Information

So identifizieren Sie Gene, die für die Biofilmbildung erforderlich sind

So identifizieren Sie Gene, die für die Biofilmbildung erforderlich sind



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Das ist nur eine Hausaufgabenfrage:

F: Nehmen wir an, es gibt einen unbekannten Satz von E. coli-Genen, die für die Biofilmbildung benötigt werden. Beschreiben Sie ein genetisches Experiment, mit dem Sie versuchen könnten, diese Gene zu identifizieren.

Die eine Idee, die mir einfällt, ist:

  • Vergleichen Sie Stämme, die Biofilm produzieren, mit Stämmen, die keinen Biofilm produzieren. Sequenzieren Sie Gene, finden Sie Unterschiede, unterbrechen Sie Gene in Biofilm-produzierenden Stämmen und bestätigen Sie, dass die Biofilmfähigkeit beeinträchtigt ist.

Gibt es einen besseren Ansatz als diesen?


Sie könnten verschiedene Dinge tun: Zuerst könnten Sie, wie Sie selbst sagen, die vollständigen Genome der Stämme aus einem Biofilm sequenzieren und diese mit einigen vergleichen, die keine Biofilme bilden. Dies kann Ihnen eine Vorstellung davon geben, welche Gene beteiligt sind, wenn sie im "Biofilm-Genom" vorhanden sind, im anderen jedoch nicht. Der Beweis wäre, diese Gene entweder durch Entfernen oder Mutieren oder durch Gen-Silencing-Techniken zu stören und zu sehen, was das Ergebnis ist.

Es ist auch möglich, dass nur eine Mutation in einem Gen, das in der Probe vorhanden ist, und dem Kontrollgenom den Unterschied macht. Dann würde eine ortsgerichtete Mutagenese helfen, die wichtigen Gene zu identifizieren.

Die zweite Möglichkeit ist, dass es keinen wirklichen Unterschied zwischen Probe- und Kontrollgenom gibt und der Unterschied für die Entwicklung eines Biofilms "einfach" in der Differenz der Genexpression liegt. Dann würde die Isolierung von RNA (entweder Gesamt- oder nur mRNA) helfen, beteiligte Gene zu finden. Wenn die Umgebung für die Entwicklung eines Biofilms ausschlaggebend ist, sollten Biofilm- und Kontrollzellen bei identischer Kultivierung keinen (oder fast keinen) Unterschied in ihren Genexpressionsprofilen aufweisen. Sie müssen dann die Genexpression für verschiedene Umweltbedingungen (einschließlich solcher, die die Entwicklung von Biofilmen begünstigen) testen, um beteiligte Gene zu finden.

Dieser Vergleich der verschiedenen Bedingungen liefert dann Gene, die in der Biofilmgruppe einzigartig oder stärker exprimiert sind, viele Gene, die in der Expression mit der Kontrollprobe vergleichbar sind, und einige Gene, die eine geringere Expression als die Kontrolle aufweisen. Es lohnt sich nun, sich die höher (oder einzigartig) und niedriger exprimierten Gene anzuschauen, ihre Funktion herauszufinden und sie dann zu mutieren, um ihre Funktion für die Bildung eines Biofilms zu überprüfen.

Zusätzlich besteht die Möglichkeit, dass das/die für die Biofilmbildung notwendige(n) Gen(e) auf einem extrachromosomalen Plasmid lokalisiert ist/sind. Ich würde auch die im Biofilm und der Kontrollprobe vorhandenen Plasmide überprüfen, sie (falls vorhanden) sequenzieren und sehen, welche Gene sie exprimieren. Die Funktion für die Biofilmbildung kann mit einer einfachen Transformation leicht getestet werden.


Ergänzung zu Chris' Antwort.

Wenn Sie keinen Stamm haben, der keinen Biofilm produziert, müssen Sie nach den Genen suchen, die an der Biofilmproduktion beteiligt sind (dies gilt für jeden Phänotyp).

In früheren Zeiten geschah dies durch Zufallsmutagenese mit Mutagenen wie EMS (Ethylmethansulfonat) oder UV. Heutzutage ist es möglich, eine Bibliothek gezielter Mutagene gegen jedes Gen aufzubauen, z.B. Bibliothek von CRISPR-Cas-Nukleasen.


Identifizierung von Streptococcus sanguinis-Genen, die für die Biofilmbildung erforderlich sind, und Untersuchung ihrer Rolle bei der Virulenz der Endokarditis

Streptococcus sanguinis ist einer der Pioniere bei der bakteriellen Besiedlung von Zähnen und eine der am häufigsten vorkommenden Arten im oralen Biofilm, dem Zahnbelag. S. sanguinis ist auch die häufigste Streptokokken-Art der Viridans-Gruppe, die an infektiöser Endokarditis beteiligt ist. Um die Assoziation von Biofilm und Endokarditis zu untersuchen, haben wir einen Biofilm-Assay etabliert und die Biofilm-Bildung mit einer Signatur-markierten Mutagenese-Bibliothek von S. sanguinis untersucht. Vier Gene, die zuvor bei keinem anderen Bakterium mit der Biofilmbildung in Verbindung gebracht wurden, purB, purL, thrB und pyrE, wurden mutmaßlich als Beitrag zur In-vitro-Biofilmbildung in S. sanguinis identifiziert. Bei der Untersuchung von 800 Mutanten auf Abschwächung im Kaninchen-Endokarditis-Modell und auf Verringerung der Biofilmbildung in vitro fanden wir einige Mutanten, die sowohl Biofilm-defekt als auch für Endokarditis abgeschwächt waren. Wir haben jedoch auch Mutanten mit nur reduzierter Biofilmbildung oder mit nur Abschwächung im Endokarditismodell identifiziert. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Fähigkeit, in vitro Biofilme zu bilden, nicht mit der Virulenz der Endokarditis in vivo in S. sanguinis verbunden ist.

