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Was ist der Vorteil von zirkulärer DNA bei Bakterien?

Was ist der Vorteil von zirkulärer DNA bei Bakterien?


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Soweit ich weiß, haben Bakterien eine zirkuläre DNA. Welche Vorteile hat es gegenüber linearen Strängen wie bei Eukaryoten?

Gibt es Bakterien mit mehr als einem DNA-Ring?


Vibrio cholerae hat bekanntlich zwei kreisförmige Chromosomen.

Die Zellteilung von Bakterien ist im Vergleich zur eukaryotischen Zellteilung viel einfacher und effizienter, teilweise aufgrund der Natur ihrer Chromosomen. Sie müssen keiner Mitose unterzogen werden – Chromosomenkondensation, Segregation, Bildung von Spindelfasern, Anheftung usw. sind nicht an der bakteriellen Zellteilung beteiligt.

Die zirkuläre DNA umgeht auch die Hayflick-Grenze (und ermöglicht ihr so, "unsterblich" zu sein), das ist die Anzahl von Malen, die sich eine Zellpopulation teilen kann, bevor sie aufhört, vermutlich aufgrund der Verkürzung der Telomere, der Sequenzen am Ende der Chromosomen. Da der zirkulären DNA Telomere fehlen, wird sie nicht mit jedem Replikationszyklus kürzer.

Zirkuläre DNA kann auch den horizontalen Gentransfer wie die Hfr-vermittelte Konjugation erleichtern. Denken Sie daran, dass die Konjugation einer Replikation vom "Rolling-Circle"-Typ analog ist, die natürlich nur auf zirkulären DNA-Stücken möglich ist.


Um die andere Antwort ein wenig zu erweitern, würde ich auch hinzufügen, dass Bakterien neben ihrem Hauptchromosom andere (normalerweise kreisförmige) DNA-Segmente haben können. Diese werden Plasmide genannt und sind doppelsträngige DNA-Moleküle, die sich autonom replizieren können.

Plasmide tragen oft Gene, die es einem Organismus ermöglichen, unter bestimmten Bedingungen zu überleben, zum Beispiel könnten sie die Resistenz gegen ein Antibiotikum tragen oder das Gen, das für einen bestimmten Nährstoff kodiert, der in der Umwelt möglicherweise nicht vorhanden ist und so weiter.

Wie die andere Antwort sagt, können Plasmide in einem Prozess namens . horizontal zwischen Bakterien übertragen werden bakterielle Konjugation, und dies wird durch die Anwesenheit eines spezifischen Plasmids, dem sogenannten F-Plasmid, im Donor ermöglicht. Das F-Plasmid kodiert unter anderem für das F-Pilus-Protein pilin, das die Bildung des für den DNA-Transfer notwendigen Pilus ermöglicht.

Aufgrund ihrer Eigenschaften werden Plasmide häufig im Labor als Vektoren, um genetisches Material auf Zellen zu übertragen, um ihnen bestimmte "Fähigkeiten" zu verleihen (z. B. könnten Sie ein Gen einfügen, das für einen bestimmten Rezeptor kodiert, der normalerweise nicht von den Zellen exprimiert wird, um seine Expression zu ermöglichen und seine Funktion zu testen).

Schließlich sei daran erinnert, dass auch in Eukaryoten (z. B. in Hefe) Plasmide vorkommen.


George Beadle und Edward Tatum beschrieben zuerst das Konzept, dass jedes Gen einem Enzym in einem Stoffwechselweg entsprach, indem sie die Hefe freilegten Neurospora crassa zu mutagenen Bedingungen (Beadle & Tatum, 1941). Nach diesen Verfahren setzte Joshua Lederberg diese Studien mit Tatum fort, wo sie zwei Mutantenstämme in erzeugten Escherichia coli. Diese Bakterien waren Auxotrophe, nicht in der Lage, einige Grundnährstoffe zu erzeugen, die für ihr Wachstum notwendig sind. Die beiden Stämme wurden beschrieben als traf &minus bio &minus Thr + Leu + Thi + (Stamm A) und Met + Bio + thr &minus leu &minus thi &minus (Stamm B). Stamm A kann die Aminosäuren Threonin, Leucin und den Cofaktor Thiamin ausreichend synthetisieren, während er bei der Produktion des Cofaktors Biotin und der Aminosäure Methionin mangelt, während für Stamm B das Gegenteil der Fall war. Wenn einer dieser beiden Stämme auf Minimalmedium ausplattiert wurde, Wachstum stattfand. Die Ergänzung des Minimalmediums mit Methionin und Biotin ermöglichte dem Stamm A ein normales Wachstum. Als die beiden Stämme miteinander vermischt und auf Minimalmedium ausplattiert wurden, gab es ein Bakterienwachstum. Die beiden Stämme waren in der Lage, sich in irgendeiner Weise zu ergänzen, als ob ein sexueller Austausch von genetischem Material stattgefunden hätte (Lederberg & Tatum, 1946).

