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Ist es richtig zu sagen, dass die kodierende Sequenz Teil der Exon-Sequenz ist?

Ist es richtig zu sagen, dass die kodierende Sequenz Teil der Exon-Sequenz ist?


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Einige grundlegende Unklarheiten machen mich verwirrt. Ich habe 5'UTR-, CDS-, 3'UTR- und Exon-Sequenzen separat von Biomart für ein Gen P4HA2 (Homo sapiens) heruntergeladen und einige einfache Sequenzwiederholungen (SSR) gefunden. Während es eine Wiederholung x auf der Exonsequenz gibt, war sie nicht auf der 5'UTR, 3'UTR und der kodierenden Sequenz (oder CDS) des Gens lokalisiert. Soweit ich mich erinnere, ist die Exonsequenz mit der kodierenden Sequenz identisch, mit Ausnahme des ersten und letzten Exons, die Teile von 5'UTR bzw. 3'UTR sind, oder? Könnten Sie mir bitte helfen herauszufinden, wie die genannte Veranstaltung möglich ist? Vielen Dank


Soweit ich mich erinnere, ist die Exonsequenz mit der kodierenden Sequenz identisch, mit Ausnahme des ersten und letzten Exons, die Teile von 5'UTR bzw. 3'UTR sind, habe ich recht?

Nicht unbedingt. Die UTRs können aus mehreren Exons bestehen und es kann ein Exon geben, das beide Seiten des Startcodons überspannt, d. h. es ist sowohl ein Teil der 5'UTR als auch des CDS. Ebenso kann ein Exon beide Seiten des Stopcodons überspannen.

Ein Grund, warum Sie Ihre Wiederholung keiner der Regionen der mRNA zuordnen können, könnte sein, dass Ihre Wiederholung in ein Exon fällt, das das Start-/Stopp-Codon überspannt. Die Wiederholung selbst kann diese Sites umfassen. Sie müssen zusätzliche Details wie den Ort des Repeats, die Größe des Repeats und das zugeordnete Exon angeben. Erwähnen Sie auch, welche Referenzgenomdatei Sie verwenden.


Die kodierende Region ist die Region des DNA-kodierenden Strangs, die in ein Produkt translatiert wird. Dies ist synonym mit der Exon-Region. Die 5'-untranslatierte Region und die 3'-untranslatierte Region sind genau das, und obwohl sie eine wenig verstandene Funktion bei der Replikation erfüllen können, werden sie nicht in ein Protein übersetzt. "kodierende Region" ist kein Begriff, den ich häufig gehört habe, obwohl ich als Molekularbiologe ein Neuling bin.


Ist es richtig zu sagen, dass die kodierende Sequenz ein Teil der Exon-Sequenz ist? - Biologie

AUGUSTUS hat 2 obligatorische Argumente. Die Abfragedatei und die Spezies. Die Abfragedatei enthält die DNA-Eingabesequenz und muss im unkomprimierten (mehrfachen) Fasta-Format vorliegen, z. die Datei kann so aussehen:

Jeder Buchstabe außer a,c,g,t,A,C,G und T wird als unbekannte Basis interpretiert. Ziffern und Leerzeichen werden ignoriert. Die Anzahl der Zeichen pro Zeile ist nicht beschränkt.

Um augustus auszuführen, führen Sie den folgenden Befehl mit den entsprechenden Parametern aus.

Wenn die Ausgabe in eine Datei umgeleitet werden soll (siehe auch Parameter outfile), können Sie Pipe-Operatoren verwenden, zum Beispiel:

SPECIES ist einer der folgenden Identifikatoren. Die Verzeichnisnamen unter config/species bilden die vollständige Liste. Die Bezeichner in Klammern bezeichnen ältere Versionen dieser Art. 'queryfilename' ist der Dateiname (einschließlich des relativen Pfads) zu der Datei, die die Abfragesequenz(en) im Fasta-Format enthält.

Kennung Spezies
Mensch Homo sapiens
fliegen Drosophila melanogaster
Arabidopsis Arabidopsis thaliana
brugia Brugia Malaysia
aedes Aedes aegypti
tribolium Tribolium castaneum
Schistosoma Schistosoma mansoni
Tetrahymena Tetrahymena thermophila
galdieria Galdieria sulphuraria
Mais Zea mays
Toxoplasma Toxoplasma gondii
Caenorhabditis Caenorhabditis elegans
(elegans) Caenorhabditis elegans
aspergillus_fumigatus Aspergillus fumigatus
aspergillus_nidulans Aspergillus nidulans
(Anidulaner) Aspergillus nidulans
aspergillus_oryzae Aspergillus oryzae
aspergillus_terreus Aspergillus terreus
botrytis_cinerea Botrytis cinerea
Candida albicans Candida albicans
candida_guilliermondii Candida guilliermondii
candida_tropicalis Candida Tropicalis
chaetomium_globosum Chaetomium globosum
coccidioides_immitis Coccidioides immitis
coprinus Coprinus cinereus
coprinus_cinereus Coprinus cinereus
coyote_tobacco Nicotiana Attenuata
cryptococcus_neoformans_gattii Cryptococcus neoformans gattii
cryptococcus_neoformans_neoformans_B Cryptococcus neoformans neoformans
cryptococcus_neoformans_neoformans_JEC21 Cryptococcus neoformans neoformans
(Kryptokokken) Cryptococcus neoformans
debaryomyces_hansenii Debaryomyces hansenii
encephalitozoon_cuniculi_GB Enzephalitozoon cuniculi
eremothecium_gossypii Eremothecium gossypii
fusarium_graminearum Fusarium graminearum
(Fusarium) Fusarium graminearum
histoplasma_capsulatum Histoplasma capsulatum
(Histoplasma) Histoplasma capsulatum
kluyveromyces_lactis Kluyveromyces lactis
laccaria_bicolor Laccaria zweifarbig
Neunauge Petromyzon marinus
leishmania_tarentolae Leishmania tarentolae
lodderomyces_elongisporus Lodderomyces elongisporus
magnaporthe_grisea Magnaporthe grisea
neurospora_crassa Neurospora crassa
(Neurospora) Neurospora crassa
phanerochaete_chrysosporium Phanerochaete chrysosporium
(Pchrysosporium) Phanerochaete chrysosporium
pichia_stipitis Pichia stipitis
rhizopus_oryzae Rhizopus oryzae
saccharomyces_cerevisiae_S288C Saccharomyces cerevisiae
saccharomyces_cerevisiae_rm11-1a_1 Saccharomyces cerevisiae
(Saccharomyces) Saccharomyces cerevisiae
schizosaccharomyces_pombe Schizosaccharomyces pombe
thermoanaerobacter_tengcongensis Thermoanaerobacter tengcongensis
Trichinellen Trichinella spiralis
ustilago_maydis Ustilago maydis
(Ustilago) Ustilago maydis
yarrowia_lipolytika Yarrowia lipolytica
nasonia Nasonia vitripennis
Tomate Solanum lycopersicum
chlamydomonas Chlamydomonas reinhardtii
amphimedon Amphimedon Queenslandica
Pneumozystis Pneumocystis jirovecii
Weizen Triticum aestivum
Hähnchen Gallus gallus
Zebrafisch Danio rerio
E_coli_K12 Escherichia coli
S. aureus Staphylococcus aureus
Volvox Volvox-Kartei

--strand=beide, --strand=forward oder --strand=backward melden vorhergesagte Gene auf beiden Strängen, nur dem Vorwärts- oder nur dem Rückwärtsstrang. Standard ist 'beide'

--genemodel=partial, --genemodel=intronless, --genemodel=complete, --genemodel=atleastone oder --genemodel=exactlyone partiell : Vorhersage unvollständiger Gene an den Sequenzgrenzen zulassen (Standard) intronless : Vorhersage nur einzelner Exons Gene wie bei Prokaryoten und einigen Eukaryoten komplett : nur vollständige Gene vorhersagen atleastone : mindestens ein vollständiges Gen genau vorhersagen : genau ein komplettes Gen vorhersagen

--singlestrand=true Gene unabhängig auf jedem Strang vorhersagen, überlappende Gene auf gegenüberliegenden Strängen zulassen Diese Option ist standardmäßig deaktiviert.

--hintsfile=hintsfilename Wenn diese Option verwendet wird, wird die Vorhersage unter Berücksichtigung von Hinweisen (extrinsische Informationen) eingeschaltet. hintsfilename enthält die Hinweise im gff-Format.

--extrinsicCfgFile=cfgfilename Optional. Diese Datei enthält die Liste der verwendeten Quellen für die Hinweise und deren Boni und Mali. Wenn nicht angegeben, wird die Datei "extrinsic.cfg" im Konfigurationsverzeichnis $AUGUSTUS_CONFIG_PATH verwendet.

--maxDNAPieceSize=n Dieser Wert gibt die maximale Länge der Teile an, in die die Sequenz geschnitten wird, damit der Kernalgorithmus (Viterbi) ausgeführt werden kann. Der Standardwert ist --maxDNAPieceSize=200000. AUGUSTUS versucht, die Grenzen dieser Stücke in der intergenischen Region zu platzieren, die durch eine vorläufige Vorhersage abgeleitet wird. Vom GC-Gehalt abhängige Parameter werden für jedes DNA-Stück gewählt, wenn /Constant/decomp_num_steps > 1 für diese Spezies ist. Aus diesem Grund sollte dieser Wert nicht sehr groß eingestellt werden, auch wenn Sie viel Arbeitsspeicher haben.

