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Aufschlüsselung der Mutationsrate nach ursprünglichem und mutiertem Nukleotid für Coronaviridae

Aufschlüsselung der Mutationsrate nach ursprünglichem und mutiertem Nukleotid für Coronaviridae



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In einer Diskussion der Mutationen S:Q677H und S:Q677P bei SARS-CoV-2 wurde erwähnt, dass die zu diesem Ergebnis führenden Mutationen „gegen die Tendenz“ von bevorzugten Mutationen auf Nukleotidebene sind. Als allgemein bekannte Tatsache wurde auch festgestellt, dass die Mutationsrate von der ursprünglichen und der mutierten Base abhängt.

Daher würde ich gerne die Mutationsraten für alle möglichen Basenpaare in menschlichen Coronaviren wissen oder einen Hinweis darauf, wo ich sie nachschlagen kann. Eine weniger spezifische, aber dennoch anwendbare Referenz ist ebenso willkommen wie relative Mutationshäufigkeiten in einigen willkürlichen Einheiten.

EDIT als Antwort auf Kommentar von @David: Dies ist der relevante Teil eines Preprints von Hodcroft et al. oben auf Seite 5

Die Aminosäure Q ändert sich aufgrund einer Mutation an der Nukleotidposition 23593 zu H. Bemerkenswerterweise ändert sich in vier dieser sechs Abstammungslinien die Mutation von G zu U, während sie sich bei den anderen beiden von G zu C ändert ( 2B ). Im Gegensatz dazu tritt die S:Q677P-Variante aufgrund einer Änderung von A zu C an Position 23592 auf. Alle Mutationen, die zu Q677H oder Q677P führen, beinhalten Transversionen. Daher ist ihr spontanes Auftreten im Vergleich zu Übergängen im Allgemeinen ungünstig. In SARS-CoV-2-Proben von menschlichen Infektionen treten A-C- und G-C-Transversionen mit nur etwa 10 % der Häufigkeit von C-U-Übergängen auf, während G-zu-U-Mutationen häufiger vorkommen und halb so häufig auftreten wie C nach U (Wright, Lakdawala und Cooper, 2020) (Ratcliff und Simmonds, 2021).


Mutationssignaturen der Karzinogen-Exposition: genomweite Erkennung und neue Möglichkeiten der Krebsprävention

Die Exposition gegenüber umweltbedingten Mutagenen ist eine wichtige Ursache für Krebs beim Menschen, und Maßnahmen zur Verringerung mutagener und karzinogener Expositionen haben sich bei der Krebskontrolle als sehr erfolgreich erwiesen. Bis vor kurzem war es nur indirekt möglich, die chemischen Eigenschaften von Mutagenen mit tatsächlichen Mutationen in menschlichen Tumoren in Verbindung zu bringen. Die Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation ermöglicht es uns nun, die Auswirkungen bekannter Mutagene wie ultravioletter Strahlung und Tabakrauch auf DNA-Sequenzebene sowie endogener mutagener Prozesse, wie etwa der mit aktivierten DNA-Cytidindeaminasen ( APOBEC). Wir können auch die Wirkungen weniger bekannter, aber potenter Mutagene beobachten, einschließlich derer, die kürzlich in einigen pflanzlichen Heilmitteln gefunden wurden. Entscheidend ist, dass wir nun die überlagerten Effekte mehrerer Mutationsexpositionen und -prozesse auseinandernehmen und bestimmen können, welche während der Entwicklung einzelner Tumoren auftraten. Hier überprüfen wir die Fortschritte beim Nachweis dieser Mutationssignaturen und diskutieren die Auswirkungen auf die Überwachung und Prävention von Krebs. Die Zahl der sequenzierten Tumoren aus verschiedenen Krebsarten und mehreren geografischen Regionen wächst explosionsartig, und die Genome dieser Tumoren werden die Signaturen noch vielfältigerer mutagener Expositionen tragen. Daher stellen wir uns die Entwicklung umfassender Kompendien von Mutationssignaturen von Tumoren und eine konzertierte Anstrengung vor, um die Signaturen einer großen Anzahl von Mutagenen experimentell aufzuklären. Diese Informationen werden verwendet, um in Tumoren beobachtete Signaturen mit den für sie verantwortlichen Expositionen in Verbindung zu bringen, was beispiellose Möglichkeiten zur Prävention bietet.


Einführung

Der erste Fall der „Coronavirus-Krankheit 2019“ (COVID-19) wurde im Dezember 2019 in der chinesischen Stadt Wuhan identifiziert. Seitdem hat sich das neuartige Virus schnell in 188 Länder und Territorien ausgebreitet, mehr als 15 Millionen Menschen infiziert und über 0,6 Millionen Tote 1,2 . COVID-19-Patienten entwickeln ein „schweres akutes Atemwegssyndrom“ analog zu dem der SARS-Epidemie 2002-2003, die sich auf 23 Länder ausbreitete, 8.000 infizierte und 774 Menschen tötete. Das COVID-19-Virus wurde von der WHO als SARS-CoV-2 bezeichnet und ist das siebte Coronavirus, von dem bekannt ist, dass es Menschen infiziert 2,3 . Derzeit gibt es keine Impfstoffe oder antiviralen Medikamente, die Infektionen beim Menschen verhindern oder behandeln können 4 .

SARS-CoV-2 gehört zu den Betacoronavirus Gattung der Coronaviridae Familie, eine Gruppe verwandter behüllter einzelsträngiger RNA-Viren mit positivem Sinn, die sowohl Säugetiere als auch Vögel infizieren. Bei Hühnern verursachen Viren Erkrankungen der oberen Atemwege, bei Kühen und Schweinen Durchfall. Beim Menschen können Viren leichte bis tödliche Atemwegsinfektionen verursachen. Zum Beispiel verursachten die bekannten SARS-CoV-2-assoziierten SARS-CoV-1- und MERS-CoV-Coronaviren schwere Krankheiten bei den Zoonoseausbrüchen von 2002-2003 bzw. ab 2012 5–8 . Im Vergleich zu seinen Geschwistern breitet sich SARS-CoV-2 schneller aus, infiziert mehr Menschen und weist eine viel geringere Sterblichkeitsrate auf 1,9,10 .

SARS-CoV-2 hat ein Genom von ∼ 30 kb, das erstmals am 5. Januar 2020 8 gemeldet wurde. Das Genom kodiert sowohl für strukturelle als auch für nicht-strukturelle Proteine. Die Leader-Sequenz und ORF1ab kodieren nicht-strukturelle Proteine ​​(NSPs), die bei der Replikation und Transkription 11 funktionieren. Zusammen mit akzessorischen Proteinen werden die Strukturproteine ​​in den stromabwärts gelegenen Regionen des Genoms kodiert. Dazu gehören das Spike (S) Protein der viralen „Corona“, das Hüllprotein (E), das Membran (M) Protein und das RNA-bindende Nukleokapsid (N) Protein. Coronaviren infizieren menschliche Zellen, indem sie das homotrimere Spike-Glykoprotein, das als S-Protein bekannt ist, verwenden, um den Angiotensin-Converting-Enzym-2-(ACE2)-Rezeptor zu binden, der sich im Epithel der Lunge und des Dünndarms des Menschen befindet 12,13 . SARS-CoV-2 hat eine optimierte Rezeptorbindungsdomäne (RBD), die bei Mensch und Tier mit hoher Affinität an ACE2 bindet 14 . Eine hohe Rezeptorhomologie wurde durch eine Reihe von strukturellen und biochemischen Studien belegt 14–19 . Im Vergleich zu SARS-CoV zeigten S-Protein-Aminosäuren an den Positionen 455 (Leucin) und 486 (Phenylalanin) auf SARS-CoV-2 eine verstärkte Interaktion mit Hot Spot 31 und viraler Bindung an humanes ACE2 16 . Diese Studien testeten die Herkunft des Virus und stellten die Vermutung in Frage, dass SARS-CoV-2 eine künstlich entworfene Manipulation darstellt. Stattdessen entstand es wahrscheinlich als neuartiges rekombinantes Virus, das sowohl von Hufeisennasen als auch von Schuppentieren übertragen wurde 20 . Somit scheint die Übertragung auf und unter den Menschen ein Ergebnis der natürlichen Selektion zu sein 14–16,21 .

Daten zur viralen Genomsequenz wurden in Echtzeit von COVID-19-Patienten in erheblichem Tempo gesammelt. Bis zum 7. Mai 2020 sammelte die GISAID-Datenbank (https://www.gisaid.org/) 15.366 vollständige Sequenzen des menschlichen Coronavirus. Diese Daten boten Möglichkeiten, zu untersuchen, wann, wo und wie Mutationen im SARS-CoV-2-Genom auftreten. Die meisten Mutationsstudien haben sich bisher hauptsächlich auf das S-Protein konzentriert. Diese Studien zeigten, dass die RBD die variabelste Region ist, wobei mehrere RBD-Aminosäuren kritische ACE2-Rezeptor-Bindungsfunktionen aufweisen 8,14–16,22 . S-Protein-Mutationen passten die Bindung effizient an seinen humanen Rezeptor an. Im Gegensatz dazu wurden Mutationen in anderen Genomregionen selten untersucht. Neben dem bemerkenswerten S-Protein könnten Mutationen am N-Protein, das das Nukleokapsid herstellt, die Virulenz und Virusausbreitung verändern. Das N-Protein (50 kDa) kommt sowohl in Viren als auch in virusinfizierten Zellen am häufigsten vor und spielt mehrere Rollen bei der Replikation und Transkription des Virus sowie beim Zusammenbau des viralen Genoms 23 . Das N-Protein bindet an das virale RNA-Genom an seinem N-terminalen Ende und bildet einen Ribonukleoprotein-Komplex, der eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung einer funktionellen RNA-Konformation spielt 24 . Da es stark immunogen ist und eine normalerweise konservierte Aminosäuresequenz besitzt, ist das SARS-Cov-2-N-Protein ein optimales Ziel sowohl für diagnostische Assays als auch für Impfstoffformulierungen 23,25.

Hier untersuchen wir Wege molekularer Veränderungen in den Genomen der wachsenden SARS-CoV-2-Population, die helfen können, molekulare Schuldige der Virulenz und Virusausbreitung zu identifizieren. Unter Verwendung der Mutationsentropie von Nukleotid- und Aminosäuresequenzen als Maß für die molekulare Diversität im Laufe der Zeit untersuchen wir den evolutionären Verlauf von entscheidenden viralen Proteinen wie den S- und N-Proteinen und mehreren NSP und akzessorischen Proteinen, während wir Mutationsänderungen in den Sequenzen von 12.606 SARS-CoV-2-Genomen. Bemerkenswerterweise stellen wir fest, dass während Virulenz-assoziierte Mutationen im S-Protein mit der Zeit fixiert werden, Nukleotidänderungen im N-Protein und dem Viroporin-Protein 3a, die wir mit einer Protein-intrinsischen Störung in Verbindung gebracht haben, sich als wichtiger herausstellen. Hier erforschen wir ihre Bedeutung.


Ergebnisse

Onkogen HRAS p.G12-Codon-Mutationen sind im Sperma erhöht.

