der Eltern zum Neugeborenenscreening variieren stark. Maryland hat ein freiwilliges Neugeborenen-Screening-Programm, Wyoming bittet um Einverständniserklärung und Massachusetts hat ein Einverständnis-Verfahren für eine Pilotstudie zum Neugeborenen-Screening auf Mukoviszidose entwickelt (27). In allen anderen Bundesstaaten ist das Neugeborenenscreening obligatorisch, obwohl die meisten Staaten die Verweigerung der Eltern zulassen. Der Bericht der Task Force empfahl, &ldquozusätzliche Ansätze zur Information und Aufklärung von Eltern weiter zu untersuchen&rdquo (27).

Viele staatliche Programme fügten in den 1980er Jahren ein Neugeborenen-Screening auf Sichelzellanämie hinzu und lenkten die Aufmerksamkeit erneut auf die Frage der Vertraulichkeit von Screening-Testergebnissen (29). In jüngerer Zeit hat die Zunahme elektronischer Datenbanken für das Neugeborenenscreening und anderer öffentlicher Gesundheitsakten diesem Problem eine weitere Dimension hinzugefügt (30). Versuche, Gesundheitsprogramme für Säuglinge und Kinder besser zu koordinieren und zu evaluieren, haben zu einer verstärkten Integration früher weitgehend unabhängiger Informationssysteme geführt. Datenverknüpfung und gemeinsame Nutzung erfordern neue Methoden zur Wahrung der Vertraulichkeit (27).

Restproben aus Neugeborenen-Screening-Programmen sind als reiche Quelle für Forschungsstudien anerkannt. Diese Proben stellen eine wirklich bevölkerungsbezogene &ldquobiobank&rdquo dar, die verwendet werden kann, um neues Wissen zu entwickeln, indem betroffene Personen aus Krankenakten identifiziert und ihre gespeicherten Proben zum Testen abgerufen werden (31). Auch ohne personenbezogene Daten sind diese Proben für populationsbasierte Genotyp-Häufigkeitsstudien nützlich. Es besteht jedoch kein allgemeiner Konsens über die Verwendung von Screening-Restproben für Neugeborene für die Forschung. Eine 1996 veröffentlichte Grundsatzerklärung skizzierte einige der Probleme und stellte Leitlinien vor (32), aber die Debatte zu diesem Thema geht weiter.

Berufserlaubnis

Die Sicherstellung eines kompetenten Personals im öffentlichen und persönlichen Gesundheitswesen ist ein wesentlicher Dienst der öffentlichen Gesundheit. Da die meisten Angehörigen der Gesundheitsberufe vor den Fortschritten in der Genomik durch das Humangenomprojekt ausgebildet wurden, verfügen nur wenige über die notwendige Ausbildung oder Erfahrung, um in diesem sich rasch entwickelnden Gebiet effektiv mitzuwirken. Zum Beispiel Giardiello und Kollegen (33) untersuchte den klinischen Einsatz von kommerziellen APC Gentest für familiäre adenomatöse Polyposis (FAP). Sie fanden heraus, dass nur 18,6% der Patienten vor dem Test eine genetische Beratung erhielten und nur 16,9% eine schriftliche Einverständniserklärung gaben. Ärzte interpretierten die Testergebnisse in 31,6% der Fälle falsch, was den Patienten die falsche Gewissheit gab, dass sie keine FAP hatten, obwohl ihre Ergebnisse tatsächlich nicht eindeutig waren.

Es werden eine Reihe von Bemühungen unternommen, um die genetische Bildung unter klinischen (33) und öffentliche Gesundheit (34) Fachleute. Es wurde auch eine Vorlage mit Schlüsseldatenelementen vorgeschlagen, die Angehörigen der Gesundheitsberufe zu einem Gentest zur Verfügung gestellt werden sollten, beispielsweise in Form eines Merkblatts (35). Da jedoch die Zahl der DNA-basierten Tests zunimmt, könnte ein Bereich, der zunehmend Aufmerksamkeit erregt, die Zulassung von Experten für genetische Beratung und Fachleuten sein, die Menschen bei Entscheidungen über Gentests unterstützen und ihnen helfen, die Ergebnisse zu interpretieren und darauf zu reagieren. Das American Board of Genetic Counselors zertifiziert genetische Berater, aber medizinische Abrechnungsverfahren verbieten normalerweise die Erstattung für nicht lizenzierte Fachkräfte. So werden den Kostenträgern genetische Beratungsbesuche nach ärztlichen Leistungscodes in Rechnung gestellt, die oft schlechte Indikatoren für die erbrachte Leistung sind und auch teurer sind als bei einer direkten Abrechnung (36).

Die Gründe für die Zulassung von genetischen Beratern sind vielfältig. Erstens kann es zum Schutz der öffentlichen Gesundheit und Sicherheit beitragen, indem es den Anwendungsbereich definiert, Mindeststandards für Qualifikationen und Verhalten festlegt und Mechanismen für Weiterbildung, Leistungsüberwachung und Disziplinarmaßnahmen bereitstellt. Durch die Einschränkung der Verwendung des Titels &ldquogenetischer Berater&rdquo kann die Zulassung auch die Öffentlichkeit schützen, indem sie ihr hilft, qualifizierte Fachkräfte zu finden. Zweitens kann die Zulassung das Angebot an ausgebildeten genetischen Beratern erhöhen. Obwohl die schnelle Kommerzialisierung von Gentests die brauchen für genetische Berater, aktuell Anforderung kann diesem wahrgenommenen Bedarf aufgrund von Erstattungsbeschränkungen nicht entsprechen. Die Gewährung einer direkten Kostenerstattung für genetische Beratungsdienste könnte dazu beitragen, die Legitimität des Berufs zu stärken und hochqualifizierte Kandidaten für diesen Bereich zu gewinnen. Unter der Annahme, dass das Angebot tatsächlich zunimmt, sodass die Verfügbarkeit kein Hindernis darstellt, kann die Zulassung schließlich den Zugang zu genetischen Beratungsdiensten durch Versicherungsschutz und möglicherweise durch reduzierte Kosten erleichtern, da ärztliche Leistungscodes vermieden werden.

Kalifornien war der erste Staat, der im September 2000 ein Lizenzgesetz (SB 1364) erlassen hat, gefolgt von Utah (SB 59) im März 2001. New York hat Lizenzgesetze anhängig (AB2360, SB2471). Eine wichtige Frage für eine solche Gesetzgebung ist: Wer hat Anspruch auf eine Zulassung? In vielen Fällen erfordert die genetische Beratung die Fähigkeit, die Familienanamnese zu erheben und zu interpretieren, Informationen über die Risiken und Vorteile von Gentests zu geben, Ergebnisse und Optionen zu interpretieren und zu erklären sowie Beratung, emotionale Unterstützung und Überweisung in Bezug auf komplexe psychosoziale Probleme bereitzustellen. Das kalifornische Gesetz fordert die Zulassung von genetischen Beratern auf Master-Niveau und klinischen Genetikern auf Doktoratsebene und beschränkt die Verwendung des Titels "ldquogenetischer Berater" auf diejenigen, die eine Lizenz beantragt und erhalten haben. Sie ermöglicht jedoch die Durchführung einer genetischen Beratung durch einen „Ärzte, eine zertifizierte Krankenschwester mit einem Spezialgebiet für Genetik oder eine andere entsprechend ausgebildete, lizenzierte medizinische Fachkraft.&rdquo Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, sicherzustellen, dass alle Angehörigen der Gesundheitsberufe über ein angemessenes Maß an Genomik verfügen Kompetenz.

Die Zulassung kann ein wichtiger Schritt sein, um den Bedarf an qualifizierten genetischen Beratungsfachkräften zu decken. Gleichzeitig basiert die genetische Beratung traditionell auf einem „Low-Throughput&rdquo-Modell und ist in der Regel ein zeitintensiver Einzelprozess, der oft auf die Analyse von Familienstammbäumen auf hoch penetrante genetische Mutationen ausgerichtet ist. Fortschritte in der Genomik werden Gentests mit hohem Durchsatz für mehrere Genvarianten mit geringerer Penetranz ermöglichen, die mit einem erhöhten Risiko für häufige Krankheiten verbunden sind. Es besteht ein erheblicher Bedarf, den Fachleute des öffentlichen Gesundheitswesens decken können, an innovativen Produkten, die eine Vielzahl von Medien verwenden, um die allgemeine genomische Kompetenz zu erhöhen, sowie an Bildungsinstrumenten, die in der Primärversorgung und in anderen Umgebungen verwendet werden können.

Aufsicht über Gentests

Der Grad der Beaufsichtigung von Gentests hat erhebliche medizinische, soziale, ethische, rechtliche, wirtschaftliche und öffentliche Auswirkungen, und das Aufsichtssystem kann sich stark auf Personen auswirken, die sich Tests unterziehen, die Tests durchführen und Tests entwickeln (21). Genetischen und nicht-genetischen Tests wird die gleiche Aufsicht zuerkannt, die hauptsächlich durch die Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) (42 CFR 493), den Federal Food, Drug, and Cosmetics Act (21 USC 301) und während der Prüfphasen erfolgt. Bundespolitik zum Schutz von Menschen (45 CFR 46, 21 CFR 50 und 56). Die meisten neuen genetischen Tests werden als klinische Labordienstleistungen entwickelt und bereitgestellt, die als interne Tests oder &ldquohome-brews&rdquo bezeichnet werden hat sich entschieden, dies im Ermessen der Durchsetzung nicht zu tun, zum Teil, weil die Anzahl solcher Tests schätzungsweise die Überprüfungskapazität der Behörde übersteigt (37,38). Allerdings hat der Beratungsausschuss des Sekretärs für Gentests (SACGT), der 1998 gegründet wurde, um das US-Gesundheitsministerium zu beraten, empfohlen, dass alle neuen Gentests von der FDA überprüft werden, bevor sie für klinische oder öffentliche Gesundheitszwecke verwendet werden (21) und entwickelt zusätzliche Empfehlungen, um die FDA bei dieser Überprüfung zu unterstützen.

SACGT empfahl auch, die CLIA-Bestimmungen zu erweitern, um spezifischere Bestimmungen zur Gewährleistung der Qualität von Labors, die Gentests durchführen, vorzusehen. CLIA hat Anforderungen für die Zertifizierung von Labors in Bereichen wie Zytologie und Mikrobiologie, aber eine spezielle Kategorie der Genetik existiert derzeit nicht. Es wurde eine Überarbeitung von CLIA vorgeschlagen, die einen Spezialbereich für Gentests anerkennen und Probleme in Bezug auf Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Testergebnisse, Einwilligung nach Aufklärung, Vertraulichkeit, Beratung und klinische Angemessenheit ansprechen würde (39).