--codingseq=on/off Ausgabeoptionen. Ausgabe der vorhergesagten Proteinsequenz, Introns, Startcodons, Stopcodons. Oder verwenden Sie 'cds' zusätzlich zu 'initial', 'internal', 'terminal' und 'single' exon. Das CDS schließt das Stopcodon aus (außer stopCodonExcludedFromCDS=false), wohingegen das terminale und einzelne Exon das Stopcodon einschließen.

--AUGUSTUS_CONFIG_PATH=Pfadpfad zum Konfigurationsverzeichnis (wenn nicht als Umgebungsvariable angegeben)

--alternatives-from-evidence=true/false meldet alternative Transkripte, wenn sie von Hinweisen vorgeschlagen werden

--alternatives-from-sampling=true/false meldet alternative Transkripte, die durch probabilistisches Sampling generiert wurden

--maxtracks=n Eine Beschreibung dieser Parameter finden Sie in Abschnitt 4 unten.

--proteinprofile=filename Liest ein Proteinprofil aus der Datei filename. Siehe Abschnitt über PPX unten.

--predictionStart=A, --predictionEnd=B A und B definieren den Bereich der Sequenz, für den Vorhersagen gefunden werden sollen. Schneller, wenn Sie Vorhersagen nur für einen kleinen Teil benötigen.

--gff3=Ein/Aus-Ausgabe im gff3-Format

--UTR=on/off sagt die untranslatierten Regionen zusätzlich zu der kodierenden Sequenz voraus. Dies funktioniert derzeit nur beim Menschen, bei Galdieria, Toxoplasma und Caenorhabditis.

--outfile=Dateiname Ausgabe in Dateiname statt in Standardausgabe ausgeben. Dies ist nützlich für Computerumgebungen, z.B. parasol-Jobs, die keine Shell-Umleitung zulassen.

--noInFrameStop=true/false Keine Transkripte mit Stopcodons im Frame melden. Andernfalls könnten Intron-übergreifende Stop-Codons auftreten. Standard: false

--noprediction=true/false Wenn wahr und die Eingabe im Genbank-Format ist, wird keine Vorhersage gemacht. Nützlich, um die annotierten Proteinsequenzen zu erhalten.

--contentmodels=on/off Bei 'off' sind die Inhaltsmodelle deaktiviert (alle Emissionen einheitlich 1/4). Die Inhaltsmodelle sind die Markov-Kette der kodierenden Region (emiprobs), die anfänglichen k-mere in der kodierenden Region (Pls), das Intron und die intergene Regin-Markov-Kette. Diese Option ist für spezielle Anwendungen gedacht, die es erfordern, Genstrukturen nur aus den Signalmodellen zu beurteilen, z.B. zur Vorhersage der Wirkung von SNPs oder Mutationen auf das Spleißen. Für alle typischen Genvorhersagen sollte dies zutreffen. Standard ein

Das Ausgabeformat ist gtf ähnlich dem General Feature Format (gff), siehe http://www.sanger.ac.uk/Software/formats/GFF/. Es enthält eine Linie pro vorhergesagtem Exon. Beispiel:

Die Spalten (Felder) enthalten:

AUGUSTUS akzeptiert auch Dateien im annotierten GENBANK-Format als Eingabe. Dies wird für die Ausbildung benötigt. Auch bei der Vorhersage einer Genbank-Datei vergleicht AUGUSTUS seine Vorhersage mit der Annotation und druckt eine Statistik aus. Beispiel für ein von AUGUSTUS akzeptiertes Genbank-Dateiformat:

Ein weiteres Beispiel, das für das Training der UTR-Modelle wichtig ist. Die folgende Genbank-Datei wird so interpretiert, dass sie drei Gene enthält. Ein Gen ('A') mit sowohl 5'- als auch 3'-UTR und zwei einzelne UTRs ohne übereinstimmende kodierende Sequenz. Gen 'B' besteht nur aus der 5'UTR, Gen 'C' nur aus der 3'UTR.

SAMPLING: ALTERNATIVE TRANSKRIPTE UND POSTERIOR-WAHRSCHEINUNGEN

Beachten Sie, dass es für die Vorhersage des alternativen Spleißens ein weiteres Verfahren gibt, das in 5. unten beschrieben wird.

Alternative Transkripte (aus der Bemusterung)

Wenn du auf der Befehlszeile sagst

oder ändern Sie die entsprechende Zeile in der Konfigurationsdatei für Ihre Spezies in Alternativen true, dann kann AUGUSTUS mehrere Transkripte pro Gen melden. Ein Gen wird dann als ein Satz von Transkripten definiert, deren kodierende Sequenzen (indirekt) überlappen. Die Anzahl der Alternativen, die AUGUSTUS für ein Gen meldet, hängt davon ab, welche Alternativen wahrscheinlich sind. Wenn nur ein Transkript in dieser Region wahrscheinlich ist, wird auch nur ein Transkript gemeldet. Das Verhalten von AUGUSTUS kann mit den Parametern angepasst werden

Die Posterior-Wahrscheinlichkeit jedes Exons und jedes Introns in einem Transkript muss mindestens 'minexonintronprob' betragen, andernfalls wird das Transkript nicht gemeldet. minexonintronprob=0,1 ist ein vernünftiger Wert. Außerdem muss das geometrische Mittel der Wahrscheinlichkeiten aller Exons und Introns mindestens 'minmeanexonintronprob' betragen. minmeanexonintronprob=0,4 ist ein vernünftiger Wert. Die maximale Anzahl von Spuren bei der Anzeige in einem Genom-Browser ist 'maxtracks' (außer maxtracks=-1, dann ist sie unbegrenzt). In Fällen, in denen sich alle Transkripte eines Gens an einer Position überlappen, ist dies auch die maximale Anzahl von Transkripten für dieses Gen. Ich empfehle, den Parameter 'maxtracks' zu erhöhen, um die Sensitivität zu verbessern und 'maxtracks' auf 1 zu setzen und minmeanexonintronprob und/oder minexonintronprob zu erhöhen, um die Spezifität zu verbessern.

AUGUSTUS berichtet über die Posterior-Wahrscheinlichkeiten von Exons, Introns, Transkripten und Genen. Die Posterior-Wahrscheinlichkeit eines Exons ist die bedingte Wahrscheinlichkeit, dass die zufällige Genstruktur bei gegebener Eingabesequenz ein Exon mit diesen Koordinaten auf diesem Strang hat. Sie hängt nicht nur wie ein Exon-Score von der Reihenfolge im Bereich des Exons selbst ab, sondern wird beispielsweise von den Möglichkeiten kompatibler Nachbar-Exons beeinflusst. Der Intron-Score ist ähnlich. Die angegebene Wahrscheinlichkeit eines Transkripts ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine Spleißvariante genau wie im angegebenen Transkript ist. Die gemeldete Wahrscheinlichkeit eines Gens ist die Wahrscheinlichkeit, dass SEINE kodierende Sequenz im gemeldeten Bereich auf dem gemeldeten Strang liegt, ungeachtet des genauen Transkripts.

Die Posterior-Wahrscheinlichkeiten werden unter Verwendung eines Abtastalgorithmus geschätzt. Der Parameter --sample==n passt die Anzahl der Sampling-Iterationen an. Je höher 'n' ist, desto genauer ist die Schätzung, aber normalerweise ist es nicht wichtig, dass die A-posterior-Wahrscheinlichkeit sehr genau ist. Alle 30 Stichproben-Iterationen dauern ungefähr so ​​lange wie ein Lauf ohne Stichproben, z. --sample=60 dauert ungefähr dreimal so lange wie --sample=0 (was bis Version 1.6 Standard war). Die Standardeinstellung ist

Wenn Sie die Posterior-Wahrscheinlichkeiten oder alternativen Transkripte nicht benötigen, sagen wir

Es gibt 3 gängige Szenarien für die obigen Parameter, je nachdem, was Sie wollen:

  1. Geben Sie einfach die wahrscheinlichste Genstruktur wie in früheren Versionen aus. Keine Posterior-Wahrscheinlichkeiten, keine Alternativen:

Beachten Sie, dass die Probenahme pseudozufällig ist und die Ergebnisse von Maschine zu Maschine variieren können.

Das probabilistische Modell von AUGUSTUS kann als grobe Annäherung an die Realität angesehen werden. Eine Folge davon ist, dass die Posterior-Wahrscheinlichkeiten für die starken Exons (z. B. die vom Viterbi-Algorithmus aufgerufenen) tendenziell größer sind als die tatsächlich gemessenen Präzisions-(Spezifitäts-)Werte. Beim Menschen sind zum Beispiel nur 94,5% der Exons mit einer vorhergesagten posterioren Wahrscheinlichkeit >= 98% (unter dem Standardwert --sample=100) tatsächlich richtig. Siehe docs/CDS.sp. für weitere Daten und eine Erklärung. Wenn das Ziel der Probenahme darin besteht, einen vielfältigen, sensiblen (einschließlich) Satz von Genstrukturen zu erzeugen, können Sie diesen Parameter verwenden

wobei t einer von 0,1,2,3,4,5,6,7 ist. Alle Wahrscheinlichkeiten des Modells werden dann mit (8-t)/8 potenziert, d. h. t=0 (der Standardwert) tut nichts. Je größer t, desto mehr Alternativen werden abgetastet. t=3 ist ein guter Kompromiss zwischen einer hohen Sensitivität, aber nicht zu viele Exons, die insgesamt abgetastet werden. Für t=3 sind 96,1% der menschlichen Exons mit einer Posterior-Wahrscheinlichkeit >= 98% korrekt.