Figuren

Untersuchung der Biofilmbildung durch…

Untersuchung der Biofilmbildung durch mutierte Stämme mit reduzierter Virulenz für Endokarditis. SK36…

Biofilmbildung durch Eltern und…

Biofilmbildung durch Eltern- und Mutantenstämme in verschiedenen Medien. SK36 und ausgewählt…

STM-Analyse von Biofilm-defekten Mutanten.…

STM-Analyse von Biofilm-defekten Mutanten. Ausgewählte Ergebnisse aus dem STM-Bildschirm von Signatur-Tagged…

Organisation des mutmaßlichen Biofilms…

Organisation der mutmaßlichen Biofilmgene unter oralen Streptokokkengenomen. Die Standorte und…


Pilus-Biogenese-Gene vom Typ IV und ihre Rolle bei der Biofilmbildung im biologischen Bekämpfungsmittel Lysobacter enzymogenes OH11

Pilus Typ IV (T4P) ist bei Bakterien weit verbreitet, sein Biogenesemechanismus und seine Funktionalität sind jedoch bei einer begrenzten Anzahl von Bakterienarten nur teilweise aufgeklärt. Hier berichteten wir unter Verwendung des Stamms OH11 als Modellorganismus über die Identifizierung von 26 T4P-Struktur- oder Funktionskomponentenproteinen (SFC) in gramnegativen Lysobacter enzymogenes, das ein biologisches Kontrollmittel ist, das möglicherweise die T4P-vermittelte zuckende Motilität für eine antimykotische Aktivität ausnutzt. Zwanzig solcher SFC-codierenden Gene wurden einzeln im Leserahmen herausgenommen, um eine T4P-SFC-Deletionsbibliothek zu erstellen. Durch kombinierte phänotypische und genetische Ansätze fanden wir, dass 14 solcher SFCs, die von vier Operons exprimiert wurden, für die zuckende Motilität essentiell sind. Zu diesen SFCs gehörten die kleineren Pilins (PilEich, PilXich, PilVich, und FimTich), das Anti-Retraktions-Protein PilY1ich, das Plattformprotein PilC, die Extensions-/Extraktions-ATPasen (PilB, PilT und PilU) und den PilMNOPQ-Komplex. Unter diesen ist die Mutation von pilT oder pilU verursachte eine Hyperpiliation, während die restlichen 12 SFCs für die Pilusbildung unentbehrlich waren. Zehn (FimTich, PilY1ich, PilB, PilT, PilU und der PilMNOPQ-Komplex) der 14 SFC-Proteine ​​sowie PilA spielen weiterhin eine Schlüsselrolle bei L. enzymogenes Biofilmbildung. Insgesamt liefern unsere Ergebnisse den ersten Bericht, der die genetische Grundlage der T4P-Biogenese und ihre Rolle bei der Biofilmbildung in . analysiert L. enzymogenes im Detail, die als alternative Plattform für die Untersuchung der T4P-Biogenese und ihrer antimykotischen Funktion dienen kann.

Dies ist eine Vorschau von Abonnementinhalten, auf die Sie über Ihre Institution zugreifen können.


2. C. albicans Biofilmentwicklung

Die meisten unserer Kenntnisse über C. albicans Die Biofilmbildung stammt aus der Untersuchung von Monospezies-Biofilmen, die in beiden charakterisiert wurden in vitro und in vivo Systeme und bestehen aus vier verschiedenen Entwicklungsphasen [9,11] ( Abb. 2). C. albicans Die Biofilmbildung beginnt mit der Adhäsion runder Hefezellen an eine feste Oberfläche (im Labor wird oft eine kleine Silikonscheibe, das Material üblicher intravaskulärer Katheter oder eine Polystyrol-Mikrotiterplatte verwendet). Typischerweise ist eine Kultur von C. albicans wird auf die feste Oberfläche gegeben, um die Adhäsionsphase (60� Minuten) zu initiieren, und nicht-adhärierte oder lose adhärierte Zellen werden dann weggewaschen, was zur Bildung einer basalen Schicht aus verankernden Hefezellen führt ( 2A ). Dieses Stadium wird oft als “seeding”-Schritt bezeichnet und ist für die normale Biofilmentwicklung unerlässlich. Die nächste Stufe der Biofilmentwicklung besteht aus der Zellproliferation und der frühen Filamentierung der anhaftenden Zellen ( 2B ). Darauf folgt die Reifung des Biofilms, was zu einem komplexen Netzwerk aus mehreren Schichten polymorpher Zellen führt, darunter Hyphenzellen (Ketten zylindrischer Zellen), Pseudohyphenzellen (ellipsoide Zellen, die Ende an Ende verbunden sind) und runde Hefezellen, die von einer extrazellulären Matrix umgeben sind , was dem Biofilm ein dickes und strukturiertes Aussehen verleiht und Schutz vor chemischen und physikalischen Verletzungen bietet (Abb. 2C). Ein reifer Biofilm bildet sich typischerweise nach 24 Stunden und kann mit dem Auge als trübe Oberflächenstruktur auf der festen Oberfläche und unter einem Mikroskop als organisierte Ansammlung verschiedener Zelltypen sichtbar gemacht werden. Während dieser Phasen der Biofilmentwicklung wird das Wachstumsmedium ständig geschüttelt, um zu verhindern, dass sich frei schwebende Zellen auf der Oberfläche absetzen, oder es fließt kontinuierlich über den Biofilm, um die in Kathetern üblichen Strömungsbedingungen nachzuahmen. Der letzte Schritt der Biofilmentwicklung wird als Ausbreitungsphase bezeichnet, bei der sich einige runde Hefezellen aus dem Biofilm ausbreiten, um neue Stellen zu säen (Abb. 2D). Dies ist die am wenigsten untersuchte Phase von C. albicans Entwicklung von Biofilmen. Mehrere Modelle von in vitro C. albicans Biofilmbildung wurde berichtet, und Studien konzentrierten sich auf die Analyse der Auswirkungen verschiedener Arten von Substraten, Nährmedien und des Vorhandenseins von Fließ- oder statischen Bedingungen auf die Biofilmentwicklung [14]. Im Labor, C. albicans Biofilme können sich auf mehreren verschiedenen Substraten und in vielen verschiedenen Arten von Medien entwickeln, was auf eine inhärente Robustheit der Biofilmentwicklung gegenüber einer Vielzahl von Umweltbedingungen hinweist.

C. albicans Lebenszyklus von Biofilmen. A. Haftung runder Hefezellen an einer Oberfläche. B. Initiierung der Biofilmbildung, bei der sich Zellen vermehren, um eine basale Schicht anhaftender Zellen zu bilden. C. Reifung des Biofilms, bei der sich komplexe Schichten polymorpher Zellen entwickeln und von einer extrazellulären Matrix umhüllt werden. D. Dispersion, bei der runde Hefezellen den reifen Biofilm verlassen, um neue Standorte zu säen.