Obwohl diese Vorschriften und Standards auf nationaler Ebene entwickelt werden, müssen staatliche und lokale öffentliche Gesundheitsprogramme darauf vorbereitet sein, zusätzliche Aktivitäten zu unternehmen, um zu empfehlen, wann und wie genetische Informationen zur Verbesserung der Gesundheit und Vorbeugung von Krankheiten in ihren eigenen Gemeinschaften verwendet werden könnten. Dies beinhaltet die Bewertung der staatseigenen medizinischen, epidemiologischen und wirtschaftlichen Daten über Krankheiten, für die Gentests verfügbar sind, die Bereitschaft und Ausbildung von Angehörigen der Gesundheitsberufe, die Angemessenheit der staatlichen Gesetze zum Schutz der Öffentlichkeit und die Gewährleistung des Zugangs zu Laborkompetenz und Infrastrukturkapazität.

Aufkommende Probleme

Angesichts der sich rasch weiterentwickelnden Art der genetischen Entdeckung könnte fast jedes Problem als "auftauchend" klassifiziert werden. Dazu gehören die Kommerzialisierung und Patentierung von genetischem Material, reproduktive Rechte und Entscheidungsfindung, das Klonen von Menschen und die genetische Veränderung von Lebensmitteln und Mikroorganismen.

Ein aufkommendes Problem, das die Umweltgesundheit, die Arzneimittelsicherheit und die Risikobewertung erheblich beeinträchtigen könnte, ist die Toxikogenomik. Toxicogenomics ist die Untersuchung, wie Genome auf Umweltstressoren reagieren. Wissenschaftler auf diesem Gebiet verwenden leistungsstarke neue Werkzeuge wie Mikroarray- und Proteomik-Technologien, um Veränderungen in der Genexpression auf genomweiter Basis zu bewerten und eine globale Perspektive darüber zu liefern, wie ein Organismus auf einen bestimmten Stress, ein Medikament oder einen Giftstoff reagiert (40). Nach Angaben des Nationalen Zentrums für Toxicogenomics (40) könnte die Toxikogenomik dabei helfen, drei große wissenschaftliche Probleme zu lösen:

  1. Verständnis biologischer Reaktionen auf Umweltstressoren und Identifizierung von Stoffen, die ein erhebliches Risiko für die menschliche Gesundheit darstellen. Toxikologen verlassen sich bei der Vorhersage menschlicher Reaktionen auf potenzielle Toxine weitgehend auf Extrapolationen aus Tierstudien. Die Toxikogenomik kann Wissenschaftlern helfen, Einblicke in Toxizitätspfade und deren Mechanismen zu gewinnen, was zu besseren Modellen für die Extrapolation, weniger Tierstudien und schnelleren Schlussfolgerungen führt.
  2. Verbesserung der Expositionsbewertung. Die Verwendung von mRNA-Signaturen kann die Identifizierung des Erregers (der Klasse) und der Dosis, denen eine Person ausgesetzt war, ermöglichen. Proteinmarker könnten auch verwendet werden, um präsymptomatische, umweltbedingte Erkrankungen nachzuweisen. Somit könnten Überwachungsprogramme bei Mensch und Tier in Bereichen durchgeführt werden, in denen eine Exposition und/oder Kontamination vermutet wird.
  3. Identifizierung von Anfälligkeitsfaktoren, die die individuelle Reaktion auf Umwelteinflüsse beeinflussen. Diese Informationen könnten verwendet werden, um die interindividuelle Variation als Reaktion auf Medikamente oder Umweltgifte vorherzusagen.

Diese möglichen Ergebnisse werfen mehrere rechtliche Fragen auf.Erstens konzentrieren sich die Diskussionen über Genetik und Beschäftigung häufig auf die Möglichkeit, dass Arbeitgeber Einzelpersonen auf der Grundlage prognostischer genetischer Informationen von der Beschäftigung ausschließen, beispielsweise Informationen über das zukünftige Krebsrisiko, wenn es um übermäßige Gesundheitskosten geht. Die Toxikogenomik bietet die Möglichkeit, dass individuelle Risiken vor der toxischen Exposition identifiziert und zum Schutz der Gesundheit der Arbeitnehmer eingesetzt werden könnten (41). Zu den Maßnahmen, die als Reaktion auf solche Informationen ergriffen werden könnten, gehören eine verstärkte medizinische Überwachung, um die frühen Auswirkungen einer Exposition zu messen, mehr persönliche Schutzausrüstung oder Umweltkontrollen zur Verringerung der Expositionsniveaus sowie administrative Kontrollen wie die Begrenzung der Expositionszeiten. Daher stellt sich in diesen Beispielen das primäre Diskriminierungsproblem, ob der Arbeitgeber eine Prüfung der Einwände der Arbeitnehmer verlangen könnte. Staatliche Gesetze unterscheiden sich darin, ob Arbeitgeber rechtmäßig verlangen oder sogar verlangen können, dass eine Person einen arbeitsbezogenen Gentest durchführt.

Ein anderer Ansatz, der in der Berylliumindustrie verwendet wird (42) trägt der Arbeitgeber die Kosten für die Tests, die der Arbeitnehmer auf freiwilliger Basis ablegen kann. Die Ergebnisse werden an den Mitarbeiter zurückgegeben, der allein entscheidet, ob er ein genetisch erhöhtes Risiko in Kauf nimmt.

Eine zweite Anwendung der Toxikogenomik ist die Festlegung von Umwelt- und Gesundheitsvorschriften. Die Standards können sich von Ort zu Ort auf der Grundlage der Genotypen der Bevölkerung in der Region unterscheiden, die mit Rasse oder ethnischer Zugehörigkeit korreliert sein können. Angenommen, eine Schmelze befindet sich neben einem Indianerreservat. Nehmen wir auch an, dass es Beweise dafür gibt, dass Individuen mit einem bestimmten genetischen Marker einem erhöhten Risiko durch Umweltschadstoffe ausgesetzt sind und dass dieser Marker in den Mitgliedern des Stammes sehr häufig vorhanden ist. Ein solches Szenario wirft eine Reihe von Fragen auf: Inwieweit sollte die genetische Variation die Umweltstandards beeinflussen? Sollte für diesen speziellen Bereich eine neue, restriktivere Umweltnorm verabschiedet werden? Oder soll überall der gleiche restriktive Standard gelten? Sollten Personen aufgefordert werden, sich einem Empfindlichkeitstest zu unterziehen, bevor sie sich in einem bestimmten Gebiet aufhalten?

Eine bedeutende Herausforderung für die Toxikogenomik wird darin bestehen, die traditionell mit der Genetik verbundene nicht-direktive Haltung mit der Direktive, die manchmal in der Praxis des öffentlichen Gesundheitswesens zu finden ist, in Einklang zu bringen. Aufgrund der Eugenik und anderer Missbräuche in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts bieten Genetiker heute patientenzentrierte Dienste an, die versuchen, die individuelle Autonomie zu respektieren. Im Gegensatz dazu konzentrieren sich öffentliche Gesundheitsprogramme oft eher auf die Gesundheit der Bevölkerung als auf die individuelle Gesundheit, und einige nutzen die Macht der Regierung, um Maßnahmen zum Schutz der Gesundheit zu erzwingen. Daher wird die politische und öffentliche Unterstützung für die Integration der Genomik in Politiken und Programme im Bereich der öffentlichen Gesundheit davon abhängen, dass die Unrichtigkeit berücksichtigt wird, die ein ethischer Ansatz für die Genomik erfordert.

Abschluss

Es wird erwartet, dass Fortschritte in der Humangenetik die Medizin und die öffentliche Gesundheit revolutionieren und zu neuen Erkenntnissen über zugrunde liegende Krankheitsprozesse führen, einschließlich Gen-Umwelt-Interaktionen im Zusammenhang mit häufigen chronischen Krankheiten und neue Wege für Prävention und Behandlung eröffnen. Die Realisierung dieses Potenzials erfordert die Integration der Genomik in ein breites Spektrum von Forschungs-, Politik- und Praxisaktivitäten im Bereich der öffentlichen Gesundheit. Aus dieser Integration ergeben sich keine grundsätzlich neuen oder anderen rechtlichen Herausforderungen, als dies für Angehörige des öffentlichen Gesundheitswesens allgemein üblich ist, sondern genetische Informationen ergänzen das ohnehin komplexe Zusammenspiel zwischen Medizin, Public Health und Gesundheitsrecht um eine Variable.

Hier haben wir die sich entwickelnden Justizbehörden untersucht, die darauf abzielen, den Missbrauch genetischer Informationen zu reduzieren, einschließlich Beispiele für staatliche und bundesstaatliche Gesetzgebungsaktivitäten in Bezug auf Versicherungs- und Beschäftigungsdiskriminierung. Diese Aktivitäten unterstreichen die Notwendigkeit, strenge Maßnahmen zu ergreifen, um die Vertraulichkeit aller Gesundheitsinformationen besser zu schützen, ohne die Kernfunktion der öffentlichen Gesundheit, nämlich die Sammlung und Bereitstellung von Informationen, die für die Gesundheit der Gemeinschaften entscheidend sind, zu behindern. Genetische Informationen sind bereits ein fester Bestandteil der öffentlichen Gesundheitspraxis im Bereich des Neugeborenen-Screenings und, da wir den Bereich seltener Einzelgen-Erkrankungen verlassen, das Aufsichtssystem für Gentests und die Notwendigkeit einer umfassenden professionellen und öffentlichen Aufklärung über Genomik stellt Gesundheitspraktiker vor Herausforderungen. Neben den rasanten Fortschritten in der Genetik und Gentechnologie tauchen weiterhin Probleme auf, die angegangen werden müssen, während wir daran arbeiten, die angemessene Verwendung genetischer Informationen in Medizin, öffentlicher Gesundheit und Gesellschaft zu verstehen.

Danksagung

Dieses Projekt wurde im Rahmen einer Kooperationsvereinbarung von den Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention durch den Verband der Lehrer für Präventivmedizin unterstützt.


Einführung

Organoide sind dreidimensionale (3D) In-vitro-Kulturen, die aus Stamm- oder Vorläuferzellen gewonnen werden und die die Vielfalt der Zelltypen, die architektonische Organisation und die Funktion ihrer in-vivo-Gewebe-Gegenstücke rekapitulieren können [17, 64]. Der erste Versuch, Organe in vitro zu erzeugen, begann 1907, als Wilson zeigte, dass dissoziierte Schwammzellen reaggregieren und sich selbst organisieren können, um den gesamten Organismus zu reformieren [117]. Aktuelle Versuche zur Generierung organspezifischer Modelle erwuchsen aus der Arbeit von Sasai und Kollegen, die zeigten, dass dreidimensionales (3D) Hirnrindengewebe in vitro aus pluripotenten Stammzellen erzeugt werden kann [26] sowie aus der Arbeit von Clevers und Kollegen, die Darmorganoide aus adulten Darmstammzellen erzeugten [95]. Diese Studien führten zur Einteilung von Organoiden in zwei Hauptkategorien: aus pluripotenten Stammzellen (PSC) stammende Organoide und aus adulten Stammzellen (AdSC) stammende Organoide.

