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Primer-Design für HLA-Locus

Primer-Design für HLA-Locus


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Ich habe Primer für den HLA-Locus DPA1 (Exon 2-Region) basierend auf den Primer-Design-Richtlinien für die Real-Time-PCR (qPCR) entwickelt. Primer wird von Intron-Regionen ausgehen, um die gesamte exonische Region abzudecken.

F-CAGCAACAGAGAATGTCAGC

R-CCCTGAAGCAGCAATTGATG

um zu prüfen, ob nur eine einzelne Region amplifiziert wurde, habe ich in silico PCR UCSC verwendet, aber es zeigt mehrere Regionen von chr6.

Bitte helfen Sie mir bei der Lösung dieses Problems.

Danke


Überprüfen Sie beim Design von rtPCR-Primern immer die umfangreiche und gut validierte taqman-Bibliothek für das ABI-System, die Primer für die gewünschte Region sind bereits gut charakterisiert:

http://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/details/gene-expression/Hs01072897_m1#more-information-section


Primer-Design für HLA-Locus - Biologie

Dies ist der erste Bericht über die Präimplantations-HLA-Sequenzierung unter Verwendung der Sequenzierungstechnik der nächsten Generation.

Die hochauflösende Typisierung von HLA-A, -B, -C, -DRB1 und -DQB1 wurde in Einzelzellen vor der Implantation durchgeführt.

Bei 92,2 % aller Allele von Embryonen wurde eine Typisierung mit niedriger Auflösung erreicht.

Bei 88,9 % der Allele wurde eine schlüssige hochauflösende Typisierung erreicht.

Es wurde eine Amplifikationseffizienz von 93,3 % mit einer Allel-Drop-out-Rate von 22,2 % gefunden.


Hintergrund

Die Region des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 ist eine der komplexesten Regionen im menschlichen Genom mit extremen Polymorphismus und Kopplungsungleichgewichten [1–3]. Mit einer Spannweite von etwa 4 Mb umfasst der MHC viele hundert Gene [4]. Von diesen werden die Gene des humanen Leukozytenantigens (HLA) am bekanntesten untersucht. Die HLA-Gene codieren Zelloberflächenproteine, die für die Antigen-Peptid-Präsentation in einer zellvermittelten Immunantwort verantwortlich sind. Vererbte DNA-Sequenzvariationen innerhalb dieser Gene sind stark mit Autoimmun- und Infektionskrankheiten sowie schweren unerwünschten Arzneimittelwirkungen assoziiert [5–8]. Klinisch werden HLA-Sequenzinformationen auch häufig verwendet, um Spender und Empfänger bei der Transplantation zuzuordnen, da ähnliche Allele das Risiko einer Abstoßung verringern [9].

Bis heute wurden 2048 eindeutige 4-stellige HLA-Allele in der IMGT/HLA-Datenbank der Klasse I und 751 der Klasse II beschrieben [10]. Über viele Jahre hinweg wurden bewährte Verfahren der HLA-Typisierung traditionell von den Teilnehmern des Internationalen Histokompatibilitäts-Workshops verbreitet. Etablierte Methoden umfassen die sequenzspezifische Oligonukleotid-(SSO)-Hybridisierung und neuerdings die Kapillarsequenzierung (Sanger-Methode). Bei der SSO-Hybridisierung werden Oligonukleotidsonden verwendet, um die Anwesenheit (oder Abwesenheit) von für jede Sonde spezifischen Polymorphismen nachzuweisen[11]. Die Sanger-Methode verwendet Kettenabbruchfluoreszenz zum Nachweis und zur Sequenzierung von DNA-Basenpaaren.

Obwohl sich diese Methoden für die HLA-Typisierung als effektiv erwiesen haben, bleiben sie arbeitsintensiv, zeitaufwendig und teuer. Ein besonderer Nachteil der Sanger-Sequenzierung besteht außerdem darin, dass sie nicht zwei separate, haploide Sequenzen erzeugt, was es in einigen Fällen schwierig macht, die einzelnen HLA-Haplotyp-Sequenzen in einem diploiden Chromosom 6-Paar aufzulösen. Das Aufkommen von Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation motiviert uns, ein effizientes Protokoll zur Genotypisierung der klassischen HLA-Gene der Klasse I zu entwickeln.

Unsere Strategie für die HLA-Typisierung verwendet die 454 GS FLX Titanium-Sequenzierungsplattform (Roche) und ermöglicht die Verwendung von Sequenz-Tags oder Barcodes, um jede DNA-Probe entweder in der Phase der Amplikon-Präparation (unter Verwendung von PCR-Primern, die mit einem molekularen Barcode versehen sind) oder . zu markieren während des Bibliotheksaufbaus (unter Verwendung von Barcode-Adaptern) (Abbildung 1, Zusätzliche Datei 1).

HLA-Klasse-I-Amplifikationsstrategie. Die PCR-Amplifikation der polymorphen Exons 2 und 3 in den Klasse-I-HLA-Loci wurde vor der 454-Sequenzierung durchgeführt (unter Verwendung von Primern innerhalb von Introns, die jedes Exon umgeben).

Das erste Verfahren, das als "Bibliothekskonstruktion-basiertes Strichkodieren" bezeichnet wird, beinhaltet das Hinzufügen eines molekularen Strichcodes zum Standard-454 "A"-Adapter, der während der Bibliothekskonstruktion an doppelsträngige Exon-spezifische Amplikons ligiert wird. Die Exon-spezifischen Amplikons werden nach der PCR probenweise (sechs Produkte pro Pool) gepoolt, und bis zu 96 Proben werden nach der Barcode-Adapter-Ligation gepoolt (Additional File 1).

Das zweite Verfahren, das als "PCR-basiertes Strichcodieren" bezeichnet wird, beinhaltet das Hinzufügen eines Strichcodes zu den Vorwärts- und Rückwärts-Exon-spezifischen PCR-Primern. Allen 6 Exon-spezifischen Primerpaaren (Exons 2 und 3 von HLA-A, -B und -C) für eine gegebene Probe wird der gleiche einzigartige Barcode hinzugefügt. Insgesamt wurden 95 verschiedene Strichcode-Primer-Sets entworfen, wobei ein leeres 96. Well als Positionsschlüssel übrig blieb (Additional File 1). Nach der PCR werden alle Amplikons aus allen 95 Proben gepoolt und der Pool durchläuft die Standardbibliothekskonstruktion unter Hinzufügung eines Adapters ohne Barcode.

Beide Methoden erleichtern das Proben-Multiplexing vor der Emulsions-PCR und -Sequenzierung, wodurch die Gesamtkosten pro Person drastisch reduziert werden, bei Gesamtkosten von weniger als 40 USD pro Probe für die Typisierung der Klasse-I-Gene HLA-A, -B und -C. Mit diesen Methoden kann ein einzelner Techniker bis zu 96 Proben gleichzeitig verarbeiten und in weniger als drei Tagen eine sequenzbereite Bibliothek erstellen. Da wir die FLX Titanium-Chemie verwenden, erstrecken sich Sequenzlesevorgänge über ganze Exons der HLA-Gene (

Parallel dazu haben wir einen HLA-Calling-Algorithmus entwickelt, um Sequenz-Reads aus dem heute üblichen SAM/BAM-Format zu verarbeiten und klassische Typen für eine gegebene DNA-Probe abzuleiten (Abbildung 2)[12]. In der Erkenntnis, dass die Verbesserungen bei den Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation schnell erfolgen, haben wir den HLA-Caller als integralen Bestandteil des Genome Analysis Toolkit (GATK) entwickelt, einem Datenverarbeitungstool für die Rekalibrierung, Qualitätskontrolle und Variantenaufruf von Sequenzen der nächsten Generation Daten [13].