Im Allgemeinen, C. albicans in vitro Die Biofilmbildung korreliert gut mit in vivo und Ex-vivo Biofilm-Modellen folgen sie in Entwicklungsphasen einem ähnlichen zeitlichen Verlauf und erscheinen auch architektonisch ähnlich zu Biofilmen, die von Patienten mit Infektionen gewonnen werden. Zum Beispiel, Kandidat Biofilme von Patienten mit Prothesen-Stomatitis und von Patienten mit infizierten intravaskulären Kathetern bestätigen das Vorhandensein von Hefen, Hyphen und extrazellulärer Matrix [1]. Einer der Vorteile von in vivo Modelle ist die Möglichkeit zu studieren C. albicans Biofilmbildung in Gegenwart des Immunsystems des Wirts, was zusätzliche mechanistische Einblicke in die Wirt-Pathogen-Interaktionen liefern kann. Die Biofilm-Architektur in zentralvenösen Kathetermodellen von Ratten und Kaninchen, Modellen für Verweil-Harnkatheter und Stomatitis-Modellen für Rattenprothesen ähneln ebenfalls der in vitro Biofilmstruktur, einschließlich zahlreicher Hefezellen in der Basalregion und Hyphen und extrazelluläre Matrix, die sich durch den gesamten Biofilm erstrecken [15�]. Vaginalschleimhaut in vivo Mausmodelle (Vaginalschleimhaut beimpft mit C. albicans bei lebenden Mäusen) und Ex-vivo Modelle (Vaginen, die aus euthanasierten Mäusen entnommen wurden, die mit C. albicans in Gewebekulturplatten) zeigen auch ähnliche Biofilmarchitekturen mit Hefezellen, Hyphen und extrazellulärer Matrix, die überall in den Biofilmen sichtbar sind und auf Schleimhautschichten gebildet werden [18]. Andere Tiermodelle zur Überwachung der Biofilmbildung umfassen Mundschleimhaut-, Oropharyngeal-, subkutane und Verbrennungswundenmodelle von Nagetieren [19,20]. Die Entwicklung neuerer Modellsysteme ist im Gange und wird uns dabei helfen, den zeitlichen und räumlichen Verlauf von Biofilminfektionen bei lebenden Tieren mittels Biolumineszenz-Bildgebung zu visualisieren. Kürzlich wurde beispielsweise ein Codon optimiert C. albicans Luciferase Bioreporter wurde in einem vulvovaginalen Candidiasis-Modell verwendet, um die Biofilmbildung im Vaginallumen in Echtzeit zu beobachten [21]. Sonstiges C. albicans biolumineszierende Biofilmmodelle umfassen oropharyngeale, kutane, subkutane und implantierte Kathetermodelle [22,23].


Die Rolle von Mss11 in Candida albicans Biofilmbildung

Candida albicans ist ein opportunistischer Humanpathogen, der auf biotischen oder inerten Oberflächen wie Epithel und klinischen Geräten einen Biofilm bilden kann. In dieser Studie untersuchen wir die Bildung von C. Albicans Biofilm durch Etablierung eines wichtigen Gen-zentrierten Netzwerks basierend auf Protein-Protein-Interaktion (PPI) und Genexpressionsdatensätzen. Ab C. Albicans Cph1 und Efg1, Transkriptionsfaktoren, die mit der Morphogenese der Biofilmbildung assoziiert sind, ein Netzwerk, das den komplexen zellulären Prozess aufklärt und potenziell unbekannte Komponenten im Zusammenhang mit der Biofilmbildung vorhersagt. Anschließend analysierten wir die Funktionen von Mss11 unter diesen identifizierten Proteinen, um die Effizienz des vorgeschlagenen Computeransatzes zu testen. MSS11-deletierte Mutanten wurden mit einem Wildtyp-Stamm verglichen, was darauf hindeutet, dass die Mutante bei der Bildung eines reifen Biofilms defekt ist und die Virulenz von . teilweise abschwächt C. Albicans in einem infizierten Mausmodell. Schließlich wurde eine DNA-Microarray-Analyse durchgeführt, um die potenziellen Zielgene von zu identifizieren C. Albicans Frau11. Die Ergebnisse dieser Studie klären komplexe Gen- oder Proteininteraktionen während des Biofilmbildungsprozesses von C. Albicans, die die Anwendung eines systembiologischen Ansatzes zur Untersuchung der Pilzpathogenese unterstützt.

Dies ist eine Vorschau von Abonnementinhalten, auf die Sie über Ihre Institution zugreifen können.


Methoden

Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen

Die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme sind in Tabelle S1 aufgeführt. Gefriervorräte wurden in 25 % Glycerin bei –80 °C gelagert.

Bakterien wurden in Hirn-Herz-Infusions-(BHI)-Brühe, modifiziertem M9-Medium mit Hefeextrakt und Glucose (MM9-YEG), 74 tryptischer Sojabrühe ohne Dextrose (TSB-D)-Wachstumsmedium oder Lysogenie-Brühe (LB, für Proteinüberexpression) kultiviert ). Agar (1% w/v) wurde für feste Medien zugegeben und Gelatine (3% w/v) wurde, wo angegeben, zugegeben. Zur Selektion wurden Antibiotika in folgenden Konzentrationen verwendet: Chloramphenicol (10 µg/ml), Erythromycin (20 µg/ml), Fusidinsäure (25 µg/ml), Gentamicin (100 µg/ml), Kanamycin (50 µg/ml) , Spectinomycin (250 μg/ml) und Tetracyclin (5 μg/ml). Bei Bedarf für die Induktion wurde das Pheromonpeptid cCF10 bis zu einer Endkonzentration von 10–50 ng/ml zugegeben. Antibiotika und Gelatine wurden von Sigma bezogen. Wachstumsmedienkomponenten wurden von Difco bezogen.

Plasmide und Oligonukleotide

In dieser Studie verwendete Plasmide und Oligonukleotide sind in Tabelle S1 aufgelistet. Oligonukleotide wurden von Invitrogen gekauft. Die PCR wurde unter Verwendung von PfuUltra II Fusion HS DNA-Polymerase (Agilent Genomics) durchgeführt. Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs bezogen. Alle Konstrukte wurden mittels Sanger-Sequenzierung (Eurofins) bestätigt. Plasmide wurden in chemisch kompetente . transformiert E coli zur Vermehrung und Proteinüberexpression, und Elektroporation wurde verwendet, um Plasmide in E. faecalis.

Überexpressionskonstrukte zur Proteinreinigung wurden durch Fusionieren bph Varianten des C-terminalen Hexahistidin (H6)-Tags, das auf dem pET28b+-Vektor kodiert ist. bph denen das native Stoppcodon fehlte, wurde unter Verwendung der Primer JW109/JW110 amplifiziert. Amplikons, die die Mutationen Y85A, N87A und D105A kodieren, wurden unter Verwendung von Megaprimern erzeugt. Die erste PCR wurde mit JW110 und einem Oligonukleotid mit der gewünschten Mutation (Y85A, JW115 N87A, JW116 D105A, JW117) mit genomischer OG1RF-DNA als Matrize durchgeführt. Diese Produkte wurden in einer zweiten Reaktion verwendet, um das Allel voller Länge mit JW109 zu amplifizieren. Die W70A-Mutation wurde unter Verwendung der überlappenden Verlängerungs-PCR konstruiert. Zwei Produkte wurden aus genomischer OG1RF-DNA unter Verwendung der Oligopaare JW109/JW130 und JW114/JW110 amplifiziert und in einer weiteren Reaktion mit den Primern JW109/JW110 gemischt. Alle Allele voller Länge wurden mit NcoI-HF/XhoI verdaut und an pET28b+ ligiert.