Da es bereits mehrere Übersichten gibt, die diese beiden Kategorien vergleichen [17, 43, 64], wird dieses Kapitel nur eine kurze Zusammenfassung der wichtigsten Unterscheidungsfaktoren zwischen PSC- und AdSC-abgeleiteten Organoiden geben. Im Prinzip werden von PSC abgeleitete Organoide entweder aus embryonalen Stammzellen (ESCs) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gezüchtet, die wir zusammenfassend als PSCs bezeichnen. Diese Zellen werden zunächst in Suspension in einem definierten Medium kultiviert, um die Zellaggregation und die gerichtete Differenzierung zu fördern [43]. Zellcluster werden dann in eine Matrix eingebettet, die strukturelle Unterstützung bietet, sodass sich die Zellen zu Strukturen organisieren können, die dem körpereigenen Gewebe ähneln. Von PSC abgeleitete Organoide können verschiedene Zelltypen enthalten, die aus den verschiedenen Keimblättern (Ektoderm, Mesoderm und Endoderm) stammen. Seit den ersten 3D-Kulturen der Großhirnrinde [26] wurden organoide Differenzierungsprotokolle entwickelt, um Modelle verschiedener anderer Gewebe zu generieren, basierend auf dem Vorhandensein spezifischer Signalfaktoren im Medium. Etablierte murinen PSC-abgeleiteten Organoide umfassen heute Modelle des Augenbechers [27], der Hypophyse [105], des Innenohrs [59] und der Schilddrüse [4, 63]. Zu den humanen PSC-abgeleiteten Organoiden gehören Modelle des Gehirns [65], der Niere [77, 106], des Dünndarms [102], des Magens [73], der Lunge [25], der Leber [107], des Dickdarms [79] und der Brustdrüse [88].

AdSC-abgeleitete Organoide hingegen erfordern keine gerichtete Differenzierung, da sie aus geweberesidenten adulten Stammzellen in einem ähnlichen Prozess wie bei der Schwammzellreaggregation gezüchtet werden [117]. AdSCs werden zuerst durch Gewebedissoziation aus dem Organ extrahiert und dann zur Bildung von Organoiden in einem Medium geleitet, das ihre Stammzellaktivität mit einer optimalen Wachstumsfaktorkombination unterstützt. Beispiele für von AdSC abgeleitete organoide Kulturen der Maus umfassen Darm [95], Magen [8, 104], Leber [15, 41, 42, 45, 83], Bauchspeicheldrüse [15, 44], Lunge [67], Endometrium [14 ], Speicheldrüse [81] und Geschmacksknospe [90]. Humane AdSC-abgeleitete Organoide wurden auch für den Darm [51, 96], die Leber [15, 41, 42], die Bauchspeicheldrüse [15], das Endometrium [14, 109], den Eileiter [55] und die Prostata [53] entwickelt. . Während die Generierung von Organoiden aus AdSCs weniger Zeit erfordert als aus PSCs, ist die Anzahl verschiedener Zelltypen, die aus AdSCs generiert werden können, begrenzt, da AdSC-abgeleitete Organoide oft nur Epithelzellen enthalten [43]. Aus diesem Grund sind sie für die Untersuchung der Erhaltung und Regeneration von Epithelgewebe nützlich, jedoch nicht geeignet für Studien, die die Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen beinhalten, z. B. die Immun-Epithel-Interaktion.

Seit ihrer Entwicklung wurden Organoide schnell zu einem beliebten Modell, indem sie die Lücke zwischen in-vivo-Tiermodellen, die zeitaufwändig zu erstellen und kostspielig in der Wartung sind, und in-vitro-Zellkultursystemen, die keine 3D-Gewebeorganisation aufweisen und oft enthalten, überbrücken krebsassoziierte genetische Veränderungen. Organoide 3D-Systeme wurden zur Untersuchung der Organentwicklung [65] und der Wirt-Pathogen-Interaktionen [20, 87] verwendet. Sie können auch zur Krankheitsmodellierung und Therapieentwicklung verwendet werden, z. B. indem Krebs und erkranktes Gewebe als Ausgangsmaterialien für die Organoidbildung verwendet werden [10, 11, 34, 65, 66, 96, 110]. Trotz all dieser Errungenschaften wurde die Fähigkeit zur Generierung, Reparatur oder Einführung spezifischer genetischer Mutationen für die Modellierung monogener Krankheiten und Krebs sowie für das genomweite Screening und die Etablierung von Reporter-Organoiden benötigt.


Gentechnische Methoden

Derzeit gibt es mehrere Methoden der Gentechnik, die bei Organoiden eingesetzt wurden, was ein neues Forschungsgebiet der Organoidgenetik eröffnet. Diese Verfahren ermöglichen spezifische Modifikationen der genomischen DNA-Sequenz. Werden die Modifikationen in eine kodierende Sequenz eingeführt, können sie zu einer spezifischen Veränderung des Zielproteins führen, die Aufschluss über die biologische Rolle eines bestimmten Rests oder des Proteins selbst geben kann. Bei diesem Prozess müssen zwei Hauptpunkte berücksichtigt werden: die genetischen Werkzeuge und die Methode, sie in die Zielzellen einzubringen.

Versandarten

Derzeit gibt es zwei gängige Methoden zum Einbringen von Gen-Editing-Komponenten in Organoide: viral (z. B. retro/lentivirale oder adenovirale Transduktion) und nicht-viral unter Verwendung von nacktem DNA-Transfer (Abb. ​ (Abb.1). 1 ). Jede Methode hat ihre Vor- und Nachteile, die hier kurz diskutiert und in Tabelle ​ Tabelle1 zusammengefasst werden. 1. Die Auswahl des geeigneten Abgabesystems erfordert die Berücksichtigung der Eigenschaften der Zielzellen, der Größe des DNA-Fragments und der erforderlichen Dauer der Genexpression.

Methoden zur Generierung von Organoiden und Gentechnik mit ihren Anwendungsmöglichkeiten. Organoide können entweder aus adulten Stammzellen (AdSCs) oder pluripotenten Stammzellen (PSCs) erzeugt werden. AdSCs, die aus dem Ursprungsgewebe extrahiert werden, können unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, um Organoide zu erzeugen, die das Organ, aus dem sie stammen, nachahmen. Von PSC abgeleitete Organoide werden aus Zelllinien mit induzierter Pluripotenz oder embryonalen Stammzellen gezüchtet. Links und rechts sind menschliche Figuren dargestellt, welche Arten von Organoiden mit AdSCs bzw. PSCs erzeugt wurden. Organoide können mit verschiedenen gentechnischen Methoden wie CRISPR/Cas, Transposase oder RNAi modifiziert werden. Diese Werkzeuge könnten mit einem nicht-viralen Ansatz wie Lipofektion oder Elektroporation oder mit einem viralen Ansatz unter Verwendung von Retrovirus, Lentivirus oder Adenovirus geliefert werden. Die gentechnisch veränderten Organoide können für verschiedene Anwendungen/Studiengebiete weiterverwendet werden, einschließlich biologischer Entwicklungsmodelle und Translations-/Präzisionsmedizin

Tabelle 1

Vor- und Nachteile verschiedener Versandarten

Kann sich nicht teilende Zellen infizieren

Infizieren sich teilende und sich nicht teilende Zellen

Einfach hohe Virustiter zu erreichen

Effizient für alle Zelltypen und lebenden Organismen

Kann große Konstrukte einführen

Effizient in vielen Zelltypen

Kann sich nicht teilende Zellen nicht infizieren

Kann eine Immunantwort auslösen

Transgengröße auf 8 kb . begrenzt

Zeitaufwendig für die Virenproduktion

Probleme mit Biosicherheit und Mutagenese

Transgengröße auf 8 kb . begrenzt

Zeitaufwändige Virenproduktion

Probleme mit Biosicherheit und Mutagenese

Transgen kann durch Teilungen verloren gehen

Probleme mit Biosicherheit und Mutagenese

Erfordern umfangreiche Optimierung

Mögliche Zellschädigung/unspezifischer Transport zu Zellen

Transgene Expression von Transgenen

Retro- und lentivirale Transfektionen nutzen die virale Maschinerie, um eine stabile Integration fremder genetischer Sequenzen zu induzieren, deren Expression konsistent an die Nachkommen weitergegeben werden kann [62]. Retroviren sind jedoch auf den Wirtszellzyklus angewiesen, um genetische Informationen in das Genom zu integrieren, und können daher keine terminal differenzierten, sich nicht teilenden Zellen infizieren. Darüber hinaus erfordert eine Retrovirusinfektion einen hohen Virustiter und kann Immunantworten induzieren, die die Effizienz der Genomintegration verringern können [92, 101]. Lentiviren haben eine Anpassung, die diese Einschränkung umgeht, und werden daher häufig für schwer zu infizierende Zellen wie Immunzellen oder sich nicht teilende Zellen verwendet [21]. Sowohl bei Retro- als auch bei Lentiviren erfolgt die Integration jedoch vorzugsweise an transkriptionell aktiven Stellen, was die Expression von Wirtsgenen nachteilig beeinflussen kann. Darüber hinaus können beide viralen Vektoren nur ein maximales DNA-Insert von etwa 8 kb aufnehmen, was die meisten cDNAs abdeckt, aber nicht alle [21, 46].

Die adenovirale Methode vermeidet eine permanente Integration, indem sie nach der Transfektion episomal bleibt und ist sowohl in sich teilenden als auch in sich nicht teilenden Zellen wirksam [101]. Es ist auch einfach, hohe Virustiter für eine höhere Expression des eingeführten Transgens zu erzeugen. Aufgrund der fehlenden genomischen Integration kann das eingeführte Gen jedoch über mehrere Runden der Wirtszellteilung verloren gehen [114, 115].