Spontane quantifizieren HRAS Mutationen entwickelten wir ein Protokoll (Abb. S1), das Restriktionsenzymverdau, PCR-Amplifikation, massiv parallele Sequenzierung und statistische Analyse kombiniert (SI-Text). Beobachtet, dass jede nicht-synonyme einzelne Nukleotidsubstitution am HRAS p.G12-Codon wurde bei Krebs beschrieben und jedes ist mit einer anderen transformierenden Aktivität assoziiert (23, 24). c.32_c.35, unabhängig vom Methylierungsstatus). Diese Strategie ermöglicht die gleiche Anreicherung aller außer 1 von 12 möglichen Einzelnukleotid-Substitutionen an der MspI-Stelle (Fig. 1, fett) sowie komplexer Mutationen. Weitere Vorteile sind, dass die MspI-Stelle ein CpG-Dinukleotid enthält, was den Vergleich von Übergangs- und Transversionsraten sowohl im Kontext von CpG- als auch Nicht-CpG-Nukleotiden ermöglicht und zwei benachbarte Codons umfasst, sodass Mutationsniveaus am p.G12 CS/Krebs-Hotspot können mit denen bei p.A11 verglichen werden, bei denen erwartet wird, dass die Mutationen selektiv neutral sind. In Proben, die für den SNP rs12628 heterozygot sind, der sich 46 bp stromabwärts von c.35G befindet, kann jede Substitution innerhalb der MspI-Stelle in Phasen unterteilt werden, sodass wir feststellen können, auf welchem ​​der beiden HRAS Allele fanden die ursprünglich beitragenden Mutationsereignisse statt (Abb. 1 SI-Text).

Um die Sensitivität und Reproduzierbarkeit des Assays zu beurteilen, schätzten wir die Mutationsniveaus in einem Titrations-Rekonstruktions-Experiment unter Verwendung von biologischen Replikaten mit 10 µg Kontrollblut-DNA (entspricht ∼3,3 × 10 6 Kopien des haploiden Genoms), ergänzt mit Verdünnungsreihen von genomischen DNA von vier CS-Patienten heterozygot für HRAS Mutationen [Bereich der Eingangsmutantenmoleküle von ∼ 10 (Konzentration: 3 × 10 –6 ) bis ∼ 1.000 (Konzentration: 3 × 10 –4 )]. Um das Mutationsniveau zu quantifizieren, wurden Proben mit ∼ 100 mutierten Kopien genomischer DNA von einem einzigartigen CS-Patienten, der heterozygot für c.35_36GC>AA-Tandemmutation war, gespikt. Wir fanden eine gute Korrelation zwischen der Menge der zugeführten DNA und den Mutationsniveaus, die durch massiv parallele Sequenzierung geschätzt wurden (Abb. 2EIN). Die Spiegel des c.34G>A-Übergangs wurden bei der niedrigeren Verdünnung (3 × 10 –6 ) um das 3,6-fache überschätzt, aber die c.35_36GC>TT-Tandemmutation wies niedrigere Mutationsspiegel im Blut auf, und eine gute Korrelation zwischen den Schätzungen und dem DNA-Input war bis zum 3 × 10 −6-Niveau beobachtet.

Schätzung von HRAS Mutationsniveaus innerhalb der c.32_35 MspI-Stelle (Codons p.A11 und p.G12) in Spermien und Blutproben. (EIN) Mutationswerte, geschätzt in einem Titrations-Rekonstruktions-Experiment mit serieller Verdünnung von vier CS-Proben, gemischt mit Blutträger-DNA und Spike-DNA. (B) Schätzung der Mutationsniveaus für Substitutionen bei p.A11 (Oberteil) und S.G12 (Mitte) in 89 Spermien (Links) und 7 Blut (Rechts) Proben. Der Farbcode für jede Substitution ist auf der Abbildung angegeben. Die Proben sind nach ihrem Genotyp am rs12628 SNP organisiert (TT links, CC in der Mitte und CT-Heterozygote rechts). Die Mutationsstufen werden unabhängig für die beiden HRAS Allele in Bezug auf den SNP, so dass das Gesamtmutationsniveau für CT-Proben die Summe der Zählungen auf jedem Allel ist. Das Alter des Probenspenders wird bei der Unterseite. (C) Durchschnittliche Werte für Mutationen am Codon p.G12 in Spermienproben, sortiert nach 5-jähriger Altersgruppe. (D) Vergleich der Spiegel verschiedener Mutationen am Codon p.G12 in Spermienproben (Oberteil) mit relativer Prävalenz von Mutationen, die in CS berichtet wurden (Tabelle S1) (Mitte) und bei Krebs (COSMIC) (Unterseite). Die Korrelation zwischen Spermiendaten und anderen Messungen wird von Spearman angegeben (RS) und Pearson (R) Korrelationskoeffizienten mit statistischer Signifikanz (NS, nicht signifikant *P = 0.02 **P = 0.009 ***P = 0,000004). Der in verwendete Farbcode C und D ist identisch mit B.

Anschließend verwendeten wir dieselbe Strategie, um fünf Einzelnukleotid-Substitutionen am p.G12-Codon und sechs Substitutionen an p.A11 in 7 Blut- und 89 Samenproben von gesunden Spendern zu quantifizieren (Abb. 2 .).B, Abb. S2EIN, und Datensatz S1). Die Schätzungen der Mutationsspiegel aus dem Blut variierten je nach Mutation, wobei Transitionen höhere Spiegel als Transversionen zeigten, insbesondere innerhalb des c.33_34 CpG-Dinukleotids (Tabelle S2). Diese Werte spiegeln wahrscheinlich eine Kombination aus seltenen endogenen Mutationen im Blut und Artefakten während der PCR wider, da diese Technik etwa 2- bis 20-mal mehr Transitionen erzeugt als Transversionsfehler (25). Basierend auf diesen Beobachtungen sind die Ergebnisse des Titrationsexperiments (Abb. 2EIN) und die Analyse der Schiefe in Bezug auf den rs12628 SNP (SI-Text und Abb. S2C) wurde angenommen, dass eine Probe eine gegebene Substitution trägt, wenn die gemessenen Pegel >3 × 10 –6 waren, außer bei Übergängen, für die der Anrufschwellenwert auf 10 –5 gesetzt wurde. Als nächstes analysierten wir die Höhe der einzelnen Mutationen (relevante Statistiken und Korrelationen mit dem Spenderalter sind in Tabelle S2 zusammengefasst). Die Spiegel für alle Substitutionen mit c.32C und c.33C (in S.A11) unterschieden sich nicht signifikant zwischen Blut und Spermien (Abb. 2B und Abb. S2EIN). Im Gegensatz dazu waren die Spiegel an den Positionen c.34G und c.35G (die nicht synonyme Veränderungen auf p.G12 kodieren) in Spermien häufig höher als im Blut (Abb. 2 .).B, Mitte) und zeigte auch eine positive Korrelation mit dem Alter der Samenspender (Abb. 2C und Abb. S2EIN): In Spermien war der c.34G>A (p.G12S)-Übergang die am häufigsten vorkommende (55/89 Proben hatten Werte von >10 –5 ) und die häufigste Mutation, die 62 % der gesamten Einzelnukleotid-Substitutionen am Codon p . ausmachte .G12. Es zeigte auch die stärkste positive Korrelation mit dem Spenderalter (RS = 0,52). Der Gehalt an c.35G>A (p.G12D) (ebenfalls ein Übergang, aber nicht bei einem CpG) war im Durchschnitt 3,2-fach niedriger als der von c.34G>A und lag bei >10 –5 in 17/89 Spermienproben vor. Die drei anderen quantifizierbaren Einzelnukleotid-Substitutionen bei p.G12 sind Transversionen, die niedrigere Hintergrundwerte aufwiesen und in 20/89 Proben für c.34G>T (p.G12C) über 3 × 10 -6 erhöht waren, in 18/89 Proben für c .35G>T (S.G12V) und in nur 3/89 Samples für c.34G>C (S.G12R). Das Ausmaß dieser Transversionen war auch mit dem Spenderalter korreliert, wenn auch schwächer als bei den Übergängen.

Tandem-Basensubstitutionen sind in der Keimbahn überrepräsentiert.

Angesichts der Tatsache, dass unser Protokoll jede Substitution auswählen würde, die gegen MspI-Verdauung resistent ist, fragten wir, ob mehrere Nukleotid-Substitutionen identifiziert werden könnten. Unerwarteterweise wurden 31 unabhängige Ereignisse mit Dinukleotid-Substitutionen in Spermienproben bei Konzentrationen von >3 × 10 –6 beobachtet. Abgesehen von c.34G>Ac.36C>T (kodierend für p.G12S) und c.34_35GG>TT (p.G12F), die jeweils in einzelnen Spermienproben beobachtet wurden, waren alle anderen Dinukleotidmutationen Tandem-Basen-Substitutionen (TBS), die die letzten beiden Nukleotide von Codon p. G12, bestehend aus c.35_36GC>AA (S.G12E) in 1 Sample, c.35_36GC>AT (S.G12D) in 4 Samples, c.35_36GC>TA (S.G12V) in 3 Samples und c.35_36GC>TT (S.G12V) in 21 Proben (Datensatz S1, Tabelle S2 und Abb. S2B). Angesichts der Tatsache, dass beide die gleiche onkogene p.G12V-Änderung kodieren und daher einer äquivalenten Selektion unterliegen würden, war überraschenderweise das durchschnittliche Niveau des am häufigsten vorkommenden TBS, c.35_36GC > TT, 1,7-fach höher als das Niveau des c. 35G>T-Einzelnukleotid-Substitution. Die Konzentrationen dieses TBS waren im Sperma signifikant höher als im Blut (P = 0,00002) und stark korreliert (RS = 0,44) mit Spenderalter (Abb. 2C und Tabelle S2).

Um die Auswirkungen der hohen Prävalenz von TBS, insbesondere GC>TT, zu beurteilen, fragten wir, ob sie in verschiedenen humanen Genomdatensätzen identifiziert werden könnten (SI-Text). Wir haben zunächst die Human Gene Mutation Database (HGMD) abgefragt, in der 441 TBS als pathogene Keimbahnmutationen katalogisiert sind. In Übereinstimmung mit einer kürzlich veröffentlichten Studie (26) beinhalten die zahlreichsten aller 78 möglichen TBS GC>TT (oder sein umgekehrtes Komplement GC>AA), was 14,7 % der Gesamtmenge ausmacht, was einer 10,6-fachen Anreicherung gegenüber einer gleichmäßigen Verteilung von TBS entspricht (P < 10 −16 Abb. 3EIN und Tabelle S3). Von den 64 codierenden GC>TT/AA codieren 26 Veränderungen, die (aufgrund der Besonderheiten des genetischen Codes) nur durch eine Doppelnukleotid-Substitution entstehen können, einschließlich der rezidivierenden RET c.2647_2648GC>TT (p.A883F)-Mutation im Zusammenhang mit men2B (11, 27).