AUGUSTUS kann Hinweise auf die Genstruktur nehmen. Früher hieß dies auch AUGUSTUS+. Es akzeptiert derzeit 16 Arten von Hinweisen:
start, stop, tss, tts, ass, dss, exonpart, exon, intronpart, intron, CDSpart, CDS, UTRpart, UTR, irpart, nonexonpart. Die Hinweise müssen in einer Datei im gff-Format gespeichert werden, die einen Hinweis pro Zeile enthält. Unten ist ein Beispiel für eine Hints-Datei:

Die Felder müssen durch einen Tabulator getrennt werden. In der ersten Spalte (Feld) wird der Sequenzname angegeben. In diesem Fall beziehen sich die Hinweise zusammen auf zwei Sequenzen. Das zweite Feld ist der Name des Programms, das den Hinweis erzeugt hat. Es wird hier ignoriert. Die dritte Spalte gibt den Typ des Hinweises an. Die 4. und 5. Spalte geben die Anfangs- und Endposition des Hinweises an. Die Positionen beginnen bei 1. Die 6. Spalte gibt eine Punktzahl. Der 7. der Strang. Der 8. der Leserahmen wie im GFF-Standard definiert. Die 9. Spalte enthält beliebige Zusatzinformationen, muss jedoch eine Zeichenfolge 'source=X' enthalten, wobei X die Quellkennung des Hinweises ist. Welche Werte für X möglich sind, ist in der Datei augustus/config/extrinsic.cfg angegeben, z.B. X=M, E oder P.

AUGUSTUS kann einem Hinweis folgen, d. h. eine damit kompatible Genstruktur vorhersagen, oder AUGUSTUS kann einen Hinweis ignorieren, d. h. eine damit nicht kompatible Genstruktur vorhersagen. Die Wahrscheinlichkeit, dass AUGUSTUS einen Hinweis ignoriert, ist umso geringer, je zuverlässiger die Hinweise dieser Art sind.

Unten in einem Beispiel, um AUGUSTUS mit der Option --hintsfile auszuführen:

Alternativ zur Angabe der Option --extrinsicCfgFile können Sie augustus/config/extrinsic.cfg durch die entsprechende Datei ersetzen, da diese Datei standardmäßig gelesen wird, wenn die Option --extrinsicCfgFile nicht angegeben wird.

Der bevorzugte Weg, Wiederholungsinformationen zu verwenden, ist die Softmaskierung, bei der die Basen in Wiederholungsbereichen in der Eingabe klein geschrieben sind (a,c,g,t statt A,C,G,T). Laufender Augustus könnte so aussehen:

interpretiert maskierte Regionen als Beweis gegen Exons (Hinweise auf Nicht-Exonteile mit einem Standardbonus von 1,15). Dies ist etwas genauer als die harte Maskierung (mit N), die Informationen verliert. Beim Menschen ist Augustus mit Softmasking=1 auch mehr als doppelt so schnell wie bei hart maskierten Sequenzen.

Erläuterung des Dateiformats der Datei extrinsic.cfg.

Die gff/gtf-Datei, die die Hinweise enthält, muss irgendwo in der letzten Spalte einen Eintrag source=? enthalten, wobei ? ist eines der Quellzeichen, die in der Zeile nach [SOURCES] oben aufgeführt sind. Sie können unterschiedliche Quellen verwenden, wenn Sie Hinweise auf unterschiedliche Zuverlässigkeit des gleichen Typs haben, z. Exon-Hinweise aus ESTs und Exon-Hinweise aus evolutionären Erhaltungsinformationen.

Im Abschnitt [ALLGEMEIN] geben die Einträge der zweiten Spalte einen Bonus für das Befolgen eines Hinweises und der Eintrag in der dritten Spalte einen Malus (Strafe) für die Vorhersage eines Merkmals an, das von keinem Hinweis unterstützt wird. Der Bonus und der Malus ist ein Faktor, der mit der späteren Wahrscheinlichkeit von Genstrukturen multipliziert wird. Beispiel:

bedeutet, dass, wenn AUGUSTUS nach der wahrscheinlichsten Genstruktur sucht, jede Genstruktur, die ein CDS genau wie in einem Hinweis angegeben hat, einen Bonusfaktor von 1000 erhält. Außerdem erhält man für jedes nicht unterstützte CDS die Wahrscheinlichkeit der Genstruktur ein Malus von 0,7. Erhöhen Sie den Bonus, damit AUGUSTUS mehr Hinweisen befolgt, verringern Sie den Malus, damit AUGUSTUS einige Funktionen vorhersagt, die nicht von Hinweisen unterstützt werden. Der Malus hilft, die Spezifität zu erhöhen, z.B. wenn die von AUGUSTUS vorhergesagten Exons verdächtig sind, weil es keine Beweise aus ESTs, mRNAs, Proteindatenbanken, Sequenzkonservierung, transMapping exprimierten Sequenzen gibt. Wenn Sie den Malus auf 1.0 setzen, werden diese Strafen deaktiviert. Wenn Sie den Bonus auf 1.0 setzen, wird die Boni deaktiviert.

  • start: Translationsstart (Startcodon), gibt ein Intervall an, das das Startcodon enthält. Das Intervall kann größer als 3 bp sein, in diesem Fall erhält jedes ATG im Intervall einen Bonus. Den höchsten Bonus erhalten ATGs in der Mitte des Intervalls, der Bonus verblasst gegen Ende.
  • stop: translation end (stop codon), siehe 'start'
  • tss: Transkriptionsstartseite, siehe 'start'
  • tts: Transkriptionsterminationsstelle, siehe 'Start'
  • ass: Akzeptor (3') Spleißstelle, die letzte Intronposition, für nur annähernd bekannte ass kann ein Intervall angegeben werden
  • dss: Donor (5') Spleißstelle, die erste Intronposition, für nur ungefähr bekannte dss kann ein Intervall angegeben werden
  • exonpart: Teil eines Exons im biologischen Sinne. Der Bonus gilt nur für Exons, die das Intervall vom Hinweis enthalten. Nur Überlappung bedeutet überhaupt keinen Bonus. Der Malus gilt für jede Basis eines Exons. Daher ist der Malus für ein Exon exponentiell in der Länge eines Exons: malus=Exonpartmalus^Länge. Daher sollte der Malus nahe 1 liegen, z.B. 0,99.
  • Exon: Exon im biologischen Sinne. Nur Exons, die genau dem Hinweis entsprechen, erhalten einen Bonus. Ausnahme: Die Exons, die das Startcodon und das Stopcodon enthalten. Dieser Malus gilt für ein komplettes Exon unabhängig von seiner Länge.
  • intronpart: Introns sowohl zwischen kodierenden als auch nicht-kodierenden Exons. Der Bonus gilt für jede intronic Base im Intervall des Hinweises.
  • intron: Ein Intron bekommt den Bonus genau dann, wenn es genau so ist wie im Hinweis.
  • CDSpart: Teil des kodierenden Teils eines Exons. (CDS = Codiersequenz)
  • CDS: Kodierender Teil eines Exons mit genauen Grenzen. Für interne Exons eines Multi-Exon-Gens ist dies identisch mit den biologischen Grenzen des Exons. Für das erste und das letzte kodierende Exon sind die Grenzen die Grenzen der kodierenden Sequenz (Start, Stop).
  • UTR: genaue Grenzen eines UTR-Exons oder der untranslatierte Teil eines teilweise kodierenden Exons.
  • UTRpart: Das Hint-Intervall muss im UTR-Teil eines Exons enthalten sein.
  • irpart: Der Bonus gilt für jede Basis der intergenischen Region. Wenn die UTR-Vorhersage aktiviert ist (--UTR=on), wird UTR als generisch betrachtet. Wenn Sie in der Konfigurationsdatei entgegen der üblichen Bedeutung den Bonus von irparts viel kleiner als 1 wählen, können Sie AUGUSTUS zwingen, eine intergenische Region im angegebenen Intervall nicht vorherzusagen. Dies ist nützlich, wenn Sie AUGUSTUS mitteilen möchten, dass zwei entfernte Exons zum selben Gen gehören, wenn AUGUSTUS dazu neigt, dieses Gen in kleinere Gene aufzuteilen.
  • nonexonpart: intergene Region oder Intron. Der Bonus gilt für sehr Nicht-Exon-Basis, die sich mit dem Intervall vom Hinweis überschneidet. Es ist geometrisch in der Länge dieser Überlappung, also wählen Sie es nahe 1,0. Dies ist als schwache Maskierung nützlich, z.B. wenn es unwahrscheinlich ist, dass ein retroponiertes Gen eine kodierende Region enthält, Sie aber Exons nicht vollständig verbieten möchten.
  • genicpart: alles, was keine intergene Region ist, d. h. Intron oder Exon oder UTR, falls zutreffend. Der Bonus gilt für jede Genbasis, die sich mit dem Intervall vom Hinweis überschneidet. Dies kann insbesondere verwendet werden, um Augustus dazu zu bringen, ein Gen zwischen den Positionen a und b vorherzusagen, wenn experimentell bestätigt wird, dass a und b Teil desselben Gens sind, z. durch ESTs vom gleichen Klon. alias: nonirpart

Alle Hinweise der Typen dss, Intron, Exon, CDS, UTR, die (implizit) auf eine Donor-Spleißstelle hindeuten, erlauben AUGUSTUS die Vorhersage einer Donor-Spleißstelle mit GC anstelle des viel häufigeren GT. AUGUSTUS sagt keine GC-Donor-Spleißstelle voraus, es sei denn, es gibt einen Hinweis darauf.