Schließlich beinhaltet der nicht-virale nackte DNA-Transfer im Allgemeinen einen von zwei Verabreichungsansätzen: Elektroporation oder Lipofektion. Bei der Elektroporation werden elektrische Impulse verwendet, um vorübergehend Öffnungen in der Zellmembran zu erzeugen, die es fremder DNA ermöglichen, in die Zelle einzudringen [32]. Diese Methode ist in der Regel für viele Zelltypen und sogar in lebenden Organismen effizient und kann auch große Konstrukte problemlos in die Zelle einbringen. Dennoch erfordert die Elektroporation ein relativ teures Gerät und umfangreiche Pilotversuche, da die optimalen Parameter für jedes Gerät und jeden Zelltyp erheblich variieren. Lipofection verwendet Lipofectamin oder verwandte Lipidmoleküle, die Liposomen bilden können, DNA einkapseln und in die Zelle einführen [97]. Diese Methode ist relativ einfach und in vielen Zellen in der Regel effizient genug. Die Transgenexpression ist jedoch normalerweise vorübergehend und die Lipofektion kann das Zellüberleben beeinträchtigen.

Werkzeuge für die Gentechnik

Nachdem Sie sich für eine Methode der genetischen Abgabe entschieden haben, ist es wichtig, die Methode der genetischen Bearbeitung zu berücksichtigen. Da es viele Übersichtsartikel gibt, die die verschiedenen Werkzeuge der Gentechnik vergleichen [19, 56, 57, 120], geben wir hier nur eine kurze Zusammenfassung wichtiger Methoden zur genetischen Veränderung von Organoiden: RNA-Interferenz (RNAi), CRISPR/Cas9 , Retro-/Lentiviren und Transposons (Abb. ​ (Abb. 1 1 und Tabelle ​ Tabelle 2 2 ).

Tabelle 2

Vor- und Nachteile von Gen-Editing-Techniken

Wirksam in allen somatischen Zellen von Säugetieren

Keine vorherige genetische Manipulation erforderlich

Führen Sie eine spezifische Modifikation der Zielsequenz ein

Anfällig für Off-Target-Effekte

Zufällige Insertion kann transkriptionell aktive Gene stören

Schwierig, im großen Stil durchzuführen

Anfällig für Immunreaktionen

Mögliche Off-Target-Effekte

Das RNAi-System nutzt die zelleigene Maschinerie, um die Expression bestimmter Gene zum Schweigen zu bringen. In diesem System bilden synthetisierte RNAi-Sequenzen, entweder Short-Hairpin-RNAs (shRNAs) oder Short-interfering RNAs (siRNAs), komplementäre Paare mit den mRNAs des Zielgens, um den Abbau oder das translationale Silencing zu fördern und dadurch die Proteinexpression des Zielgens zu unterdrücken mRNA. Diese Methode ist in allen somatischen Zellen von Säugetieren wirksam und es ist keine vorherige genetische Manipulation erforderlich [28, 39]. shRNAs können mit verschiedenen Vektoren wie Retro-/Lentiviren, Adenoviren, Plasmiden und Transposons in Zellen eingebracht werden. [120]. RNAi ist jedoch nur ein Knockdown-System, hat eine geringere Wirksamkeit und ist anfällig für Off-Target-Effekte.

Eine nützliche Wahl für eine stabile Genexpression sind Transposon-basierte Systeme, z. B. PiggyBac und Sleeping Beauty, die das interessierende Gen für eine langfristige Expression stabil in das Wirtsgenom einführen können. Sowohl PiggyBac als auch Dornröschen verwenden den 𠇌ut-and-paste”-Mechanismus, um die genetische Sequenz, die von einer spezifischen terminalen invertierten Wiederholung flankiert wird, von einem Locus zu 𠇌ut” und in einen anderen zu “paste” [46]. Diese zufällige Insertion tritt jedoch manchmal in einem aktiven Gen auf, was zu unerwarteten Auswirkungen auf die Wirtszelle führen kann.

Seit 2012 wurden Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-assoziierte (Cas) Systeme weitgehend für das sequenzspezifische Editieren in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen in vitro adaptiert [16, 18, 35, 50, 71]. Das System wurde zuerst bei Bakterien entdeckt und verleiht ihnen eine adaptive Resistenz gegen Bakteriophageninfektionen [9]. Das CRISPR/Cas9-System wurde dann mit zwei Komponenten weiter entwickelt: Cas9-Endonuklease und Single-Guide-RNA (sgRNA oder gRNA), wobei eine Spacer-Sequenz an eine komplementäre DNA-Sequenz (Protospacer-Sequenz) bindet und Cas9 zu einem bestimmten Ziel führt. Ein DNA-Target, das sowohl die Protospacer-Sequenz als auch das Protospacer-Advantage-Motiv (PAM) enthält, bildet ein Ziel für den Cas9-gRNA-Komplex, um einen Doppelstrangbruch (DSB) einzuführen. Die PAM-Sequenz unterscheidet sich für die verschiedenen Cas9- und Cas12a (Cpf1)-Endonukleasen, die von verschiedenen Bakterienarten stammen, und ermöglicht so ein breites Anwendungsspektrum [18, 89, 121]. Nach der Spaltung durch die Cas9-Nuklease kann das DSB entweder durch homologiegerichtete Reparatur (HDR), die eine Schablone für eine präzise Reparatur mit hoher Wiedergabetreue erfordert, oder durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ), bei der die stumpfen Enden wiederhergestellt werden, repariert werden -zusammen ligiert [13]. Die Reparatur durch HDR nach einer mitgelieferten Vorlage ermöglicht es Forschern, spezifische Sequenzänderungen in Zielgene einzuführen [33]. Dieser Prozess ist jedoch ineffizient und erfordert, dass sich die Zelle in der S-Phase des Zellzyklus befindet, damit die Reparatur stattfinden kann [47]. Das Template-Plasmid muss auch mit für jedes Gen spezifischen Homologiearmen kloniert werden, wodurch der Arbeitsaufwand erhöht wird. Alternativ kann die DNA-Reparatur durch Nukleotid-Insertionen oder -Deletionen durch NHEJ erfolgen, die Rasterverschiebungs-Mutationen erzeugen, die zur Inaktivierung des Zielgens führen. Da NHEJ oft als fehleranfällig angesehen wird, wird es nicht für eine gezielte Mutation verwendet. Neuere Arbeiten von Artegiani et al. [6] passten das NHEJ zur Erzeugung schneller Knock-ins in verschiedenen humanen Organoiden an. Dieses Verfahren beseitigt den Aufwand, der für die Homologiearm-Klonierung erforderlich ist, da Knock-in-DNA in ein selbstspaltendes Plasmid kloniert wird, das eine nicht-humane Sequenz enthält, die von sgRNA erkannt wird. Die Autoren konnten sogar mit TP53-Hemmung eine effizientere Knock-in-Generierung im Vergleich zu HDR zeigen, die die HDR-Effizienz in humanen pluripotenten Stammzellen verbessern sollte [6, 48].

Weitere Fortschritte in der CRISPR/Cas9-Entwicklung zielen auch darauf ab, die Effizienz verschiedener Cas-Enzyme zu erhöhen, um einen breiteren PAM-Sequenzbereich zu detektieren [41, 42] oder die PAM-Sequenzbeschränkung nahezu vollständig zu beseitigen [113]. Modifikation der Cas9-Endonuklease durch Fusion von inaktivierter Cas9-Nickase mit Cytidin-Desaminase, um Baseneditoren zu erzeugen [36, 40, 60]. Dadurch wurden neue Werkzeuge zur Generierung präziser Basenänderungen in Organoiden eingeführt [37, 112].

Die Kombination der Organoid-Technologie mit den verschiedenen genetischen Bearbeitungstechniken bietet eine neue Plattform für die Organoid-Genetik und die organoid-basierte Krankheitsmodellierung. Das folgende Kapitel enthält weitere Details zu den Anwendungen der Geneditierung mit dem CRISPR/Cas9-System in verschiedenen AdSC- und PSC-abgeleiteten Organoiden.


Einführung

Die Huntington-Krankheit (HD MIM 143100), eine familiäre neurodegenerative Erkrankung, die durch fortschreitende Bewegungsstörungen, kognitiven Verfall und psychiatrische Störungen gekennzeichnet ist, wird durch eine erweiterte CAG-Glutamin-Codon-Wiederholung in . verursacht HTTP, das Huntingtin kodiert [1𠄳]. Dieser genetische Defekt wurde ursprünglich auf Chromosom 4p16.3 kartiert, indem eine Kopplungsanalyse zum Teil in venezolanischen Familien aus einem Huntington-Populationscluster verwendet wurde, deren großzügige Beteiligung an dieser grundlegenden Huntington-Genforschung ebenfalls dazu beigetragen hat, zusammen mit vielen nordamerikanischen und europäischen Familien, die auch eine CAG-Expansionsmutation tragen , zur Entdeckung von HTTP [3𠄶]. Die HTTP Repeat ist in der Normalbevölkerung polymorph [7], aber die Vererbung von 㸵 CAGs kann zu Huntington führen, während Repeats von 㹀 CAGs innerhalb einer normalen Lebensspanne vollständig penetrant sind [8,9]. Erweiterte Wiederholungen zeigen häufige Keimbahninstabilität, so dass Huntington-Individuen möglicherweise keine identische CAG-Wiederholungslänge wie ihr übertragendes Elternteil haben [10�]. Selten de novo Fälle von Huntington werden sporadisch in der Bevölkerung durch intergenerationelle Expansion einer CAG-Wiederholung normaler Länge erzeugt [13,14]. Die Länge des vererbten HTTP Die CAG-Wiederholung ist die primäre Determinante für das Alter beim Einsetzen diagnostischer neurologischer Symptome und macht

65 % der Varianz dieses Phänotyps, wobei längere Wiederholungen im Durchschnitt zu früheren klinischen Manifestationen führen [7,15�]. Personen mit biallelischen Huntington-Mutationen (d. h. Huntington-Homozygoten) wurden berichtet und unterstützen eine vollständige Dominanz in Bezug auf den pathogenen Mechanismus, der zu Krankheitsmanifestationen führt, seit dem Alter bei Ausbruch eines Individuums mit zwei expandierten HTTP CAG-Wiederholungen sind mit der eines Heterozygoten mit der längeren der beiden Wiederholungen vergleichbar [7,19]. Interessanterweise, basierend auf einem Bericht, trotz eines ähnlichen Alters wie bei Huntington-Heterozygoten, Individuen mit zwei expandierten HTTP CAG-Wiederholungen können einen schnelleren Rückgang der funktionellen Kapazität zeigen [20]. Obwohl der Zeitpunkt des Krankheitsausbruchs von der Größe der CAG-Wiederholungen abhängt, ist die Dauer der manifesten Krankheit (d klinischer Beginn. Die Beziehung zwischen der CAG-Wiederholungsgröße und dem klinischen Beginn der Huntington-Krankheit spielte eine wichtige Rolle bei der Führung 1) der Erstellung von Tiermodellen [22�], 2) des Designs/der Interpretation von molekularen Studien [27] und 3) der Identifizierung genetischer Modifikatoren [ 28].