Bakterien sind mit allen notwendigen Kapazitäten ausgestattet, um DNA zu replizieren. Gewöhnliche Bakterienarten wurden für die Verwendung im Labor angepasst, um DNA zu tragen und sie für die Verwendung in der Biotechnologie zu vermehren. Neben der chromosomalen DNA des Bakteriengenoms besitzen Bakterien auch extrachromosomale DNA, genannt Plasmide. Diese Plasmide replizieren unabhängig vom Bakterienchromosom und können in hoher Kopienzahl vorkommen. Diese kreisförmigen DNA-Stücke werden in Labors modifiziert, um spezifische DNA-Stücke zu tragen, damit sie untersucht oder zur Expression in Proteinen verwendet werden können. Plasmide können von Natur aus wichtige Eigenschaften tragen, einschließlich Antibiotikaresistenz. Plasmide sind relativ klein und reichen in der Größe von 1000 Basen bis 1.000.000 Basen lang (1 kb-1000 kb).

Bakterielle DNA existiert normalerweise als große kreisförmiges Chromosom (rot). Plasmide sind extrachromosomale und sich autonom replizierende DNA-Stücke (Blau).

Durch einen Prozess namens Konjugation, Bakterien können genetisches Material auf andere &ldquosexuell&rdquo übertragen, indem sie Plasmide durch eine Struktur namens a . leiten Konjugationspilus.

Konjugationsverfahren zwischen einem Plasmid tragenden Donor und einem Plasmid-losen Empfänger. Der Spender erzeugt einen Konjugationspilus, um eine zytosolische Brücke mit dem Spender zu bilden, wobei das Plasmid durch das Rolling-Circle-Replikationsverfahren in den Empfänger repliziert wird. Der Empfänger wird dann handlungsfähig als Spender.


Bakterielle Transformation

Transformation ist die genetische Veränderung einer Zelle durch die Aktualisierung von DNA aus der Umgebung. Dieser Prozess kann bei einigen Bakterienarten natürlich vorkommen, ist aber normalerweise selten. In einem Labor können wir Bakterien Bedingungen aussetzen, die dazu führen, dass sie DNA aus der Umgebung aufnehmen (um „transformiert“ zu werden). Es gibt mehrere Möglichkeiten, Bakterien in einer Laborumgebung zu transformieren, aber eine der häufigsten besteht darin, die Konzentration der Ionen in der Umgebung der Bakterien zu ändern und die Zellen dann auf bestimmte Weise zu erhitzen. Bakterien, die leicht DNA aus der Umgebung aufnehmen können, nennt man „kompetent“. Wenn Zellen kompetent gemacht werden, wird ihre Zellmembran für DNA durchlässiger. Nachdem die neue DNA in die Bakterien eingedrungen ist, wird sie von der Zelle verwendet, um RNA und dann Proteine ​​herzustellen. Die neuen Proteine, die aus dieser DNA hergestellt werden, sind es, die die Veränderung der Eigenschaften der Zellen bewirken.

Plasmide

Zusätzlich zu ihrem DNA-Genom (das zirkulär ist) können Bakterien auch weitere kleinere DNA-Kreise enthalten, die als Plasmide bezeichnet werden. EIN Plasmid ist ein kleines, kreisförmiges Stück doppelsträngiger DNA, das von Bakterienzellen kopiert werden kann. Plasmide kommen natürlicherweise in Bakterien vor und werden von Wissenschaftlern häufig als Methode zur Einführung fremder DNA in diese Zellen verwendet, da die DNA-Sequenz innerhalb des Plasmids im Labor modifiziert werden kann. Sobald ein Plasmid in eine Zelle eingedrungen ist, wird es von der DNA-Replikationsmaschinerie der Zelle kopiert. Wenn sich die Bakterienzelle teilt, erhält jede neue Tochterzelle Kopien des Plasmids. Ein ursprünglich transformiertes Bakterium teilt sich zu einem sichtbaren Kolonie besteht aus einer Million oder mehr transformierten Bakterien, die jeweils eine Kopie des Plasmids enthalten (Abbildung 3).

Figur 2: Diagramm eines Bakteriums, das bakterielle genomische DNA und drei Plasmide enthält. Beachten Sie, dass die Plasmide nicht maßstabsgetreu sind und typischerweise viel kleiner als das Bakteriengenom sind. Wenn sich die Bakterien teilen, erhalten die Tochterzellen eine Kopie der genomischen DNA und aller in der Zelle vorhandenen Plasmide. Bildnachweis: Spaully CC SA 2.5 Plasmidreplikation

Figur 3: E. coli wächst auf einer Nährplatte. Jeder Fleck ist eine isolierte Kolonie (ein eindeutiger kreisförmiger Fleck). Jede Kolonie besteht aus 10 oder Hunderttausenden von Zellen, die aus einer einzigen ursprünglichen Bakterienzelle gewachsen sind. Bild modifiziert von: Madprime „K12 E coli Kolonien auf Platte Public Domain.