Lego-Plots, die die Prävalenz von TBS im menschlichen Genom darstellen. (EIN) Daten von HGMD. (B) Genomweite Variation über 85 LWK-Gesamtgenomsequenzen (Cortex-Assembler). Die x Achse repräsentiert die ursprünglichen Dinukleotidsequenzen und ihre umgekehrten Komplemente, während die ja Achse zeigt die mutierte Sequenz und ihr umgekehrtes Komplement (die ja Achsenlegende ist in beiden Diagrammen gleich und um die Visualisierung zu erleichtern, sind mutierte Sequenzen in verschiedenen Farben schattiert). Gezeichnet auf dem z Achse ist die Gesamtzahl der Ereignisse für jede TBS (Tabelle S3). Aufgrund der komplementären Natur der DNA können nur 78 verschiedene TBS auftreten, und graue Bereiche zeigen Veränderungen an, die nicht zu TBS führen (wie zum Beispiel Einzelnukleotid-Substitutionen) oder mit ihrem umgekehrten Komplement identisch sind.

Als nächstes untersuchten wir die Verteilung von TBS bei Krebs. Obwohl 406 Einzelnukleotid-Substitutionen an der HRAS p.G12-Codon im Catalog Of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC) gibt es keinen einzigen Fall von TBS, was darauf hindeutet, dass ein anderes Mutationsmuster (entweder durch unterschiedliche Mutationsmechanismen in Körper- und Keimbahnzellen und/oder spezifische Mutagenexposition verursacht) ) wird in diesen unterschiedlichen zellulären Kontexten beobachtet. Diese Interpretation wird durch das in COSMIC katalogisierte Profil von 3.769 TBS (Tabelle S3) unterstützt. Die häufigsten TBS in somatischen Geweben sind CC/GG>AA/TT (31,4 %) und CC/GG>TT/AA (19,2 %). (28) bzw. Im Gegensatz dazu gab es nur 107 Ereignisse (2,8% der TBS) von GC>TT/AA, was darauf hindeutet, dass es eine viel weniger ausgeprägte Anreicherung (2,0-fach über der zufälligen Erwartung) für diese TBS bei Krebs gibt (Tabelle S3).

Um die Auswirkungen von TBS weiter zu untersuchen, analysierten wir die Prävalenz und Verteilung von TBS, die zur menschlichen Variation beitragen, basierend auf WGS-Daten (SI-Text). Wir verwendeten Cortex, einen De-novo-Assembly-basierten Varianten-Calling-Algorithmus (29), um die TBS-Repräsentation in 85 menschlichen Genomsequenzen aus dem Luhya in Webuye, Kenia (LWK)-Datensatz des 1000 Genomes Project (30) zu bewerten und identifizierten 5.425.856 Nukleotidvarianten. von denen 22.898 (0,42 %) an TBS beteiligt waren. Bemerkenswerterweise war die GC>TT/AA-Änderung die zweithäufigste TBS, beobachtet in 1.417 Fällen (6,2%), was einer 4,5-fachen Anreicherung entspricht (Abb. 3 .).B und Tabelle S3). Da das TBS-Muster bei der HRAS p.G12-Codon legte nahe, dass das CpG-Dinukleotid an Position c.36_37 ( 1 ) die scheinbare c.35_36GC>TT-Mutationsrate beeinflussen könnte, wir charakterisierten weiter den lokalen Sequenzkontext, in dem die 1.417 genomischen GC>TT/AA-TBS aufgetreten waren. Verglichen mit der relativen Häufigkeit einzelner Substitutionen (G>T oder C>A) im gleichen Sequenzkontext tritt die GC>TT/AA-TBS dreimal häufiger als Teil eines CpG-Dinukleotids auf [842 von 103.732 Ereignissen (0,81 %) für die einzelnen Substitutionen und 35 von 1.417 (2,5 %) für TBS P = 2.2 × 10 −8 SI-Text]. Diese genomweiten Beobachtungen legen nahe, dass der Sequenzkontext, in dem die TBS auftritt, eine wichtige, wenn auch noch nicht charakterisierte Rolle spielt, und insbesondere schlagen wir vor, dass die Hypermutabilität des C>T-Übergangs innerhalb des CpG-Dinukleotids zumindest teilweise für die hohe spontane GC>TT . verantwortlich ist /AA-Mutationsrate in der Keimbahn beobachtet.

Vergleich zwischen der Prävalenz von HRAS Mutationen in Spermien und in CS-, SpS- und Krebsdatensätzen.

Um die biologische Relevanz der Messungen von HRAS Mutationsniveaus in Spermien verglichen wir diese Daten mit der Verteilung der veröffentlichten CS-Allele, mit experimentellen Daten, die in unserem Labor zu Mutationen in SpS generiert wurden, und mit Krebs-assoziierten Mutationen, die in der COSMIC-Datenbank katalogisiert sind.

Von den 236 in der Literatur berichteten CS-Fällen beinhalten 207 (88%) Mutationen am Codon p.G12 (Fig. 1 und Tabelle S1). Die Mutation c.34G>A (p.G12S), die mit einer relativ homogenen Präsentation einhergeht, ist mit Abstand am häufigsten (81%). Andere p.G12-Mutationen wurden ebenfalls beschrieben, einschließlich p.G12A, p.G12C, p.G12D, p.G12V und p.G12E. Diese selteneren Allele sind tendenziell mit schwereren Manifestationen verbunden, die oft eine hypertrophe Kardiomyopathie beinhalten und zu einer neonatalen Mortalität führen (31 ⇓ ⇓ –34), was mit biochemischen Beweisen übereinstimmt, dass p.G12S weniger aktivierend ist als jede andere Mutation an diesem Codon (23, 24).

Wir fanden eine starke Korrelation zwischen der Prävalenz von HRAS Allele in Spermien und die Anzahl der Fälle, die für jede CS-Mutation gemeldet wurden, was darauf hindeutet, dass die durchschnittliche Mutation in Spermien eine wesentliche Determinante für die Prävalenz verschiedener HRAS Allele in der CS-Population (Abb. 2D). Ein Vergleich der Spermiendaten mit beobachteten Geburten von CS zeigt, dass p.G12S im Vergleich zu anderen p.G12-Substitutionen unerwartet häufig vorkommt, was darauf hindeutet, dass diese anderen (mehr aktivierenden) Mutationen mit einem höheren Sterberisiko während der die Schwangerschaft (33). In Übereinstimmung mit unserem Befund, dass TBS in Spermien nicht ungewöhnlich ist, wurde von insgesamt sechs CS-Patienten mit ähnlichen Mutationen berichtet (Tabelle S1). Auffallend ist, dass bei Patienten mit diagnostizierter HRAS Mutationen, die p.G12V kodieren, wurden fünf Fälle mit TBS in Verbindung gebracht (vier mit c.35_36GC>TT und einer mit c.35_36GC>TA), während nur ein einziger Patient die c.35G>T-Substitution aufwies (31 ⇓ –33). Die Dominanz des c.35_36GC>TT TBS unter den beobachteten CS-Allelen unterstützt die Relevanz unserer Spermiendaten, da dies die Mehrheit (21/30) der beobachteten TBS war.

Wir haben unsere vorherige Umfrage zu SpS um ein Screening erweitert (SI-Text) ein Panel von 33 Tumoren für Hotspot-Mutationen in FGFR3 und HRAS (Tabelle S4). Nicht weiter FGFR3 Mutationen wurden gefunden, aber zwei weitere Tumorproben enthielten anscheinend homozygot HRAS Mutationen, die in übereinstimmendem histologisch normalem Gewebe nicht beobachtet wurden. Die Mutationen waren c.37G>C (p.G13R) und c.182A>G (p.Q61R) in Tumoren von Männern im Alter von 79 bzw. 81 Jahren (Abb. S3 EIN und B). Obwohl diese Daten bestätigen, dass HRAS ist das am häufigsten mutierte Gen bei SpS (11%) und die Mutationspositivität korreliert stark mit dem Patientenalter (Abb. S3C), wurden keine Mutationen am Codon p.G12 identifiziert. Derzeit alle HRAS Mutationen, die bei SpS gefunden werden, schließen sich gegenseitig mit CS-Mutationen aus, die entweder embryonale oder fötale Letalität aufgrund der stark aktivierenden Natur der mit SpS assoziierten Mutationen (35) oder der Unfähigkeit von mutierten SSC, differenzierende meiotische Zellen und Spermien zu produzieren, widerspiegeln können.

Wie in Abb. 2 dargestelltD, Mutationen am p.G12-Codon treten in Spermien im Vergleich zu Krebs in unterschiedlichen relativen Anteilen auf. Bei Krebserkrankungen macht HRAS p.G12V, das die niedrigste GTPase-Aktivität (36) und das höchste Transformationspotential (23) aufweist, 64 % der Mutationen am Codon p.G12 aus (Abb. 1), während bei Spermien HRAS p. G12S (c.34G>A) ist trotz seiner geringeren Transformationsaktivität am häufigsten. Diese Beobachtungen weisen auf einen anderen Mutations- und/oder Selektionsmechanismus bei Spermatogonien hin als bei den meisten Tumoren, den wir durch statistische Modellierung weiter untersucht haben.

Modellierung der Mutationsrate und des selektiven Vorteils.

Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die HRAS Mutationsniveaus in Spermien werden durch ein Zusammenspiel zwischen der intrinsischen genomischen Mutationsrate eines Rests und dem selektiven Vorteil bestimmt, den das resultierende mutierte Protein der Spermatogonienzelle verleiht (8, 10, 11). Um den relativen Einfluss dieser beiden Faktoren auf das Ergebnis egoistischer Selektion zu verstehen, haben wir ein statistisches Modell entwickelt (SI-Text). Wir entwickelten ein einfaches Modell (9), bei dem ab dem Alter der Pubertät (13 Jahre) die SSC-Homöostase durch regelmäßige asymmetrische Teilungen aufrechterhalten wird, d. Es wird vorhergesagt, dass egoistische Mutationen das mitotische Verhalten des SSC verändern und gelegentliche symmetrische Teilungen ermöglichen, was im Laufe der Zeit zu einer exponentiellen Anreicherung von Mutationen in Spermien führt. Um der Tatsache Rechnung zu tragen, dass mitwirkende Mutationen voraussichtlich selten sind, modellieren wir ihr Auftreten als Poisson-Zufallsvariable mit dem Parameter μ (d. h. der Mutationsrate pro Zellteilung). Wir definieren dann einen Selektionskoeffizientenparameter (S), die der Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer solchen symmetrischen Teilung bei jeder SSC-Mitose entspricht. Werte von μ und S wurden dann durch Monte-Carlo-Simulation für jeden abgeleitet HRAS Substitution an den Codons p.A11 und p.G12 in den 89 Spermaproben, mit Aufteilung der Daten für die 46 Individuen, die heterozygot für den rs12628 SNP über die beiden Allele sind.