Die umfangreichen gesammelten experimentellen Daten und die vollständige Dominanz des mutierten Allels stimmen am ehesten mit einem Funktionsgewinn-Mechanismus überein, der zur Erforschung mutanter Allel-spezifischer Interferenzen mit HTTP Expression als Behandlungsoption [29]. Obwohl in Modellsystemen sehr vielversprechend, beginnen gerade Gen-Targeting-Ansätze mit Humanstudien zur Sicherheit und Wirksamkeit. Eine alternative Strategie zur Identifizierung von therapeutischen Zielen besteht darin, Beobachtungen von Menschen mit Huntington-Krankheit zu nutzen, um natürlich vorkommende Krankheitsmodifikatoren zu entdecken. Obwohl die CAG-Länge einen signifikanten Anteil der Varianz des Huntington-Alters bei Beginn ausmacht [15,16,18], ist jede CAG-Wiederholungsgröße in der Huntington-Population mit einem breiten Spektrum von Beginnaltern verbunden [7]. Da individuelle Unterschiede zwischen dem beobachteten Alter bei klinischem Einsetzen und dem Alter bei klinischem Einsetzen, das aufgrund der Größe der Mutation erwartet wird (dh Restalter bei Einsetzen), teilweise vererbbar sind [30,31], wird angenommen, dass sowohl genetische als auch Umweltfaktoren einen Einfluss haben der Zeitpunkt des Einsetzens zusätzlich zur CAG-Länge [32]. Die Huntington-assoziierte CAG-Expansion basiert auf verschiedenen Haplotypen [33�], die mehrere unabhängige Mutationsereignisse auf verschiedenen polymorphen Chromosomenrückgraten widerspiegeln. Allerdings ist keiner der häufigsten Chromosomen-Haplotypen der Krankheit mit einem Altersunterschied bei Krankheitsbeginn verbunden [34], was argumentiert, dass die Huntington-Krankheit nicht häufig durch ein häufiges . verändert wird cis genetischer Faktor bei HTTP. In ähnlicher Weise wird das Alter beim diagnostischen motorischen Beginn der Huntington-Krankheit nicht durch die Länge der normalen CAG-Wiederholung [7,32] oder durch das Vorhandensein eines zweiten mutierten Allels [7] beeinflusst, was darauf hindeutet, dass eine vererbbare Varianz des Alters bei Beginn für ein bestimmtes CAG-Wiederholung ist hauptsächlich auf nicht verknüpfte zurückzuführen trans Faktoren [39]. Um diese zu identifizieren, führten wir eine erste genomweite Assoziationsanalyse (GWA) bei Huntington-Patienten europäischer Abstammung durch, die den ersten Satz genomweiter signifikanter Loci im Zusammenhang mit dem Restalter bei Einsetzen der motorischen Symptome aufdeckte. Kurz gesagt, es gab zwei unabhängige Onset-Modifikationssignale auf Chromosom 15 [28], ein Modifikationssignal auf Chromosom 8 [28] und ein Modifikationssignal auf Chromosom 3 [40]. Zwei der Modifikator-Loci wirkten, um den Beginn zu verzögern, und zwei wirkten, um den Beginn zu beschleunigen [28,40,41]. Diese Ergebnisse begründeten den Grundsatzbeweis, dass die Pathogenese der Huntington-Krankheit vor dem Auftreten einer klinischen Erkrankung verändert werden kann. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der einzelnen SNP-Analyse unterstützte die Pathway-Analyse eine Rolle der DNA-Reparatur-/Wartungswege bei der Modifizierung des Alters bei Beginn der Huntington-Krankheit, was darauf hindeutet, dass somatische Größenänderungen der CAG-Wiederholung eine Rolle bei der Modifikation des Huntington-Pathogenprozesses spielen können, der zu diagnostische klinische Zeichen [28]. Zusammen zeigten diese Beobachtungen, dass genetische Faktoren beim Menschen in der Lage sind, die Rate der Huntington-Pathogenese vor der Diagnose zu modifizieren, und weisen auf einen Ansatz auf, der auf solchen menschlichen Beobachtungen für therapeutisches Targeting basiert, um den Beginn der Huntington-Krankheit zu verzögern.

Die meisten genomweiten Analysen haben sich bisher auf Europäer konzentriert und liefern wichtige, aber möglicherweise begrenzte Einblicke in den genetischen Beitrag zum Krankheitsrisiko und zu normalen Merkmalen (GWAS-Katalog https://www.ebi.ac.uk/gwas/). Unsere erste europäische HD-GWA-Studie [28] war sehr erfolgreich bei der Aufdeckung signifikanter Modifikator-Loci mit relativ starker Wirkung basierend auf einer kleineren Stichprobengröße als die meisten gängigen krankheitsgenetischen Risikostudien (GWAS-Katalog https://www.ebi.ac.uk/gwas /). Möglicherweise haben wir jedoch genetische Modifikatoren übersehen, die bei Europäern nicht vorhanden sind. Hier haben wir unsere genetische Analyse auf den venezolanischen Huntington-Cluster von nichteuropäischen Huntington-Patienten ausgeweitet, um: 1) die vollständige Sequenz von zu bestimmen HTTP auf dem Chromosom, das die CAG-Expansionsmutation trägt, 2), um seinen Ursprung zu untersuchen, und 3) um zu bestimmen, ob die Veränderung des Alters zu Beginn in dieser venezolanischen Population mit spezifischen natürlich vorkommenden genetischen Faktoren verbunden ist.


Abstrakt

Abstrakt Der Cholesterinmetabolismus in Makrophagen von Arteriosklerose-anfälligen C57BL/6J-Mäusen wurde mit dem in Makrophagen von Arteriosklerose-resistenten C3H/HeN-Mäusen verglichen. Der Gesamtcholesterinspiegel im Plasma war bei beiden Mäusetypen signifikant erhöht, der HDL-Cholesterinspiegel war jedoch nur bei C3H/HeN-Mäusen erhöht, wenn eine cholesterinreiche Diät (1% Cholesterin) 5 Wochen lang gefüttert wurde. Nach 24-stündiger Inkubation von Makrophagen aus männlichen und weiblichen Mäusen mit cholesterinreicher Nahrung mit β-VLDL war der Cholesteringehalt in Makrophagen aus C57BL/6J etwa 1,5- bis 2,0-fach höher als in denen aus C3H/HeN-Mäusen. Die Aufnahme von [ 3 H]Cholesterinoleat-β-VLDL in Makrophagen von C57BL/6J-Mäusen auf der cholesterinreichen Diät war größer als die Aufnahme in die von C3H/HeN-Mäusen. Die Freisetzung von [ 3 H]Cholesterin aus Makrophagen von C57BL/6J-Mäusen mit einer cholesterinreichen Diät war ein Siebtel derjenigen von Makrophagen von C57BL/6J-Mäusen mit der Grundnahrung oder die von Makrophagen von C3H/HeN-Mäusen mit der Grund- oder Hoch -Cholesterin-Diät. Die Aktivität der sauren Cholesterinesterase war in Makrophagen aus jeder Gruppe fast gleich. Die Acyl-CoA:Cholesterin-Acyltransferase-Aktivität in Makrophagen von C57BL/6J-Mäusen mit der cholesterinreichen Ernährung stieg im Vergleich zu der von Makrophagen von C57BL/6J-Mäusen mit normaler Ernährung an. Die Aktivität der neutralen Cholesterinesterase in Makrophagen von C57BL/6J-Mäusen war unabhängig von der Art der Ernährung etwa halb so hoch wie in Makrophagen von C3H/HeN-Mäusen. Es gab keine Geschlechtsunterschiede in diesen Metabolismen. In Anbetracht unserer früheren Daten legen diese Ergebnisse nahe, dass eine cholesterinreiche Ernährung metabolische Veränderungen verursachen kann, um Cholesterinester in Makrophagen von C57BL/6J-Mäusen in Übereinstimmung mit genetischen Anomalien anzusammeln.

Es ist bekannt, dass C57BL/6J-Mäuse mit einer cholesterinreichen Diät sehr anfällig für Arteriosklerose sind. 1 2 3 4 5 C3H/HeN-Mäuse, die 1 Jahr lang eine cholesterinreiche Diät erhielten, waren jedoch resistent gegen die Bildung von atherosklerotischen Läsionen. 3 4 5 Nachdem C57BL/6J-Mäuse eine cholesterinreiche Diät zu sich genommen hatten, waren die HDL-C-Spiegel in der 4. Aorta und Koronararterien. 5 Schaumzellen, die offensichtlich von Makrophagen in typischen Fettläsionen abstammen, wurden bei C57BL/6J-Mäusen beobachtet, die über azellulären Bereichen lagen, die Zelltrümmer enthielten. 1 2 Der HDL-C-Spiegel von C3H/HeN-Mäusen änderte sich jedoch bei einer cholesterinreichen Ernährung nicht und sie entwickelten keine atheromatösen Läsionen. 4 Es ist jedoch ungewiss, ob der Unterschied in der Reaktion der Plasma-HDL-Spiegel ausreicht, um den Unterschied in der Atherogenität zwischen den beiden Mäusestämmen zu erklären. Dies veranlasste uns, den genetischen Unterschied des Fettstoffwechsels auf zellulärer Ebene aufzuklären.

Wir haben über den Mechanismus der Schaumzellbildung durch Makrophagen unter Verwendung von β-VLDL berichtet. 6 7 Das heißt, Makrophagen bauen β-VLDL 8 ein und akkumulieren Cholesterinester als Lipidtröpfchen in Zellen. Der Cholesterinstoffwechsel, der die Cholesterinesterakkumulation in Makrophagen reguliert, wirkt wie folgt. 9 Zunächst wird Cholesterinester in β-VLDL durch saure Cholesterinesterase in Lysosomen hydrolysiert. 10 11 Anschließend wird das Produkt, freies Cholesterin, durch ACAT erneut verestert und als Cholesterinester in intrazellulären Lipidtröpfchen gespeichert. 12 13 Danach wird das wiederveresterte Cholesterin durch neutrale Cholesterinesterase hydrolysiert, 14 15 16 und schließlich freies Cholesterin aus den Zellen freigesetzt. Es wird angenommen, dass das Ungleichgewicht von eingebautem Cholesterin und freigesetztem Cholesterin eine Ansammlung von Cholesterinester und dadurch die Bildung von Schaumzellen induziert. Jede Enzymaktivität beeinflusst dieses Ungleichgewicht. Um den genetischen Unterschied zwischen C57BL/6J- und C3H/HeN-Mäusen auf zellulärer Ebene weiter aufzuklären, untersuchten wir auch den β-VLDL-C-Stoffwechsel in Makrophagen.