Auswahl nach transformierten Bakterien

Um Bakterien mit Plasmid-DNA zu transformieren, müssen Biotechnologen zwei Probleme überwinden. Erstens haben Zellen, die Plasmid-DNA enthalten, einen Nachteil, da zelluläre Ressourcen (wie Energie) verwendet werden, um das Plasmid zu replizieren und die Proteine ​​zu synthetisieren, für die die DNA des Plasmids kodiert. Wenn eine gemischte Population von Zellen mit Plasmiden und Zellen ohne Plasmide in Gegenwart von reichlich Nährstoffen zusammengewachsen wird, wachsen die Zellen ohne die Plasmide schneller, da sie keine Energie für ein Plasmid verschwenden, das sie nicht benötigen (Abbildung 4). Daher besteht immer ein enormer Druck auf Zellen, ihre Plasmide loszuwerden. Wenn sie das Plasmid loswerden können, wachsen sie auf einer Nährplatte (oder in der Umwelt) schneller. Das Plasmid loszuwerden ist jedoch genau das, was wir nicht wollen. Um den Druck zu überwinden, das Plasmid loszuwerden, müssen wir den Zellen, die das Plasmid besitzen und behalten, einen Vorteil verschaffen.

Figur 4: Wenn Bakterien mit und ohne Plasmid auf einer LB-Nährstoffplatte (kein Antibiotikum vorhanden) gezüchtet werden, wachsen die Bakterien ohne das Plasmid schneller, da sie keine Energie verwenden, um das Plasmid zu replizieren und Proteine ​​herzustellen, die durch das Plasmid kodiert werden. Bildnachweis: Lisa Bartee, 2020, CCBY.

Zweitens müssen wir in der Lage sein, festzustellen, welche Bakterien das Plasmid erhalten haben. Bei einer typischen Transformation werden Milliarden von Bakterien behandelt, um sie kompetent zu machen, und dann Plasmid-DNA ausgesetzt. Typischerweise erwerben weniger als 1 von 1000 Bakterien das Plasmid (Abbildung 5). Wir brauchen einen Weg, die untransformierten Bakterien (mehr als 99% der gesamten vorhandenen Bakterien) loszuwerden, damit nur die Bakterien übrig bleiben, die mit dem Plasmid transformiert wurden. Wenn wir die nicht transformierten Bakterien nicht loswerden, können wir die transformierten Bakterien nicht sehen, da sie einen so kleinen Prozentsatz der Gesamtzahl ausmachen.

Abbildung 5: Nur wenige Bakterien in einer Transformation (typischerweise weniger als 1%) nehmen das Plasmid tatsächlich auf und werden transformiert. Wir brauchen einen Weg, die Bakterien loszuwerden, die das Plasmid nicht aufgenommen haben, damit wir nur noch transformierte Bakterien haben. Bildnachweis: Lisa Bartee, 2020, CCBY.

Antibiotikaresistenzgene bieten ein Mittel, um die Bakterien, die die Plasmid-DNA erworben haben, inmitten all der Bakterien zu finden, die dies nicht getan haben. Antibiotika sind Chemikalien, die das Wachstum von Bakterien hemmen oder abtöten. Wenn das Plasmid ein Gen für die Resistenz gegen ein Antibiotikum enthält, werden Bakterien, die auf einer das Antibiotikum enthaltenden Nährplatte gewachsen sind, nach der Transformation dadurch nicht gehemmt oder abgetötet. Dies bedeutet, dass Bakterien, die das Plasmid während der Transformation aufgenommen haben, von Bakterien unterschieden werden können, die dies nicht getan haben, indem die Bakterien auf einer Nährplatte mit dem Antibiotikum gezüchtet werden (Abbildung 6). Nur die Bakterien, die mit dem Plasmid transformiert wurden, überleben die Abtötungswirkung des Antibiotikums und wachsen zu sichtbaren Kolonien auf der Platte. Denken Sie daran, dass eine Kolonie aus mehr als einer Million genetisch identischer Bakterienzellen gebildet wird. Dies bedeutet, dass die einzigen Kolonien, die nach einer Transformation auf einer Nähr- + Antibiotikum-Platte wachsen, die Bakterien sind, die das Plasmid erworben und behalten haben. Die Verwendung eines Antibiotikums in der Nährplatte und eines Antibiotikaresistenzgens im Plasmid erreicht unsere beiden Ziele, Zellen mit einem Plasmid einen Vorteil zu verschaffen, damit das Plasmid erhalten bleibt, und einen Marker zu haben, damit wir wissen, dass unsere Zellen neue DNA enthalten. Die Resistenz gegen ein Antibiotikum wird als a . bezeichnet wählbarer Marker weil wir für Zellen auswählen können, die es enthalten.

Abbildung 6: Wenn Bakterien mit und ohne Plasmid auf einer LB-Nährplatte mit Antibiotikum gezüchtet werden, werden alle Bakterien ohne Plasmid durch das Antibiotikum abgetötet. Nur Bakterien, die das Antibiotikum enthalten, können wachsen. Bildnachweis: Lisa Bartee, 2020, CCBY. Gabriel Van Helsing, CCSA 3.0, Totenkopf.