Das Modell liefert signifikant positive Werte von S zum Aktivieren HRAS Mutationen an p.G12, wohingegen für die synonymen oder nicht aktivierenden Mutationen an p.A11, S nahe Null ist (Fig. 4 und Tabelle S5). Obwohl S für verschiedene Mutationen bei p.G12 spiegelt ihre dokumentierten in vitro aktivierenden Eigenschaften wider (niedrigste für p.G12S und höchste für p.G12V) (23, 24), den engen Wertebereich von S, innerhalb des 1,5-fachen, bedeutet, dass die relative Häufigkeit einer gegebenen p.G12-Mutation hauptsächlich durch ihre Mutabilität μ bestimmt wird, die zwischen c.34G>A (höchste Transition bei CpG-Dinukleotid) und c.35G>T (geringste Transversion bei Nicht-CpG). Der Effekt der relativen Mutabilität wird deutlich, wenn man die Verteilung der Mutationen auf die beiden HRAS Allele bei Individuen, die für den rs12628-SNP heterozygot sind. Während die Werte seltenerer Mutationen (einschließlich TBS) im Allgemeinen eine deutliche Verzerrungspräferenz auf dem einen oder anderen Allel aufweisen, was darauf hindeutet, dass nur eine Ursprungsmutation zu den endgültigen Konzentrationen beigetragen haben könnte, ist diese Verzerrung für den c.34G>A-Übergang viel weniger ausgeprägt ( p.G12S) wegen seiner höheren intrinsischen Mutationsrate (SI-Text und Abb. S2C).

Beiträge von Mutationsrate (μ) und Selektion (S) zu Spiegeln in Spermien für Mutationen in HRAS, FGFR2, und FGFR3. Daten für HRAS (diese Arbeit) in Schwarz Referenzen für Daten aus früheren Studien sind als Rot (8), Grün (12) und Blau (10) farbcodiert. Balken und schattierte Bereiche repräsentieren die 95 %-Konfidenzintervalle (Tabelle S5).

Um die Nützlichkeit des Modells weiter zu testen, analysierten wir drei zuvor veröffentlichte Datensätze von Mutationsniveaus, die in Spermien für Substitutionen mit quantifiziert wurden FGFR2 c.755C (8, 12), FGFR2 c.758C (12), und FGFR3 c.1948A oder c.1949A (10). Obwohl diese Datensätze mit unterschiedlichen Methoden gewonnen wurden, stimmten die Schätzungen von μ für eine gegebene Substitutionskategorie sowohl zwischen den Datensätzen als auch mit zuvor erhaltenen Schätzungen der Mutationsrate weitgehend überein (1, 2, 6). Schätzungen von S und μ für die Apert c.755C>G-Mutation, die aus zwei unabhängigen Datensätzen stammt, stimmen ebenfalls gut überein. Insbesondere Selektionskoeffizienten für die am stärksten selektierten Mutationen in FGFR2 und FGFR3 sind 1,5- bis 2,1-fach höher als bei der am stärksten selektierten Mutation in HRAS, was wahrscheinlich für die geringere Geburtenprävalenz von CS verantwortlich ist (SI-Text) im Vergleich zu den Erkrankungen, die mit der spezifischen FGFR2 und FGFR3 Mutationen (11) (Tabelle S5).


Ergebnisse

Klinische Merkmale der Patienten mit COVID-19

Vom 25. Januar bis 10. Februar 2020 haben wir insgesamt 62 klinische Serienproben von acht hospitalisierten Patienten (GZMU-Kohorte) mit bestätigter SARS-CoV-2-Infektion mittels Echtzeit-RT-qPCR gesammelt (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Alle Patienten hatten im frühen Stadium des Ausbruchs direkte Kontakte zu bestätigten Fällen. Die meisten Patienten, mit Ausnahme von P15 und P62, hatten schwere Symptome und erhielten eine mechanische Beatmung auf der Intensivstation, einschließlich des Patienten P01, der schließlich verstarb. Patient P01 zeigte im Vergleich zu anderen Patienten auch viel niedrigere Antikörperreaktionen (IgG und IgM) (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Wir sequenzierten dann die 62 klinischen Proben mit metatranskriptomischen und/oder hybriden Capture-Methoden (zusätzliche Datei 1: Tabelle S1). Die Anzahl der SARS-CoV-2-Reads pro Million (SARS-CoV-2 RPM) unter den metatranskriptomischen Daten korrelierte gut mit der entsprechenden RT-qPCR-Zyklusschwelle (Ct) von SARS-CoV-2, was eine robuste Schätzung der Viruslast widerspiegelt (R = 0.71, P = 6,7e−11) (Abb. 1a). Die Proben des Respirationstrakts (RT: Nasenabstrich, Sputum, Rachenabstrich) und des Gastrointestinaltrakts (GIT: Anus-Anal-Abstrich, Kot) zeigten im Vergleich zu Magenschleimhaut- und Urinproben höhere SARS-CoV-2-RPMs (Abb. 1b). Die Daten hier können eine aktive Replikation von SARS-CoV-2 in RT und GIT widerspiegeln, insbesondere bei Patienten mit schweren Symptomen [38, 39].

Sequenzdaten von verschiedenen Probentypen von Patienten mit COVID-19. ein SARS-CoV-2-RPM der metatranskriptomischen Daten, aufgetragen gegen den RT-qPCR-Zyklusschwellenwert (Ct) für die klinischen Proben. B Häufigkeitsverteilung der Proben basierend auf SARS-CoV-2 Reads per Million (SARS-CoV-2 RPM). C Maximum-Likelihood-Baum von Konsensus-SARS-CoV-2-Genomen unter Verwendung von IQ-TREE. Die Farben der gepunkteten Spitzen repräsentieren die geografischen Standorte der Proben. Nukleotidmutationen, die den Zweig definieren, wurden außerhalb des Baums markiert. D Verteilung der in der GZMU-Kohorte nachgewiesenen Konsensusvarianten (in runden Kreisen) über das SARS-CoV-2-Genom. Farben repräsentieren die biologische Wirkung von Mutationen. Nicht-synonyme Varianten werden mit Grün bezeichnet, synonyme Varianten mit Rot und Frameshift mit Blau. Als Referenzsequenz wurde EPI_ISL_402125 verwendet

Konsens genomische Variationen

Hier haben wir mit metatranskriptomischen Daten 32 vollständige Konsensusgenome aus den klinischen Proben mit mindestens 60-facher Sequenzabdeckung erhalten (Zusatzdatei 1: Tabelle S1 und Tabelle S4). Der Vergleich der Assemblies mit der Referenzsequenz (GISAID-Zugang: EPI_ISL_402125) ergab 14 Konsensusvarianten (6 synonyme und 8 nicht-synonyme), die hauptsächlich in ORF1ab-, S-, ORF8- und N-Genen lokalisiert sind (Zusatzdatei 1: Tabelle S4). Die meisten der Konsensusvarianten wurden auch unter öffentlichen Sequenzen nachgewiesen, einschließlich der weit verbreiteten assoziierten Varianten (C8782T und T28144C), die bei vier Patienten (P10, P13, P14 und P62) nachgewiesen wurden. Die neuartige Konsensus-Variante verursacht einen Frameshift am Ende von ORF8 bei Patient P14, was die phänotypische Plastizität während der Evolution und Adaptation von SARS-CoV-2 zeigt. Evolutionäre Beziehungen zeigten, dass die Konsensus-SARS-CoV-2-Genome der GZMU-Kohorte zu unterschiedlichen Kladen gehörten, einschließlich der Kladen, die durch T28144C bzw. A23403G definiert sind (Abb. 1c). Bemerkenswerterweise beobachteten wir in den GIT-Proben des Patienten (P08) unterschiedliche SARS-CoV-2-Genotypen mit drei Nukleotidunterschieden (Abb. 1d und zusätzliche Datei 1: Tabelle S4), was auf unabhängige Replikationen verschiedener SARS-CoV-2 . hindeutet Genotypen innerhalb desselben Wirts [40]. Die Existenz verschiedener Genotypen könnte durch Co-Transmission, wiederkehrende Mutation oder alternative Quasispezies, die aus einer adaptiven Immunantwort entwickelt wurden, erklärt werden. Ein ähnliches Phänomen wurde beim Hepatitis-C-Virus (HCV) [41] und beim humanen Polyomavirus JC (JCV) [42] berichtet.

Erkennung und Eigenschaften von iSNVs

Obwohl in SARS-CoV-2-Populationen viele polymorphe Stellen identifiziert wurden, werden Intra-Wirt-Variantenspektren eng verwandter viraler Genome meistens durch die Konsensussequenzen verschleiert. Wir untersuchten zunächst die Reproduzierbarkeit unserer experimentellen Verfahren zur Schätzung der Allelfrequenz. Zwischen den biologischen Replikaten zweier ausgewählter Proben wurde nur ein geringer Unterschied der alternativen Allelfrequenzen (AAFs) beobachtet (Zusatzdatei 2: Abb. S2), was zeigt, dass die geschätzte Populationszusammensetzung durch unabhängige experimentelle Verfahren geringfügig beeinflusst wurde. Um die Rate falscher Entdeckungen zu kontrollieren, haben wir einen strengen Ansatz zur Erkennung von iSNVs angewendet. Die iSNVs wurden aus den 32 Proben anhand metatranskriptomischer Daten identifiziert und dann anhand von Hybrid-Capture-basierten Daten verifiziert, die für die meisten (27/32) Proben verfügbar sind (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S5 und Tabelle S3). Insgesamt beobachteten wir 1 bis 23 iSNVs bei sechs Patienten mit einem Cut-off von 5% Minor-Allel-Frequenz (Abb. 2a, b). Wenn bei einem Patienten eine iSNV entdeckt wurde, haben wir den Cut-off auf 2 % reduziert, um diese iSNV in den restlichen Proben desselben Patienten zu erkennen (siehe Abschnitt „Methoden“). Die AAFs von iSNVs, die aus den metatranskriptomischen Daten nachgewiesen wurden, korrelierten gut mit denen der Hybrid-Capture-basierten Daten (Spearman’s ρ = 0.99, P < 2.2e−16 Zusatzdatei 2: Abb. S1). Darüber hinaus korrelierten die Zahlen der beobachteten iSNVs nicht mit der Sequenzierungsabdeckung (zusätzliche Datei 2: Abb. S3), was darauf hindeutet, dass die Abdeckung der metatranskriptomischen und hybriden Capture-basierten Daten ausreichend war, um die Intra-Wirt-Variation in den meisten Proben abzuschätzen.