Ab Spalte 4 können Sie AUGUSTUS mitteilen, wie der Bonus in Abhängigkeit von der Quelle des Hinweises und der Punktzahl des Hinweises geändert werden soll. Die Punktzahl der Hinweise ist in der 6. Spalte des Hinweises gff/gtf angegeben. Wenn der Score überhaupt verwendet wird, wird der Score nicht direkt durch eine Umrechnungsformel verwendet, sondern durch die Unterscheidung verschiedener Klassen von Scores, z. niedrige Punktzahl, mittlere Punktzahl, hohe Punktzahl. Das Format ist wie folgt: Zuerst geben Sie das Quellzeichen an, dann die Anzahl der Klassen (sagen wir n), dann geben Sie die Bewertungsgrenzen an, die die Klassen trennen (n-1 Schwellenwerte) und dann geben Sie für jede Bewertungsklasse das Multiplikativ an Modifikator des Bonus (n Faktoren).

bedeutet, dass es für den manuellen Hinweis nur eine Bewertungsklasse gibt, der Bonus für diesen Hinweistyp wird mit 10^100 multipliziert. Dies zwingt AUGUSTUS praktisch dazu, alle manuellen Hinweise zu befolgen.

Bei den transMap-Hinweisen unterscheidet man 2 Klassen. Diejenigen mit einer Punktzahl unter 1,5 und mit einer Punktzahl über 1,5. Der Bonus bei den Hinweisen mit der niedrigeren Punktzahl bleibt unverändert und der Bonus der Hinweise mit der höheren Punktzahl wird mit 5x10^29 multipliziert.

Verwenden Sie 8 Bewertungsklassen für die DIALIGN-Hinweise. DIALIGN-Hinweise geben einen Score, einen Strang und Informationen zum Leserahmen für CDSpart-Hinweise. Strang und Leserahmen sind oft richtig, aber nicht oft genug, um sich darauf zu verlassen. Um dem Rechnung zu tragen, habe ich Hinweise für alle 6 Kombinationen aus Strang und Leserahmen generiert und dann 2x2x2=8 verschiedene Score-Klassen verwendet: x x Dieses Beispiel zeigt, dass Scores nicht eintönig sein müssen. Eine höhere Punktzahl muss nicht unbedingt einen höheren Bonus bedeuten. Sie dienen lediglich dazu, die Hinweise nach Belieben in Kategorien einzuteilen. Insbesondere könnten Sie den Effekt verschiedener Quellen erzielen, indem Sie nur Hinweise auf eine Quelle haben und dann mehrere Bewertungsklassen unterscheiden.

Alternative Transkripte / Alternatives Spleißen (evidenzbasiert)

AUGUSTUS kann alternatives Spleißen oder - allgemeiner - alternative Transkripte vorhersagen, die durch Hinweise in Hinweisen nahegelegt werden. Die Methode ist sehr allgemein. Aber um ein Beispiel zu nennen: Wenn zwei EST-Alignments zu demselben genomischen Bereich nicht durch ein einziges Transkript erklärt werden können, kann AUGUSTUS ein Gen mit zwei verschiedenen Spleißformen vorhersagen, wobei eine Spleißform mit jedem der EST-Alignments kompatibel ist.

Jedem Hinweis kann ein Gruppenname gegeben werden, indem in der letzten Spalte für den Hinweis in der gff-Datei 'group=groupname' oder 'grp=groupname' angegeben wird. Dies sollte verwendet werden, um alle Hinweise zu gruppieren, die aus dem Alignment derselben Sequenz zum Genom stammen. Wenn beispielsweise ein EST mit dem Namen est_xyz mit einer Lücke am Genom ausgerichtet ist, was auf ein Intron hindeutet, dann könnten die aus dieser Ausrichtung resultierenden Hinweise wie folgt aussehen

Die Gruppierung sagt AUGUSTUS, dass Hinweise zusammengehören. Im Idealfall werden alle Hinweise einer Gruppe von einem vorhergesagten Transkript befolgt oder die gesamte Gruppe von Hinweisen wird bei der Vorhersage ignoriert.

Hinweisen oder Hinweisgruppen kann eine Priorität zugewiesen werden, indem in der letzten Spalte für den Hinweis in der gff-Datei 'priority=n' oder 'pri=n' angegeben wird. Zum Beispiel

Wenn sich zwei Hinweise oder Hinweisgruppen widersprechen, werden die Hinweise mit der niedrigeren Prioritätsnummer ignoriert. Dies ist vor allem dann sinnvoll, wenn für ein Genom mehrere Hinweisquellen zur Verfügung stehen, denen man im Zweifelsfall vertrauen sollte. Zum Beispiel hat der Rhesus-Makaken derzeit nur wenige native ESTs, aber menschliche ESTs stimmen oft auch mit Rhesus überein. Den Hinweisen von nativen ESTs eine höhere Priorität zu geben bedeutet, dass AUGUSTUS diese nur für Gene mit Unterstützung durch native ESTs verwendet und die Alien-EST-Alignments verwendet, wenn für ein Gen keine nativen EST-Alignments verfügbar sind. Wenn die Priorität nicht angegeben ist, wird sie intern auf -1 gesetzt.

Wenn AUGUSTUS mit --alternatives-from-evidence=false ausgeführt wird, werden alle Hinweise gleichzeitig an AUGUSTUS gegeben, ob sie mit einem einzigen Transkript pro Gen erklärt werden können. AUGUSTUS wählt dann die wahrscheinlichste Transkriptvariante aus.

Wenn AUGUSTUS mit --alternatives-from-evidence=true ausgeführt wird, sagt AUGUSTUS alternative Transkripte basierend auf den von den Hinweisen vorgeschlagenen Alternativen voraus. Dies kann jede Form des alternativen Spleißens sein, einschließlich verschachtelter Gene, die in Introns anderer Gene enthalten sind, überlappender Gene, alternativer Translationsstarts und Variation in der UTR.

Die Verbesserung der Vorhersagen durch die Integration von ESTs oder mRNA-Daten ist ziemlich einfach. Lassen Sie cdna.fa eine Fasta-Datei mit ESTs und/oder mRNAs sein. Hier ist die Liste der Befehle, die den Trick machen:

Erklärung und mögliche Verbesserungen

BLAT ist ein schnelles gespleißtes Ausrichtungsprogramm von Jim Kent. blat2hints.pl ist ein Skript aus dem AUGUSTUS-Skriptverzeichnis. Die Datei extrinsic.ME.cfg gibt die Parameter für die Aufnahme der Hinweise an. Sie können die wenigen Parameter für Ihr Genom manuell anpassen. Ich empfehle, die Boni und Malusen in extrinsic.ME.cfg nach einer Sichtprüfung der Vorhersagen anzupassen. Wenn es zum Beispiel so aussieht, als ob AUGUSTUS versucht, zu viele falsche EST-Ausrichtungen zu passen, reduzieren Sie die Boni. Erfahrungsgemäß richten sich einige ESTs oft an sehr vielen Stellen im Genom aus. Die meisten dieser Übereinstimmungen entsprechen nicht den echten Protein-kodierenden Genstrukturen. Daher ist es besser, nach dem BLAT-Lauf einen weiteren Schritt hinzuzufügen. Der Befehl

filtert die cDNA-Alignments und meldet nur die gespleißte(n) Alignments mit der höchsten Punktzahl für jede cDNA. Verwenden Sie dann die gefilterte Datei cdna.f.psl, um Hinweise zu erstellen. Das Programm pslCDnaFilter ist Teil des Kent-Quellbaums (aber nicht in der BLAT-Distribution).

Informationen zur RNA-Seq-Integration finden Sie in der Dokumentation in doc/readme.rnaseq.html.

AUGUSTUS-PPX: VORHERSAGEN MIT PROTEINPROFILEN

AUGUSTUS kann seine Vorhersage auf der Grundlage eines Proteinprofils treffen, das aus einem Multiple Sequence Alignment generiert werden kann. Das Proteinprofil wird an AUGUSTUS übergeben, indem der Parameter --proteinprofile wie im folgenden Beispiel angegeben wird:

Das Profil besteht aus einem Satz positionsspezifischer Frequenzmatrizen, die konservierte Regionen in einem MSA ohne Deletionen oder Insertionen modellieren. Wenn AUGUSTUS mit einem Profil ausgestattet ist, wird es zusätzliche Anstrengungen unternehmen, um Gene vorherzusagen, die dem Profil ähnlich sind, zum Beispiel Mitglieder einer bestimmten Proteinfamilie von Interesse. Die Vorhersagegenauigkeit für diese Gene wird im Allgemeinen durch die zusätzlichen Informationen aus dem Proteinmodell verbessert, während andere Gene identisch mit der Ab-initio-Version vorhergesagt werden.