So würde die Verwendung eines Antibiotikums zur Selektion transformierter Zellen, die ein Plasmid enthalten, aussehen:

Für unser Labor:

Das Plasmid, das wir verwenden werden, heißt pGLO (erhältlich von Bio-Rad). Dieses Plasmid enthält mehrere wichtige Teile:

  • Ori – ein Replikationsstartpunkt, der es ermöglicht, das Plasmid zu kopieren, wenn sich die Bakterien teilen.
  • GFP-Gen (grün fluoreszierendes Protein) – das GFP-Protein leuchtet in Gegenwart von UV-Licht grün.
  • bla-Gen – aus diesem Gen wird das Enzym Beta-Lactamase hergestellt. Dieses Enzym baut einige Antibiotika wie Ampicillin ab, wenn sie in der Umwelt vorhanden sind, bevor sie die Bakterien abtöten können.
  • araC-Gen – das von diesem Gen produzierte AraC-Protein schaltet das GFP-Gen ein, wenn Arabinose in der Umwelt vorhanden ist.

Bakterien, die mit diesem Plasmid transformiert werden, haben zwei neue Eigenschaften: Sie fluoreszieren unter UV-Licht grün und sind resistent gegen das Antibiotikum Ampicillin.

Die grundlegenden Schritte im Prozess der bakteriellen Transformation sind:

  • Mischen Sie aktiv wachsende Bakterien mit der Plasmid-DNA, die Sie in ein Röhrchen mit CaCl2-Lösung (Calciumchlorid) einfügen möchten.
  • „Hitzeschock“ der Bakterien durch schnelles Erhitzen und anschließendes Abkühlen. Dieser Prozess bewirkt, dass das Plasmid in die Bakterien eindringt.
  • Übertragen Sie die Bakterien auf eine LB-Nährplatte (mit Nährstoffen), damit sie ihre neu erworbenen Gene erholen und exprimieren können.

Nach Durchführung des bakteriellen Transformationsverfahrens werden Zellen, die das Plasmid enthalten, selektiert, indem die Bakterien auf LB-Nährplatten gezüchtet werden, die Ampicillin. Das Ampicillin tötet jede Zelle, die nicht mit dem Plasmid transformiert wurde. Dies bedeutet, dass die einzigen Bakterien, die auf einer Platte mit LB-Nährstoffen und Ampicillin zu sichtbaren Kolonien wachsen können, transformierte Zellen sind. Diese Zellen produzieren GFP in sehr geringen Mengen und erscheinen bei Betrachtung unter UV-Licht weißlich.

Arabinose ist eine Zuckerart, die beim Einschenken auf die Teller gegeben werden kann. Obwohl Arabinose ein Zucker ist, wird sie in diesem Experiment nicht als Nährstoffquelle verwendet. Wenn transformierte Bakterien auf Platten mit LB-Nährstoffen + Ampicillin + Arabinose gezüchtet werden, interagiert die Arabinose mit dem araC-Protein (das aus dem araC-Gen produziert wird). Die Interaktion von Arabinose + araC-Protein stimuliert die Transkription des GFP-Gens. Dies führt zu einem brillanten grünen Leuchten, wenn die Bakterien unter einer UV-Lichtquelle betrachtet werden.

Proben in unserem Experiment

In unserem Labor werden wir transformierte (+pGLO) und nicht transformierte (-pGLO) Bakterien vergleichen, die auf verschiedenen Plattentypen gezüchtet wurden. Hier sind die wichtigsten Punkte, die Sie sich merken sollten:


Den Fehlermythos entlarven

Die Stärke der SMRT-Sequenzierungsdaten liegt sowohl in ihren langen Leselängen als auch in der zufälligen Natur des Fehlerprozesses (Abbildung 2). Es stimmt, dass einzelne Lesevorgänge eine höhere Fehlerzahl aufweisen: etwa 11 bis 14 % oder Q12 bis Q15, verglichen mit Q30 bis Q35 von Illumina und anderen Technologien. Bei ausreichender Tiefe (z. B. 8x oder mehr) bietet die SMRT-Sequenzierung jedoch eine hochgenaue statistisch gemittelte Konsensusperspektive des Genoms, da es sehr unwahrscheinlich ist, dass derselbe Fehler mehrmals zufällig beobachtet wird. Bekanntermaßen leiden andere Plattformen unter systematischen Fehlern, die durch komplementäre Methoden behoben werden müssen, bevor die endgültige Sequenz erstellt wird [16].

Eine Aufschlüsselung des Sequenzierungskontexts der empirischen Insertionsfehlerrate der beiden Plattformen auf NA12878-Gesamtgenomdaten. In dieser Abbildung zeigen wir alle Kontexte der Größe 8, die mit AAAA beginnen. Der empirische Einfügungsqualitätswert (ja-Achse) ist PHRED-skaliert. Trotz der höheren Fehlerrate (ungefähr Q12) des PacBio RS-Instruments ist der Fehler unabhängig vom Sequenzierungskontext. Es ist bekannt, dass andere Plattformen unterschiedliche Fehlerraten für unterschiedliche Sequenzierungskontexte aufweisen. Die hier gezeigte HiSeq-Plattform von Illumina hat eine niedrigere Fehlerrate (ungefähr Q45 über acht unabhängige Läufe), aber Kontexte wie AAAAAAA und AAAAACAG haben extrem unterschiedliche Fehlerraten (Q30 vs. Q55). Diese kontextspezifische Fehlerrate erzeugt einen Bias, der durch eine größere Sequenzierungstiefe nicht leicht zu klären ist. Empirische Insertionsfehlerraten wurden mit dem Genome Analysis Toolkit (GATK) - Base Quality Score Recalibration Tool gemessen.