Eigenschaften von iSNVs. ein Heatmap, die die alternativen Allelfrequenzen (AAFs) von Intra-Host-Single-Nucleotid-Varianten (iSNVs) und Konsensusvarianten zwischen Proben zeigt. Der Probenname (z. B. P01N0129) gibt die Patientennummer P01, den Probentyp (N Nasenabstrich, T Rachenabstrich, A Analabstrich, F Kot, S Sputum) und das Entnahmedatum (29. Januar) an. Gängige iSNVs wurden durch Sternsymbole gekennzeichnet. Variantentyp und Probentyp wurden in unterschiedlichen Farben markiert und Konsensusvarianten wurden rot gekennzeichnet. B Die Anzahl der erkannten iSNVs pro Patient. C Anzahl der iSNV-Stellen unter proteinkodierenden Genen. D Boxplot, der die Verteilung alternativer Allelfrequenzen (AAFs) von nicht-synonymen und synonymen iSNVs zeigt. Jeder Punkt zeigt den Median-AAF unter allen erkannten iSNVs von Proben desselben Patienten an. e Boxplot, der die Verteilung von AAFs häufiger und seltener iSNVs zeigt. Jeder Punkt gibt den Median-AAF unter allen erkannten iSNVs von Proben desselben Patienten an

Wir analysierten die Intra-Wirt-Variation zwischen den Genen weiter, um Hinweise auf eine reinigende Selektion oder neutrale Selektion zu erhalten. Wenn sich SARS-CoV-2 unter neutraler Selektion entwickelt, ist das Verhältnis von nicht-synonymer zu synonymer Substitution tendenziell für alle ORFs ähnlich, und die iSNVs verteilen sich wahrscheinlich gleichmäßig an jeder Codon-Position. In dieser Untersuchung verteilten sich die 40 identifizierten iSNV-Sites (10 synonyme iSNVs und 30 nicht-synonyme iSNVs) gleichmäßig über die genomischen Regionen (Abb. 2c Zusätzliche Datei 1: Tabelle S5). Eine ähnliche Anzahl von iSNVs unter den Codon-Positionen (Position 1: n = 15 Stelle 2: n = 12 Stelle 3: n = 13 Chi-Quadrat-Test: P = 0,84) deutet darauf hin, dass die meisten iSNVs einer neutralen Selektion oder einer unzureichenden Reinigungsselektion unterzogen wurden. Unterdessen konnten wir weder zwischen nicht-synonymen und synonymen iSNVs (Abb. 2d) noch zwischen den Codonpositionen (Zusatzdatei 2: Abb. S4) einen signifikanten Unterschied bei AAFs feststellen, was auch die neutrale Selektion von iSNVs widerspiegelt.

Gleichzeitig auftretende iSNVs

Eine zentrale Aufgabe bei der Schätzung der Intra-Host-Variation besteht darin, die Quelle von iSNVs zu identifizieren. Insgesamt korreliert die Verteilung der iSNVs unter den Stichproben nicht gut mit den Konsensus-SNPs (Abb. 2a). Proben mit den gleichen Konsensus-SNPs wiesen im Allgemeinen unterschiedliche iSNVs auf, insbesondere in P01, P10 und P13. Hier klassifizierten wir die iSNVs in (i) seltene iSNVs (30/40), die bei einem einzelnen Patienten nachgewiesen wurden, und (ii) gemeinsame oder geteilte iSNVs (10/40), die bei mindestens zwei Patienten nachgewiesen wurden und/oder mit Konsensusvarianten identisch sind. Die gemeinsame iSNV könnte verwendet werden, um die Übertragung von Mensch zu Mensch und den Übertragungsengpass abzuschätzen.Hier zeigten die zehn gängigen iSNVs keine Kopplung mit anderen Konsensusvarianten. Darüber hinaus konnten ihre AAFs nicht von denen der seltenen iSNVs unterschieden werden (Abb. 2e), was eine enge genetische Engpassübertragung widerspiegelt. Der Vergleich von SNPs und iSNVs impliziert auch, dass die meisten der nicht-synonymen iSNVs nicht effizient übertragen werden konnten oder die nicht-synonymen iSNVs möglicherweise verschwunden sind, da die meisten von ihnen schädlich sind. Zu den üblichen iSNVs gehören insbesondere zwei iSNVs (G11083T und C21711T), die ausschließlich in den GIT-Populationen P01, P08 und P10 nachgewiesen wurden (Zusatzdatei 1: Tabelle S5). Unter den gängigen iSNVs ist G11083T die am weitesten verbreitete Konsensusvariante, die in mehreren Linien von SARS-CoV-2 verbreitet ist, was darauf hindeutet, dass sie eher von wiederkehrenden Mutationen an verschiedenen Stämmen als von der Mutation an einem einzelnen Vorfahrenstamm abgeleitet werden könnte. Obwohl G11083T in den GIT-Proben von drei Patienten als Intra-Host-Variante nachgewiesen wurde, wurde es in den entsprechenden RT-Proben nicht nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass diese Loci wiederholt mutieren könnten. Interessanterweise befindet sich G11083T in einer Region, die für ein vorhergesagtes T-Zell-Epitop kodiert [43], was darauf hindeutet, dass diese vermutete rezidivierende Mutation genetische Plastizität bieten könnte, um sich besser gegen die Wirtsabwehr anzupassen. Um die Möglichkeit potenzieller Sequenzierungsfehler auszuschließen, die die Genauigkeit der Analyse beeinflussen, wurden außerdem mehrere Sequenzierungsmethoden, einschließlich metatranskriptomischer und hybrider Einfangsequenzierung, mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

Genetische Vielfalt innerhalb der GIT- und RT-Proben

Anhand der Shannon-Entropie beobachteten wir innerhalb der GIT-Proben eine signifikant höhere genetische Diversität als die der RT-Proben (Wilcoxon-Rangsummentest, P = 1,4e−05 Abb. 3a und Zusatzdatei 1: Tabelle S6), die eine größere Viruspopulation innerhalb der GIT-Populationen oder unter entspanntem Selektionsdruck widerspiegeln. Wir untersuchten weiter die genetischen Unterschiede zwischen den beiden Intra-Wirt-Populationen. Bemerkenswerterweise wurde kein iSNV zwischen RT- und GIT-Proben von denselben Patienten geteilt, was auf eine häufige genetische Differenzierung zwischen Intra-Wirt-Viruspopulationen unterschiedlicher anatomischer Lokalisationen hindeutet. Hier haben wir die L1-Norm-Distanz verwendet, um die genetische Unähnlichkeit zwischen Probenpaaren basierend auf iSNVs und ihren AAFs abzuschätzen (Abb. 3b und Zusatzdatei 1: Tabelle S7). Erwartungsgemäß waren die genetischen Abstände zwischen Proben desselben Wirts kleiner als die zwischen den Proben zwischen den Wirten (Abb. 3b und Zusatzdatei 1: Tabelle S7). Innerhalb jedes Wirts wurde die größte genetische Distanz zwischen GIT-Proben und zwischen GIT- und RT-Proben beobachtet, während die Distanzen zwischen RT-Proben relativ klein waren. Beispielsweise wurden sieben iSNVs unter den GIT-Proben von P01 geteilt, während keine von ihnen in RT-Proben beobachtet wurde (Abb. 2a). Es scheint, dass die klare genetische Differenzierung zwischen GIT- und RT-Populationen hauptsächlich durch weit entfernte Intra-Wirts-Engpässe getrieben wird. Die genauen viralen Migrationsmechanismen zwischen Intra-Wirt-Populationen erfordern jedoch weitere Untersuchungen.

Genetische Vielfalt und genetische Distanz. ein Boxplot, der die Verteilung der genetischen Diversität zwischen Proben aus dem Gastrointestinaltrakt (GIT) und Respirationstrakt (RT) zeigt. Für die Patienten mit mehr als einer GIT/RT-Probe wurde nur der Medianwert gewählt, um die genetische Diversität in der GIT/RT darzustellen. B Boxplot, der die Verteilung der L1-Norm-Abstände zwischen Proben aus dem Gastrointestinaltrakt (GIT) und Respirationstrakt (RT) zeigt. Jeder Punkt repräsentiert die genetische Distanz zwischen einem einzigartigen Paar

Allelfrequenzdynamik von iSNVs

Frühere Studien haben bei einigen wichtigen RNA-Viren eine longitudinale Evolution von Intra-Wirt-Populationen gezeigt [44,45,46,47,48]. Wir haben zunächst die erkannten iSNVs in Serienproben verglichen. Alle iSNVs früher GIT-Proben wurden auch in späteren GIT-Proben präsentiert, während die meisten iSNVs, die in RT-Proben entdeckt wurden, in mindestens einer folgenden Probe verschwanden, was darauf hindeutet, dass die Intra-Host-Varianten in GIT besser erhalten blieben. Wir konzentrierten uns weiter auf die Allelfrequenzdynamik von iSNVs, die in den GIT-Populationen beobachtet wurden. Bemerkenswerterweise waren die meisten GIT-iSNVs bemerkenswert stabil und zeigten kontinuierliche Trends der AAFs über die Probenahmedaten hinweg. Beispielsweise zeigten innerhalb der GIT-Population von P01 sieben iSNVs kontinuierliche Trends der Allelfrequenzdynamik, darunter vier iSNVs mit erhöhten AAFs und zwei iSNVs mit verringerten AAFs über die drei Probenahmedaten (Abb. 4a). Angesichts ihrer ähnlichen Wachstumsraten, aber unterschiedlichen Allelfrequenzen ist es wahrscheinlich, dass mehr als zwei genetisch verwandte Haplotypen innerhalb der GIT-Population von P01 koexistierten. Ähnliche Muster wurden auch in der GIT-Population von P08 beobachtet ( 4b ). Bemerkenswerterweise veränderte die Dynamik der Intra-Wirt-Variation gleichzeitig die Konsensus-Allele (> 50%) von drei viralen genetischen Loci (3160, 21711 und 28854) in P08 (Abb. 2a), was darauf hindeutet, dass Polymorphismen an den drei Loci mit . korrelieren könnten gegenseitig. Trotz dieser Veränderungen schienen die GIT-Populationen relativ stabil zu sein, während sie sich zu einer hohen genetischen Vielfalt entwickelten. Nichtsdestotrotz beobachteten wir sowohl in P01 als auch in P08 erhöhte AAFs der GIT-spezifischen Varianten (C21711T und G11083T). Es sind jedoch weitere Beweise erforderlich, um zu untersuchen, ob die gewebespezifische Anpassung aktiv an der Divergenz zwischen entfernten Intrawirt-Populationen beteiligt ist.

Zeitliche Dynamik von Intra-Host-Populationen bei den Patienten P01 und P08. ein, B Alternative Allelfrequenzen (AAFs) unter den Probenahmedaten bei den Patienten P01 und P08. Tage nach dem ersten Symptomdatum sind in der Klammer angegeben. Der Probenname (z. B. P01A0129) gibt die Patientennummer P01, den Probentyp (N Nasenabstrich, T Rachenabstrich, A Analabstrich, F Kot, S Sputum) und das Entnahmedatum (29. Januar 2020) an. Kombinierte iSNVs sind die durchschnittliche Häufigkeit von vier ähnlichen iSNVs (A391T, A2275G, C25163A und T27817G). Farben repräsentieren verschiedene iSNVs. Unterstriche stehen für gängige iSNVs

Entwicklung der Intra-Host-Diversität innerhalb der GIT-Population

Wir stufen proximale iSNVs weiter in lokale Haplotypen ein, indem wir Paired-End-Mapping-Reads verwenden (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S8). Die meisten Neben-Haplotypen wiesen einen Unterschied von einem Nukleotid zum dominanten Haplotyp derselben Probe auf, was darauf hindeutet, dass sie vom Hauptstamm der entsprechenden Population mutiert sein könnten. Dennoch beobachteten wir eine Ausnahme in der GIT-Population von P01. An den variablen Loci von C21707T, C21711T und A21717G zeigte die GIT-Population von P01 einen dominanten Haplotyp (T-C-A) und zwei kleinere Haplotypen (T-T-A und T-T-G) (Zusatzdatei 2: Abb. S5). Obwohl ein kleinerer Haplotyp (TTA) relativ stabil war (8–10%), sank der Anteil des dominanten Haplotyps (TCA) von 89 auf 67%, während der des anderen kleinen Haplotyps (TTG) von 2 auf 22% anstieg. . Basierend auf der Haplotyp-Dynamik und ihren Nukleotidunterschieden stellten wir die Hypothese auf, dass der Minor-Haplotyp (TTG) vom dominanten Haplotyp (TCA) über den Intermediate Minor-Haplotyp (TTA) abgeleitet werden kann, was mit dem jüngsten Bericht über das weit verbreitete Auftreten von C . übereinstimmt → U-Hypermutation in den Genomen von SARS-CoV-2 [49]. Wichtig ist, dass unsere Beobachtung unterstützt, dass die mutierten Viren sich weiter replizieren und Varianten in der GIT-Population akkumulieren und sich schließlich in der spezifischen Umgebung zu einer bestimmten viralen Abstammungslinie entwickeln.