Schema des HLA-Caller-Algorithmus. Der HLA-Calling-Algorithmus bestimmt das wahrscheinlichste Paar von HLA-Typen an jedem Locus, indem er alle möglichen Paare von 4-stelligen HLA-Typen systematisch auswertet. A) Der Genotypisierungsalgorithmus innerhalb des GATK berechnet die Wahrscheinlichkeit, bestimmte Genotypen in den Daten zu beobachten, wenn ein Paar von HLA-Allelen gegeben ist. Wahrscheinlichkeiten wurden multiplikativ über Basispositionen kombiniert, um die kumulative Wahrscheinlichkeit basierend auf Genotypen zu erhalten. B) Eine Binomialverteilungsfunktion wurde verwendet, um die Wahrscheinlichkeit der Beobachtung bestimmter Haplotypen in den Daten zu berechnen, die einem Paar von HLA-Allelen gegeben wurden. Wahrscheinlichkeiten wurden multiplikativ über Paare von polymorphen Positionen kombiniert, um die auf der kumulativen Wahrscheinlichkeit basierenden Phaseninformationen zu erhalten. C) Frühere Wahrscheinlichkeiten für spezifische Allelpaare wurden als Produkt der Allelhäufigkeiten in einer spezifischen Population berechnet. Wahrscheinlichkeiten basierend auf Genotypen, Phaseninformationen und Allelfrequenzen wurden multiplikativ kombiniert, um die Posterior-Wahrscheinlichkeit für jedes HLA-Allelpaar zu erhalten.

Der HLA-Calling-Algorithmus bestimmt das wahrscheinlichste Paar von HLA-Typen an jedem Locus, indem er alle möglichen Paare von 4-stelligen HLA-Typen systematisch auswertet. Wir verwenden drei Schlüsselkomponenten, um die Posterior-Wahrscheinlichkeit für jedes HLA-Allelpaar zu berechnen. Zuerst vergleichen wir Genotypen für jedes Allelpaar mit den Genotypen, die vom Genome Analysis Toolkit (GATK) basierend auf Sequenzdaten bestimmt wurden. Zweitens überprüfen wir die allelische Phase jedes HLA-Allelpaares auf Übereinstimmung mit den Sequenzdaten. Insbesondere berechnen wir die binomiale Wahrscheinlichkeit, dass die Phasenorientierung für ein spezifisches HLA-Allelpaar mit den Sequenzdaten an einem Paar benachbarter polymorpher Stellen übereinstimmt, und aggregieren diese Wahrscheinlichkeiten über alle Paare von polymorphen Stellen. Drittens verwenden wir Informationen über die erwartete Allelfrequenz, um die vorherige Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, jedes Paar von HLA-Allelen in der Population zu beobachten (wenn die Abstammung bekannt ist). Anschließend multiplizieren wir die aus Basisgenotypen, Allelphaseninformationen und Allelfrequenzen berechneten Wahrscheinlichkeiten, skalieren neu (um sicherzustellen, dass sich alle Posterior-Summe auf 1 summieren) und geben die Posterior-Wahrscheinlichkeit für jedes HLA-Allelpaar aus. Das Paar mit der höchsten Posterior-Wahrscheinlichkeit entspricht dem am besten geschätzten Genotyp für diese DNA-Probe.

In dieser Studie vergleichen wir unser Protokoll an DNA-Proben, die im International HapMap Project verwendet wurden, mit bekannten HLA-Typen: 270 Proben für das bibliotheksaufbaubasierte Barcode-Verfahren und 95 Proben für das barcodierte PCR-Verfahren. Wir haben die Probenanzahl in unserem Validierungstest der barcodierten PCR-Methode aufgrund der Ähnlichkeiten mit der bereits getesteten Methode auf Basis der Bibliothekskonstruktion und der Anzahl der pro Platte angeordneten barcodierten Primer auf 95 begrenzt (d. h. 95 Barcodes plus 1 leeres Well). Wir demonstrieren, dass wir zuverlässige HLA-Anrufe generieren und in einigen Fällen die bestehenden Anrufe verbessern können, aber auch Fälle problematischer Allele hervorheben, bei denen Anrufe in unserem aktuellen Protokoll weniger robust sind. Insgesamt bietet unser Protokoll eine vergleichbare Datenqualität, übertrifft jedoch die traditionelle Sanger-Sequenzierung in Bezug auf Kosteneffizienz und Durchsatz.


EINLEITUNG

Der Komplex des humanen Leukozyten-Antigens (HLA) befindet sich auf Chromosom 6p21 und umfasst Dutzende von Genen, die für die Immunfunktion wichtig sind (1, 2). Von zentraler Bedeutung für die Bestimmung der antigenen Spezifitäten der adaptiven Immunantwort besteht eine im HLA-Komplex kodierte Genfamilie aus den „klassischen“ HLA-Genen ( 3, 4). Die genaue Zuordnung einzelner HLA-Allele an diesen Loci ist in mehreren Disziplinen unerlässlich, z.B. Klinische Transplantationsmedizin ( 5, 6), Anfälligkeitsforschung für Entzündungskrankheiten ( 7–9), Tumorimmunologie ( 10–12) und Evolutionsbiologie ( 13).

Bis vor kurzem erfolgte die HLA-Typisierung hauptsächlich mit sequenzspezifischen Oligonukleotidsonden (SSOP), sequenzspezifischen Primern (SSP) und der sequenzbasierten Typisierung (SBT) mit der Sanger-Sequenzierung der Exons 2 und 3 in Klasse-I-HLA-Genen (HLA-A/B/C) oder Exon 2 in Klasse-II-HLA-Genen (HLA-DR/DQ/DP). Hochauflösendes (dh alle Kodierungsvariationen abdeckend und nach Nomenklaturkonsens zumindest das erste und zweite Feld, klassisch „vierstellig“)) Typisierung mittels SSOP und/oder SSP ist normalerweise ein iterativer Ansatz, der mit niedrigauflösender Typisierung beginnt (dh erstes Feld, klassisch zweistellig), gefolgt von weiteren Charakterisierungen, soweit dies für die Anwendung erforderlich ist. Dieser Prozess ist zeitaufwendig und mit keinem Hochdurchsatz-Forschungskontext vereinbar. Die auf der Sanger-Sequenzierung basierende Typisierung kann eine hochauflösende Typisierung durchführen, erfordert jedoch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation einzelner Exons an jedem Locus und oft mehrere separate Sequenzierungsreaktionen für jedes Amplikon. Darüber hinaus enthalten die Ergebnisse in der Regel eine Vielzahl von cis/trans-Ambiguitäten, d. h. heterozygote Positionen können nicht ausreichend phasiert werden und alle zum Sequenzierungsergebnis passenden Allele werden somit als mögliche Genotypkombinationen aufgelistet. Eine auf PCR und Sanger-Sequenzierung basierende Methode, die eine eindeutige HLA-Typisierung für vier HLA-Loci generiert, wurde von Voorter veröffentlicht et al. ( 14). Obwohl es automatisierbar ist und zuverlässige Ergebnisse liefert, bleiben praktische Herausforderungen aller PCR-basierten Ansätze bestehen.

In den letzten Jahren haben sich alternative SBT-Methoden mit Next-Generation-Sequencing (NGS)-Technologie herauskristallisiert ( 15–20). Die meisten dieser NGS-Methoden beruhen auf der traditionellen PCR der Zielregionen, gefolgt von einer massiven parallelen Sequenzierung der Amplikons. Der Vorteil von NGS ist die Einzelstrang-Sequenzierungsnatur in Kombination mit der erhöhten Anzahl von Sequenzierungs-Reads pro Probe und Locus. Dies ermöglicht eine hochgradig sichere Allelbestimmung, die im Folgenden als Calling bezeichnet wird. Aufgrund der einzelsträngigen NGS-Reads ermöglichen die neuen Typisierungsansätze oft eine intragene Phaseneinstellung zwischen polymorphen Nukleotiden. Für diese NGS-Ansätze bleiben jedoch die Einschränkungen der anfänglichen PCR bestehen. Amplikonbasierte Methoden sind aufwendig, erfordern umfangreiche Optimierungsschritte für PCR-Primer und erfordern oft eine manuelle Kuratierung der Ergebnisse.