Ein weiterer Ansatz, der von der stochastischen Natur des SMRT-Fehlerprofils profitiert, ist die Verwendung von zirkulären Konsensus-Reads, bei denen ein Sequenzierungs-Read mehrere Beobachtungen derselben Base erzeugt, um eine hochgenaue Konsensussequenz aus einzelnen Molekülen zu generieren [17]. Bei dieser Strategie wird die Leselänge gegen Genauigkeit eingetauscht, was in einigen Fällen effektiv sein kann (gezielte Neusequenzierung, kleine Genome), aber nicht notwendig ist, wenn man eine gewisse Redundanz in den Sequenzierungsdaten erreichen kann (8x wird empfohlen). Bei dieser Redundanz ist es vorzuziehen, von der verbesserten Zuordnung längerer Inserts zu profitieren, als sich für zirkuläre Consensus-Reads zu entscheiden, da die längeren Reads mehr Wiederholungen umfassen können und dennoch eine hohe Genauigkeit durch ihren Konsens erreicht wird.


DNA-Topoisomerasen: Biochemie und Molekularbiologie

Karl Drlica , Barry Kreiswirth , in Fortschritte in der Pharmakologie , 1994

A Beibehaltung fester Supercoiling-Werte

Intakte zirkuläre DNA, die aus Bakterienzellen extrahiert wurde, weist ein Verknüpfungsdefizit auf, das heißt, die DNA weist weniger Duplexwindungen auf, als sie in einem eingeschnittenen oder linearen Molekül der gleichen Länge zu finden wären. Dieses Verknüpfungsdefizit führt dazu, dass die DNA unter einer negativen superhelikalen Spannung steht, so dass ein Verknüpfungsdefizit, das bei extrahierter DNA beobachtet wird, oft als „negatives Supercoiling“ bezeichnet wird. Spannung ist auch innerhalb von Zellen vorhanden, jedoch nur auf der Hälfte des Niveaus, das bei extrahierter DNA gefunden wird (für Referenzen siehe Drlica, 1992). Nicht identifizierte Faktoren beschränken den Rest des Verknüpfungsdefizits und verhindern, dass intrazelluläre Nicks in der DNA es vollständig eliminieren. Da viele Aktivitäten der DNA empfindlich auf Supercoiling-Niveaus reagieren (siehe zum Beispiel Drlica, 1984, Pruss und Drlica, 1989), ist es von allgemeinem Interesse, zu verstehen, wie diese Niveaus hergestellt und gestört werden.

Vier Topoisomerasen wurden identifiziert in Escherichia coli: Topoisomerase I ( Wang, 1971 ), Gyrase [Topoisomerase II ( Gellert et al., 1976a)], Topoisomerase III (Dean et al., 1983) und Topoisomerase IV (Kato et al., 1990). Nur Gyrase führt negative Superspulen ein in vitro. Es scheint die Hauptquelle des negativen Supercoilings zu sein in vivo, da Gyrasehemmer die Einführung negativer Supercoils in Bakteriophagen-λ-DNA während der Superinfektion eines Lysogens blockieren ( Gellert et al., 1976b). Diese Inhibitoren, insbesondere die Cumarine, verursachen auch einen Verlust von Supercoils sowohl des Chromosoms als auch der Plasmide (Drlica und Snyder, 1978 Kano et al., 1981 Manes et al., 1983 ). In vitro, Gyrase, sowie Topoisomerasen I und III relaxieren DNA. Defekte in Topoisomerase I (das Produkt von nach obenA) zu erhöhten Supercoiling-Spiegeln führen, folglich verhindert Topoisomerase I normalerweise, dass ein übermäßiges Supercoiling aufrechterhalten wird. Löschung von nach obenA blockiert das Wachstum von E. coli, und dies führte zur Wiederherstellung von kompensatorischen Mutationen. Viele davon sind in den Gyrase-Genen (gyrA und gyrB) und reduzieren Supercoiling unter normale Werte ( DiNardo et al., 1982 Preußen et al., 1982 Richardson et al., 1984 Raji et al., 1985). Diese Mutationsstudien betonen die Bedeutung des Supercoilings für das Zellwachstum und stellen fest, dass ein starkes Wachstum innerhalb eines Bereichs des Supercoilings von ± 15 % auftritt. Es gibt wenig Beweise dafür, dass Topoisomerase III oder IV normalerweise an der Kontrolle des Supercoilings beteiligt ist.

Gyrase und Topoisomerase I neigen dazu, das Supercoiling durch ihre Substratspezifität innerhalb eines festgelegten Bereichs aufrechtzuerhalten. Gyrase ist auf relaxierten als auf superspiralisierten Substraten aktiver ( Sugino und Cozzarelli, 1980 ). Topoisomerase I bevorzugt eindeutig stark negativ superspiralisierte DNA als Substrat in vitro, und es entspannt die DNA nicht vollständig (Wang, 1971). In vivo, Topoisomerase I ist keine Hauptquelle für entspannende Aktivität, wenn das Supercoiling unter das normale Niveau fällt: In einer Studie hatte die Anwesenheit dieses Enzyms keine nachweisbare Wirkung auf die Geschwindigkeit der DNA-Relaxation, die durch Gyrase-Inhibitoren induziert wird, die wahrscheinlich die Gyrase zur Relaxation der DNA stimulieren ( Pruss et al., 1986) in einer anderen Studie erzeugte Topoisomerase I eine langsame und nur teilweise Relaxation (Bliska und Cozzarelli, 1987).