G gegen D

Originalbeispiele des Romans Coronavirus aus Wuhan, China, waren eine Variante, die Wissenschaftler heute als "D"-Klade bezeichnen. Vor dem 1. März stammten mehr als 90 % der von Patienten entnommenen Virusproben aus dieser D-Variante. Im Laufe des Märzes begann G zu dominieren. Diese Mutation wird durch den Austausch eines Adenin (A)-Nukleotids gegen ein Guanin (G)-Nukleotid an einer bestimmten Stelle im Coronavirus-Genom verursacht. Es tritt immer neben drei anderen Mutationen auf, die auf ähnliche Weise einen RNA-Baustein gegen einen anderen austauschen. (Die Buchstaben in der RNA helfen bei der Kodierung der Proteine, die das Virus im Inneren einer Zelle herstellt.)

Die G-Variante machte 67 % der weltweiten Proben aus, die im März entnommen wurden, und 78 % der zwischen dem 1. April und dem 18. Mai entnommenen Proben. Während dieser Zeit verlagerte sich der Ort der Ausbrüche von China nach Europa und in die Vereinigten Staaten.

Die Mutation erregte Interesse, weil sie sogar in Bereichen zu dominieren schien, in denen die D-Variante ursprünglich vorherrschte, sagte Bette Korber, Hauptautorin des neuen Cell-Papiers und Computerbiologin am Los Alamos National Laboratory in New Mexico. Sie und ihre Kollegen von der Duke University und dem La Jolla Institute of Immunology in Kalifornien fügten die G-Mutation und die D-Mutation in Pseudoviren ein, bei denen es sich um Viren handelt, die so konstruiert sind, dass sie die Oberflächenproteine ​​anderer Viren zeigen. Pseudoviren sind nützlich, sagte Korber gegenüber Live Science, weil sie keine Krankheiten verbreiten können und weil sie molekulare Markierungen enthalten, mit denen Forscher ihre Bewegung in Zellen verfolgen können.

Die Forscher setzten dann Zellkulturen Pseudoviren mit entweder der G- oder der D-Variante des Coronavirus-Spike-Proteins aus, um zu verfolgen, welche infektiösere war. Sie fanden heraus, dass die G-Variationen zu viel höheren Virusmengen in der Zellkultur führten, was auf eine erhöhte Infektion und Replikation hindeutet. Die gefundenen Viruslasten von G-Variationen des Spike-Proteins waren 2,6 bis 9,3 mal größer als von den D-Variationen des Spike-Proteins.

Die im Experiment verwendeten Pseudoviren und Zellen waren weder echte Coronaviren noch menschlich Lunge Zellen, aber eine andere Studie, die infektiöse SARS-CoV-2-Virionen verwendet, kam zu ähnlichen Ergebnissen. Diese Studie, die am 7. Juli auf dem Preprint-Server veröffentlicht wurde bioRxiv und wurde noch nicht von Experten begutachtet, wurde von dem Biologen Neville Sanjana an der New York University angeführt. Er und seine Kollegen testeten die G- und D-Versionen von SARS-CoV-2 in Zellkulturen, darunter menschliche Lungenzellen, und stellten fest, dass die G-Variante bis zu achtmal mehr Zellen infizierte als die D-Variante.

Aber nur weil ein Virus Zellen in einer Laborkultur besser infizieren kann, heißt das nicht, dass es in der realen Welt übertragbarer ist, sagte Grubaugh. „Wenn es nur noch ein paar Stunden dauert, bis die andere Variante genau dasselbe tut, ist das Ergebnis im Wesentlichen das gleiche“, sagte er gegenüber Live Science. Und die Eingabe von Zellen ist nur ein Teil der Gleichung. Es gibt viele Faktoren, die die Übertragbarkeit beeinflussen, sagte er, wie zum Beispiel, wie effizient das Virus den Körper verlässt und wie stabil es in der äußeren Umgebung ist, während es auf einen neuen Wirt wartet.

Einige klinische Studien haben gezeigt, dass der offensichtliche Vorteil der G-Variante auch außerhalb der Petrischale bestehen könnte. Eine Studie, die am 26. Mai in der Preprint-Datenbank veröffentlicht wurde medRxiv, ebenfalls noch nicht begutachtet, unter der Leitung von Dr. Egon Ozer, den Forschern der Feinberg School of Medicine der Northwestern University, fand Judd Hultquist Mitte März drei verschiedene Versionen von SARS-CoV-2, die in Chicago im Umlauf waren. Einige stimmten mit der dominanten Version überein, die in New York City zirkulierte, einige passten zu der vorherrschenden Version von der Westküste, und einige schienen den Originalproben aus China am nächsten verwandt zu sein.

„Das Virus kam in beide Richtungen rund um den Globus und schlug in Chicago ein, und wir haben das Virus ursprünglich aus China bekommen, wir glauben, dass O’Hare ein solcher Verkehrsknotenpunkt ist“, sagte Hultquist gegenüber Live Science.

Die New Yorker Klade, die die G-Mutation enthielt, war mit einer höheren Viruslast in den oberen Atemwegen verbunden als das Virus, das dem ursprünglichen China-Stamm näher war, fanden die Forscher heraus. Forscher im Bundesstaat Washington haben ähnliche Ergebnisse veröffentlicht. Wenn die Ergebnisse anhalten, könnten sie auf eine erhöhte Übertragung hindeuten, da höhere Viruskonzentrationen in den oberen Atemwegen dazu führen könnten, dass mehr Viren emittiert werden, wenn Menschen atmen und sprechen, sagte Ozer gegenüber Live Science. Aber das kann man nicht mit Sicherheit sagen, sagte er. Wissenschaftler wissen nicht einmal, mit wie vielen Virionen eine Person in Kontakt kommen muss, um sich zu infizieren, daher ist nicht klar, ob die zusätzliche Viruslast einen Unterschied macht.


Diskussion

Trotz der jüngsten Fortschritte in der HCC-Genomik bleibt vieles unklar, insbesondere in Bezug auf HBV-assoziierte HCC. Unseres Wissens ist dies die erste Studie zu HBV-assoziiertem HCC, bei der die HBV-RNA-Messung im Tumorgewebe als alleinige Determinante für den HBV-Status des Tumors verwendet wurde, und die größte Studie zu HBV-assoziiertem HCC, bei der die HBV-RNA-Messung von Tumoren in früheren Studien berücksichtigt wurde haben die Beurteilung des HBV-Status entweder teilweise oder ausschließlich auf klinischen Daten wie gemeldeter HBV-Anamnese oder Virusserologien gestützt und, falls eine HBV-RNA-Messung des Tumors durchgeführt wurde, eine kleinere Kohorte verwendet. Hier berichten wir, dass die HBV-RNA-Messung von Tumoren eine einzigartige Untergruppe von HCC definiert, die durch unterschiedliche klinische und molekulare Merkmale gekennzeichnet ist.

In unserer Kohorte fanden wir, dass HBV-RNA-positives HCC mit ähnlichen klinischen Merkmalen assoziiert war, wie sie in früheren Studien zu HBV-assoziiertem HCC berichtet wurden, einschließlich männlichem Geschlecht, asiatischer Abstammung und jüngerem Alter und höherem Tumorgrad bei Diagnose, obwohl die Gesamtprävalenz von HBV Die RNA-Positivität in unserer Kohorte war mit 28,2 % etwas höher als die für den Kern-TCGA-Datensatz berichteten 22,4 % [6,7]. Wir fanden auch, dass HBV-RNA-positives HCC mit einer angereicherten Transkription von Gensets assoziiert ist, die an einer Vielzahl von zellulären Signalwegen beteiligt sind, sowie Gensets, die im proliferativen HCC-Phänotyp hochreguliert sind, verbunden mit größerer chromosomaler Instabilität und zuvor charakterisiert von Boyault, Chiang, Hoshida , Lee und ihre Kollegen [17–21]. Nach unserem Wissen wurde der Zusammenhang zwischen einer HBV-Infektion und allen vier dieser proliferativen HCC-Unterklassen bisher nicht berichtet.

Darüber hinaus fanden wir, dass bei den 225 Patienten mit positiver klinischer HBV-Annotation im TCGA-Datensatz (d hatte HBV-RNA-negatives HCC. Diese Diskrepanz zwischen der klinischen HBV-Anmerkung und dem HBV-RNA-Status des Tumors bei einer beträchtlichen Untergruppe von Patienten war unerwartet. Während eine ungenaue klinische Annotation des HBV-Status eine mögliche Erklärung dafür ist, besteht eine andere darin, dass einer Untergruppe von Patienten mit HBV-assoziiertem HCC möglicherweise eine intrahepatische HBV-Integration oder HBV-Genexpression fehlt – möglicherweise im Zusammenhang mit ihrer antiviralen Behandlung oder der Seroclearance von Hepatitis B e-Antigen (HBeAg), das mit einer Verringerung der zirkulierenden HBV-DNA verbunden sein kann, die überproportional zur Verringerung der zirkulierenden HBsAg-Spiegel ist [23]. Wie bereits erwähnt, fanden wir auch, dass Gene, deren Mutationsraten signifikant vom HBV-RNA-Status abhingen, sich minimal mit denen überlappten, deren Mutationsraten signifikant vom klinischen HBV-Annotationsstatus abhingen. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass HBV-assoziierte HCC eine genomisch heterogene Gruppe darstellen können, innerhalb derer Tumore mit HBV-RNA-Positivität bedeutende genomische Unterschiede aufweisen im Vergleich zu solchen ohne und für die eine Tumorsegmentierung basierend auf dem HBV-RNA-Status in der Lage sein könnte, aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen Einblicke in diese Heterogenität. Eine ähnliche Heterogenität kann auch innerhalb viraler Untergruppen anderer Virus-assoziierter Tumorarten, wie etwa Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich oder Magenkrebs, bestehen.

Eine kürzlich durchgeführte Studie ergab, dass HBV-Insertionen Veränderungen in verursachen können CCNA2 und CCNE1, die für die Zellzyklusregulatoren Cyclin A2 bzw. Cyclin E1 kodieren, und dass diese Veränderungen mit einem aggressiveren HCC-Phänotyp assoziiert sind, der als Cyclin-driven HCC bezeichnet wird und durch ein einzigartiges Muster häufiger chromosomaler Strukturumlagerungen im Einklang mit einem Bruch definiert ist -induzierter Replikationsmechanismus [24]. Unser Befund, dass HBV-RNA-positives HCC mit einem signifikant höheren HRD-Score mit drei Biomarkern verbunden ist, stimmt damit überein. Die angereicherte Transkription von Gensets für multiple DNA-Schadensreparaturpfade – einschließlich Genen, die an der Fehlpaarung, Basenexzision und Nukleotidexzisionsreparatur beteiligt sind – in HBV-RNA-positiven Tumoren könnte ebenfalls damit in Einklang stehen, da diese Pfade möglicherweise als kompensatorischer Mechanismus in der Einstellung des Replikationsstresses.