Für gezielte NGS sind Array-basierte ( 21) und Bead-basierte ( 22) Anreicherungstechniken gut etabliert und weit verbreitet. Die Vorteile dieser Oligonukleotid-basierten Anreicherungen sind ihre einfache Handhabung, da keine zusätzliche Instrumentierung und PCR-Optimierungen erforderlich sind, sowie die Flexibilität, genomische Targets unterschiedlicher Größe und Komplexität anzureichern. Heutzutage werden Whole-Exome-Enrichments von NGS-Plattformen und verschiedenen Gruppen weltweit verwendet. Haupt et al. ( 23) veröffentlichte ein HLA in silico Typisierungsansatz, bei dem NGS-Daten des gesamten Exoms und des gesamten Genoms aus dem 1000-Genome-Projekt verwendet wurden ( 24). Wie durch diese Anmeldung beispielhaft dargestellt, kann die traditionelle Exom-Anreicherung für die HLA-Genotypisierung jedoch zu einem allelischen Dropout führen, da die Zielköder auf der Grundlage der menschlichen Standard-Referenzgenomsequenz entworfen werden, die die allelische Variation an den HLA-Loci nicht berücksichtigt. Die Komplexität der klassischen HLA-Loci stellt die Entwicklung spezifischer Anreicherungskits in diagnostischer Qualität vor Herausforderungen. Dennoch ist die Sammlung bekannter HLA-Allelsequenzen groß, erfasst wahrscheinlich alle gängigen Allele und ist öffentlich zugänglich (25). Hier präsentieren wir einen zielgerichteten Anreicherungsansatz in Lösung für die NGS-basierte HLA-Genotypisierung ohne PCR-basierte Amplifikation. Unser Ansatz besteht aus einem kompletten Turnaround für die HLA-Sequenzierung einschließlich eines benutzerfreundlichen Softwaretools zur Zuordnung von HLA-Allelen.


IPD-IMGT/HLA

Mit dem Sonden- und Primer-Suchtool können Sie ganz einfach die bekannte Codierung Sequenz eines beliebigen Allels für ein bestimmtes Nukleotidmotiv. Das Tool kann verwendet werden, um entweder eine Online-Ausgabe oder eine tabulatorgetrennte Textdatei bereitzustellen, die zum Laden in Excel zur Verwendung als Treffertabelle oder ähnlichem geeignet ist.

So verwenden Sie das Sonden- und Primer-Suchwerkzeug:

  • Wählen Sie einfach den gewünschten Locus und die erforderliche Datenbankversion aus
  • Geben Sie die Nukleotidsequenz oder Ihre Sonde oder Ihren Primer in das dafür vorgesehene Feld ein. Sie können mehrere Sequenzen eingeben, solange sich jede Sequenz in einer separaten Zeile befindet.
  • Um die Suche zu erleichtern, sind auch genehmigte IUB-Codes innerhalb der Suchzeichenfolge zulässig. Aufgrund der Anzahl von Permutationen, die durch die Eingabe von Ns in eine Sequenz erzeugt werden, sind Sie jedoch auf 5 Ns pro Sequenz beschränkt.
  • Das Suchwerkzeug durchsucht nur die bekannten CDS-Sequenzen für jedes Allel. Wenn eine Sonde oder ein Primer Intron-, UTR- oder Pseudoexon-Sequenzen enthält, wird das Werkzeug diese nicht finden.
  • Das Tool umfasst auch keine Einfügungen oder Löschungen mit der Suchzeichenfolge.
  • Alle Bibliotheken vor Version 3.0.0 verwenden die Nomenklarturbezeichnungen vor 2010.

Die folgenden IUB-Codes können in der Abfragesequenz verwendet werden. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Suche umso langsamer abläuft, je mehrdeutiger Code verwendet wird.

IUB-Code Nukleinsäure IUB-Code Nukleinsäure
EIN EIN Ja C oder T
C C K G oder T
g g V A oder C oder G
T T h A oder C oder T
m A oder C D A oder G oder T
R A oder G B C oder G oder T
W A oder T n A oder C oder G oder T
S C oder G

Weitere Informationen

Für weitere Informationen zur Datenbank, Anfragen (einschließlich Website) oder zum Abonnieren der IPD-Mailinglisten wenden Sie sich bitte an den IPD-Support.


IPD-IMGT/HLA

Die IPD-IMGT/HLA-Datenbank bietet eine Fachdatenbank für Sequenzen des humanen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) und enthält die offiziellen Sequenzen, die vom Nomenklaturkomitee der WHO für Faktoren des HLA-Systems benannt wurden. Die IPD-IMGT/HLA-Datenbank ist Teil des internationalen ImMunoGeneTics-Projekts (IMGT).

Die Datenbank verwendet die Namenskonvention von 2010 für HLA-Allele in allen hierin enthaltenen Tools. Um die Annahme der neuen Nomenklatur zu unterstützen, können alle Suchwerkzeuge sowohl mit den aktuellen als auch mit den Allelbezeichnungen vor 2010 verwendet werden. Die Nomenklaturbezeichnungen vor 2010 werden nur verwendet, wenn ältere Berichte oder Ausgaben zum Download bereitgestellt wurden.

Neueste Entwicklungen

Zu den jüngsten Entwicklungen der IPD-Datenbank gehören

Neueste Veröffentlichungen

  • Robinson J., Barker DJ, Georgiou X, Cooper MA, Flicek P, Marsh SGE. IPD-IMGT/HLA-Datenbank. Nukleinsäureforschung (2020) 48:D948-55
    Volltext-PDF erhältlich von Nucleic Acids Research
  • Weitere IPD-Publikationen finden Sie auf unserer Zitationsseite.

Finanzierung und Unterstützung

Haftungsausschluss

Bei Diskrepanzen zwischen den gemeldeten Sequenzen und den in den Datenbanken gespeicherten Sequenzen wurden nach Möglichkeit die ursprünglichen Autoren kontaktiert und notwendige Änderungen an veröffentlichten Sequenzen vorgenommen. Zukünftige Sequenzierungen können Fehler aufdecken, und die Nomenklaturausschüsse würden jeden Beweis begrüßen, der dazu beiträgt, die Genauigkeit der Datenbank aufrechtzuerhalten. Wir übernehmen daher keine Gewähr für die Richtigkeit der Daten und lehnen jegliche Haftung für Schäden aus deren Verwendung ab. Wir können keine uneingeschränkte Zustimmung zur Verwendung der Daten geben, da einige Daten durch Patente oder andere Rechte geschützt sein können. Alle medizinischen oder genetischen Informationen werden nur zu Forschungs-, Bildungs- und Informationszwecken bereitgestellt. Es ist in keiner Weise als Ersatz für professionelle medizinische Beratung, Diagnose, Behandlung oder Pflege gedacht.

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Inhalt

Die von HLAs kodierten Proteine ​​sind diejenigen im äußeren Teil der Körperzellen, die (in der Tat) einzigartig für diese Person sind. Das Immunsystem verwendet die HLAs, um Eigenzellen und Nicht-Eigenzellen zu unterscheiden. Jede Zelle, die den HLA-Typ dieser Person anzeigt, gehört zu dieser Person und ist daher kein Eindringling.

Bei Infektionskrankheiten Bearbeiten

Wenn ein fremder Krankheitserreger in den Körper eindringt, verschlingen spezifische Zellen, die als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) bezeichnet werden, den Krankheitserreger durch einen Prozess, der Phagozytose genannt wird. Proteine ​​des Erregers werden in kleine Stücke (Peptide) verdaut und auf HLA-Antigene (genauer gesagt MHC-Klasse II) geladen. Sie werden dann von den Antigen-präsentierenden Zellen CD4+-Helfer-T-Zellen präsentiert, [7] die dann eine Vielzahl von Effekten und Zell-Zell-Interaktionen zur Eliminierung des Pathogens erzeugen.