Der markerlose Deletionsstamm Δbph wurde unter Verwendung von Allelaustausch und Gegenselektion, wie zuvor beschrieben, 75 erzeugt, wobei die ersten und letzten drei Codons des intakt blieben bph offener Leserahmen. Das Konstrukt für den Allelaustausch (pJW270) wurde durch die Amplifikation von flankierenden Genomregionen erzeugt bph mit Oligos JW133/134 bzw. JW135/136. PCR-Produkte wurden mit EcoRI-HF verdaut, ligiert, dann mit BamHI-HF/SphI-HF verdaut und an pCJK218 75 ligiert, das mit den gleichen Restriktionsenzymen behandelt wurde. Die Deletion wurde durch PCR und Sequenzierung bestätigt.

Ein Tetracyclin-resistentes Derivat des Pheromon-induzierbaren pCIE-Vektors 76 wurde konstruiert, indem die Chloramphenicol-Resistenzkassette durch ein SpeI/EcoRI-flankiertes Fragment ersetzt wurde, das tetM um pCIE-tet (pJW8) zu erzeugen. Die Multiklonierungsstelle von pCIE-tet wurde durch eine Oligonukleotidkassette (JW29/30) ersetzt, die einzigartige BamHI/HincII-SalI/EcoRV/PvuI/NheI Restriktionsenzymstellen codiert, was zu pCIEtm (pJW76) führte. Die volle Länge bph Allel und native Ribosomen-Bindungsstelle wurden aus genomischer DNA unter Verwendung von JW163/93 amplifiziert. Die bph Punktmutanten (W70A, Y85A, N87A, D105A) wurden im pCIEtm-Rückgrat unter Verwendung von Megaprimern konstruiert, wie oben für die pET28b+-Konstrukte beschrieben, außer dass der Rückwärtsprimer in der ersten PCR JW93 war, der Vorwärtsprimer in der zweiten PCR war JW163 und die zweite PCR wurde mit dem Wildtyp durchgeführt bph Ausdruckskonstrukt als Vorlage. Megaprimer-PCRs wurden mit DpnI behandelt, um Matrizen-DNA zu entfernen. Alle PCR-Produkte wurden mit BamHI-HF/PvuI-HF verdaut und an pJW76 ligiert.

Generierte Tn-Bibliotheken in Arrays

Die Array-Tn-Bibliothek wurde von einer zuvor generierten Array-Bibliothek abgeleitet, die als gefrorene Vorräte in 2D-Barcoderöhrchen (Micronic) am University of Minnesota Genomics Center aufbewahrt wurde. Mutanten mit Tn-Insertionen in Genen, die als hypothetisch/unbekannt (n = 1052) oder in intergenischen Regionen (n = 894) wurden zusammen mit 11 Kontrollmutanten für die Aufnahme in diese Bibliothek ausgewählt. Einzelne Klone wurden unter Verwendung eines automatisierten XL20-Röhrchen-Handlers (BioMicroLab) erhalten und in 96-Well-Platten, die BHI/10% Glycerin enthielten, inokuliert. Die Stammkulturen der Bibliothek wurden über Nacht gezüchtet und bei –80 °C eingefroren. Die vollständige Liste der Mutanten in der Bibliothek ist in den ergänzenden Daten 1 enthalten.

Biofilm- und Attachment-Assays

Der Biofilm-Screen der angeordneten Tn-Bibliothek wurde wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. 23,25,77 Alle Inkubationen wurden bei 37 °C in einer statischen befeuchteten Kammer durchgeführt. Ein replizierender Stift (Boekel Scientific) wurde verwendet, um 96-Well-Platten, die 100 &mgr;l frisches TSB-D enthielten, mit den gefrorenen Array-Tn-Bibliotheksstämmen zu beimpfen, und diese Platten wurden über Nacht gezüchtet. Am nächsten Morgen wurde der Replikationsstift verwendet, um Inokulum von Übernachtkulturen auf 96-Well-Platten zu übertragen, die 100 &mgr;L frisches TSB-D enthielten, die 6 h bei 37 °C inkubiert wurden. Gleichzeitige Kontrollexperimente wurden in einer separaten Platte durchgeführt. Ein Modulus-Mikroplattenlesegerät (Turner Biosystems) wurde verwendet, um die optische Dichte bei 600 nm (OD600) und planktonische Kulturen wurden dann entfernt. Die Platten wurden dreimal mit bidestilliertem Wasser unter Verwendung eines Plattenwaschgeräts (Biotek) gewaschen, getrocknet und mit 100 &mgr;l Safranin (0,01% w/v) gefärbt. Überschüssiges Safranin wurde durch dreimaliges Waschen der Platte mit bidestilliertem Wasser entfernt. OD450 wurde gemessen, um mit Safranin gefärbtes Biofilmmaterial zu quantifizieren, und die Biofilm-Indexwerte wurden als Verhältnis von Safranin-gefärbtem Material zur Zelldichte (OD450/OD600) normalisiert auf den von OG1RF produzierten Biofilm. Alle anderen Biofilm-Assays wurden wie oben beschrieben unter Verwendung von Übernachtkulturen, die in TSB-D plus Antibiotika und cCF10 gezüchtet wurden, durchgeführt, und die Platten wurden in einer Verdünnung von 1:100 angeimpft.

Mutanten mit negativen Biofilm-Indexwerten wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Andere OG1RF_10987- und OG1RF_11802-Mutanten wiesen in diesem Screen keinen reduzierten Biofilm auf, und für die OG1RF_11756-Tn-Mutante an Position 183636 wurde ein allgemeiner Wachstumsdefekt beobachtet des Transposase enthaltenden Plasmids, das bei der Generierung der Bibliothek verwendet wurde. Eine dritte OG1RF_10435-Tn-Mutante in der Array-Bibliothek enthält eine Insertion von 82,9% in das Gen und hatte eine reduzierte Biofilmproduktion im 6-h-Biofilm-Screen (Ergänzende Daten 2). Es war uns jedoch nicht möglich, einen Erythromycin-empfindlichen Klon dieser Mutante zu isolieren, sodass er von der weiteren Analyse ausgeschlossen wurde.

Um die Anhaftung an Mikrotiterplatten zu messen, werden 1-ml-Aliquots von entweder Übernachtkulturen (für Tn-Mutanten) oder Log-Phase-Kulturen, die aus über Nacht gezüchteten Stämmen subkultiviert wurden (für bph Komplementation) wurden in einer Tischzentrifuge (9615 × g für 1 min), mit 1 Volumen Kaliumphosphat-gepufferter Kochsalzlösung (KPBS) gewaschen, in 100 &mgr;l KPBS resuspendiert und auf eine 96-Well-Platte gegeben, die 1 h bei 37 °C inkubiert wurde. Zelldichte (OD600), angeheftete Biomasse (OD450) und Anhangsindexwerte (OD600/OD450) wurden wie für Biofilm-Assays beschrieben gemessen.