Darüber hinaus fanden wir, dass nicht-synonyme somatische Mutationen in mehreren Genen das Gesamtüberleben in unserer Kohorte signifikant beeinflussten, selbst nach Kontrolle auf Kovariaten. Das einzige Gen, bei dem Mutationen mit einem Überlebensvorteil verbunden waren, war BAP1, bei HBV-RNA-negativen Patienten. (BAP1 Mutationen waren fast ausschließlich in HBV-RNA-negativen Tumoren in unserer Kohorte vorhanden der einzige HBV-RNA-positive Tumor mit a BAP1 Mutation hatte eine relativ niedrige HBV-RNA-Read-Zahl von 2,84 HBV-Reads pro Million menschlicher Reads, was sie im untersten Dezil der HBV-RNA-Read-Zahlen unter HBV-RNA-positiven Tumoren platziert.) BAP1 ist eine Deubiquitinase und ein Tumorsuppressor, der in menschlichen Leberzellmodellen , scheint die Zugänglichkeit von Chromatin und die Genexpression zu regulieren [25]. Bei anderen Tumorarten, BAP1 Mutationen wurden sowohl mit einem erhöhten als auch mit einem verringerten Überleben in Verbindung gebracht: während BAP1 Expressionsverlust und Keimbahnmutationen sind mit einem Überlebensvorteil beim malignen Pleuramesotheliom verbunden [26,27], sie sind mit einem schlechteren Überleben beim Aderhautmelanom und klarzelligem Nierenzellkarzinom verbunden [28]. Obwohl wir also nicht festgestellt haben, dass der HBV-RNA-Status selbst mit dem Überleben in Verbindung steht, interagiert er mit spezifischen Mutationen, um die unterschiedlichen Überlebensergebnisse zu verändern, einschließlich BAP1, wo Mutationen bei HBV-RNA-negativen Patienten mit einem erhöhten Überleben verbunden waren. Dies – zusammen mit der Feststellung, dass BAP1 Mutationsraten waren signifikant höher, und BAP1 Mutationen fast ausschließlich vorhanden, in HBV-RNA-negativen Tumoren – deutet darauf hin BAP1 mutiertes HCC könnte einen HCC-Subtyp darstellen, der durch fehlende HBV-Aktivität im Tumor und verbesserte Ergebnisse gekennzeichnet ist. Es ist zwar unklar, warum unsere Kohorte ein nahezu vollständiges Fehlen der Überlappung zwischen HBV-RNA-positiven Tumoren und BAP1 mutierten Tumoren gibt es zwei faszinierende Möglichkeiten. Erstens deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, dass BAP1 eine anti-apoptotische Rolle im Lebergewebe spielt und dass BAP1 mutiertes HCC ist mit einer Dysregulation des PKA-Signalwegs verbunden [25,29] Eine HBV-Infektion bei HCC kann eine dieser Funktionen direkt ersetzen und somit den Selektionsdruck verringern, der andernfalls den BAP1-Verlust begünstigt hätte. Zweitens ist bekannt, dass BAP1 selbst mit BRCA1 interagiert, daher können HBV-Effekte auf HRD HBV-RNA-positives HCC anfälliger für genomische Instabilität in Gegenwart von BAP1-Verlust machen und das Auftreten dieser Mutation begünstigen.

Schließlich fanden wir heraus, dass Mutationen in mehreren Genen mit einem schlechteren Überleben verbunden waren, einschließlich KEAP1 Mutationen selektiv in der begrenzten Untergruppe von 7 HBV-RNA-positiven Patienten, die diese Mutationen aufweisen. KEAP1 ist ein Redox-Sensing-Protein, das mit NRF2 als Teil des Reaktionswegs von oxidativem Stress interagiert. Wie bereits erwähnt, fanden wir einen nicht signifikanten Trend zu NFE2L2, das für NRF2 kodiert und fast ausschließlich in HBV-RNA-negativen Tumoren mutiert ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in unserer Kohorte HBV-RNA-positive Tumoren durch ein nahezu vollständiges Fehlen von . gekennzeichnet waren NFE2L2 Mutationen und eine Assoziation zwischen KEAP1 Mutationen und eine verringerte Überlebensrate bei der begrenzten Untergruppe von Patienten mit diesen Mutationen – könnten einen funktionellen Unterschied in der Art und Weise nahelegen, in der der Reaktionsweg auf oxidativen Stress bei HBV-vermittelter Tumorentstehung im Vergleich zu Nicht-HBV-HCC fehlreguliert ist.

Der Befund, dass HBV-RNA-positive Tumoren in unserer Studie eine wesentliche Mehrheit von unterschiedlich mutierten Genen und unterschiedlich exprimierten Gensets enthielten, war unerwartet. Wie bereits erwähnt, variierte die Tumormutationslast basierend auf dem HBV-RNA-Status nicht signifikant, wobei eine höhere Gesamtmutationslast bei HBV-RNA-positiven Tumoren als Ursache dieses Phänomens ausgeschlossen wurde.Wir haben auch die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass HBV-RNA-negative Tumoren mehrere genotypische Untergruppen umfassen könnten, so dass der Vergleich aller dieser Tumoren als eine einzige Gruppe wichtige Variationen zwischen den Untergruppen maskieren könnte, aber die Hauptkomponentenanalyse der normalisierten RNA-Seq-Gen-Level-Read-Zahlen war inkonsistent damit (S3 Abb). Während die Ursache dieses Phänomens unklar bleibt, besteht eine Möglichkeit darin, dass HBV einen spezifischen genotoxischen Stress ausübt, der unabhängig von anderen tumorbiologischen Merkmalen ist und eine eigene separate Heterogenität besitzt.

Unsere Studie hat mehrere Einschränkungen. Erstens haben wir die Tumor-HBV-RNA-Messung als Proxy für die virale Aktivität verwendet, anstatt diese direkter zu messen (z. B. durch direkte Virion-Quantifizierung in Tumorgewebe). Wir hielten dies für vernünftig, weil die Transkription von HBV-DNA in RNA ein wichtiges Ereignis im Lebenszyklus des Virus ist und weil wir, wie bereits erwähnt, eine ausgezeichnete Übereinstimmung zwischen dem HBV-RNA-Status und dem genomischen Nachweis der HBV-Integration, einem weiteren wichtigen Ereignis im Lebenszyklus, gefunden haben. Zweitens, obwohl der Schwellenwert von 1 HBV-RNA-Read pro Million Human Reads (RPM), der verwendet wurde, um den HBV-RNA-positiven Status zu definieren, auf Präzedenzfällen für seine Verwendung in früheren Studien beruhte [6,30], hätten wir einen anderen Schwellenwert wählen können. Die Verwendung eines alternativen Schwellenwerts von 0,5 oder 2 U/min hätte unsere Ergebnisse jedoch nicht wesentlich verändert, da die Tumor-RPM-Scores nicht um den 1-RPM-Schwellenwert gruppiert waren. Drittens war unsere Kohorte klinisch und pathologisch heterogen, was erklären könnte, warum sich einige unserer Ergebnisse von früheren veröffentlichten Studien unterscheiden, wie zuvor diskutiert. Viertens basieren einige der zuvor erwähnten Assoziationen zwischen nicht-synonymen somatischen Mutationen und dem Überleben auf begrenzten Stichprobengrößen – z. B. 7 HBV-RNA-positive Patienten mit KEAP1 Es wurde festgestellt, dass Mutationen die Überlebensrate signifikant verringert haben – und daher eine vorsichtige Interpretation erforderlich ist.

Unsere Ergebnisse legen mögliche Wege für zukünftige Untersuchungen nahe. Erstens wurde der Zusammenhang zwischen HBV-RNA-positivem HCC und einem erhöhten HRD-Score mit drei Biomarkern bisher nicht berichtet und wirft die Frage auf, ob diese Tumoren für HRD-gerichtete Therapien zugänglich sind. Bei anderen Tumorarten wurden Drei-Biomarker-HRD-Werte von 42 oder höher mit einer Sensitivität gegenüber dem PARP-Inhibitor Niraparib (bei rezidivierendem Ovarialkarzinom) [31] und einer Platin-Chemotherapie (bei triple-negativem Brustkrebs) [32] in Verbindung gebracht. Während der in diesen Studien verwendete HRD-Score-Schwellenwert von 42 wesentlich höher ist als der mediane HRD-Score von 22 in unserer HBV-RNA-positiven Kohorte, gibt es große Unterschiede bei den HRD-Scores zwischen den Tumorarten, und niedrigere HRD-Score-Schwellenwerte haben sich in anderen als prognostisch erwiesen Tumorarten wie Prostatakrebs, bei denen ein HRD-Score-Schwellenwert von 20 mit einem potenziellen Ansprechen auf HRD-gerichtete Therapien in Verbindung gebracht wurde [33]. Auch wenn eine frühere Phase-II-Studie mit Temozolomid und dem PARP-Inhibitor Veliparib bei fortgeschrittenem HCC keinen Überlebensvorteil zeigte (ClinicalTrials.gov-Kennung NCT01205828), verwendete diese Studie den Tumor-HBV-Status nicht als Patientenauswahlkriterium [34]. Zweitens werfen unsere Ergebnisse die Frage auf, inwieweit der Tumor-HBV-RNA-Status mit Serummarkern der HBV-Infektion wie Serologien und Viruslast übereinstimmen kann und ob die direkte Messung von Tumor-HBV-RNA eine erweiterte Rolle spielen könnte – z Leberbiopsie – im Rahmen der Vorbehandlung.

Zusammenfassend berichten wir hier, dass HCC-Tumoren mit genomischem Nachweis von HBV-Aktivität eine eigene HCC-Untergruppe darstellen, die durch spezifische Unterschiede in nicht-synonymen somatischen Mutationen, Genexpression, Drei-Biomarker-HRD-Score und mutationsspezifischem Überleben gekennzeichnet ist. Diese Unterschiede können eine Begründung für zukünftige therapeutische Studien liefern, einschließlich Studien zu HRD-gerichteten Therapien, in dieser einzigartigen Patientenuntergruppe. Sie schlagen auch vor, dass eine Tumorsegmentierung basierend auf dem genomischen Nachweis der HBV-Aktivität aussagekräftige Einblicke in die Heterogenität von HBV-assoziierten HCC liefern könnte, auch in Bezug auf die Ergebnisse früherer therapeutischer Studien (z. B. haben frühere Studien mit Multikinase-Inhibitoren bei fortgeschrittenem HCC widersprüchliche Ergebnisse bezüglich der Auswirkung des HBV-Status auf das Überleben [35,36], eine mögliche Erklärung dafür ist, dass die intratumorale Virusaktivität ein nicht gemessener Störfaktor gewesen sein könnte). Weitere Studien sind erforderlich, um unsere Ergebnisse in einer größeren Kohorte zu validieren, und die hier aufgeworfenen Fragen legen nahe, dass eine integrierte genomische und virologische Charakterisierung von HBV-assoziierten HCC dringend erforderlich ist.