Durch einen ähnlichen Prozess werden Proteine ​​(sowohl native als auch fremde, wie die Proteine ​​des Virus), die in den meisten Zellen produziert werden, auf HLAs (genauer gesagt MHC-Klasse I) auf der Zelloberfläche präsentiert. Infizierte Zellen können von CD8+ T-Zellen erkannt und zerstört werden. [7]

Das nebenstehende Bild zeigt ein Stück eines giftigen bakteriellen Proteins (SEI-Peptid), das im Bindungsspalt des HLA-DR1-Moleküls gebunden ist. In der Abbildung weit unten, einer anderen Ansicht, sieht man ein ganzes DQ mit einem gebundenen Peptid in einer ähnlichen Spalte von der Seite gesehen. In diese "Schlitze" passen krankheitsbezogene Peptide, ähnlich wie eine Hand in einen Handschuh passt. Wenn sie gebunden sind, werden Peptide T-Zellen präsentiert. T-Zellen benötigen eine Präsentation über MHC-Moleküle, um fremde Antigene zu erkennen – eine Anforderung, die als MHC-Restriktion bekannt ist. T-Zellen haben Rezeptoren, die B-Zell-Rezeptoren ähnlich sind, und jede T-Zelle erkennt nur wenige MHC-Klasse-II-Peptid-Kombinationen. Sobald eine T-Zelle ein Peptid innerhalb eines MHC-Klasse-II-Moleküls erkennt, kann sie B-Zellen stimulieren, die dasselbe Molekül auch in ihren B-Zell-Rezeptoren erkennen. Somit helfen T-Zellen den B-Zellen, Antikörper gegen dieselben fremden Antigene zu bilden. Jedes HLA kann viele Peptide binden, und jede Person hat 3 HLA-Typen und kann 4 Isoformen von DP, 4 Isoformen von DQ und 4 Isoformen von DR (2 von DRB1 und 2 von DRB3, DRB4 oder DRB5) für insgesamt 12 Isoformen. Bei solchen Heterozygoten ist es für krankheitsbezogene Proteine ​​schwierig, der Detektion zu entgehen.

Bei Transplantatabstoßung Bearbeiten

Jede Zelle, die einen anderen HLA-Typ aufweist, ist "nicht-eigen" und wird vom körpereigenen Immunsystem als Eindringling angesehen, was zur Abstoßung des Gewebes führt, das diese Zellen trägt. Dies ist besonders bei transplantiertem Gewebe wichtig, da es zu einer Transplantatabstoßung kommen kann. Aufgrund der Bedeutung von HLA bei der Transplantation gehören die HLA-Loci zu den am häufigsten durch Serologie und PCR typisierten. Es hat sich gezeigt, dass eine hochauflösende HLA-Typisierung (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1 und HLA-DPB1) bei der Transplantation relevant sein kann, um eine vollständige Übereinstimmung zu identifizieren, selbst wenn der Spender verbunden. [8]

HLA und Autoimmunerkrankungen
HLA-Allel Krankheiten mit erhöhtem Risiko Relatives Risiko
HLA-B27 Spondylitis ankylosans 12 [9]
Reaktive Arthritis 14 [9]
Akute anteriore Uveitis 15 [9]
HLA-B47 21-Hydroxylase-Mangel 15 [9]
HLA-DR2 Systemischer Lupus erythematodes 2 bis 3 [10]
HLA-DR3 Autoimmunhepatitis 14 [9]
Primäres Sjögren-Syndrom 10 [9]
Diabetes mellitus Typ 1 5 [9]
Systemischer Lupus erythematodes 2 bis 3 [10]
HLA-DR4 Rheumatoide Arthritis 4 [9]
Diabetes mellitus Typ 1 6 [9]
HLA-DR3 und
-DR4 kombiniert
Diabetes mellitus Typ 1 15 [9]
HLA-DQ2 und HLA-DQ8 Zöliakie 7 [11]

In Autoimmunität Bearbeiten

HLA-Typen werden vererbt, und einige von ihnen sind mit Autoimmunerkrankungen und anderen Krankheiten verbunden. Menschen mit bestimmten HLA-Antigenen entwickeln mit größerer Wahrscheinlichkeit bestimmte Autoimmunerkrankungen wie Typ-I-Diabetes, Spondylitis ankylosans, rheumatoide Arthritis, [12] Zöliakie, SLE (systemischer Lupus erythematodes), Myasthenia gravis, Einschlusskörpermyositis, Sjögren-Syndrom und Narkolepsie. [13] Die HLA-Typisierung hat zu einer gewissen Verbesserung und Beschleunigung bei der Diagnose von Zöliakie und Typ-1-Diabetes geführt, jedoch erfordert die DQ2-Typisierung entweder eine hochauflösende B1*-Typisierung (Auflösung *02:01 von *02: 02), DQA1*-Typisierung oder DR-Serotypisierung. Die derzeitige Serotypisierung kann DQ8 in einem Schritt auflösen. Die HLA-Typisierung bei Autoimmunerkrankungen wird zunehmend als Werkzeug in der Diagnose verwendet. Bei Zöliakie ist es das einzige wirksame Mittel, um gefährdete Verwandte ersten Grades von nicht gefährdeten Verwandten zu unterscheiden, bevor manchmal irreversible Symptome wie Allergien und sekundäre Autoimmunerkrankungen auftreten.

Bei Krebs Bearbeiten

Einige HLA-vermittelte Krankheiten sind direkt an der Förderung von Krebs beteiligt. Glutensensitive Enteropathie ist mit einer erhöhten Prävalenz von Enteropathie-assoziierten T-Zell-Lymphomen verbunden, und DR3-DQ2-Homozygoten gehören mit fast 80 % der Fälle von glutensensitiven Enteropathie-assoziierten T-Zell-Lymphomen zur Gruppe mit dem höchsten Risiko. Häufiger jedoch spielen HLA-Moleküle eine schützende Rolle, indem sie Zunahmen von Antigenen erkennen, die aufgrund niedriger Spiegel im Normalzustand nicht vertragen werden. Abnormale Zellen könnten für die Apoptose anvisiert werden, von der angenommen wird, dass sie viele Krebsarten vor der Diagnose vermittelt.

In der Partnerauswahl Bearbeiten

Es gibt Hinweise auf eine nicht-zufällige Partnerwahl in Bezug auf bestimmte genetische Merkmale. [14] [15] Dies hat zu einem Feld geführt, das als genetisches Matchmaking bekannt ist.

MHC-Klasse-I-Proteine ​​bilden auf den meisten kernhaltigen Zellen des Körpers einen funktionellen Rezeptor. [16]

Es gibt 3 Major- und 3 Minor-MHC-Klasse-I-Gene in HLA.

Nebengene sind HLA-E, HLA-F und HLA-G. β2-Mikroglobulin bindet an Haupt- und Nebengenuntereinheiten, um ein Heterodimer zu produzieren

Es gibt 3 Haupt- und 2 Nebenproteine ​​der MHC-Klasse II, die von HLA kodiert werden. Die Gene der Klasse II verbinden sich zu heterodimeren (αβ) Proteinrezeptoren, die typischerweise auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen exprimiert werden.

Wichtige MHC-Klasse-II-Proteine ​​kommen nur auf Antigen-präsentierenden Zellen, B-Zellen und T-Zellen vor. [16]

    • α-Kette, kodiert durch den HLA-DPA1-Locus
    • β-Kette, kodiert durch den HLA-DPB1-Locus
    • α-Kette, kodiert durch den HLA-DQA1-Locus
    • β-Kette, kodiert durch den HLA-DQB1-Locus
    • α-Kette, kodiert durch den HLA-DRA-Locus
    • 4 β-Ketten (nur 3 pro Person möglich), kodiert von HLA-DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 Loci

    Die anderen MHC-Klasse-II-Proteine, DM und DO, werden bei der internen Verarbeitung von Antigenen verwendet, indem die von Pathogenen erzeugten antigenen Peptide auf die HLA-Moleküle der Antigen-präsentierenden Zellen geladen werden.