Die Befestigung an Schweineherzklappen wurde wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. 36,37 Schweine wurden für andere Zwecke im Labor für experimentelle Chirurgie an der University of Minnesota getötet (Protokollnummer 1803A35699, genehmigt vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Minnesota). Die Herzen wurden sofort ausgeschnitten und in gekühlte Kochsalzlösung gelegt, und die Klappen wurden innerhalb von 24 Stunden nach dem Töten des Tieres entfernt. Ventilstücke wurden unter Verwendung eines 6 mm Stanzbiopsiewerkzeugs (Acuderm Inc.) erhalten und auf eine 24-Well-Platte (Corning) übertragen, die 2 ml DMEM/5% FBS/gent100 enthielt. Nicht sofort verwendete Ventile wurden bei –80 °C in DMEM/5% FBS/gent100, ergänzt mit 10% DMSO, eingefroren. Vor der Verwendung wurden die Ventile über Nacht in DMEM/5 % FBS/gent100 bei 37 °C/5 % CO . inkubiert2, 3 × in KPBS gewaschen und in eine 48-Well-Platte mit 1 ml DMEM (1 Ventilstück pro Well) gegeben. Die Wells wurden mit 5 × 10 7 Bakterien beimpft und bei 37 °C/5% CO . inkubiert2 für 3 h, danach wurden die Ventile 3 × in KPBS gewaschen und in konische 15 ml-Röhrchen mit 5 ml KPBS überführt. Die Proben wurden mit einem QSonica Q500 Beschallungsgerät (1,6 mm Spitze, 20 % Amplitude, 10 s an/20 s aus für insgesamt 2 min Pulszeit) beschallt, um gewebeassoziierte Bakterien zu entfernen, und Aliquots wurden in KPBS verdünnt und plattiert, um aufzuzählen KBE/ml. Um die Ventilgröße zu kontrollieren, wurden die CFU/ml-Werte auf das Gewicht jedes Ventilstücks normalisiert. Wir bestätigen, dass wir bei diesen Experimenten alle ethischen Vorschriften eingehalten haben.

CPRG-Assay

Die Stämme wurden über Nacht in TSB-D, ergänzt mit Erythromycin, gezüchtet und auf OD . verdünnt600 = 0,05 in frischem Medium mit Erythromycin und 25 µg/ml CPRG. Die Kulturen wurden statisch bei 37 °C inkubiert. Die Zelldichte wurde bei OD . gemessen630, und die CPRG-Hydrolyse wurde als OD . quantifiziert570 des Kulturüberstands nach Entfernung der Zellen durch Zentrifugation (17.000 × g für 2 Minuten). Das Verhältnis von OD570/630 wurde aufgetragen, um die Hydrolyse relativ zum Zellwachstum zu bewerten.

Gelatinase-Assays

Die Kulturen wurden über Nacht in TSB-D gezüchtet und auf TSB-D-Agarplatten, ergänzt mit 3% Gelatine (w/v), getüpfelt. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C für das Koloniewachstum und dann bei 4 °C für die Zonenentwicklung inkubiert. Die Platten wurden auf einem FluorChem FC3-Imager von ProteinSimple Cell Biosciences abgebildet. Stämme wurden als Gelatinase-positiv angesehen, wenn sich um die Kolonie eine undurchsichtige Zone entwickelte.

EDNA- und Polysaccharid-Aufreinigung

eDNA wurde aus Kulturen wie zuvor beschrieben 16 mit Modifikationen geerntet. Übernachtkulturen wurden 1:50 in frischem Medium plus Antibiotika und cCF10 verdünnt und 4 h gezüchtet. 1 ml Zellen wurden durch Zentrifugation (17.000 × ) pelletiert g für 2 min) und die Überstände wurden durch einen 0,22 µm Spritzenfilter geleitet. DNA wurde unter Verwendung von Isopropanol und Ethanol präzipitiert und in 10 mM Tris-HCl pH 8,0 resuspendiert. Doppelsträngige DNA wurde mit dem Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Die Kulturen wurden verdünnt und ausplattiert, um CFU/ml zu quantifizieren, und die Werte wurden als Fluoreszenz pro CFU/ml ausgedrückt.

Polysaccharide wurden wie zuvor beschrieben isoliert, 25 unter Verwendung von nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und unter Verwendung von Stains-All (Sigma) gefärbt. Die gezeigten Bilder sind repräsentative Bilder aus drei unabhängigen Experimenten. Die Gele wurden in Graustufen auf einem BioRad Gel Doc EZ Imager abgebildet.

Proteinexpression und -reinigung

pET28b+-Derivate, die Bph-H6-Varianten kodieren, wurden transformiert in E coli BL21 (DE3) Zellen und in LB/Kanamycin gezüchtet. Die Kulturen wurden bei 37 °C auf einem Innova 2300-Plattform-Bodenschüttler (New Brunswick Scientific) bei 150 U/min bis zu einer OD . gezüchtet600 von 0.4–0.6, zu welchem ​​Zeitpunkt 1.5 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zugegeben wurde, um die Proteinexpression für 3 h zu induzieren. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet (6371 × g für 10 min) und in Lysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,01 % Triton X-100, 20 mM Imidazol, 100 µg/mL Lysozym, 1 mM PMSF, 10 U/mL DNase) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Beschallung in einem Eisbad unter Verwendung eines QSonica Q500 Beschallers (1,6 mm Spitze, 40% Amplitude, 10 s an/20 s aus für insgesamt 2 min Pulszeit) aufgebrochen und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation pelletiert (30.000 × g für 15 Minuten). Die Überstände wurden in Röhrchen mit vorgewaschenem Nickel-NTA-Harz (Qiagen) überführt und unter Rotation bei 4 °C inkubiert. Das Harz wurde 3 × mit Waschpuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,01 % Triton X .) gewaschen –100, 20 mM Imidazol) und Proteine ​​wurden eluiert (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 250 mM Imidazol). Die Fraktionen wurden mit Tris-Glycin SDS-PAGE auf Reinheit analysiert und gegen 2 L Puffer mit Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl dialysiert. Proteine ​​wurden bei –20 °C in Dialysepuffer plus 50 % Glycerin (v/v) gelagert.