Erstellen von Proteinprofilen aus mehreren Sequenzausrichtungen

Das Skript msa2prfl.pl wandelt ein Multiple Sequence Alignment im FASTA- oder CLUSTAL-Format in ein Proteinprofil um, indem es Frequenzen aus allen Blöcken von mindestens 6 lückenlosen Spalten im Alignment berechnet. Die minimale Blockbreite kann mit dem Parameter --width geändert werden. Das Skript blocks2prfl.pl konvertiert eine flache Datei aus der BLOCKS-Datenbank in ein Proteinprofil

Vorbereiten der Kernausrichtungen

Große Achsen können durch ein Blockprofil nicht dargestellt werden, wenn sie nicht genügend lückenlose Spalten haben. Es wird dann empfohlen, die Sequenzen nach Ähnlichkeit zu clustern oder Sequenzen aus dem Alignment zu verwerfen, die die meisten Blöcke nicht abdecken. Das Programm PrepareAlign kann das mit einem MSA im FASTA-Format. Verwendungszweck:

Die Umgebungsvariablen PA_FULL_COL_WEIGHT, PA_SKIP_COL_WEIGHT, PA_MINSIZE, PA_MIN_COL_COUNT steuern das Verhalten des Programms. Einzelheiten finden Sie in der Quelldatei.

Format der Proteinprofil-Eingabedatei

Ein Abschnitt "[name]", gefolgt vom Namen der Familie. Abwechselnde Abschnitte "[dist]" und "[block]" Jeder Abschnitt "[dist]" enthält eine Linie mit minimalem und maximalem Abstand zwischen den Blöcken. kann als "*" angegeben werden, um eine unbegrenzte Entfernung anzugeben.

Jeder Abschnitt "[block]" enthält eine Frequenzmatrix, wobei eine Zeile im Abschnitt einer Spalte im Alignment entspricht. Jede Zeile enthält 21 durch Tabulatoren getrennte Werte, der erste ist der Spaltenindex im Block (0,1,2. ), die anderen 20 Werte sind die Häufigkeiten (addiert zu 1), angegeben in der Reihenfolge G,D,E ,R,K,N,Q,S,T,A,V,L,I,F,Y,W,H,M,C,P

Beispielproteinprofile befinden sich im Verzeichnis example/profile/

Die Laufzeit von AUGUSTUS-PPX ist als Faustformel proportional zur Größe des Profils, der Faktor gegenüber AUGUSTUS ist ungefähr die Anzahl der Blöcke im Profil. Bei großen Profilen wird empfohlen, die Vorhersage mit --predictionStart und --predictionEnd einzuschränken. Auf Standard-Intel-Rechnern wurden Laufzeiten von etwa einer Stunde für ein großes Profil auf einer Region mit einer Größe von 1 Mbit/s beobachtet. Um Regionen zu ermitteln, in denen ein Profil relevant ist, führen Sie eine fastBlockSearch aus (siehe unten). Wichtige Parameter für den Betrieb von AUGUSTUS-PPX sind:

  • /ProteinModel/allow_truncated: Ermöglicht Profiltreffer in rechtsbeschnittenen Genen (Standard: ja)
  • /ProteinModel/block_threshold_spec: Kontrolliere die Spezifität (Standard: spec=4.0)
  • /ProteinModel/block_threshold_sens: Kontrolle der Sensitivität bei der Bestimmung von Blocktreffern (Default: sens=0.4)

Zunehmend. _sens und abnehmend . _spec führt zu mehr gefundenen Blocktreffern (und möglicherweise zu mehr Genen bei Profiltreffern), auf Kosten von mehr falsch positiven Treffern. Wenn die Anforderungen nicht beide erfüllt werden können, wird ein Block aus dem für die Vorhersage verwendeten Profil verworfen. Spezifität und Sensitivität werden in Einheiten der Standardabweichung vom erwarteten Block-Score angegeben (Prozentsätze können durch Anwendung der Gaußschen Verteilungsfunktion berechnet werden, z. B. entspricht der Standardwert von 2,5 einer geschätzten Spezifität von 99,3%: 7 FP-Treffer in 1000 bps). Beachten Sie, dass das Filtern von Blocktreffern hauptsächlich ein Leistungsproblem ist und es sehr unwahrscheinlich ist, dass ein falsch positiver Blocktreffer die Vorhersage beeinflusst, wenn die Punktzahl niedrig ist. Um zu verhindern, dass Blöcke aus dem Profil verworfen werden, verringern Sie einen der Parameter.

  • /ProteinModel/blockpart_threshold_spec: Spezifität für Blockpräfixe oder -suffixe (4.5)
  • /ProteinModel/blockpart_threshold_sens: Empfindlichkeit für Blockpräfixe oder -suffixe (2.0)

Das gleiche gilt für den Fall, dass ein Block durch ein Intron getrennt wird.

  • /ProteinModel/weight:Einfluss des Proteinmodells auf den kombinierten Score, kann gewichtet werden (Standard: 1, gleicher Beitrag) Ein höherer Wert führt zu mehr Genstrukturen, die näher am Proteinmodell liegen, falls vorhanden.

Wenn ein Gen ein Profiltreffer ist, werden die folgenden Zeilen zur gff-Ausgabe hinzugefügt:

  • ein protein_match-Merkmal für jeden der DNA zugeordneten Block (oder Blockteil, wenn der Block durch ein Intron getrennt wurde). Wenn --gff3=on angegeben ist, werden der Zielblock und die Proteinposition in der Attributspalte angegeben:

Schnelle Blocksuche zur Bestimmung von Regionen für die Genvorhersage

Sind ein Proteinprofil und ein Genom angegeben, kann mit dem Programm fastBlockSearch eine vorläufige Suche durchgeführt werden. Es werden die Standorte der Profiltreffer ausgegeben. Ein AUGUSTUS-PPX-Lauf kann dann auf Regionen mit diesen Standorten beschränkt werden. Er sollte mit den gleichen Parametern wie der AUGUSTUS-PPX-Lauf ausgeführt werden. Außerdem kann mit dem Parameter --cutoff ein Schwellenwert angegeben werden, der die Anzahl der angezeigten Profiltreffer steuert.

Die von fastBlockSearch gefundenen Profiltreffer enthalten möglicherweise nicht immer alle Blöcke. In this case, it may improve the prediction to modify the profile with the following command

where 2,3,5 is to be replaced with the list of blocks to be deleted from the profile.

Please see the file README.autoAug for documentation for the automatic training script autoAug.pl. See also the file retraining.html. Here is some background:

AUGUSTUS uses parameters which are species specific like the Markov chain transition probability of coding and non-coding regions. These parameters can be trained on training sets of annotated genes in genbank format. They are stored in the config directory in 3 files containing the parameters for the exon-related, intron-related and intergenic-region-related parameters, e.g. human_exon_probs.pbl, human_intron_probs.pbl, human_igenic_probs.pbl. For each species there are also parameters like the order of the markov chain or the size of the window used for the splice site models. Let's call these meta parameters. These meta parameters are stored in a separate file, e.g. human_parameters.cfg. Which meta parameters work best depends on the species and on the training set, in particular on the size of the training set. Using the meta parameters of another species or for another training set is likely to result in poor prediction performance. The meta parameters are not documented sufficiently. However, when optimizing the meta parameters for a new species it helps to know their meaning. Please contact me in case you want me to do the training. The program 'etraining' reads the meta parameters from the .cfg file and a genbank file with annotated genes and writes the other species specific parameters into the 3 .pbl files.

'trainfilename' is the filename (including relative path) to the file in genbank format containing the training sequences. These can be multi-gene sequences and genes on the reverse strand. However, the genes must not overlap.


Einführung

Recent work has highlighted the essential contribution of non-coding regions in controlling gene expression, especially in complex mammalian genomes [1]. In particular, 3′-untranslated regions (3′UTRs) play a crucial role in mRNA metabolism, e.g., by controlling mRNA stability, translation efficiency, and localization, or even as scaffolds to control protein localization [2,3,4,5,6]. Moreover, 3′UTRs emerge as essential regulatory elements in biological processes such as immune cell activation and tumorigenesis. In these settings, alternative cleavage and polyadenylation produce mRNA isoforms with shorter 3′UTRs that, due to the loss of microRNA-mediated repression, display increased protein expression [5, 6]. In tumor cells, elevated protein expression upon shortening of 3′UTRs is used to activate oncogenes or repress tumor-suppressor genes without mutating the genetic sequence [5, 7]. While these studies describe regulatory roles for 3′UTRs that do not affect the sequence of the expressed protein, some 3′UTRs are longer than their coding regions and could therefore fulfill additional, unknown functions [8]. Indeed, Fire and colleagues suggested that failure of the ribosome to terminate at stop codons can lead to translation into the 3′UTR. This resulted in a C-terminal extension of the investigated protein, which led to its destabilization the authors suggest this to be a safety mechanism to quickly discard such aberrantly produced proteins [9]. Another report suggests that failure of ribosome recycling in yeast can result in re-initiation of translation after the canonical stop codon, leading to the expression of micropeptides [10, 11]. While these studies provide evidence for translation of short sequences from 3′UTRs, it remains unclear to what extent 3′UTRs can be expressed in mammals and if and how 3′UTR-encoded sequences are used in a regulated manner beyond a safety mechanism. Moreover, possible functionalities and a potential evolutionary conservation of 3′UTR-encoded amino acid sequences remain elusive.

Alternative splicing (AS) is a well-established mechanism that, through joining together different combinations of exons during mRNA maturation in over 90% of human multi-exon genes, multiplies the genome’s coding capacity and controls functionality at the molecular and the cellular level [12,13,14]. Deregulation of AS has been linked to various human diseases such as cancer and neurological disorders [15, 16], emphasizing its crucial regulatory function. So far, the analysis of AS has been almost exclusively directed towards frame-preserving splicing events, as frameshift-inducing AS is generally believed to induce nonsense-mediated mRNA decay (NMD) through generation of premature stop codons [17]. Thus, the coding information hidden in alternative reading frames and the potential regulatory function of isoforms encoded by these frames remain largely unexplored. In our work, we reasoned that transcripts resulting from frameshift-inducing AS of the penultimate exon escape NMD, as this leads to the usage of an alternative stop codon located in the last exon. Consistent with this idea, we have previously shown that frameshift-inducing AS of the penultimate U2af26 (U2AF1L4) exons 6 and 7 in mice allows regulated translation into the sequences supposedly representing the 3′UTR [18].