    Nomenklatur Bearbeiten

    Moderne HLA-Allele werden typischerweise mit einer Vielzahl von Detaillierungsebenen notiert. Die meisten Bezeichnungen beginnen mit HLA- und dem Locus-Namen, dann * und einer (gerade) Anzahl von Ziffern, die das Allel angeben. Die ersten beiden Ziffern geben eine Gruppe von Allelen an, auch Supertypen genannt. Ältere Typisierungsmethoden konnten Allele oft nicht vollständig unterscheiden und blieben daher auf dieser Ebene stehen. Die dritte bis vierte Ziffer geben ein nicht-synonymes Allel an. Die Ziffern fünf bis sechs bezeichnen alle synonymen Mutationen innerhalb des Kodierungsrahmens des Gens. Die siebte und achte Ziffer unterscheiden Mutationen außerhalb der kodierenden Region. Buchstaben wie L, N, Q oder S können auf die Bezeichnung eines Allels folgen, um ein Expressionsniveau oder andere darüber bekannte nicht-genomische Daten anzugeben. Somit kann ein vollständig beschriebenes Allel bis zu 9 Ziffern lang sein, ohne HLA-Präfix und Locus-Notation. [17]

    Variabilität Bearbeiten

    MHC-Loci sind einige der genetisch am variabelsten kodierenden Loci bei Säugetieren, und die humanen HLA-Loci sind keine Ausnahmen. Trotz der Tatsache, dass die menschliche Bevölkerung im Laufe ihrer Geschichte mehrmals eine Verengung durchgemacht hat, die in der Lage war, viele Loci zu reparieren, scheinen die HLA-Loci eine solche Verengung mit vielen Variationen überlebt zu haben. [18] Von den 9 oben erwähnten Loci behielten die meisten ein Dutzend oder mehr Allelgruppen für jeden Locus bei, eine weitaus stärker erhaltene Variation als die überwiegende Mehrheit der menschlichen Loci. Dies stimmt mit einem heterozygoten oder ausgleichenden Selektionskoeffizienten für diese Loci überein. Darüber hinaus gehören einige HLA-Loci zu den sich am schnellsten entwickelnden kodierenden Regionen im menschlichen Genom. Ein Diversifizierungsmechanismus wurde in der Studie von Amazonas-Stämmen in Südamerika festgestellt, die anscheinend eine intensive Genkonversion zwischen variablen Allelen und Loci innerhalb jeder HLA-Genklasse durchlaufen haben. [19] Weniger häufig wurden längerfristige produktive Rekombinationen durch HLA-Gene beobachtet, die chimäre Gene produzieren.

    Sechs Loci haben über 100 Allele, die in der menschlichen Bevölkerung nachgewiesen wurden. Von diesen sind HLA B und HLA DRB1 die variabelsten. Die Anzahl der ermittelten Allele (Stand 2012) ist in der folgenden Tabelle aufgeführt. Um diese Tabelle zu interpretieren, muss berücksichtigt werden, dass ein Allel eine Variante der Nukleotid(DNA)-Sequenz an einem Locus ist, so dass sich jedes Allel von allen anderen Allelen in mindestens einer Position (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) unterscheidet. Die meisten dieser Veränderungen führen zu einer Veränderung der Aminosäuresequenzen, die zu leichten bis großen funktionellen Unterschieden im Protein führen.

    Es gibt Probleme, die diese Variation einschränken. Bestimmte Allele wie DQA1*05:01 und DQA1*05:05 kodieren Proteine ​​mit identisch verarbeiteten Produkten. Andere Allele wie DQB1*0201 und DQB1*0202 produzieren funktionell ähnliche Proteine. Bei Klasse II (DR, DP und DQ) neigen Aminosäurevarianten innerhalb der Peptidbindungsspalte des Rezeptors dazu, Moleküle mit unterschiedlicher Bindungsfähigkeit zu produzieren.

    Aus der Typisierung wurden jedoch die Genhäufigkeiten der häufigsten Allele (>5%) von HLA-A, -B, -C und HLA-DPA1, -DPB1, -DQA1, -DQB1 und -DRB1 aus Südamerika berichtet und Sequenzierung, die in Studien zur genetischen Vielfalt und in Fällen und Kontrollen durchgeführt wird. [20] Darüber hinaus wurden Informationen zu den Allelfrequenzen der HLA-I- und HLA-II-Gene für die europäische Bevölkerung zusammengestellt. [21] [22] In beiden Fällen zeigt die Verteilung der Allelhäufigkeiten eine regionale Variation im Zusammenhang mit der Geschichte der Populationen.

    Tabellen der Variantenallele Bearbeiten

    Anzahl der Varianten-Allele an Klasse-I-Loci gemäß IMGT-HLA-Datenbank, Stand Oktober 2018:

    MHC-Klasse I
    Ort # [23] [24]
    Hauptantigene
    HLA A 4,340
    HLA B 5,212
    HLA C 3,930
    Geringe Antigene
    HLA E 27
    HLA F 31
    HLA G 61

    Anzahl der Varianten-Allele an Klasse-II-Loci (DM, DO, DP, DQ und DR):

    MHC-Klasse II
    HLA -A1 -B1 -B3 bis -B5 1 Theor. möglich
    Ort # [24] # [24] # [24] Kombinationen
    DM- 7 13 91
    TUN- 12 13 156
    DP- 67 1,014 16,036
    DQ- 95 1,257 34,528
    DR- 7 2,593 312 11,431
    1 DRB3, DRB4, DRB5 sind beim Menschen unterschiedlich vorhanden

    Sequenzmerkmal-Variantentyp (SFVT) Bearbeiten

    Die große Variabilität der HLA-Gene stellt erhebliche Herausforderungen bei der Untersuchung der Rolle genetischer Variationen von HLA bei Krankheiten. Krankheitsassoziationsstudien behandeln typischerweise jedes HLA-Allel als eine einzelne vollständige Einheit, die die mit der Krankheit verbundenen Teile des Moleküls nicht beleuchtet. Karp D.R. et al. beschreibt einen neuartigen Ansatz des Sequenzmerkmalsvariantentyps (SFVT) für die genetische Analyse von HLA, der HLA-Proteine ​​in biologisch relevante kleinere Sequenzmerkmale (SFs) und deren Variantentypen (VTs) kategorisiert. [25] Sequenzmerkmale sind Kombinationen von Aminosäurestellen, die basierend auf Strukturinformationen (z. B. Beta-Faltblatt 1), funktionellen Informationen (z. B. Peptidantigenbindung) und Polymorphismus definiert sind. Diese Sequenzmerkmale können in der linearen Sequenz überlappend und kontinuierlich oder diskontinuierlich sein. Variantentypen für jedes Sequenzmerkmal werden basierend auf allen bekannten Polymorphismen in dem beschriebenen HLA-Locus definiert. Die SFVT-Kategorisierung von HLA wird in der genetischen Assoziationsanalyse angewendet, so dass die Wirkungen und Rollen der Epitope identifiziert werden können, die von mehreren HLA-Allelen geteilt werden. Für alle klassischen HLA-Proteine ​​wurden Sequenzmerkmale und deren Variantentypen beschrieben. Das internationale Repository für HLA-SFVTs wird in der IMGT/HLA-Datenbank geführt. [26] Ein Tool zur Umwandlung von HLA-Allelen in ihre SFVT-Komponenten kann auf der Website des Immunology Database and Analysis Portal (ImmPort) gefunden werden. [27]

    Häufige, gut dokumentierte und seltene Allele Bearbeiten

    Obwohl die Zahl der identifizierten einzelnen HLA-Allele groß ist, scheinen ungefähr 40% dieser Allele einzigartig zu sein, da sie nur bei einzelnen Individuen identifiziert wurden. [28] [29] Ungefähr ein Drittel der Allele wurde bei nicht verwandten Personen mehr als dreimal berichtet. [29] [30] Aufgrund dieser Variation in der Rate, mit der einzelne HLA-Allele nachgewiesen werden, wurden Versuche unternommen, Allele an jedem exprimierten HLA-Locus hinsichtlich ihrer Prävalenz zu kategorisieren. Das Ergebnis ist ein Katalog von häufigen und gut dokumentierten (CWD) HLA-Allelen [30] [31] und ein Katalog von seltenen und sehr seltenen HLA-Allelen. [28] [29]

    Häufige HLA-Allele sind definiert als mit einer Häufigkeit von mindestens 0,001 in Referenzpopulationen von mindestens 1500 Individuen beobachtet worden. [30] [31] Gut dokumentierte HLA-Allele wurden ursprünglich so definiert, dass sie bei nicht verwandten Personen mindestens dreimal nachgewiesen wurden, [30] und werden jetzt definiert als mindestens fünfmal bei nicht verwandten Personen durch Anwendung einer Sequenz nachgewiesen -basierte Typisierungsmethode (SBT) oder mindestens dreimal über eine SBT-Methode und in einem bestimmten Haplotyp bei nicht verwandten Personen. [31] Seltene Allele sind definiert als solche, die ein- bis viermal gemeldet wurden, und sehr seltene Allele als solche, die nur einmal gemeldet wurden. [28] [29]

    Tabelle der HLA-Allele in jeder Prävalenzkategorie Bearbeiten

    Während die aktuellen CWD- und seltenen oder sehr seltenen Bezeichnungen unter Verwendung verschiedener Datensätze und verschiedener Versionen der IMGT/HLA-Datenbank entwickelt wurden, [29] [31] wird der ungefähre Anteil der Allele an jedem HLA-Locus in jeder Kategorie unten gezeigt.