Strukturvorhersagen und Phosphatase-Assays

Die Bph-Aminosäuresequenz wurde als Eingabe für Phyre2 55 und PaperBLAST verwendet. 57 Hochkonfidenz-Alignments wurden in Pymol importiert. 78 Alle Strukturbilder wurden mit Pymol erstellt. Für In-vitro-Phosphatase-Assays wurden gereinigte Bph-H6-Varianten (1 μM) mit den angegebenen Substraten (100 μM) in einer 96-Well-Platte mit 100 μL Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl und 10 mM des angegebenen zweiwertigen Metallkations) pro Vertiefung. Die Reaktionen wurden 1 h bei 37 °C inkubiert. 4,2% Ammoniummolybdat in 4 M HCl und 0,045% Malachitgrün (jeweils 20 ul) wurden zu jeder Vertiefung gegeben, gefolgt von 1,4 ul 1% Triton. Absorption bei 640 nm (EIN640) wurde mit einem BioTek Synergy H1-Plattenlesegerät gemessen. EIN640 die Werte wurden auf Kontrollen nur mit Substrat normalisiert und freies Phosphat wurde relativ zu einer Standardkurve quantifiziert. Die Experimente mit Bph-H6-Punktmutanten und zweiwertigen Kationen wurden parallel durchgeführt, so dass die Kontrollreaktionen gleich sind.

Zellfraktionierung, Proteinelektrophorese und Western Blots

Zur Herstellung von Proteinlysaten von E. faecalis, Übernachtkulturen wurden auf eine OD . verdünnt600 von 0,05 in frisches Medium und inkubiert bei 37 °C (46 °C für die Ace-Proteinexpression). Zu den in Fig. 4a angegebenen Zeitpunkten entspricht das Äquivalent von 1 ml Zellen bei OD600 = 1,0 wurde in einer Tischzentrifuge pelletiert (9615 × g für 2 Minuten). Western-Blots wurden mit Proben durchgeführt, die nach 2 und 4 h geerntet wurden, und Pro-Q Diamond-Färbung wurde an Proben durchgeführt, die nach 4 h geerntet wurden. Pellets wurden in 100 &mgr;l Puffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 25 % Saccharose, 15 mg/ml Lysozym) resuspendiert und bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert. Diese Suspension wurde direkt mit 2× Laemmli Probenpuffer (BioRad) für Ganzzelllysate gemischt oder zentrifugiert (17.000 × g für 1 min), um das Pellet (Protoplast) vom Überstand (Zellwandextrakt) zu trennen. Im Kulturüberstand sekretierte Proteine ​​wurden durch Mischen von 1 Volumen Überstand mit 0,25 Volumen gekühlter 100 % Trichloressigsäure auf Eis ausgefällt. Ausgefällte Proteine ​​wurden in einer 4 o C Tischzentrifuge (17.000 × ) pelletiert g 10 min) und zweimal mit Aceton gewaschen. Die Pellets wurden getrocknet und in Harnstoff-Lysepuffer (8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) resuspendiert. Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE unter Verwendung von 10 % Tris-Glycin-Gelen analysiert. Die Proben wurden mit 2 × Laemmli-Puffer gemischt und vor dem Laden auf 95 °C erhitzt. Die Gele wurden bei 110 V laufen gelassen, mit Coomassie gefärbt, entfärbt und auf einem BioRad Gel Doc EZ Imager abgebildet.

Der Phosphoprotein-Nachweis wurde mit dem Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain (ThermoFisher Scientific) durchgeführt. Ganzzelllysate wurden in unbehandelte und behandelte Fraktionen aufgespalten, die nach Herstellerangaben mit Chloroform und Methanol behandelt wurden. Die Proben wurden durch SDS-PAGE getrennt, gefärbt und unter Verwendung eines zuvor beschriebenen modifizierten Protokolls entfärbt. 79 Bilder wurden unter Verwendung des 600-nm-Kanals auf einem Licor Odyssey FC Imaging System (LI-COR Biosciences) aufgenommen. Das Gel wurde dann mit Coomassie gefärbt und abgebildet.

Für Western Blots wurden Proteine ​​unter Verwendung von Towbin-Puffer (0,05% SDS, 5–20% Methanol) auf Nitrozellulosemembranen (Protran, Sigma-Aldrich) übertragen. Membranen wurden unter Verwendung von 1 % Milch, gelöst in KPBS, ergänzt mit 0,01 % Tween-20 (KPBST, pH 7,4), blockiert. Primäre Antikörper (1:20.000 Anti-Ace und Anti-SA80, 1:10.000 Anti-EbpC und Anti-PrgB) und Sekundärantikörper (1:20.000 Meerrettichperoxidase (HRP)-Ziege-Anti-Kaninchen, Invitrogen #65-6120) wurden in KPBST verdünnt. Das Signal wurde unter Verwendung des Chemilumineszenzsubstrats SuperSignal West Pico (Thermo Scientific) entwickelt, und Bilder wurden unter Verwendung des Chemilumineszenzfilters auf einem Licor Odyssey FC Imaging System erhalten. Unbeschnittene Western-Blots sind in den ergänzenden Fig. 1 und 2 gezeigt. 6–9. Alle Proben für einen gegebenen Western-Blot wurden aus demselben Experiment gewonnen und parallel verarbeitet.

Massenspektrometer

Übernachtkulturen wurden in frischem Medium verdünnt und 4 h kultiviert, an welchem ​​Punkt Zelllysate wie oben beschrieben für die Gelelektrophorese hergestellt wurden. Gelschnitte wurden aus Coomassie-gefärbten Tris-Glycin-SDS-PAGE-Gelen mit einer Rasierklinge ausgeschnitten und an das University of Minnesota College of Biological Sciences Center for Mass Spectrometry and Proteomics zur In-Gel-Trypsinverdauung und proteomischen Analyse durch LC/MS . gesendet –MS auf einem LTQ Orbitrap Velos Massenspektrometer. Alle MS/MS-Proben wurden mit Sequest (nur XCorr) (Thermo Scientific, Version IseNode in Proteome Discoverer 2.2.0.388) analysiert, um zu suchen E. faecalis OG1RF-Proteine ​​unter Annahme des Verdauungsenzyms Trypsin mit einer Fragment-Ionen-Massentoleranz von 0,100 Da und einer Eltern-Ionen-Toleranz von 50 ppm. Gerüst (Version Scaffold_4.8.9, Proteome Software Inc.) wurde verwendet, um MS/MS-basiertes Peptid (>77,0% Wahrscheinlichkeit, FDR < 1,0% durch lokale Gerüst-FDR) und Protein (>97,0% Wahrscheinlichkeit, FDR < 1,0 .) zu validieren %, mindestens zwei identifizierte Peptide) Identifizierungen. Proteinwahrscheinlichkeiten wurden durch den Protein Prophet-Algorithmus zugewiesen. 80 Prozent der Gesamtspektren wurden zwischen OG1RF und . verglichenbph Proben, um die am häufigsten vorkommenden differentiell exprimierten Proteine ​​zu identifizieren.