Here, we show that more than 10% of mouse and human genes contain splicing-accessible extended frames in their 3′UTR, and confirm translation in many cases using mass spectrometry of endogenous proteins. The resulting alternative C-termini control protein stability, likely through an elevated degree of protein disorder, and, in addition, show a strong enrichment for proline-rich protein-protein interaction motifs. Tissue- and development-specific AS of penultimate exons thus suggests dynamic control of protein levels and rewiring of interaction networks. Our data reveal that this mechanism is conserved across mammalian species, thus representing a general evolutionary strategy. Furthermore, as we demonstrate for a Retinitis pigmentosa-causing mutation in the human phosphodiesterase PDE6G gene, misregulated translation into the 3′UTR is associated with the development of disease.


Multiple sequence alignment is a prerequisite for many evolutionary analyses. Multiple Alignment of Coding Sequences (MACSE) is a multiple sequence alignment program that explicitly accounts for the underlying codon structure of protein-coding nucleotide sequences. Its unique characteristic allows building reliable codon alignments even in the presence of frameshifts. This facilitates downstream analyses such as selection pressure estimation based on the ratio of nonsynonymous to synonymous substitutions. Here, we present MACSE v2, a major update with an improved version of the initial algorithm enriched with a complete toolkit to handle multiple alignments of protein-coding sequences. A graphical interface now provides user-friendly access to the different subprograms.

Multiple Alignment of Coding Sequences (MACSE) was the first automatic solution developed to align multiple protein-coding nucleotide sequences based on their amino acid translation while allowing for the occurrence of frameshifts ( Ranwez et al. 2011). Its key feature is to align DNA sequences at the nucleotide level, but with the possibility to include gap lengths that are not a multiple of three bases, that is, generating frameshifts, while scoring the resulting nucleotide alignments based on their amino acid translation. This allows one to produce nucleotide alignments that preserve the underlying codon structure while benefiting from the higher similarity of amino acid sequences. Since its first release in 2011, MACSE has been used in multiple contexts including comparative transcriptomic studies ( Lan and Pritchard 2016), pseudogene evolution ( Delsuc et al. 2015), genome-wide analyses of selection ( Assis et al. 2012), metabarcoding analyses ( Leray et al. 2013), and phylogenomic pipelines ( Bragg et al. 2016).

Here we present a major update of MACSE with an improved version enriched by a series of subprograms aimed at facilitating the production and handling of multiple alignments of protein-coding sequences. Altogether, the subprograms implemented in the new MACSE v2 release compose a powerful toolkit now easily accessible through a graphical user interface ( fig. 1).

The graphical user interface of MACSE v2 (links) allows to select the desired subprogram, to browse the file system for choosing input FASTA files, and to set parameter values. It automatically generates the corresponding command line (bottom left). When the user selects a new subprogram or click on an option field, a brief help related to this program or option is displayed on the top of the interface (red arrows). An exemplar data set of 15 mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 3 (nad3) gene sequences of turtles has been aligned by MACSE (parameters shown). The resulting alignment is displayed at the nucleotide (oben rechts), codon (Mitte), and amino acid (bottom right) levels using SeaView v4.6.4 ( Gouy et al.2010). Exclamation marks (!) emphasize the frameshifts detected by MACSE, most of which corresponding to programmed frameshift mutations ( Russell and Beckenbach 2008).

The graphical user interface of MACSE v2 (links) allows to select the desired subprogram, to browse the file system for choosing input FASTA files, and to set parameter values. It automatically generates the corresponding command line (bottom left). When the user selects a new subprogram or click on an option field, a brief help related to this program or option is displayed on the top of the interface (red arrows). An exemplar data set of 15 mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 3 (nad3) gene sequences of turtles has been aligned by MACSE (parameters shown). The resulting alignment is displayed at the nucleotide (oben rechts), codon (Mitte), and amino acid (bottom right) levels using SeaView v4.6.4 ( Gouy et al.2010). Exclamation marks (!) emphasize the frameshifts detected by MACSE, most of which corresponding to programmed frameshift mutations ( Russell and Beckenbach 2008).

The core alignment subprogram (alignSequences) has been improved in performance through a faster estimation of its objective function, namely the SP-score, thanks to recently derived optimal algorithmic solutions ( Ranwez 2016). Additional parameters have also been introduced to control the speed/extensiveness ratio of the heuristic search for an alignment optimizing the SP-score. MACSE v2 uses a progressive alignment strategy to obtain an initial draft of the multiple sequence alignment that is subsequently improved using the 2-cut refinement strategy. This widespread strategy, also used for instance by MUSCLE ( Edgar 2004), consists of partitioning the current solution into two subalignments that are subsequently realigned. The resulting alignment replaces the previous one if its SP-score is improved and the refinement process stops when no more improvements are found (see Ranwez et al. 2011 Ranwez 2016 for algorithmic details).

A tricky part of multiple sequence alignment is the choice of the elementary cost of each possible event. For instance, the relative costs of gap openings and gap extensions with respect to amino acid substitution strongly impact the final result and no efficient strategy as been found so far to select the ideal costs with respect to the sequences to be aligned ( Wheeler and Kececioglu 2007). MACSE requires additional costs for frameshifts and stop codons that are not easier to set than traditional gap-associated costs. We provide default values that have proved to be effective based on our experience. This is further discussed in the MACSE online documentation that provides guidelines for handling specific sequences such as pseudogenes or RNAseq contigs resulting from error prone long read sequencing technologies.

Die TrimNonHomologousFragments subprogram was developed to remove long sequence fragments that are unrelated to other sequences. Indeed, positioning long insertions in one or several sequences could drastically slow down and impede the alignment process. Moreover, long insertions may often prove finally useless since they are removed by alignment filtering tools in subsequent analyses. When a compatibility graph of maximum exact match (MEM) is constructed between two genomic sequences, they can be rapidly aligned after identification of the longest weighted path ( Hohl et al. 2002). We extended this approach to handle the translation of nucleotide sequences in the three possible coding frames using a compressed amino acid alphabet. This allows identifying and trimming long insertions present in only few sequences, as such regions are rarely part of long MEM paths.

Die enrichAlignment subprogram can be used to sequentially add new DNA sequences to an existing alignment. Its input parameters allow defining criteria that the additional sequences should fulfil to be actually incorporated into the final alignment. For instance, sequences can be automatically discarded when, once aligned, they would contain a stop codon, too many gaps, or more than a given number of frameshifts. The original alignment can either be sequentially enriched, or kept unchanged so that all sequences are compared with the same reference alignment. This latter option is especially useful for metabarcoding projects based on markers such as the mitochondrial Cytochrome Oxidase subunit I (Steuermann1) Gen. This typically involves enriching a reference alignment containing sequences from databases such as BOLD ( Ratnasingham and Hebert 2007) or MIDORI ( Machida et al. 2017) with thousands of newly generated sequences.

Die reportMaskAA2NT subprogram takes as input a nucleotide alignment and a filtered version of the corresponding amino acid alignment, for example, produced by HMMcleaner ( Philippe et al. 2017), and reports this filtering at the codon level. By default, it additionally filters out small sequence fragments mostly surrounded by gaps or filtered nucleotides. Other MACSE v2 subprograms allow performing useful alignment manipulations such as translating sequences using different genetic codes in the same alignment (translateNT2AA) restricting a coding alignment to a subset of sequences and/or sites (splitAlignment, trimAlignment) or refining an existing alignment using the 2-cut strategy to improve its SP-score (refineAlignment).

The command line interface is still key in most analyses that require running MACSE v2 in parallel on hundreds or thousands of data sets using a computing cluster. However, as the number of subprograms and options increased significantly, we now provide a user-friendly graphical interface. This should make it easier for new users to adopt MACSE v2 and hopefully broaden its usage and application scope.

MACSE v2 is Java software freely available under the CECILL license (GPL variant) at https://bioweb.supagro.inra.fr/macse/, last accessed August 22, 2018. MACSE v2 and OMM_MACSE, a pipeline strongly relying on the MACSE v2 toolkit that has been used to align the thousands of orthologous genes in the OrthoMAM database ( Douzery et al. 2014), are also available through dedicated web services at http://mbb.univ-montp2.fr/MBB/, last accessed August 22, 2018.


GDNA, mRNA and cDNA sequences of a gene? - (May/29/2005 )

Where and how to get the gDNA, mRNA and cDNA sequences of a gene? Any search tools?

Where and how to get the gDNA, mRNA and cDNA sequences of a gene? Any search tools?

Put in your favorite gene, click search, then you get all information you need. For example, put in FOS, you will get a list of FOS gene from different organisms, find the one from human, click on the link. Then, scroll down, you will find genomic sequences and mRNA sequences for the gene.

For your question, you will need to find genomic sequences in the gene record for your gDNA, NM_005252 (RefSeq) for mRNA, and other mRNA sequences as cDNA sequences.

If you want literature information, scroll up, you will have gene structure and literature reports.