Da auch berichtet wurde, dass weibliche C57BL/6J-Mäuse anfälliger für Atherosklerose waren als männliche Mäuse (dh weibliche Mäuse entwickelten mehr und größere Läsionen als männliche 4 ), verglichen wir auch den β-VLDL-C-Stoffwechsel bei männlichen und weibliche Mausmakrophagen.

Methoden

Materialien

Cholesterin[ 14 C]oleat (2,1 GBq/mmol), [ 3 H]Cholesterinoleat (3,0 GBq/mmol) und [1 – 14 C]Oleoyl-CoA (1,5 GBq/mmol) wurden von New England Nuclear Corp. bezogen. DMEM stammte von Nissui Pharmaceutical Co, Ltd. Männliche und weibliche C57BL/6J- und C3H/HeN-Mäuse stammten von Japan Clea.

Behandlung von Tieren

Mäuse im Alter von 6 Wochen wurden 5 Wochen lang mit einer Grunddiät (Oriental Kobo) oder einer Grunddiät mit 1% Cholesterin (Diät mit hohem Cholesteringehalt) gefüttert (die Zusammensetzung jeder Diät ist in Tabelle 1 gezeigt). Wir bezeichneten C57BL/6J-Mäuse als C57 und C3H/HeN-Mäuse als C3H. Die Gruppen erhielten C57 mit der Grundnahrung (C57-B), C57 mit der cholesterinreichen Diät (C57-H), C3H mit der Grundnahrung (C3H-B) und C3H mit der cholesterinreichen Diät (C3H-H .). ).

Vorbereitung von Makrophagen

Peritoneale Exsudatmakrophagen wurden 4 Tage nach Injektion von 1 ml Thioglykolatmedium (DIFCO) geerntet. 17 Zellen wurden mit einer Dichte von 2 × 10 6 Zellen/ml in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS (DMEM/10 % FBS), ausplattiert. Nach 4 Stunden Adhärenz wurden die Zellen gewaschen und über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden dann für die Experimente verwendet.

Bestimmung des Gesamtcholesterin-, LDL-C+VLDL-C- und HDL-C-Spiegels im Plasma

Die Isolierung von HDL wurde bestimmt, nachdem LDL und VLDL mit dem Fällungsreagenz mit 555 µmol/L Phosphorwolframsäure und 25 mmol/L MgCl . ausgefällt worden waren2, pH-Wert 2,5. 18 Das Präzipitationsreagenz (100 µL) wurde zu 50 µL Plasma gegeben, dann wurde die Mischung 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und zweimal für je 2 Minuten bei 14000 . zentrifugiertg. Der ausgefällte Rückstand enthielt apoB-enthaltende Lipoproteine ​​(LDL und VLDL) und der Überstand enthielt HDL. Die HDL-Fraktion wurde zur Analyse von Cholesterin innerhalb von 2 Stunden durch ein enzymatisches Verfahren unter Verwendung eines Kits bestimmt, der sowohl freies als auch verestertes Cholesterin nachwies (Bestimmungsgerät TC 555 Kyowa Medex Co, Ltd). Das Gesamtcholesterin wurde mit dem gleichen Kit bestimmt. LDL-C plus VLDL-C wurde durch Subtraktion von HDL-C vom Gesamtcholesterin bestimmt.

Herstellung von rekonstituiertem [ 3 H]Cholesterinoleat in β-VLDL

β-VLDL (D<1.006) wurde aus dem Serum von mit Cholesterin gefütterten Kaninchen durch Ultrazentrifugation für 16 Stunden isoliert. 8 Der Einbau von [ 3 H]Cholesterinoleat in β-VLDL erfolgte im Wesentlichen nach dem Verfahren von Brown et al. 19: 1 GBq [ 3 H]Cholesterinoleat wurde mit 1 ml DMSO versetzt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt, dann 2 ml Plasmadichtepuffer (0,154 mol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA und 10 mmol/l Tris-HCl, pH 7,4, 0,01% NaN3) wurde zugegeben und die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt. Es wurde dann tropfenweise zu 6 ml β-VLDL (10 mg Gesamtcholesterin/ml) in 3 Minuten zugegeben. Die Lösung wurde 8 Stunden bei 37ºC inkubiert und dann 10 Stunden gegen 3 l Plasmadichtepuffer dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung 16 Stunden bei 105 000 . zentrifugiertg. Die oberste Schicht wurde als [ 3 H]Cholesterinoleat-inkorporiertes β-VLDL verwendet. Die spezifische Aktivität betrug etwa 1 × 10 7 dpm/mg Gesamtcholesterin.

Einbau von [ 3 H]Cholesterinoleat–β-VLDL durch Makrophagen

Makrophagen (2 × 10 6 Zellen/Well) wurden in 12-Well-Platten ausplattiert und für bestimmte Zeiten in 0,75 ml DMEM/10 % FBS mit 200 μg [ 3 H]Cholesterinoleat-β-VLDL (5 × 10 6 dpm .) inkubiert ). Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit DMEM/10% FBS gewaschen und ihre Radioaktivität wurde mit einem Szintillationszähler gemessen. Um das während der Inkubation aus den Zellen freigesetzte freie [ 3 H]Cholesterin zu bestimmen, wurde dem Medium organisches Lösungsmittel (Chloroform:Methanol, 2:1) zugesetzt und die Lipide wurden aus der Chloroformschicht extrahiert. Die Lipide wurden auf Dünnschichtchromatographen aufgetragen. 20 Anschließend wurde die Radioaktivität in der Fraktion des freien Cholesterins gezählt. Die Gesamtaufnahme war die Summe der intrazellulären Radioaktivität und der Radioaktivität von freiem [ 3 H]Cholesterin im Medium. 7

Freisetzung von [ 3 H]Cholesterin aus Makrophagen, die mit [ 3 H]Cholesterinoleat-β-VLDL . beladen sind

Makrophagen (2 × 10 6 Zellen) wurden in 12-Well-Platten ausplattiert und 24 Stunden in 1 ml DMEM/10% FBS mit 200 μg [ 3 H]Cholesterinoleat-β-VLDL inkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal mit DMEM/10% FBS gewaschen. Diese Makrophagen wurden in 2 ml DMEM/10% FBS weiter inkubiert. Zu den in Fig. 1 angegebenen Zeiten wurden 0,4 ml des Mediums entfernt und seine Radioaktivität wurde mit einem Szintillationszähler gemessen. 7

Assay von sauren und neutralen Cholesterinesterase-Aktivitäten 5

Makrophagen (2 × 10 7 Zellen) wurden dreimal mit PBS gewaschen und in 1 ml 10 mmol/l Tris-HCl (pH 7,4), enthaltend 0,25 mol/l Saccharose, suspendiert. Die Zellen wurden dann zweimal 15 Sekunden lang beschallt und als Enzymlösung verwendet. Die Reaktionsmischung enthielt neben der Enzymlösung 0,5 mmol/L Cholesterinoleat, 0,37 MBq Cholesterin [ 14 C]oleat, 0,5 mmol/L Phosphatidsäure und 100 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, für neutrales Cholesterin Esterase oder 0,5 mmol/L Phosphatidylcholin und Natriumacetatpuffer, pH 4,0, für saure Cholesterinesterase in einem Gesamtvolumen von 200 µL. Die Inkubation wurde 1 Stunde bei 37ºC durchgeführt. Das freigesetzte [ 14 C]Oleat wurde durch eine Modifikation der Methode von Belfrage und Vaughan extrahiert. 21 Kurz gesagt wurde die Reaktion mit 3,25 ml Chloroform/Methanol/Heptan (1,42:1,25:1,00) gestoppt und dann wurde 1 ml 0,1 N NaOH zugegeben. Die Radioaktivität in der Wasserphase wurde gemessen.

Assay der ACAT-Aktivität

Die ACAT-Aktivität der obigen Enzymlösung wurde nach dem Verfahren von Gillies et al. 20 mit [1-14 C]Oleoyl-CoA ohne exogenes Cholesterin getestet.

Analysen

Der intrazelluläre Cholesteringehalt wurde wie folgt gemessen 7 : die gewaschenen Zellen in jeder Vertiefung wurden mit 1 ml Hexan/Isopropanol (2:1) behandelt und das organische Lösungsmittel wurde verdampft. Das Pellet wurde in 100 ml Methanol gelöst und der Gesamtcholesteringehalt und der Gehalt an freiem Cholesterin in der Methanollösung wurden enzymatisch unter Verwendung der Sets "Determiner TC 555" und "Determiner FC 555" bestimmt. Der Cholesterinestergehalt wurde als Differenz zwischen dem Gesamt- und dem freien Cholesteringehalt genommen.

Die Proteinkonzentration wurde mit einem Kit unter Verwendung des Bradford-Verfahrens (Bio-Rad, Protein Assay) bestimmt.

Die Signifikanz wurde von Student’s . analysiert T Prüfung.

Ergebnisse

Einfluss einer cholesterinreichen Ernährung auf den Gesamtcholesterinspiegel im Plasma von Mäusen

Die Plasmalipidspiegel sind in Tabelle 2 gezeigt. Der Gesamtcholesterinspiegel der weiblichen C57-B-Mäuse war geringer als der der anderen drei Gruppen. Die HDL-C-Spiegel von C57-B-Mäusen beiderlei Geschlechts waren niedriger als die von C3H-B-Mäusen beiderlei Geschlechts. Darüber hinaus war der Spiegel bei männlichen C57-B-Mäusen höher als bei weiblichen C57-B-Mäusen. Der LDL-C+VLDL-C-Spiegel bei männlichen C57-B-Mäusen war höher als die Spiegel in den anderen drei Gruppen. Das Verhältnis von HDL-C zu LDL-C + VLDL-C war in der Reihenfolge männlich C3H-B >weiblich C3H-B >weiblich C57-B >männlich C57-B.

Nach Aufnahme einer cholesterinreichen Diät waren Gesamtcholesterin- und LDL-C+VLDL-C-Spiegel in allen Gruppen erhöht. Allerdings änderten sich die HDL-C-Spiegel in C57-H-Mäusen beiderlei Geschlechts statistisch nicht, während die in C3H-H-Mäusen beiderlei Geschlechts anstiegen. Die Verhältnisse von HDL-C zu LDL-C+VLDL-C waren in allen Gruppen mit cholesterinreicher Diät viel geringer als in denen mit Basaldiät. Trotzdem war das Verhältnis bei C57-H-Mäusen etwa halb so groß wie bei C3H-H-Mäusen.