    Untersuchen von HLA-Typen Bearbeiten

    Serotyp- und Allelnamen Bearbeiten

    Es gibt zwei parallele Nomenklatursysteme, die auf HLA angewendet werden. Das erste und älteste System basiert auf serologischer (antikörperbasierter) Erkennung. In diesem System wurden Antigenen schließlich Buchstaben und Zahlen zugeordnet (z. B. HLA-B27 oder abgekürzt B27). Ein paralleles System, das eine verfeinerte Definition von Allelen ermöglichte, wurde entwickelt. In diesem System wird ein "HLA" in Verbindung mit einem Buchstaben, * und einer vier- oder mehrstelligen Zahl verwendet (z. B. HLA-B*08:01, A*68:01, A*24:02 :01N N=Null), um ein spezifisches Allel an einem gegebenen HLA-Locus zu bezeichnen. HLA-Loci können weiter in MHC-Klasse I und MHC-Klasse II (oder selten D-Locus) eingeteilt werden. Alle zwei Jahre wird eine Nomenklatur veröffentlicht, um den Forschern bei der Interpretation von Serotypen zu Allelen zu helfen. [23]

    Serotypisierung Bearbeiten

    Um ein Typisierungsreagenz herzustellen, würde Blut von Tieren oder Menschen entnommen, die Blutzellen vom Serum abgetrennt und das Serum auf seine optimale Empfindlichkeit verdünnt und zur Typisierung von Zellen von anderen Individuen oder Tieren verwendet. Thus, serotyping became a way of crudely identifying HLA receptors and receptor isoforms. Over the years, serotyping antibodies became more refined as techniques for increasing sensitivity improved and new serotyping antibodies continue to appear. One of the goals of serotype analysis is to fill gaps in the analysis. It is possible to predict based on 'square root','maximum-likelihood' method, or analysis of familial haplotypes to account for adequately typed alleles. These studies using serotyping techniques frequently revealed, in particular for non-European or north East Asian populations many null or blank serotypes. This was particularly problematic for the Cw locus until recently, and almost half of the Cw serotypes went untyped in the 1991 survey of the human population.

    There are several types of serotypes. A broad antigen serotype is a crude measure of identity of cells. For example, HLA A9 serotype recognizes cells of A23- and A24-bearing individuals. It may also recognize cells that A23 and A24 miss because of small variations. A23 and A24 are split antigens, but antibodies specific to either are typically used more often than antibodies to broad antigens.

    Cellular typing Edit

    A representative cellular assay is the mixed lymphocyte culture (MLC) and used to determine the HLA class II types. [32] The cellular assay is more sensitive in detecting HLA differences than serotyping. This is because minor differences unrecognized by alloantisera can stimulate T cells. This typing is designated as Dw types. Serotyped DR1 has cellularly defined as either of Dw1 or of Dw20 and so on for other serotyped DRs. Table [33] shows associated cellular specificities for DR alleles. However, cellular typing has inconsistency in the reaction between cellular-type individuals, sometimes resulting differently from predicted. Together with difficulty of cellular assay in generating and maintaining cellular typing reagents, cellular assay is being replaced by DNA-based typing method. [32]

    Gene sequencing Edit

    Minor reactions to subregions that show similarity to other types can be observed to the gene products of alleles of a serotype group. The sequence of the antigens determines the antibody reactivities, and so having a good sequencing capability (or sequence-based typing) obviates the need for serological reactions. Therefore, different serotype reactions may indicate the need to sequence a person's HLA to determine a new gene sequence.

    Broad antigen types are still useful, such as typing very diverse populations with many unidentified HLA alleles (Africa, Arabia, [34] Southeastern Iran [35] and Pakistan, India [36] ). Africa, Southern Iran, and Arabia show the difficulty in typing areas that were settled earlier. Allelic diversity makes it necessary to use broad antigen typing followed by gene sequencing because there is an increased risk of misidentifying by serotyping techniques.

    In the end, a workshop, based on sequence, decides which new allele goes into which serogroup either by sequence or by reactivity. Once the sequence is verified, it is assigned a number. For example, a new allele of B44 may get a serotype (i.e. B44) and allele ID i.e. B*44:65, as it is the 65th B44 allele discovered. Marsh et al. (2005) [23] can be considered a code book for HLA serotypes and genotypes, and a new book biannually with monthly updates in Tissue Antigens.

    Phenotyping Edit

    Gene typing is different from gene sequencing and serotyping. With this strategy, PCR primers specific to a variant region of DNA are used (called SSP-PCR). If a product of the right size is found, the assumption is that the HLA allele has been identified. New gene sequences often result in an increasing appearance of ambiguity. Because gene typing is based on SSP-PCR, it is possible that new variants, in particular in the class I and DRB1 loci, may be missed.

    For example, SSP-PCR within the clinical situation is often used for identifying HLA phenotypes. An example of an extended phenotype for a person might be:

    A *01:01 / *03:01 , C *07:01 / *07:02 , B *07:02 / *08:01 , DRB1 *03:01 / *15:01 , DQA1 *05:01 / *01:02 , DQB1 *02:01 / *06:02

    In general, this is identical to the extended serotype: A1,A3,B7,B8,DR3,DR15(2), DQ2,DQ6(1)

    For many populations, such as the Japanese or European populations, so many patients have been typed that new alleles are relatively rare, and thus SSP-PCR is more than adequate for allele resolution. Haplotypes can be obtained by typing family members in areas of the world where SSP-PCR is unable to recognize alleles and typing requires the sequencing of new alleles. Areas of the world where SSP-PCR or serotyping may be inadequate include Central Africa, Eastern Africa, parts of southern Africa, Arabia, S. Iran, Pakistan, and India.

    Haplotypes Edit

    An HLA haplotype is a series of HLA "genes" (loci-alleles) by chromosome, one passed from the mother and one from the father.

    The phenotype exampled above is one of the more common in Ireland and is the result of two common genetic haplotypes:

    A *01:01 C *07:01 B *08:01 DRB1 *03:01 DQA1 *05:01 DQB1 *02:01 (By serotyping A1-Cw7-B8-DR3-DQ2)

    which is called ' 'super B8' ' or ' 'ancestral haplotype' ' and

    A *03:01 C *07:02 B *07:02 DRB1 *15:01 DQA1 *01:02 DQB1 *06:02 (By serotyping A3-Cw7-B7-DR15-DQ6 or the older version "A3-B7-DR2-DQ1")

    These haplotypes can be used to trace migrations in the human population because they are often much like a fingerprint of an event that has occurred in evolution. The Super-B8 haplotype is enriched in the Western Irish, declines along gradients away from that region, and is found only in areas of the world where Western Europeans have migrated. The "A3-B7-DR2-DQ1" is more widely spread, from Eastern Asia to Iberia. The Super-B8 haplotype is associated with a number of diet-associated autoimmune diseases. There are 100,000s of extended haplotypes, but only a few show a visible and nodal character in the human population.

    Studies of humans and animals imply a heterozygous selection mechanism operating on these loci as an explanation for this variability. [37] One proposed mechanism is sexual selection in which females are able to detect males with different HLA relative to their own type. [38] While the DQ and DP encoding loci have fewer alleles, combinations of A1:B1 can produce a theoretical potential of 7,755 DQ and 5,270 DP αβ heterodimers, respectively. While nowhere near this number of isoforms exist in the human population, each individual can carry 4 variable DQ and DP isoforms, increasing the potential number of antigens that these receptors can present to the immune system.