Note that for mRNA sequence, you should probably use RefSeq, which is after curation of NCBI researchers. Other mRNAs listed are genbank sequences, most are from cDNA. If you want more of cDNA/EST, you will need to search through dbEST for a complete list of them related to YFG.

Second suggestion is to check out http://www.ensembl.org/ the resource is pretty much integrated the same way.

Thanks for your great answer!

I still have some questions regarding these search tools. Let us take for example the FOS gene for the human.
I came to this site:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.f. &list_uids=2353

I am now overwhelmed with all the infos and sequences in this site. Besides there are alot of socalled mRNA and genomic sequences which i don't know which one of them is the mRNA, gDNA and cDNA for the FOS gene.

1: Which link should i now click on to get the mRNA of the fos gene?

2. Which link should i now click on to get the cDNA of the fos gene?

3. Which link should i now click on to get the gDNA of the fos gene?

4. The sequence under "translation" is that the amino acid of a gene?

5. What kind of sequence (mRNA, gDNA or cDNA) is under "CDS" of a gene?

1: Which link should i now click on to get the mRNA of the fos gene?

I believe you need RefSeq of mRNA of the gene. There are two ways to do this on the page of fos gene:
first, use the gene structure map, this is the picture at the very begining of the fos gene entry showing the intron, exon, and 3'/5' UTR structure of the gene. Now, on left hand side of the picture, there is a NM_005252 link, click on it, javascript will popup a list with two entries: FASTA and GenBank. FASTA will give you the mRNA sequence, Genbank will give you the Genbank record of the mRNA.
second, you can use the links in the "NCBI Reference Sequences (RefSeq)" section, click on NM_005252, it will give you the same information.

2. Which link should i now click on to get the cDNA of the fos gene?

First, you should keep in mind, there are more than one cDNA sequence for this gene. Listed in the "Related Sequences" section of the record, you will see "genomic" and "mRNA" sequences, those "mRNA" sequences are actually cDNA sequences. The more complete view of all cDNA resources of a gene is to look into its UniGene link page, which is in the last section "Additional Links", click on UniGene Hs_25647, then in the "mRNA sequences (8)" section (8 sequences) you can see all the cDNAs associated with this gene, for example, full-length cDNA clone CS0DI066YO13 of Placenta Cot 25-normalized of Homo sapiens (human). As you can see, this resource is much more comprehensive because it provide tissue and disease information.

3. Which link should i now click on to get the gDNA of the fos gene?
In this case it should be the link of "Genomic V01512" under section "Related Sequences". All genomic sequences listed in that section are gDNA, but if you examine each record carefully, you will find most of them are partial, but this one "Genomic V01512" is complete. A trick to locate the complete gDNA CDS is to look in the section "NCBI Reference Sequences (RefSeq)", where you can find that RefSeq NM_005252 is built from source sequence V01512, which means that V01512 is probably the best covered sequene of this gene.

One thing you need to keep in mind is that the genbank record could come from an individual submission rather than from the whole genome sequence project. Therefore it might be specific to the tissue type or diseased type of that record (read carefully all information you can read). It might have SNP compare to genomic sequence of the gene built from whole genome sequencing project. To get the genomic of a gene in the whole genomic sequencing context, you should do things differently, which is use annotations on a NC or NT sequence of a gene to retrieve the gene sequence. There are much more to say on that end.

4. The sequence under "translation" is that the amino acid of a gene?

I didn't find "translation" in the gene page, I guess you opened one of the mRNA genbank record page, say, maybe you opened NM_005252 genbank record, in there, yes, the "translation" gives you the amino acid sequence.

5. What kind of sequence (mRNA, gDNA or cDNA) is under "CDS" of a gene?

This is rather a biology question than bioinformatics question. In biology point of view, coding sequence are portions of a gene that correspond to amino acid, but since is a part of a gene sequence, it should be DNA sequence in principle, however, bioinformatically, CDS as a joint of all exons can only be identified with mRNA and cDNA. Therefore, sequence-wise, CDS are same as mRNA and cDNA from start codon to stop codon, but CDS is actually an annotation term which must be combined with informations with information of intron and exon structure. You can find this within the genbank record of V01512.

Firstly, thank you alot for putting your time on me. I am grateful for that!

1: Which link should i now click on to get the mRNA of the fos gene?

I believe you need RefSeq of mRNA of the gene. There are two ways to do this on the page of fos gene:
first, use the gene structure map, this is the picture at the very begining of the fos gene entry showing the intron, exon, and 3'/5' UTR structure of the gene. Now, on left hand side of the picture, there is a NM_005252 link, click on it, javascript will popup a list with two entries: FASTA and GenBank. FASTA will give you the mRNA sequence, Genbank will give you the Genbank record of the mRNA. second, you can use the links in the "NCBI Reference Sequences (RefSeq)" section, click on NM_005252, it will give you the same information.

When I look for the mRNA of the human pituitary fos gene, do I have to make any other advanced search or does pituitary fos gene have the same mRNA sequence like any fos genes in other parts of the body, like no matter it is an intestine or pituitary fos gene?

2. Which link should i now click on to get the cDNA of the fos gene?

First, you should keep in mind, there are more than one cDNA sequence for this gene. Listed in the "Related Sequences" section of the record, you will see "genomic" and "mRNA" sequences, those "mRNA" sequences are actually cDNA sequences. The more complete view of all cDNA resources of a gene is to look into its UniGene link page, which is in the last section "Additional Links", click on UniGene Hs_25647, then in the "mRNA sequences (8)" section (8 sequences) you can see all the cDNAs associated with this gene, for example, full-length cDNA clone CS0DI066YO13 of Placenta Cot 25-normalized of Homo sapiens (human). As you can see, this resource is much more comprehensive because it provide tissue and disease information.

Why are there more than one cDNA sequence for this gene? For example I want to use cDNA of human pituitary Fos gene to design the primers, which one of these 8 cDNA sequences can I use as the template for designing?

So CDS of gDNA is the part where mRNA or cDNA come from? Can I use Blast to check for at which part of gDNA the mRNA comes from? For example I am going to find the exon-intron junctions of the pituitary fos gene, for doing this I have to compare the gDNA and cDNA sequences. Do you know which one of these gDNA is the gDNA of pituitary fos gene? Or does gDNA for human pituitary fos gene have the same sequence like in any parts of the body?

How can I see this? Is there any special labels for this?

I would like to know, since I have used for it. Do you mind telling me how to get the genomic of the human fos gene or another gene in the whole genomic sequencing context?

5. What kind of sequence (mRNA, gDNA or cDNA) is under "CDS" of a gene?

This is rather a biology question than bioinformatics question. In biology point of view, coding sequence are portions of a gene that correspond to amino acid, but since is a part of a gene sequence, it should be DNA sequence in principle, however, bioinformatically, CDS as a joint of all exons can only be identified with mRNA and cDNA. Therefore, sequence-wise, CDS are same as mRNA and cDNA from start codon to stop codon, but CDS is actually an annotation term which must be combined with informations with information of intron and exon structure. You can find this within the genbank record of V01512.

CDS: join (289..429,1183..1434,1866..1973,2088..2729)
The different sequences behind the “join” are they the exon sequences that will unite and make the mature mRNA?

Every human cell share the same genomic sequences, so gene sequence is the same no matter which part of the body. However, tissue-specific alternative splicing, alternative polyadenylation, and alternative transcription initiation are known mechanisms that contribute to the diversity of mRNA from the same gene. So the answer is no, you cannot assume the pituitary fos gene you are looking at have the same mRNA sequences comparing to those from the other part of a human body. You will need to read literature, and read the gene record that we discussed before for literature links and descriptions to get to know your gene better.

This is something in general to all biologists, you must be an expert to whatever you are studying, inside out, every details. Biologists will always debate with computer scientist and mathmatician, because in biology, you cannot assume YFG just have one form of mRNA, nor could you define a gene's behavior, you would have to keep an open mind and make hypothesis and do experiment or read other people's work to find it out.

Like I said before, in eukaryotes, alternative splicing, alternative polyadenylation, and alternative transcription initiation are known mechanisms that contribute to the diversity of mRNA from the same gene. So different group might study the same gene from different tissue or diseased states, and their cloned cDNA might thus have different sequences if there are tissue or disease specific regulation.

To design primers, depends on you goal, you should do it differently. If you know your isoform of mRNA/cDNA. Then you want to target to the specific exon in your isoform. If you don't know, want to fish for all isoforms, then design the primers target to the common sequence expressed in all isoforms. So, that being said, here is what I would do:
1. find out if the gene has evidence of alternative splicing or alternative polyadenylation. You can check out off the shelf database, such as ASD (alternative splicing database: http://www.ebi.ac.uk/asd/) and PolyA_DB (polyadenylation database: http://polya.umdnj.edu/). Or you can get all cDNAs of the gene, align them (use blast) to the genomic sequence, check if there are alternative splicing or alternative polyadenylation. Then find consititutive exons and alternative exons.

2. design primer according to your goal by targeting to either consititutive exons or alternative exons.

Once again, this is YFG, you got to know every detail about it.

This should be clear by now with the above two answers.

No, you just need to read the genbank id carefully see if it is part of the whole genome sequence effort or a BAC clone. You will need to read a bioinformatics book for this background information on human genomic sequencing project.

From the fos gene page, look at the gene picture at the top. Click on the NC_000014 link, this will give you the genomic sequence of the gene in a new page. Its a genbank format record, it tells you it displays the REGION: 74815284..74818666 of chromosome 14, which is where the gene is located, at the end you have the sequence. You can get the FASTA format sequence from the drop-down menu at the top of the page.