Cholesterinmetabolismus in männlichen Mausmakrophagen

Um die Wirkung der cholesterinreichen Diät auf die Cholesterinesterakkumulation in Makrophagen von männlichen Mäusen zu klären, haben wir zunächst den Cholesterinestergehalt nach Inkubation mit oder ohne β-VLDL gemessen ( 1 ).Der Cholesteringehalt war ohne β-VLDL sehr niedrig und es gab kaum Unterschiede zwischen den vier Gruppen. Nach Inkubation mit β-VLDL stieg jedoch der Cholesterinestergehalt von Makrophagen aller Gruppen stark an. Die bei C57-B-Makrophagen war fast die gleiche wie bei C3H-B- und C3H-H-Makrophagen, aber die bei C57-H-Makrophagen war doppelt so hoch wie bei C57-B-Makrophagen.

Als nächstes untersuchten wir den Einbau von β-VLDL in Makrophagen bei männlichen Mäusen unter Verwendung von [ 3 H]Cholesterinoleat-β-VLDL ( 2 ). Der Einbau von [ 3 H]Cholesterinoleat-β-VLDL in C57-H-Makrophagen war nach 12 und 36 Stunden im Vergleich zu C57-B-Makrophagen 1,3-fach erhöht. Die Einbaumengen in C57-B-, C3H-B- und C3H-H-Makrophagen waren ziemlich ähnlich.

Als nächstes untersuchten wir die Freisetzung von [ 3 H]Cholesterin in das Medium aus Makrophagen, die mit [ 3 H]Cholesterinoleat-β-VLDL beladen waren. Fig. 3 zeigt das Verhältnis der in das Medium freigesetzten Radioaktivität zur gesamten inkorporierten Radioaktivität in Makrophagen als Prozentsatz. Die Menge nahm in allen Makrophagen zeitabhängig zu. Die Menge der C57-H-Makrophagen war jedoch bemerkenswert gering, sie betrug nach 12 Stunden etwa ein Sechstel der Mengen der Makrophagen der anderen drei Gruppen. Die obigen Ergebnisse zeigten, dass C57-H-Makrophagen Cholesterinester akkumulieren, indem sie eine große Menge an β-VLDL aufnehmen und kaum freies Cholesterin aus den Zellen freisetzen.

Wir haben dann die Enzymaktivitäten gemessen, die am intrazellulären Cholesterinstoffwechsel beteiligt sind ( 4 , 5 und 6 ). Es ist bekannt, dass drei wichtige Enzyme an der Lipidakkumulation in Makrophagen beteiligt sind. Das erste ist die saure Cholesterinesterase ( 4 ), das zweite ACAT ( 5 ) und das dritte neutrale Cholesterinesterase ( 6 ). Die Aktivitäten der sauren Cholesterinesterase bei männlichen Mäusen ( 4 ) änderten sich unter den vier Gruppen von Makrophagen nicht. Die ACAT-Aktivität von C57-B-Makrophagen aus männlichen Mäusen (Fig. 5) betrug etwa ein Drittel der von C3H-B-Makrophagen. Allerdings erhöhte sich die Aktivität von C57-H-Makrophagen um mehr als das Dreifache im Vergleich zu der von C57-B-Makrophagen. Die Aktivität von C3H-H-Makrophagen wurde nicht verändert. Die neutralen Cholesterinesterase-Aktivitäten von C57-B- und C57-H-Makrophagen in männlichen Mäusen ( 6 ) waren etwa halb so groß wie die von C3H-B- und C3H-H-Makrophagen. Die Enzymaktivität wurde bei den beiden Mäusestämmen durch eine cholesterinreiche Ernährung nicht signifikant verändert. Diese Ergebnisse legen daher stark die Beteiligung der genetischen Regulation an diesen Enzymaktivitäten und ihrer Reaktion auf eine cholesterinreiche Ernährung nahe.

Vergleich des Cholesterinstoffwechsels zwischen männlichen und weiblichen Mäusen

Der β-VLDL-C-Metabolismus in Makrophagen war bei männlichen und weiblichen Mäusen in beiden Stämmen fast gleich. Der Cholesterinestergehalt in weiblichen C57-H-Makrophagen, die mit β-VLDL inkubiert wurden, war unter allen Makrophagengruppen am höchsten und 1,6-fach höher als der in C57-B-Makrophagen ( 1 ). Die Freisetzung von [ 3 H]Cholesterin aus weiblichen C57-H-Makrophagen war die niedrigste und betrug nur ein Sechstel derjenigen anderer Makrophagen ( 3 ). Absolute und relative Enzymaktivitäten in männlichen und weiblichen Mausmakrophagen waren fast gleich ( 3 , 4 und 5 ).

Beim Einbau von [ 3 H]Cholesterinoleat-β-VLDL wurde jedoch ein leichter Geschlechtsunterschied beobachtet. Die bei weiblichen C57-H-Makrophagen war nach 36 Stunden Inkubation 1,3-fach größer als bei weiblichen C57-B. Der Einbau von [ 3 H]Cholesterinoleat-β-VLDL in weibliche C3H-B-Makrophagen betrug zwei Drittel dessen in weibliche C57-B-Makrophagen. Der Einbau in weibliche C3H-H-Makrophagen war fast der gleiche wie der in weibliche C3H-B-Makrophagen. Die obigen Ergebnisse zeigten, dass es keine bemerkenswerten Geschlechtsunterschiede im Hinblick auf den Lipidstoffwechsel in Makrophagen gab.

Diskussion

Es wurde berichtet, dass sich der Gesamtcholesterinspiegel zwischen C57- und C3H-Stämmen weder bei Basalfutter (4 % Fett) noch bei atherogener Ernährung (15 % Fett, 1,25% Cholesterin und 0,5 % Cholsäure) stark unterscheidet und dass HDL-C-Werte wurden nur im C57-Stamm mit atherogener Diät verringert. 3 4 In dieser Studie beobachteten wir einen Unterschied in den HDL-C-Spiegeln zwischen C57- und C3H-Stämmen entweder bei basalem Futter oder bei cholesterinreicher Ernährung. Trotz eines solchen Unterschieds waren die Verhältnisse von HDL-C zu LDL-C + VLDL-C in allen Gruppen von Mäusen, die die cholesterinreiche Diät erhielten, im Vergleich zu denen, die mit der Grundnahrung gefüttert wurden, sehr niedrig. Dementsprechend beobachteten wir Unterschiede in den Eigenschaften von Makrophagen zwischen den beiden Mäusestämmen. Die Ergebnisse legten nahe, dass zwischen den beiden Stämmen mit cholesterinreicher Ernährung genetische Unterschiede im Cholesterinstoffwechsel auf zellulärer Ebene bestehen.

Fünf Wochen nach Beginn der cholesterinreichen Diät zeigten männliche und weibliche C57-H-Makrophagen die Eigenschaft, mehr Cholesterinester durch erhöhten β-VLDL-Einbau und verringerte Freisetzung von freiem Cholesterin aus den Zellen im Vergleich zu anderen Makrophagen anzureichern (Abb. 2 und ). 3 ). Enzymveränderungen stimmten mit diesem Stoffwechsel überein. Das heißt, die ACAT-Aktivität wurde nur in Makrophagen von C57-Mäusen durch Fütterung einer cholesterinreichen Diät induziert. Die Aktivität der neutralen Cholesterinesterase wurde jedoch durch eine solche Diät in C57-Makrophagen nicht induziert. Diese Aktivitäten ähneln denen, die bei Ratten-Thioglycollat-ausgelösten Peritonealmakrophagen, atherosklerotischen Läsionszellen von Kaninchen 6 und von Blutmonozyten abgeleiteten Makrophagen von Kaninchen, die eine cholesterinreiche Diät erhielten, berichtet wurden. 22 Alle diese Makrophagen reichern leicht Cholesterinester in den Zellen an. Daraus konnte geschlossen werden, dass C57-Maus-Makrophagen die Eigenschaft besitzen, mehr Cholesterinester anzusammeln und Schaumzellen zu bilden, und dass dies bei Beladung mit Lipoproteinen zur Bildung von Atherom beitragen kann.

Der Cholesterinstoffwechsel der Makrophagen in C3H-H-Makrophagen war jedoch fast der gleiche wie in C3H-B-Makrophagen, und der Cholesterinestergehalt in C3H-H-Makrophagen, die mit β-VLDL inkubiert wurden, war geringer als der in C57-H-Makrophagen. Diese Ergebnisse legten nahe, dass Makrophagen von C3H-Mäusen ihren Cholesterinstoffwechsel als Reaktion auf eine cholesterinreiche Ernährung nicht veränderten. Die C3H-Makrophagen hatten eine hohe Aktivität des Cholesterinstoffwechsels, wie die alveolären Makrophagen 6 von Ratten und Kaninchen und von THP-1 abgeleitete Makrophagen, die mit Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor 7 behandelt wurden, dh C3H-H-Makrophagen bewahrten eine hohe ACAT-Aktivität und eine hohe neutrale Cholesterinesterase-Aktivität. Diese Makrophagen (C3H-B und C3H-H) müssen eine hohe Kapazität haben, exogenes Cholesterin abzubauen und Cholesterin aus den Zellen freizusetzen, und diese Zellen akkumulieren weniger Cholesterinester. Diese Eigenschaften können erklären, warum die C3H-Maus resistent gegen Atherosklerose ist, die durch eine atherogene Ernährung induziert wird.

Von den verschiedenen Unterschieden war der bemerkenswerteste zwischen C57- und C3H-Mäusen die Aktivität der neutralen Cholesterinesterase bei Mäusen, die mit normaler Ernährung und mit cholesterinreicher Ernährung gefüttert wurden ( 6 ). Wahrscheinlich ist dieses Enzym in Kombination mit ACAT entscheidend für die Freisetzung von Cholesterin aus Makrophagen. Das Fehlen der Induktion dieses Enzyms in Verbindung mit der Induktion von ACAT in C57-Mäusen durch Cholesterinfütterung führt zu einer geringen Freisetzung und Akkumulation von Cholesterinester. Bei C57-B-Mäusen war die Cholesterinfreisetzung trotz niedriger neutraler Cholesterinesterase-Aktivität hoch. Unter Bedingungen niedriger ACAT-Aktivität könnte die Freisetzung von Cholesterin in Abhängigkeit sowohl von saurer als auch von neutraler Cholesterinesterase stimuliert werden. 23

Weibliche C57-Mäuse werden leichter atherosklerotisch als männliche Mäuse. Wenn Testosteron an weibliche C57-Mäuse verabreicht wurde, nahmen die atherosklerotischen Läsionen ab. 4 In dieser Studie waren Gesamtcholesterin- und HDL-C-Spiegel bei weiblichen C57-B-Mäusen signifikant niedriger als bei männlichen C57-B-Mäusen (Tabelle 2). Allerdings war das Verhältnis von HDL-C zu LDL-C+VLDL-C bei weiblichen C57-B-Mäusen höher als bei den männlichen. Nach einer cholesterinreichen Diät stiegen sowohl der Gesamtcholesterin- als auch der LDL-C+VLDL-C-Spiegel bei beiden Geschlechtern an. Der absolute HDL-C-Spiegel und das Verhältnis von HDL-C zu LDL-C + VLDL-C waren zwischen beiden Geschlechtern von C57-H-Mäusen nicht signifikant unterschiedlich. Diese Ergebnisse legten nahe, dass Plasmalipide die Geschlechtsunterschiede in Bezug auf die Atherogenität nicht erklären. Darüber hinaus gab es keinen Unterschied im β-VLDL-C-Stoffwechsel zwischen männlichen und weiblichen Mausmakrophagen, was darauf hindeutet, dass unsere Ergebnisse auch keine Geschlechtsunterschiede auf zellulärer Ebene erklären können. Andere geschlechtsbezogene Faktoren können zusammen mit Anomalien des Plasmalipid- und Makrophagen-Lipidstoffwechsels zur Atherogenität weiblicher C57-Mäuse beitragen.