    Studies of the variable positions of DP, DR, and DQ reveal that peptide antigen contact residues on class II molecules are most frequently the site of variation in the protein primary structure. Therefore, through a combination of intense allelic variation and/or subunit pairing, the class II peptide receptors are capable of binding an almost endless variation of peptides of 9 amino acids or longer in length, protecting interbreeding subpopulations from nascent or epidemic diseases. Individuals in a population frequently have different haplotypes, and this results in many combinations, even in small groups. This diversity enhances the survival of such groups, and thwarts evolution of epitopes in pathogens, which would otherwise be able to be shielded from the immune system.

    HLA antibodies are typically not naturally occurring, and with few exceptions are formed as a result of an immunologic challenge to a foreign material containing non-self HLAs via blood transfusion, pregnancy (paternally inherited antigens), or organ or tissue transplant.

    Antibodies against disease-associated HLA haplotypes have been proposed as a treatment for severe autoimmune diseases. [39]

    Donor-specific HLA antibodies have been found to be associated with graft failure in renal, heart, lung, and liver transplantation.

    In some diseases requiring hematopoietic stem cell transplantation, preimplantation genetic diagnosis may be used to give rise to a sibling with matching HLA, although there are ethical considerations. [40]


    HLA-B locus products resist degradation by the human cytomegalovirus immunoevasin US11

    To escape CD8+ T-cell immunity, human cytomegalovirus (HCMV) US11 redirects MHC-I for rapid ER-associated proteolytic degradation (ERAD). In humans, classical MHC-I molecules are encoded by the highly polymorphic HLA-A, -B and -C gene loci. While HLA-C resists US11 degradation, the specificity for HLA-A and HLA-B products has not been systematically studied. In this study we analyzed the MHC-I peptide ligands in HCMV-infected cells. A US11-dependent loss of HLA-A ligands was observed, but not of HLA-B. We revealed a general ability of HLA-B to assemble with β2m and exit from the ER in the presence of US11. Surprisingly, a low-complexity region between the signal peptide sequence and the Ig-like domain of US11, was necessary to form a stable interaction with assembled MHC-I and, moreover, this region was also responsible for changing the pool of HLA-B ligands. Our data suggest a two-pronged strategy by US11 to escape CD8+ T-cell immunity, firstly, by degrading HLA-A molecules, and secondly, by manipulating the HLA-B ligandome.

    Interessenkonflikt-Erklärung

    Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

    Figuren

    Fig 1. Changes in the relative abundance…

    Fig 1. Changes in the relative abundance of HLA class I ligands in HCMV-infected fibroblasts.

    ) HLA-A*02:01, A*03:01, B*07:02 or CD99 molecules were transduced with lentiviruses encoding US11 in front of an IRES-EGFP sequence. At 0, 24 and 48 h post-transduction the cells were analyzed by flow cytometry using an anti-HA mAb. The MFI in EGFP + cells relative to MFI at 0 h post transduction is depicted. Two independent biological replicates of the experiment with similar outcomes were performed.

    Fig 2. HLA locus specific downregulation by…

    Fig 2. HLA locus specific downregulation by US11.

    HeLa cells were transiently co-transfected with US11…

    ) HLA molecules expressed from the pUC-IP vector (SFFV U3 promoter). (EIN) At 20 h post-transfection HLA-I cell surface expression of EGFP positive cells was measured by flow cytometry using anti-HA mAbs. (B) The HLA-I expression from (A) was defined as ratio of the MFI in US11 expressing cells compared to control cells, the value of which was normalized to the downregulation of a control molecule (HA-CD99). Bars represent normalized mean values ± SEM from three independent experiments. Statistical analyses were performed to compare HLA-A or -B alleles among themselves, applying one-way ANOVA followed by a Tuckey’s multiple comparisons method for all pairwise differences of means. Endogenous HLA-I expressed in MRC-5 or HeLa cells are indicated. (C) At 20 h post-transfection cells were labeled with [ 35 S]-Met/Cys for 30 min and chased for 0 or 45 min and an immunoprecipitation was performed using anti-HA mAb. An uncropped autoradiography is depicted in S3 Fig. (D) Whole cell lysates were prepared and digested with EndoH prior to analysis by Western blot with antibodies as indicated. Equal loading of lysates was controlled by Ponceau S staining. (E) Cells were analyzed as described in A. In addition, the cells were incubated with LIR1-Fc. In the upper panel binding of LIR1-Fc to the CD99/ctrl transfected cells is shown in green. Representatives of two independent biological replicates with similar outcomes are shown.

    Fig 3. Analysis of factors that could…

    Fig 3. Analysis of factors that could affect HLA-B resistance against US11.

    ) HLA in pIRES-EGFP (CMV major IE promoter). At 20 h post-transfection cells were labeled with [ 35 S]-Met/Cys for 30 min and chased for 0 or 45 min and a co-immunoprecipitation experiment was performed using anti-HA mAb or anti-US11 antiserum. A complete autoradiography is depicted in S5 Fig. A representative of two independent biological replicates with similar outcomes is shown. (B-C) HeLa cells were transiently co-transfected with US11 or a ctrl pIRES-EGFP plasmid together with indicated HA-tagged (

    ) MHC-I molecules and mutants encoded by the pUC-IP vector. At 20 h post-transfection flow cytometry and statistical analysis were performed as described in Fig 2A and 2B. (D) β2m-deficient FO-1 cells were co-transfected with US11 or a control pIRES-EGFP plasmid together with indicated HA-tagged (

    ) HLA alleles encoded by the pUC-IP vector. At 20 h post-transfection cell surface expression of EGFP positive cells was measured by flow cytometry using anti-HA mAbs. (E) FO-1 cells were transfected as described in (D). At 20 h post-transfection cells were labeled with [ 35 S]-Met/Cys for 1 or 3 h and an immunoprecipitation was performed using anti-HA antibodies. A representative of two independent biological replicates with similar outcomes is shown. A complete autoradiography is depicted in S6 Fig.

    Fig 4. US11 co-immunoprecipitation with the PLC…

    Fig 4. US11 co-immunoprecipitation with the PLC in HCMV-infected cells.

    Fig 5. The N-terminal LCR of US11…

    Fig 5. The N-terminal LCR of US11 is required for MHC-I ER retention but not…

    Fig 6. Resistant HLA-B in cells ectopically…

    Fig 6. Resistant HLA-B in cells ectopically expressing US11.

    US11) or control cells (-) were treated for 36 h with IFN-γ (500 U/ml) or left untreated. Cells were labeled with [ 35 S]-Met/Cys for 2 h and immunoprecipitation was performed using indicated antibodies. Distinct MHC-I HCs are indicated with blue and red asterisks. A representative of two independent biological replicates with similar outcomes is shown. (B) Hela cells were transiently transfected with HA-tagged MHC-I encoded by the pUC-IP vector. At 20 h post-transfection an immunoprecipitation experiment as described in (A) was performed.

    Fig 7. Anchor residue usage of HLA-B…

    Fig 7. Anchor residue usage of HLA-B ligands is modified by US11.

    ) US11Q/A, ΔLCRUS11Q/A or US3. Cells were collected and MHC-I molecules were isolated using the mAb W6/32. Peptide ligands were eluted and analyzed by mass spectrometry. (EIN) The relative distribution of MHC-I specific 9-mer ligands between HLA-A*68:02 and B*15:03 is shown. (B) The frequency of P2 peptide anchor residues of HLA-B*15:03 9-mer ligands was determined and depicted as percentage of total pool at that specific position. Two independent biological replicates of the experiment are shown (#1 and #2). (C-D) Pooled #1 and #2 ligands from Fig 1A predicted by NetMHC3.4 to bind to HLA-B*07:02 and B*44:02 with an affinity of <500 and <1000 nM, respectively, were divided into common and unique ΔUS2-6 and ΔUS2-6/US11 ligands respectively (S13A Fig). From these pools the frequency of specific amino acids (x-axis) at positions P1 and P3 of HLA-B*07:02 (C) and positions P3 and P4 of HLA-B*44:02 (D) was determined and depicted as percentage of total pool at that specific position.