Die Topoisomerasen korrigieren Störungen der helikalen Ganghöhe, die die Superhelikalspannung verändern. Beispielsweise erhöht eine sinkende Temperatur die Anzahl der Duplexwindungen in der DNA, was die Superhelikalspannung erhöhen sollte. Die Topoisomerasen scheinen diese Überspannung zu lockern, da DNA weniger Supercoils aufweist, wenn sie aus Zellen extrahiert wird, die bei niedrigeren Temperaturen gezüchtet wurden (Goldstein und Drlica, 1984). In einem anderen Beispiel entwickelt die Behandlung von Zellen mit dem interkalierenden Farbstoff Chloroquin die DNA, was die Superhelikalspannung verringern sollte. Gyrase scheint dann Superspulen einzuführen (Esposito und Sinden, 1987). Die anschließende Entfernung von Chloroquin hat den gegenteiligen Effekt und löst eine schnelle Entspannung aus.

Andere Beispiele für korrigierende Maßnahmen der Topoisomerasen sind mit DNA-Aktivitäten verbunden, die eine Strangtrennung beinhalten. Einige bemerkenswerte Fälle sind aus der Untersuchung der transkriptionellen Effekte auf das Supercoiling hervorgegangen. In einem nach obenA mutierte Transkription der tet Gen auf pBR322 verursachte, dass das supercoiling der plasmatischen DNA stark negativ wurde (Pruss und Drlica, 1986). Dies, gepaart mit der Beobachtung, dass die Hemmung der Gyrase positive Supercoils in pBR322 erzeugen kann (Lockshon und Morris, 1983), führte zu der Idee, dass die Translokation von Transkriptionskomplexen entlang der DNA eine negative superhelikale Spannung hinter dem Komplex und eine positive Spannung (oder eine Relaxation von negativen) erzeugt Spannung) voraus (Liu und Wang, 1987). Topoisomerase I würde eine übermäßige negative Spannung korrigieren, während Gyrase eine Relaxation (oder die Einführung positiver Supercoils) korrigieren würde. Somit führt ein Ungleichgewicht zwischen den beiden Enzymen zu transkriptionsinduzierten Veränderungen des Nettoverknüpfungsdefizits: Negative Supercoils akkumulieren in Abwesenheit von Topoisomerase I (Pruss und Drlica, 1986) und positive Supercoils akkumulieren in Gegenwart eines Gyrase-Inhibitors (Wu et al., 1988). Unter normalen Umständen könnte die Transkription zumindest vorübergehend ein lokales Supercoiling erzeugen, das signifikant von den Durchschnittswerten abweicht. Bei Plasmiden wurden lokale Störungen beobachtet in vivo (Rahmouni und Wells, 1989, 1992).

Eine weitere Erhaltungsstufe beinhaltet die Expression von den Genen, die für Gyrase und Topoisomerase I kodieren. Die Cumarin-Hemmer der Gyrase verursachen eine DNA-Relaxation (Drlica und Snyder, 1978), und mit der Relaxation ist eine Zunahme der Expression von beiden verbunden gyrA und gyrB ( Menzel und Gellert, 1983 ) sowie eine Abnahme der Expression von nach obenA (Tse-Dinh, 1985). Es wurden auch Fälle gefunden, in denen die Chinolone das Supercoiling verstärken können ( Manes et al., 1983 Preußen et al., 1986 Franco und Drlica, 1989 ) unter diesen Bedingungen nach obenA die Expression nimmt zu (Tse-Dinh und Beran, 1988). Somit gibt es eine homöostatische Regulation der Supercoiling- und Topoisomerase-Genexpression.


DNA in Bakterien (mit Diagramm)

Die DNA von Bakterien, z.B. E. coli ist ein kovalent geschlossenes ringförmiges Molekül. Es bildet das Bakterienchromosom, obwohl dieses Chromosom in Struktur und Organisationsniveau viel einfacher ist als die eukaryotischen Chromosomen von Pflanzen und Tieren. Außerdem hat jede Bakterienzelle normalerweise ein einzelnes Chromosom, das ein einzelnes ringförmiges DNA-Molekül enthält.

In E. coli ist das DNA-Molekül in vollständig gestreckter Form 1.300 µm lang und enthält etwa 4.700 x 10 3 Basenpaare, die etwa 4.000 Gene kodieren. Um dieses lange DNA-Molekül in eine nur etwa 1 µm x 3 µm große Zelle zu packen, muss das Molekül stark gefaltet und superspiralisiert werden.