Zusammenfassend führen unsere Ergebnisse zu dem Schluss, dass Enzymaktivitäten im zellulären Fettstoffwechsel und deren Reaktionen auf eine cholesterinreiche Ernährung bei C57- und C3H-Mäusen genetisch reguliert sind.


CReasPy-Klonen: Eine Methode zum gleichzeitigen Klonen und Engineering von Megabasen-großen Genomen in Hefe unter Verwendung des CRISPR-Cas9-Systems

In den letzten zehn Jahren wurde eine neue Strategie entwickelt, um die Schwierigkeiten bei der Gentechnik einiger mikrobieller Arten zu umgehen, indem ihr Genom in einen anderen Organismus übertragen (oder "kloniert") wird, der effizienten genetischen Veränderungen zugänglich ist und daher als lebende Werkbank fungiert. Als solche ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde verwendet, um Genome von Viren, Bakterien und Algen zu klonen und zu entwickeln. Der Klonierungsschritt erfordert die Insertion von genetischen Hefeelementen in das interessierende Genom, um seine Replikation und Erhaltung als künstliches Chromosom in der Wirtszelle voranzutreiben. Derzeitige Verfahren, die verwendet werden, um diese genetischen Elemente einzuführen, sind immer noch unbefriedigend, entweder aufgrund ihrer zufälligen Natur (Transposon) oder der Notwendigkeit einzigartiger Restriktionsstellen an spezifischen Positionen (TAR-Klonierung). Hier beschreiben wir die CReasPy-Klonierung, eine neue Methode, die sowohl die Fähigkeit von Cas9, DNA an einem benutzerdefinierten Locus zu spalten, als auch die hocheffiziente homologe Rekombination der Hefe kombiniert, um gleichzeitig ein bakterielles Chromosom in Hefe zu klonen und zu konstruieren. Unter Verwendung des 0,816 Mbp-Genoms von Mycoplasma pneumoniae Als Machbarkeitsnachweis zeigen wir, dass unsere Methode verwendet werden kann, um das genetische Element der Hefe an jeder Stelle des Bakterienchromosoms einzuführen und gleichzeitig verschiedene Gene oder Gengruppen zu löschen. Wir zeigen auch, dass CReasPy-Klonen verwendet werden kann, um bis zu drei unabhängige genomische Loci gleichzeitig mit einer Effizienz zu bearbeiten, die hoch genug ist, um das Screening einer kleinen (<50) Anzahl von Klonen zu rechtfertigen, was eine deutlich verkürzte Genom-Engineering-Zykluszeit ermöglicht.

Schlüsselwörter: CRISPR-Cas9 Saccharomyces cerevisiae Genomklonierung Genome Editing Genomtransplantation Mykoplasmen.


Verweise

Baujat, G., Le Merrer, M. (2007, 23. Januar). Ellis-Van Creveld-Syndrom. Orphanet Journal für seltene Krankheiten, 2, 27. https://doi.org/10.1186/1750-1172-2-27

Hecht, M. (2019, 26. Juni). Was ist Polydaktylie? [Online-Artikel]. Gesundheitslinie. https://www.healthline.com/health/polydactyly

Informationszentrum für genetische und seltene Krankheiten (GARD). (2016). Hypophosphatämische Rachitis (früher Vitamin-D-resistente Rachitis genannt) [Online-Artikel]. NIH. https://rarediseases.info.nih.gov/diseases/6735/hypophosphatemic-rickets [letzte Aktualisierung 01.07.2020]

Mitarbeiter der Mayo-Klinik. (o.D.). Mukoviszidose [Online-Artikel]. MayoClinic.org. https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/cystic-fibrosis/symptoms-causes/syc-20353700

Mitarbeiter der Mayo-Klinik. (o.D.). Down-Syndrom [Online-Artikel]. MayoClinic.org. https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/down-syndrom/diagnosis-treatment/drc-20355983

Mitarbeiter der Mayo-Klinik. (o.D.). Hämophilie [Online-Artikel]. MayoClinic.org. https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/hemophilia/symptoms-causes/syc-20373327

Mitarbeiter der Mayo-Klinik. (o.D.). Klinefelter-Syndrom [Online-Artikel]. MayoClinic.org. https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/klinefelter-syndrom/symptoms-causes/syc-20353949

Mitarbeiter der Mayo-Klinik. (o.D.). Marfan-Syndrom [Online-Artikel]. MayoClinic.org. https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/marfan-syndrom/symptoms-causes/syc-20350782

Mitarbeiter der Mayo-Klinik. (o.D.). Phenylketonurie (PKU) [Online-Artikel]. MayoClinic.org. https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/phenylketonuria/symptoms-causes/syc-20376302

Mitarbeiter der Mayo-Klinik. (o.D.). Sichelzellenanämie [Online-Artikel]. MayoClinic.org. https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/sickle-cell-anemia/symptoms-causes/syc-20355876

Mitarbeiter der Mayo-Klinik. (o.D.). Turner-Syndrom [Online-Artikel]. MayoClinic.org. https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/turner-syndrom/symptoms-causes/syc-20360782

Mitarbeiter der Mayo-Klinik. (o.D.). Triple-X-Syndrom [Online-Artikel]. MayoClinic.org. https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/triple-x-syndrom/symptoms-causes/syc-20350977

Nationales Zentrum für Geburtsfehler und Entwicklungsstörungen. (2020). Fetale Alkoholspektrumstörungen (FASDs): Grundlagen zu FASDs [Webseite]. Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten (CDC). https://www.cdc.gov/ncbddd/fasd/facts.html

TED-Ed. (2019, 24. Januar). Wie Sie mit CRISPR DNA bearbeiten können – Andrea M. Henle. Youtube. https://www.youtube.com/watch?v=6tw_JVz_IEc

TED. (2016, 24. Oktober). Was Sie über CRISPR wissen müssen | Ellen Jörgensen. Youtube. https://www.youtube.com/watch?v=1BXYSGepx7Q&feature=youtu.be

TED. (2017, 10. Februar). Das ethische Dilemma von Designerbabys | Paul Knöpfler. Youtube. https://www.youtube.com/watch?v=nOHbn8Q1fBM&t=3s

Krankheiten, Syndrome oder andere abnormale Zustände, die durch Mutationen in einem oder mehreren Genen oder durch Chromosomenveränderungen verursacht werden.

Eine Veränderung der Nukleotidsequenz des Genoms eines Organismus.

Ein medizinischer Zustand, der bei oder vor der Geburt vorliegt. Diese Erkrankungen, auch Geburtsfehler genannt, können während der fetalen Entwicklungsphase oder durch die genetische Ausstattung der Eltern erworben werden.

Bezieht sich auf die Beziehung zwischen zwei Versionen eines Gens. Individuen erhalten von jedem Elternteil zwei Versionen jedes Gens, die als Allele bekannt sind. Wenn die Allele eines Gens unterschiedlich sind, wird ein Allel exprimiert, es ist das dominante Gen. Die Wirkung des anderen Allels, das als rezessiv bezeichnet wird, wird maskiert.

Eine Person oder ein anderer Organismus, der ein rezessives Allel für ein genetisches Merkmal oder eine Mutation geerbt hat, aber normalerweise dieses Merkmal nicht aufweist oder Symptome der Krankheit zeigt.

Eine spezielle Art der Zellteilung in sich sexuell fortpflanzenden Organismen, die zur Produktion der Gameten verwendet wird, wie zum Beispiel Spermien oder Eizellen. Es umfasst zwei Teilungsrunden, die letztendlich zu vier Zellen mit nur einer Kopie jedes Chromosoms führen.

Das Versagen von homologen Chromosomen oder Schwesterchromatiden, sich während der Zellteilung richtig zu trennen.

Eine fadenförmige Struktur aus Nukleinsäuren und Proteinen, die im Kern der meisten lebenden Zellen vorkommt und genetische Informationen in Form von Genen trägt.

Eine reife haploide männliche oder weibliche Keimzelle, die sich bei der sexuellen Fortpflanzung mit einer anderen des anderen Geschlechts zu einer Zygote vereinigen kann.

Die Vereinigung von Samenzelle und Eizelle. Die Zygote, auch befruchtete Eizelle genannt, beginnt als einzelne Zelle, teilt sich aber in den Tagen nach der Befruchtung schnell. Nach dieser zweiwöchigen Zellteilung wird die Zygote schließlich ein Embryo.

Ein medizinisches Verfahren, das hauptsächlich in der pränatalen Diagnostik von Chromosomenanomalien und fetalen Infektionen sowie zur Geschlechtsbestimmung verwendet wird. Bei diesem Verfahren wird eine kleine Menge Fruchtwasser, das fötales Gewebe enthält, aus der Fruchtblase, die einen sich entwickelnden Fötus umgibt, entnommen.

Biologische Moleküle, die die erforderliche Energie für eine Reaktion verringern.

Eine experimentelle Technik, die Gene verwendet, um Krankheiten zu behandeln oder zu verhindern.

Eine Sequenz von Nukleotiden in DNA oder RNA, die für ein Molekül kodiert, das eine Funktion hat.

Die kleinste Einheit des Lebens, bestehend aus mindestens einer Membran, Zytoplasma und genetischem Material.

Eine Klasse biologischer Moleküle, die aus verknüpften Monomeren von Aminosäuren bestehen und die vielseitigsten Makromoleküle in lebenden Systemen sind und entscheidende Funktionen in praktisch allen biologischen Prozessen erfüllen.

Ein Träger, der gentechnisch verändert wurde, um ein Gen zu liefern. Bestimmte Viren werden oft als Vektoren verwendet, da sie das neue Gen durch Infektion der Zelle liefern können.


Schau das Video: Gentechnik - Einfach erklärt (Januar 2023).