Wachstumskurven und Antibiotika-Empfindlichkeitstests

Das Wachstum in mit Glucose oder Arginin ergänzten Medien wurde unter Verwendung eines zuvor beschriebenen halbsynthetischen Mediums durchgeführt. 52 Stämme wurden in TSB-D gezüchtet, pelletiert in einer Tischzentrifuge (9615 × g für 2 min) und in halbsynthetischem Medium gewaschen. Die Zellen wurden auf eine Start-OD . verdünnt600 0,05 in 200 μL Basismedium oder Medium ergänzt mit 1 % Glucose oder 1 % Arginin in einer 96-Well-Platte, die mit Microseal B PCR-Plattenversiegelungsfolie (Bio-Rad) versiegelt wurde. OD600 Messungen wurden in 15-Minuten-Intervallen für 15 Stunden in einem BioTek Synergy H1-Plattenlesegerät durchgeführt. Für antibiotische Sensitivitätsassays wurden Stämme in TSB-D gezüchtet und auf OD . eingestellt600 = 0,05 in 200 μl zweifacher Verdünnung von Antibiotika (höchste Konzentrationen: Cefoxitin, 512 μg/ml Oxacillin, 64 μg/ml) in einer 96-Well-Platte. 15 h Wachstumskurven wurden wie oben beschrieben durchgeführt und die Endung OD600 Wert für jede Bedingung wurde durch die OD . geteilt600 der unbehandelten Kultur.

Konjugation

Übernachtkulturen von Spendern und Empfängern wurden in TSB-D oder TSB-D/tet gezüchtet, 1:10 in frischem TSB-D ohne Antibiotika verdünnt und 1 h bei 37 °C inkubiert. Cells were mixed at a 1:9 donor:recipient ratio in a microfuge tube. At indicated time points, aliquots were removed, diluted in KPBS supplemented with 2 mM EDTA, and plated on selective antibiotic agar plates.

Microscopy

E. faecalis biofilms were grown on Aclar fluoropolymer substrates essentially as described previously. 15,24 Overnight cultures were diluted 1:50 in TSB-D medium supplemented with 50 ng/mL cCF10 and cultured for 6 h in a 24-well polystyrene plate (Corning) at 100 rpm on a MaxQ 2000 tabletop shaker (Thermo Scientific). Cells were stained with 10 μg/mL Hoechst 33342 (Molecular Probes/Thermo Fisher Scientific), and images were captured with a Zeiss AX10 wide-field microscope using Zen2 (blue edition) software with a ×20 0.8-numerical-aperture objective. Images were imported as grayscale and false-colored (LookUp Table: cyan) using Fiji 81 and cropped to 500 × 500 pixels using GIMP (https://www.gimp.org/).

Statistische Analyse

For experiments where numerical values are presented, individual data points from three independent biological replicates are shown. Error bars indicate standard error of the mean. Statistical significance was assessed using analysis of variance (ANOVA) with corrections for multiple comparisons by controlling the false discovery rate. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism. For assays where qualitative images are shown, experiments were performed in triplicate, and representative images are shown.


Advances in scientific research: In vitro und in vivo biofilm detection methods

Many in vitro and in vivo methods have been used for a better understanding of the biology of biofilms and their detection. Colorimetric assays are the most widely used ones and commonly applied in studies related to the development and susceptibility of biofilms to drugs and the quantification of specific biofilm structures (Shukla and Rao 2017 ). These methods, although requiring significant amounts of time and a high number of trained staff, are important allies in identifying biofilm formation and for a better understanding, mainly of the susceptibility of biofilms to anti-biofilms and antimicrobial compounds, which can assist in the development of new methods of diagnosis and treatment that can be useful in clinical practice (Qu et al. 2017). The main in vitro and in vivo tests used by the academic community are listed in Table 1 and described below.


Future perspective

We are only beginning to understand the biology of commensal bacteria such as S. epidermidis and their function in the maintenance of human health. Current microbiome studies will allow us to first understand and identify the ‘players’ that utilize the human skin as their ecological niche. It is unclear whether each species has a particular role in maintenance of and integrity of the skin structure or, possibly, immune development [2]. Second, the utilization of newer technologies will enable investigators to further probe each stage of biofilm formation to identify new strategies to inhibit biofilm formation on biomaterials. Many strategies, some very successful, have addressed inhibiting the initial adherence step of biofilm formation. Although vaccines against staphylococcal targets have proven to be problematic, multivalent vaccines against S. epidermidis should certainly target factors that are important for adherence to biomaterials. A virtually untapped area of staphylococcal biofilm research has been the identification of factors that are responsible for biofilm maturation. These maturation processes may include tower formation or the shift from a primarily aerobic metabolism to a microaerobic/anaerobic condition. It is hypothesized that inhibition of maturation may facilitate increased phagocytosis by the innate immune system or susceptibility to antibiotics. Newer technologies, such as laser capture microdissection microscopy, are needed to address the heterotypic nature of biofilms and study the single cell/regional response(s) to the nutrient and oxygen gradients that are generated by biofilms [123]. It is hypothesized that phenotypic variation is a byproduct of maturation and metabolic status of the biofilm. Importantly, future studies need to address the function/role of PIA-, Aap-, Bhp- or Embp-dependent S. epidermidis biofilms. Are all of these biofilms clinically relevant and recalcitrant to the innate immune system and the bactericidal action of antibiotics? Finally, further studies are required to address the interaction of PGA and other biofilm accumulation factors (PIA, Aap, Embp and Bhp) as the loss of PGA appears to dampen the anti-innate immune system properties of a PIA-dependent biofilm [7].

Executive summary

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus epidermidis is a commensal bacterium living on the skin of humans. It is a significant cause of biomaterial-related infections.

Biofilm synthesis is a primary virulence factor. Staphylococcal biofilm is recalcitrant to host innate immune response and antibiotic treatment therefore, treatment of S. epidermidis infections frequently requires removal of offending device.

Genome structure of S. epidermidis

The genomes of two S. epidermidis isolates have been sequenced, ATCC12228 and RP62A.

The genome sequence reflects the ecological niche (skin) of S. epidermidis by encoding genes related to osmoprotection.

Im Kontrast zu Staphylococcus aureus, S. epidermidis produces few virulence factors. Most are related to biofilm synthesis or resistance to host innate immune system.

Most clinical S. epidermidis isolates are part of a large clonal complex defined as CC2.

S. epidermidisbiofilm formation

Lack of virulence of S. epidermidis im Kontrast zu S. aureus may be related to ease of transmission from host to host.

Many virulence factors produced by S. epidermidis, including phenol-soluble modulins and the three-component antimicrobial peptide-sensing system, help to mediate resistance to the innate immune system.

Biofilm formation in staphylococci is typically viewed as a four-step mechanism: adherence, accumulation, maturation and detachment.