SARS-CoV-2-Mutationsrate im Frühstadium der Pandemie

Das Genom von SARS-CoV-2 galt bisher als genetisch stabiler als das von SARS-CoV oder MERS-CoV [40]. Das Mutationsrisiko von SARS-CoV-2 ist jedoch, abhängig von den derzeit verfügbaren Nachweisen der Genomsequenz, dem von SARS, das die Epidemie in den Jahren 2002-2003 auslöste, signifikant ähnlich [1, 41]. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Genome von SARS-CoV-2 sehr homogen sind. Molekulargenetiker, die die Entwicklung des Virus genau verfolgen, haben vorgeschlagen, dass die SARS-CoV-2-Mutationsrate niedrig bleiben würde [41, 42]. Obwohl in der Regel vernünftigerweise davon auszugehen ist, dass SARS-CoV-2 weiterhin in geringer Rate mutiert, konzentrieren sich alle vorliegenden Analysen ausschließlich auf Daten im Frühstadium dieser Pandemie [41]. Die Entwicklungs- und Mutationsdynamik von SARS-CoV-2 muss ebenfalls sorgfältig untersucht werden, da sich das Virus weiterhin schnell auf der ganzen Welt ausbreitet und sich mehr genomische Beweise häufen [41]. Yong-Jiaet al. entdeckten, dass im Zentrum des phylogenetischen Baums mit dem kürzesten Ast die ersten wenigen aufgezeichneten SARS-CoV-2-Akzessionen aus Wuhan China identifiziert wurden. Interessanterweise wurden verschiedene US-Virusgenome identifiziert, die den mutmaßlichen Ausgangsvarianten des Wuhan-Virus fast ähnlich sind [41].

Roujian Lu et al. fanden zuerst heraus, dass das S-Protein RBD in SARS-CoV-2 mit menschlichem SARS-CoV verwandt ist, während der andere Teil seines Genoms viel analoger zu SARS-CoV-Fledermäusen ist [43]. Tommy Tsan-Yuk Lam et al. beschrieben später eine CoV-RaTG13-Fledermaus und viele SARS-CoV-Schuppentiere, die SARS-CoV-2 signifikant ähnlich sind als menschliches SARS-CoV entweder in Full-S- oder RBD-Protein [44]. Abhängig von der engen Assoziation von SARS-CoV-2 mit SARS hat sich die laufende Produktion von SARS-CoV-2-Impfstoffen und Medikamenten auch auf das S-Protein und seinen humanen Bindungsrezeptor ACE2 konzentriert [45, 46]. Beobachtungen von Yong Jia et al. hat Alarm geschlagen, dass jederzeit eine SARS-CoV-2-Mutation mit einem variierenden Epitop-Phänotyp auftreten kann, was darauf hindeutet, dass die bestehende Produktion des Impfstoffs gegen SARS-CoV-2 mit hohem Risiko wirkungslos bleibt. Da der Rezeptoridentifikationsprozess zwischen SARS-CoV-2 und SARS-CoV, der nachweislich den spezifischen menschlichen Zellrezeptor ACE2 teilt, stark konserviert ist [41]. Eine Empfehlung für die nächste Phase der Wirkstoffforschung wird sich wahrscheinlich auf die Entdeckung möglicher humaner ACE2-Blocker-Rezeptoren konzentrieren, wie in einer aktuellen Stellungnahme angegeben [45]. Diese Strategie würde die oben erwähnte Bedrohung für die Entwicklung von Impfstoffen überwinden.

Hangping Yao et al. stach in ihrer Studie drei Ergebnisse hervor: Erstens wurde in den 11 Virusisolaten eine große Anzahl von Mutationen gemeldet, darunter zwei Mutationssätze, die zwei Hauptcluster von Viren bilden, die derzeit die Weltbevölkerung infizieren können. Darüber hinaus sind angesichts der vergleichsweise frühen Probenahmedaten 19 der 31 gefundenen Mutationen neu, was darauf hindeutet, dass die wahre Vielfalt der Virusstämme immer noch meist unterbewertet wird. und das Kartieren der aktuellen Struktur zeigte, dass dieser Rest in einem stabilen Schleifenbereich innerhalb der N-terminalen Domäne der S-Protein-Untereinheit S1 liegt. Die genaue Lokalisation von S247 konnte jedoch nicht festgestellt werden [47]. Obwohl die N-terminale Domäne nicht explizit mit ACE2 verwandt ist [48], haben Hangping Yao et al. gibt an, dass sich diese Domäne direkt neben der C-terminalen Domäne befindet, die mit ACE2 verbunden ist. Überraschenderweise wurde die T22303G-Mutation in 5 Virusisolaten gefunden, wenn auch in bestimmten Mengen, was darauf hindeutet, dass diese spezielle Mutation in den frühen Tagen der Pandemie noch vorhanden war, und möglicherweise bei einer kleinen Anzahl von Bürgern von Wuhan, da sie immer noch vorhanden ist fehlen meist in der aktuellen GISAID-Datenbank [47]. Es kann auf den Gründungseffekt der Mutation zurückzuführen sein, in dem die T22303G-Mutation in den frühen Tagen nicht aus China übertragen wurde [47] 3. Die Trinukleotid-Mutation in ZJU-11 ist unerwartet, dass sie in ihrer Viruslast und Zytopathika erkennen Wirkungstest (CPE) ist dieses spezielle Virusisolat sehr aktiv, und ihr Patient blieb über einen beeindruckenden Zeitraum von 45 Tagen positiv und wurde erst kürzlich aus dem Krankenhaus entlassen [47]. Dies wird besonders wichtig sein, um die praktische Wirkung dieser Trinukleotid-Mutation zu untersuchen. Sie stellen fest, dass in der bestehenden Sammlung eine weitere Trinukleotid-Mutation (G28881A, G2882A und G28883C) gefunden wurde, die ebenfalls zu zwei Missense-Mutationen auf Proteinebene beiträgt. Es trägt zu einem Cluster von über 300 Virusstämmen bei, und es lohnt sich, deren Mutationswirkung auf die virale Pathogenität zu untersuchen [47]. Im Vergleich zu der kürzlich durchgeführten Studie, dass kein lebensfähiges Virusisolat aus Stuhlproben gewonnen werden konnte, wurden schließlich drei ihrer isolierten Virusproben aus Stuhlproben gewonnen [47], was darauf hindeutet, dass sich SARS-CoV-2 in Stuhlproben vermehren würde [47]. 49].

Yvonne CF Su et al. identifizierten das erste signifikante biologische Vorkommen des SARS-CoV-2-Virus seit seiner Einführung in die menschliche Gemeinschaft [40]. Während die biologischen Auswirkungen dieser Deletion unklar sind, könnte dies aufgrund der Modifikation der N-Gen-Transkription den Virus-Phänotyp beeinflussen [40]. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass ORF8 von SARS-CoV eine spezifische Rolle bei replikativen Fitnessviren spielt und mit der Abschwächung in den Anfangsstadien der Übertragung von Mensch zu Mensch korreliert werden kann [50]. Angesichts des Auftretens mehrerer Deletionen im ORF8 von SARSr-CoV ist es möglich, dass sich mit der fortgesetzten Übertragung von SARS-CoV-2 beim Menschen weitere Formen der Deletion entwickeln [40]. Potenzielle Arbeiten werden sich auf die phänotypischen Auswirkungen von Δ382 Viren über globale Krankheitsausbreitungsmechanismen und die unmittelbare Anwendung dieses genomischen Markers auf die molekularepidemiologische Wissenschaft [40].


Wir danken den Kerneinrichtungen für Bio- und Medizintechnik, School of Life Sciences, Beijing Institute of Technology, für die Unterstützung bei experimentellen Studien.

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Zhao, Y., Lin, L., Zhang, Y. und Geng, D. (2017). Die SHP-2-Aktivierungsmutation fördert das bösartige biologische Verhalten von Gliomzellen. Med. Wissenschaft Überwachen. 23, 2931�. doi: 10.12659/msm.904381

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Schlüsselwörter : SHP2-Mutation, Tumor, zellautonome/nichtzellautonome Mechanismen, SHP2-Hemmung, Tumormikroumgebung

Zitat: Dong L, Han D, Meng X, Xu M, Zheng C und Xia Q (2021) Die Aktivierung der Mutation von SHP2 etabliert einen tumorigenen Phonotyp durch zellautonome und nichtzellautonome Mechanismen. Vorderseite. Zell-Entw. Biol. 9:630712. doi: 10.3389/fcell.2021.630712

Eingegangen: 18. November 2020 Angenommen: 04. Januar 2021
Veröffentlicht: 11. März 2021.

Serge Roche, Institut National de la Santé et de la Recherche Mຝicale (INSERM), Frankreich

Jean-max Pasquet, Institut National de la Santé et de la Recherche Mຝicale (INSERM), Frankreich
Ernesto Diaz-Flores, University of California, San Francisco, USA

Copyright © 2021 Dong, Han, Meng, Xu, Zheng und Xia. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License (CC BY) verbreitet wird. Die Verwendung, Verbreitung oder Vervielfältigung in anderen Foren ist unter Nennung der Urheber und Urheber sowie unter Angabe der Originalpublikation in dieser Zeitschrift im Einklang mit der anerkannten wissenschaftlichen Praxis gestattet. Es ist keine Verwendung, Verbreitung oder Vervielfältigung gestattet, die nicht diesen Bedingungen entspricht.


Wir danken den Autoren und den Ursprungs- und Einreichlaboratorien der Sequenzen aus der EpiCov-Datenbank von GISAID, auf der diese Forschung basiert. Wir danken Lionel Condé, Robert Gramzinski, Joshua Herbeck, Mélanie Merbah, Thembi Mdluli, Lydie Trautmann, Douglas Whalin und Suzanne Wollen-Roberts. Wir danken auch zwei Gutachtern für kritische Verbesserungen des Originalmanuskripts. Diese Arbeit wurde von der Gesundheitsbehörde des US-Verteidigungsministeriums und dem US-Armeeministerium sowie einer Kooperationsvereinbarung zwischen der Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. und dem US-Armeeministerium (W81XWH-18 .) finanziert -2-0040). Die geäußerten Ansichten sind die der Autoren und sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie die Positionen der US-Armee, des Verteidigungsministeriums oder des Gesundheitsministeriums repräsentieren.

↵ 1 BD und E. L. trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit bei.

↵ 2 km und M. R. trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit bei.

Autorenbeiträge: B.D., E.L., K.M. und M.R. haben die Forschung von B.D., E.L., H.B. und Y.L. führte Forschungen durch M.G.J., P.T.S., M.F.A., S.V. und N.L.M. steuerten neue Reagenzien/Analysewerkzeuge bei B.D., E.L., H.B., Y.L., D.B.R. und M.R. analysierten Daten und B.D., E.L., K.M. und M.R. schrieben die Arbeit.

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

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