Das prokaryontische Chromosom – auch Nukleoid genannt – besteht aus einer Reihe von Schlingen, die von mehreren Proteinen zusammengehalten werden. E. coli-Nukleoid hat beispielsweise 45 (40-50) Schleifen, die von einem zentralen Proteinkern ausstrahlen. Jede Schleife ist supercoiled (Abb. 9.8A). Der supercoiled-Zustand der DNA-Schleifen kann durch Behandlung mit DNase entfernt werden, was einen Einzelstrangbruch (nick) verursacht.

Eine einzelne Kerbe führt zum Abwickeln einer einzelnen Schlinge, ohne die Superwicklung anderer Schlingen zu beeinflussen (Abb. 9.8B). Dies zeigt, dass jede Schleife von der anderen isoliert ist, obwohl das ds-DNA-Molekül alle Schleifen durchläuft. Die Assoziation mit Proteinen im Nukleoidkern verhindert das Abwickeln anderer Schleifen. Das E. coli-Chromosom benötigt etwa 45 Kerben, um alle supercoiled-Schleifen zu entfernen, wodurch ein geschlossener Kreisring entsteht.

Ein zirkuläres DNA-Molekül ohne Supercoiling befindet sich in einem entspannten Zustand. In diesem Zustand enthält die standardmäßige rechtsgängige DNA-Doppelhelix etwa 10 Nukleotidpaare pro Helixwindung. Wenn nun einer der beiden Stränge geknickt und um 360° gedreht wird, um eine komplette Helixwindung abzuwickeln, und die Schnittenden wieder verschlossen werden, kann das zirkuläre DNA-Molekül auf eine der beiden folgenden Arten reagieren: Es kann eine Region von . produzieren ungepaarte Basen, die als Blase bezeichnet werden, oder sie kann sich alternativ in eine der Entwindungsrichtung entgegengesetzte Richtung verdrehen, um ein negativ superspiralisiertes zirkuläres DNA-Molekül zu erzeugen.

Die drei Zustände der zirkulären DNA – relaxiert, mit Blase und negativ supercoiled – sind in Abb. 9.9 schematisch dargestellt:

Negatives Supercoiling von ds-DNA wird durch eine Klasse von Enzymen erzeugt, die als Topoisomerasen bekannt sind. Der einzelsträngige Nick wird durch Topoisomerase I erzeugt, die einen Bruch oder eine Lücke in der Phosphodiesterbindung des DNA-Strangs erzeugt. Der intakte komplementäre Strang wird durch die Lücke geführt und die Kerbe wird dann wieder verschlossen. Eine andere Klasse von Topoisomerasen, die Topoisomerase II, wird auch als DNA-Gyrase bezeichnet.

Diese Enzyme induzieren einen Doppelstrangbruch in den Phosphodiesterbindungen beider Stränge. Diese Enzymklasse spielt eine entscheidende Rolle bei der DNA-Replikation. Durch das Induzieren von Brüchen in beiden Strängen hilft das Enzym, ein intaktes doppelsträngiges DNA-Molekül oder einen Teil durch ein anderes zu passieren.

Wenn sich also ein zirkuläres DNA-Molekül repliziert, können die beiden Tochtermoleküle wie zwei Ringe einer Kette ineinandergreifen. DNA-Gyrase kann die beiden Moleküle trennen, indem sie einen Doppelschnitt in einem induziert und das andere durch die Lücke passieren lässt, die dann wieder verschlossen wird.

DNA-Gyrase hat eine wichtigere Funktion bei der normalen DNA-Replikation. Mit dem Vorrücken der Replikationsgabel entwickelt sich im nicht replizierten Teil der ds-DNA-Helix ein positives Supercoiling. Um die Spannung zu kompensieren, führt die DNA-Gyrase durch Nicken ein negatives Supercoiling ein.


F20: a) Bakterien haben kleine zirkuläre DNA außerhalb der genomischen DNA. Wie heißt es? Hat es eine Bedeutung für Bakterien?c) Wie unterscheiden sich Zusammensetzung und Dicke der Glykokalyx bei Bakterien?d) Welche Rolle spielen Mesosomen und Fimbrien in Bakterien?​

Diese kleinere DNA werden Plasmide genannt. . Auch Jahrzehnte nach ihrem ersten Einsatz sind Plasmide noch immer wichtige Laborwerkzeuge der Biotechnologie: Wissenschaftler können Bakterien zwingen, sie zu behalten. Praktisch alle Plasmide, die verwendet werden, um DNA zu liefern, enthalten Gene für Antibiotikaresistenz. . Nur diejenigen Zellen, die das Plasmid enthalten, werden überleben, wachsen und sich vermehren.

c) Struktur der endothelialen Glykokalyx und ihre Aktivierung der Gefäßmuskelrelaxation durch Stickstoffmonoxid (NO) als Reaktion auf eine erhöhte Scherkraft3,6

d) Fimbrien sind dünne filamentöse Anhängsel, die sich von der Zelle aus erstrecken, oft zu Dutzenden oder Hunderten. Sie bestehen aus Pilin-Proteinen und werden von der Zelle verwendet, um sich an Oberflächen zu binden. Sie können besonders wichtig für pathogene Bakterien sein, die sie nutzen, um sich an Wirtsgewebe anzuheften.


Mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese wird die A. tumefaciens Genom analysiert, wobei ein lineares Chromosom und ein zirkuläres Chromosom identifiziert wurden [1]. Die Größe des linearen Chromosoms beträgt 2100 Kb, was kleiner ist als das 3000 Kb des kreisförmigen Chromosoms [1]. Die Agrobacterium-Spezies haben eine enge 16s-rRNA-Sequenzbeziehung mit Brucella-Spezies, von denen bekannt ist, dass sie zwei zirkuläre Chromosomen haben [1].

B. Melitensis ist ein gramnegatives Coccobacillus-Bakterium, das zwei zirkuläre Chromosomen besitzt [5]. Die beiden Chromosomengrößen betragen 2117 Kb und 1178 Kb [5]. Andere Brucella-Arten mit zwei kreisförmigen Chromosomen umfassen B. suis Biovar 1, B. suis Biovar 2, B. suis Biovar 4, B. abortus und B. ovis [9].


Supercoiling von bakterieller DNA | Mikrobiologie

DNA-Moleküle existieren in zwei Zuständen, relaxiert und supercoiled. Ein entspannter Zustand eines DNA-Moleküls ist ein Zustand, in dem die genaue Anzahl der Windungen der Helix durch Berechnung der Anzahl der Basenpaare vorhergesagt werden kann, während der Zustand, wenn das entspannte DNA-Molekül stark verdreht ist, um sich in einem kleinen Raum unterzubringen, als Supercoiled bezeichnet wird .

Das Beispiel von Escherichia coli macht deutlich, warum das entspannte DNA-Molekül in den supercoiled-Zustand übergeht. Die DNA von E. coli wird im entspannten Zustand mit mehr als 1 mm Länge etwa 400 Mal länger als die E. coli-Zelle selbst. Wie kann so viel DNA in einen so kleinen Raum einer E. coli-Zelle gepackt werden? Die Natur hat dieses Problem gelöst, indem sie dem DNA-Molekül eine Art „Struktur höherer Ordnung“ auferlegt hat.

In dieser Struktur wird die doppelsträngige helikale DNA durch den sogenannten Supercoiling-Prozess weiter stark verdrillt und leicht in E. coli-Zellen gepackt. Das supercoiled DNA-Molekül bleibt unter Torsion, fast ähnlich der zusätzlichen Spannung eines Gummibandes, die auftritt, wenn es verdreht wird.

DNA-Molekül-Supercoils in positiver oder negativer Richtung Es ist die negative Supercoiling, die überwiegend in allen nicht-hyperthermophilen Organismen in der Natur funktioniert. Beim negativen Supercoiling wird das DNA-Molekül um seine Achse entgegengesetzt zur rechtsgängigen Doppelhelix verdreht.

DNA-Moleküle können abwechselnd supercoiled und relaxiert werden. Dies liegt daran, dass das Supercoiling für das Packen der DNA in die Bakterienzelle und das Relaxen für die Replikation der DNA notwendig ist. Abb. 5.35 zeigt, wie Supercoiling in einem relaxierten, kovalent geschlossenen, zirkulären dsDNA-Molekül stattfindet, und es zeigt auch, wie ein supercoiled DNA-Molekül zu einem relaxierten DNA-Molekül wird.

Supercoiling in bakterieller und den meisten archaealen DNA wird mit Hilfe eines Enzyms namens DNA-Gyrase durchgeführt, einer Enzymart namens Topoisomerase, insbesondere Topoisomerase II.

Der Prozess läuft in mehreren Schritten ab:

(i) Ein Strang zirkulärer relaxierter DNA wird über den anderen gelegt,

(ii) Das Übereinanderlegen eines Teils führt zu einem Kontakt zwischen der Helix an zwei Stellen, und die DNA-Gyrase (Topoisomerase II) macht einen Doppelstrangbruch (nick) im Kontaktbereich an einer Stelle, und(3) der gebrochene Der (eingeschnittene) Doppelstrang wird auf der gegenüberliegenden Seite des intakten Strangs wieder versiegelt, was zu einem Supercoiling im DNA-Molekül führt.

Supercoiling im DNA-Molekül, das durch die Wirkung eines anderen Enzyms namens Topoisomerase I entfernt wird. Dieses Enzym führt einen Einzelstrangbruch (nick) in die supercoiled DNA ein und bewirkt die Rotation eines Einzelstrangs der doppelsträngigen DNA um den anderen, was zu die Rückkehr des supercoiled-Zustands der DNA in den entspannten Zustand.

Um jedoch zu verhindern, dass sich die gesamte Bakterien-DNA bei jedem Bruch (nick) entspannt, enthält die DNA supercoiled-Domänen (Abb. 5.36). Tatsächlich ist die doppelsträngige Bakterien-DNA nicht in einem Supercoil, sondern in mehreren Supercoiled-Domänen angeordnet.

In E. coli werden über 50 Supercoiled-Domänen berichtet, von denen jede durch Bindung an spezifische Proteine ​​stabilisiert wird. Ein Nick in einem Strang doppelsträngiger DNA in einer dieser Domänen erlaubt jedoch nicht, dass die DNA in anderen Domänen relaxiert.


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