A factor complicating experimental analysis of S. epidermidis biofilm formation is that not all isolates encode factors demonstrated to augment biofilm formation, including icaADBC, aap, embp und bhp.

Adherence to biomaterials is mediated by both nonspecific and specific interactions. Specific adhesins include the bifunctional adhesins/autolysins AtlE/Aae and the MSCRAMM proteins SdrG, SdrF and Embp.

The best studied accumulation factor is polysaccharide intercellular adhesin (PIA) synthesized by gene products of the icaADBC Operon. icaADBC is transcriptionally regulated by multiple factors, demonstrating that PIA synthesis is tied to metabolic status of the bacterium.

S. epidermidis strains have also been isolated from clinically relevant infections that do not synthesize PIA, suggesting that other factors can replace PIA in the biofilm accumulation phase. Aap and Bhp are two identified proteins that can function in this role.

Little is known regarding the maturation phase of staphylococcal biofilm synthesis, but some data suggest that arginine catabolism is important. Phenotypic variation may be a by-product of biofilm maturation and tower formation.

Dispersal of both S. aureus und S. epidermidis biofilms is agr abhängig. Allerdings in S. epidermidis, dispersal is related to synthesis of phenol-soluble modulins and δ-toxin, whereas S. aureus dispersal is related to protease production.

Poly-γ-DL-glutamic acid

Poly-γ-DL-glutamic acid is a virulence factor not found in S. aureus that protects S. epidermidis against high salt concentrations in addition to mediating resistance to antimicrobial peptides and phagocytosis.


Hemmung von Pseudomonas aeruginosa Biofilm Formation by Traditional Chinese Medicinal Herb Herba patriniae

New antimicrobial agents are urgently needed to treat infections caused by drug-resistant pathogens and by pathogens capable of persisting in biofilms. The aim of this study was to identify traditional Chinese herbs that could inhibit biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa, an important human pathogen that causes serious and difficult-to-treat infections in humans. EIN luxCDABE-based reporter system was constructed to monitor the expression of six key biofilm-associated genes in P. aeruginosa. The reporters were used to screen a library of 36 herb extracts for inhibitory properties against these genes. The results obtained indicated that the extract of Herba patriniae displayed significant inhibitory effect on almost all of these biofilm-associated genes. Quantitative analysis showed that H. patriniae extract was able to significantly reduce the biofilm formation and dramatically altered the structure of the mature biofilms of P. aeruginosa. Further studies showed H. patriniae extract decreased exopolysaccharide production by P. aeruginosa and promoted its swarming motility, two features disparately associated with biofilm formation. These results provided a potential mechanism for the use of H. patriniae to treat bacterial infections by traditional Chinese medicines and revealed a promising candidate for exploration of new drugs against P. aeruginosa biofilm-associated infections.

Interessenkonflikt-Erklärung

The authors declare that they have no competing interests regarding the publication of this paper.

Figuren

Ausdrücke von algU , algA…

Ausdrücke von algU , algA , pslM, und bdlA in medium with water…

(a) Inhibition of biofilm production…

(a) Inhibition of biofilm production of PAO1 by H. patriniae extract. The control…

Photograph of exopolysaccharide production on…

Photograph of exopolysaccharide production on Congo red plates. (a) Without H. patriniae .…

Swarming motility of PAO1. (a)…

Swarming motility of PAO1. (a) PAO1 grown with H. patriniae was at right…


Zusätzliche Informationen

S1 Fig. Comparative analysis of becA-R biofilm gene cluster from B. mallei ATCC23344, B. pseudomallei 1026b, and B. thailandensis E264.

Die becA-R gene cluster from the sequenced genomes of B. mallei ATCC23344 (top), B. pseudomallei 1026b (middle), and B. thailandensis E264 (bottom). Genes for becA-R von B. pseudomallei 1026b, Bp1026b_I2907-Bp1026b_I2927 (becA-R) are aligned with BMA0027-BMA0048 from B. mallei ATCC and B. thailandensis E264 BTH_I0520-BTH_I0537. Coding sequences are depicted by arrows per positive or negative strand orientation and sizes of genes and intergenic regions are to scale. The results of BLASTN annotations with minimum identity of 60% and threshold E-value of 1E-3 are aligned to regions of similarity. Red bars depict sequence inversions and blue bars depict direct homology in a color density gradient.

S2 Fig. Comparative analysis of bce-I und bce-II gene clusters from B. pseudomallei und B. vietnamiensis G4.

The cepacian biosynthesis (bce-I und bce-II) gene clusters from the sequenced genomes of B. pseudomallei 1026b (top) and B. vietnamiensis G4 (bottom). (A) Genes for bce-I von B. pseudomallei 1026b, Bp1026b_II1966-Bp1026b_II1956 are aligned with Bcep1808_4200-Bcep1808_4210 from B. vietnamiensis G4. (B) Genes for bce-II von B. pseudomallei 1026b, Bp1026b_II1796-Bp1026b_II1807 are aligned with Bcep1808_4471-Bcep1808_4480 from B. vietnamiensis G4. Coding sequences are depicted by arrows per positive or negative strand orientation and sizes of genes and intergenic regions are to scale. The results of BLASTN annotations with minimum identity of 60% and threshold E-value of 1E-3 are aligned to regions of similarity. Red bars depict sequence inversions and blue bars depict direct homology in a color density gradient.

S3 Fig. Growth curves of B. pseudomallei 1026b biofilm mutants.

Overnight cultures were grown in LB and cultures were adjusted to a final OD600 0.1. Bacteria were grown at 37°C with shaking. Readings were taken every hour (A-D).

S1 Tabelle. Biofilm-defective transposon mutants identified in primary screen.

Columns presented are the old NCBI gene locus, new NCBI gene locus, K96243 gene locus, gene description as found in burkholderia.com [38], gene locus, and if the gene was noted to have increased gene expression in a recent transcriptomic study [66]. Gene loci in bold represent transposon mutants that are predicted to be the first gene in an operon and were studied in detail.

S2-Tabelle. Strains and plasmids used in the study.

S3 Table. Percent nucleotide and amino acid identities of the becA-R biofilm exopolysaccharide gene clusters from B. pseudomallei 1026b as compared to B. mallei ATCC2334, B. thailandensis E264, and B. cenocepacia J2315 exopolysaccharide gene clusters.

S4 Table. Percent nucleotide identity of the bce-I und bce-II gene clusters from B. pseudomallei 1026b compared to B. vietnamiensis G4, B. cenocepacia J2315, B. thailandensis E264, and B. mallei ATCC23344.

S5 Table. Veröffentlicht B. pseudomallei genes that contribute to biofilm formation.

The asterisk indicates that a transposon insertional mutant was identified in the screen described in the current study.


Schau das Video: Demo: Biofilm Formation (September 2022).