CDS: join (289..429,1183..1434,1866..1973,2088..2729)
The different sequences behind the “join” are they the exon sequences that will unite and make the mature mRNA?


Inhalt

The structures of both eukaryotic and prokaryotic genes involve several nested sequence elements. Jedes Element hat eine spezifische Funktion im mehrstufigen Prozess der Genexpression. The sequences and lengths of these elements vary, but the same general functions are present in most genes. [2] Although DNA is a double-stranded molecule, typically only one of the strands encodes information that the RNA polymerase reads to produce protein-coding mRNA or non-coding RNA. This 'sense' or 'coding' strand, runs in the 5' to 3' direction where the numbers refer to the carbon atoms of the backbone's ribose sugar. The open reading frame (ORF) of a gene is therefore usually represented as an arrow indicating the direction in which the sense strand is read. [7]

Regulatory sequences are located at the extremities of genes. These sequence regions can either be next to the transcribed region (the promoter) or separated by many kilobases (enhancers and silencers). [8] The promoter is located at the 5' end of the gene and is composed of a core promoter sequence and a proximal promoter sequence. The core promoter marks the start site for transcription by binding RNA polymerase and other proteins necessary for copying DNA to RNA. The proximal promoter region binds transcription factors that modify the affinity of the core promoter for RNA polymerase. [9] [10] Genes may be regulated by multiple enhancer and silencer sequences that further modify the activity of promoters by binding activator or repressor proteins. [11] [12] Enhancers and silencers may be distantly located from the gene, many thousands of base pairs away. The binding of different transcription factors, therefore, regulates the rate of transcription initiation at different times and in different cells. [13]

Regulatory elements can overlap one another, with a section of DNA able to interact with many competing activators and repressors as well as RNA polymerase. For example, some repressor proteins can bind to the core promoter to prevent polymerase binding. [14] For genes with multiple regulatory sequences, the rate of transcription is the product of all of the elements combined. [15] Binding of activators and repressors to multiple regulatory sequences has a cooperative effect on transcription initiation. [16]

Although all organisms use both transcriptional activators and repressors, eukaryotic genes are said to be 'default off', whereas prokaryotic genes are 'default on'. [5] The core promoter of eukaryotic genes typically requires additional activation by promoter elements for expression to occur. The core promoter of prokaryotic genes, conversely, is sufficient for strong expression and is regulated by repressors. [5]


Sequence variation

During the human chromosome 10 project we discovered 35,882 single nucleotide polymorphisms (SNPs) by sequence alignment in regions of clone overlaps. In total, we mapped 143,364 SNPs (dbSNP release 115) to the chromosome 10 sequence. Supplementary Fig. S1 shows the density plots for randomly discovered 24 and all SNPs across the chromosome.

There are 5,864 (4.1%) exonic and 65,973 (46%) intronic SNPs. Of the 1,821 SNPs in coding exons 984 are non-synonymous. MSMB has the most polymorphic coding region with 43 SNPs kb -1 it encodes a protein with inhibin-like activity and its expression is decreased in prostate cancer 25 .

We also considered 729,553 human–chimpanzee single base differences (SBDs) remapped on the current assembly of human chromosome 10. These were high-confidence sequence differences originally identified by aligning 14 million shotgun reads of the chimpanzee genome, generated jointly by the Whitehead Institute and Washington University Genome Centers, to the human genome sequence assembly (NCBI build 31). We first removed all human–chimpanzee SBDs that co-localized with known human SNPs. Supplementary Fig. S1 shows the density plot of the remaining 703,338 SBDs. Of those, 55.3% are intergenic, 42.9% intronic and 1.8% exonic. The highest density of human–chimpanzee SBDs, fourfold greater than the average level, was observed in a 200-kb gene-poor region at 19.43–19.63 Mb. We then examined the 12,710 human–chimpanzee SBDs that lie in exons of the 816 human coding genes. Of those, 3,972 were in coding regions and can be subdivided further into 2,273 synonymous, 1,678 non-synonymous and 21 nonsense with respect to the human sequence. For each gene we calculated the rate of evolution of non-synonymous (Kein) and synonymous (KS) changes, and the ratio Kein/KS, which provides a measure of evolutionary selection. Supplementary Table S5 lists the 1,413 transcripts with at least one coding human–chimpanzee SBD sorted on the Kein/KS Wert. There are only 29 transcripts (21 genes) that have a Kein/KS value ≥1, whereas there are 484 without non-synonymous SBDs. Note that several caveats apply in this type of analysis owing to the incomplete nature of both the chimpanzee data and the list of human SNPs we used the number of intronic human–chimpanzee SBDs per base in comparison to the chromosome average of 0.005 as a possible estimate of coverage. The gene with most non-synonymous human–chimpanzee SBDs is MKI67, an antigen identified by monoclonal antibody Ki-67, which appears to be fast evolving in humans (Kein/KS = 1.038507 SNP data). The expression pattern of MKI67 in gastric and other cancers is under investigation as this gene is expressed in proliferating cells. Interestingly, a nonsense human–chimpanzee SBD is present in both of its coding transcripts. Among the 21 genes with nonsense human-chimpanzee SBDs notable examples are the serotonin receptor HTR7 (the neurotransmitter serotonin is thought to be involved in cognition and behaviour), PSAP (prosaposin involved in variant Gaucher's disease and metachromatic leukodystrophy) and the developmental gene NODAL.


3.7 How to View and Retrieve Gene Product Sequences

To retrieve BBS1 gene product sequences (or any gene product sequence) from the UCSC genome browser, click on the schematic for the BBS1 transcript in the “Gene and Gene Predictions track”. The top half of the new page contains numerous links to pages that provide sequence information associated with this gene (Figure 3.16). For example, to view information specifically about the BBS1 mRNA, click on the NM_024649.5 link. To view information specifically about the protein sequence, click on the NP_078925.3 link. NM_024649.5 and NP_078925.3 are known as accession codes. Accession codes that begin with NM_ correspond to mRNA sequences. While those that begin with NP_ correspond to protein sequences. Both sequence pages are in so-called “Genbank format”. This format includes useful annotations that can be “read” by sequence analysis software programs. The mRNA or protein sequence is at the very bottom of the page. Scroll down. Alternatively, click the “FASTA” link to see the sequence in a simpler format. One thing you might notice: There are no uracil bases (U) in the mRNA sequence! Sequence databases do not expend any computational energy to convert thymines (T) to uracils (U) for display purposes only.

Finally, to get an overview of how BBS1 mRNA aligns with the genomic sequence, click on the “View details of parts of alignment within browser window”. Read the text to determine what highlighting means although you may be able to deduce their meaning.

Figure 3.16: When you click on a gene/transcript schematic in the gene prediction track you are taken to its gene information page. BBS1 only has one isoform and so there is only one gene information page. In other words, this information is transcript specific and depends on which isoform you click on. Useful links are highlighted. Some links will help you answer Test Your Understanding questions. Explore!

3.7.1 Test Your Understanding

  • List the first four nucleotides of the BBS1 mRNA according to the accession record, NM_024649.5 (Answer found in FASTA or Genbank format).
  • How long (in bp) is the BBS1 spliced transcript (mRNA) according to the accession record, NM_024649.5 (Answer found in Genbank format only)?
  • List the first four amino acids of the BBS1 protein according to the accession record, NP_078925.3 (Answer found in FASTA or Genbank format).
  • How long (in amino acids) is the protein according to the accession record, NP_078925.3 (Answer found in Genbank format only)?
  • In general, what is the difference between FASTA and Genbank formats?
  • EXTRA CREDIT. How long is the BBS1 unspliced transcript (the pre-mRNA)? (HINTS:You will find this information in the gene information page for BBS1 although you will not find the phrase “unspliced transcript” there. That said, the length of the unspliced transcript is equivalent to the length of the _______)

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Wissenschaft

Vol 314, Issue 5797
13 October 2006

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By Tobias Sjöblom , Siân Jones , Laura D. Wood , D. Williams Parsons , Jimmy Lin , Thomas D. Barber , Diana Mandelker , Rebecca J. Leary , Janine Ptak , Natalie Silliman , Steve Szabo , Phillip Buckhaults , Christopher Farrell , Paul Meeh , Sanford D. Markowitz , Joseph Willis , Dawn Dawson , James K. V. Willson , Adi F. Gazdar , James Hartigan , Leo Wu , Changsheng Liu , Giovanni Parmigiani , Ben Ho Park , Kurtis E. Bachman , Nickolas Papadopoulos , Bert Vogelstein , Kenneth W. Kinzler , Victor E. Velculescu

Wissenschaft 13 Oct 2006 : 268-274

Sequence analysis of >13,000 genes in breast and colorectal tumors shows that almost 200, a surprisingly large number, can be mutated, complicating any simple classification.


Mitgliedschaften

Interdisciplinary Centre for Bioinformatics, University of Leipzig, Haertelstraße 16-18, D-04107, Leipzig, Germany

Roman R Stocsits & Peter F Stadler

Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna, Währingerstraße 17, A-1090, Wien, Austria

Ivo L Hofacker & Peter F Stadler

Bioinformatics Group, Department of Computer Science, University of Leipzig, Haertelstraße 16-18, D-04107, Leipzig, Germany

Claudia Fried & Peter F Stadler

Santa Fe Institute, 1399 Hyde Park Rd., Santa Fe, NM, 87501, USA

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