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    Diskussion

    The technology of HLA typing has significantly evolved since the PCR method was introduced by Mullis and Faloona [17]. Nowadays, there are several kinds of PCR-based HLA typing being used: DNA amplification with sequence specific primers (SSP) [18], sequence specific oligonucleotide probes (SSO) [19], single-stranded conformation polymorphism (SSCP) [20], sequence-based typing (SBT) [21], and DNA chip technology [22]. These HLA typing techniques are of much higher accuracy as well as reliability than the conventional serologic typing method, and also may facilitate the standardization of HLA typing processes [23]. The SSP and SSO methods are low-intermediate resolution techniques at two-digit level. The advantage of the SSO method based on Luminex system lies in its high throughput, because 96 samples can be completed in one day by a skilled technician. SBT is a gold-standard [24], high-resolution method at the four-digit level that was used to resolve theambiguous types and to identify novel alleles. In this paper, the data of HLA genotyping from 2003 to 2006 were based on the SSP and SSO methods. The SBT method was used only to resolve the ambiguous types and to identify novel alleles. In 2007, we began to use the SBT method in the routine HLA genotyping. The high-resolution data are being analyzed and will be reported in another paper.

    HLA functions as a useful tool to clarify the differences between genetic makeup of Liaoning residents and other parts of China. The Han Chinese is divided into two major groups, namely northern Han and southern Han [25]. The HLA allele frequencies of the Liaoning Han show close similarity to the frequencies of the Shaanxi Northern Han, because both have less than 20% variation in allele frequencies. Shaanxi played a central role in ancient northern Chinese history for thousands of years. This is predictable given that Liaoning is one of the three northeastern Chinese provinces that was populated by the geographic expansion of the Northern Han Chinese.

    There are striking similarities between Liaoning Han and Liaoning Manchu ethnic group in HLA allele and haplotype frequencies. This genetic closeness is also supported by the genetic distance calculation. This can be explained by the fact that Manchus are descended from the Jurchen people with North East Asia origin (http://en.wikipedia.org/wiki/Manchu_people#Origins_and_early_history). There is difference in Manchu HLA allele frequencies between our study and previous one [26]. For example, A*33, B*38, B*46, and DRB*14 have frequencies of 6.57%, 2.10%, 7.11%, 6.31% in the current study, but 2.8%, 0.9%, 4.1% and 12.3% in the previous study conducted with Manchu residents living in Harbin. Harbin is located about 600 km to the north of Liaoning. It is not clear about what contributes to this difference beside different geographic locations. Liaoning was the historic home for Manchu. It is possible that more intensive gene exchange took place between Liaoning Han and Liaoning Manchu in the Liaoning region. The HLA allele frequencies of Liaoning Mongol in our dataset are similar to those published previously [27], [28]. Both B*37 and B*57 distinguish Mongol from the northern Han based on much higher frequencies in Mongol.

    The HLA haplotype analysis is widely used in human population genetics, anthropological studies, as well as the optimal marrow donor bank size planning. It carries more specific information than allele frequencies. A number of studies have addressed the Chinese HLA allele and haplotype distribution from different regions including Sichuan, Jiangsu, Fujian, Guangdong, Xi'an, Yunan [29]–[34]. However, there is no report of any large sample study about HLA haplotypes in Liaoning.

    Linkage disequilibrium is the common characteristic of HLA genetics. This is true for Liaoning Han population according to Table 5. The top four most common haplotypes found among Liaoning Han in this study include A*30-B*13-DRB1*07, A*02-B*46-DRB1*09, A*02-B*13-DRB1*12 and A*33-B*58-DRB1*03(17) which actually consist of allele groups ranking the 5 th (A*30, B*46) and 10 th (B*58, DRB1*03(17)) positions in the allele frequency ranking (Table 2). B*57 and B*37 rank at the 20 th and 21 st places in the frequency list but their corresponding haplotypes, A*01-B*37-DRB1*10 and A*01-B*57-DRB1*07 ranked within the top 10 most frequent haplotypes. The LDs are similar to the findings in the studies conducted in Shaanxi and Inner Mongolia, China [10], [28].

    The fact that HLA-A-B-DRB1 haplotype frequencies of Liaoning Han show high similarities to those in Shaanxi can be expected since both of them belong to the northern China regions (the North of Yangtze River). There is below 30% difference in haplotype frequencies among 18 out of the top 20 haplotypes when Liaoning is compared with Shaanxi (The data were not shown).

    Korea is adjacent to Liaoning on its southeast side. Our haplotype data do show that the Korean population is much closer to the northern Han than to the southern Han. Nine out of top 10 haplotype rankings in Liaoning Han are also listed in the top 10 most frequent haplotypes in Liaoning Korean. Korean do have own unique haplotypes that show a very different frequency pattern compared to Han. The most common haplotype A*02-B*15(62)-DRB1*15 in Liaoning Korean is five-time less frequent than that in Liaoning Han (Table 3). A*33-B*58-DRB1*13 (3.91%) and A*33-B*44-DRB1*13 (3.13%), the very common haplotypes in Liaoning Korean, reflect also a 3-fold lower frequency in Liaoning Han.

    It is well known that A*30-B*13-DRB1*07 is the most common haplotype in the northern Han Chinese, while A*02-B*46-DRB1*09 is the most common haplotype in the southern Han Chinese [29]–[34]. Indeed, the A*30-B*13-DRB1*07 turned out to be the most common haplotype in all ethnic groups in our study with the exception of Liaoning Korean.

    A*02-B*35-DRB1*04 and A*24-B*52-DRB1*15, two high-frequency haplotypes appear to be unique to the Mongolian population, i.e. both of them clearly present a lower frequency in Liaoning and Shaanxi Han, but much less in southern Han (The data were not shown).

    Our phylogenetic tree study has placed Liaoning Han, Liaoning Manchu, Liaoning Mongol, Liaoning Hui and Liaoning Xibe in the same close cluster as expected. In addition to the Liaoning Han cluster, Liaoning Hui differs substantially from others. A*01 is significantly less common in Liaoning Hui than in Liaoning Han (1.980% vs. 4.686%), and B*14(65), B*18 and B*38 are 3–7 times more common in Liaoning Hui than in Liaoning Han volunteers. We have noted that Liaoning Manchu, Liaoning Hui, Liaoning Korean are quite different in their HLA profiles from the same ethnic groups reported previously. The differences between Liaoning Manchu and Harbin Manchu were already discussed. Liaoning Hui also differs in many alleles from Qinghai Hui [26]. A*30, A*31, B*14(65), and B*18 show 2.5–12-fold higher allele frequencies in Liaoning Hui than in Qinghai Hui, while A*01, B*27, and B*40(61) behave in the opposite way. Liaoning Korean display a large genetic distance to Liaoning Han, but it clearly differs from the Korean residents in Seoul, Korea [11]. It is possible that Liaoning Koreans have undergone substantial gene exchange with the Liaoning Han population in the Liaoning region and have acquired certain HLA characteristics from the Liaoning Han while still maintaining Korean unique HLA gene composition. The genetic distance between Shaanxi Han and Liaoning Han is three times shorter than that between Guangdong Han and Liaoning Han. This explains the fact that both Shaanxi and Liaoning belong to northern China while Guangdong represents a southern China province. Thailand, Taiwan/Minnan and Japan lie relative close to each other in the same branch since they are all from the Southeast Asia region. Japan population shows the most distinct features with the longest distance from the rest of all the study groups. This can be explained with the fact that Japan is most isolated nation from their neighbors during the thousand years of history.

    Finally it is important to emphasize that our data may not reflect the true ethnic makeup of the Liaoning population due to the fact that the minority ethnic groups are less represented in the marrow donor registry population. The frequency data are also based on local bone marrow donor volunteers who could be a biased group in terms of representing the entire Liaoning population. We have no way to verify the ethnicity of samples from minority groups.

    In summary, we have analyzed HLA-A-B-DRB1 allele and haplotype frequencies of Liaoning residents based on the local marrow donor registry volunteers classified by various ethnic backgrounds and compared to the populations from other parts of China including its geographic neighbors, Koreans and Mongolians. The HLA haplotypes of Liaoning Han carry a clear Northern Han signature while other ethnic groups possess their unique characteristics except Liaoning Manchu who show almost identical HLA-A, -B and -DRB1 allele frequencies to those of Liaoning Han. Liaoning Mongolians and Koreans show clearly more similarities to Liaoning Han than to southern Han in respect to their HLA haplotypes. No specific haplotype has been found to be uniquely shared between Liaoning and Koreans or between Liaoning and Mongolians.


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