Information

Enzym mit langer Röhre zum aktiven Zentrum?

Enzym mit langer Röhre zum aktiven Zentrum?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Gibt es Enzyme, die eines oder mehrere ihrer Substrate zwingen, eine relativ lange Strecke durch eine kleine Öffnung/Röhre durch das Enzym und zum aktiven Zentrum zu wandern? (kein Transportprotein)


Zunächst einmal gibt es, wie Sie erwähnt haben, viele Membran- / Transportproteine ​​mit sehr schönen, gut definierten Tunneln. Aber Sie suchen nach einem löslichen / zytosolischen Enzym.

Einige sauerstoffabhängige Enzyme haben ziemlich lange Tunnel, die Sauerstoff verwendet. Zum Beispiel diese hier: http://www.jbc.org/content/283/36/24738.short oder diese: http://europepmc.org/articles/PMC2698890

Dann gibt es einige Enzyme mit nur tiefen aktiven Zentren, ich denke, das p450 BM3 ist dafür ziemlich bekannt, aber jedes Enzym mit einer vernünftigen Spezifität (und insbesondere solche mit sehr reaktiven Cofaktoren) wird einen "Tunnel" haben.

Sie können auch lange "Tunnel" in Enzymen finden, die lange Substrate akzeptieren. Ich mag dieses Beispiel für Squalen-Synthase: http://science.sciencemag.org/content/277/5333/1811.full. Das Substrat muss zuerst tief in das Enzym eindringen, um das Proton zu finden, das es braucht, um eine recht interessante Reaktion zu starten.

Wenn Sie neue Tunnel in Ihrem Enzym finden möchten, stehen Ihnen auch Tools wie CAVER zur Verfügung: http://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id=10.1371/journal.pcbi.1002708 Mit diesem Werkzeug finden Sie möglicherweise auch einige Hohlräume.


Lebende Organismen halten die Aktivitäten des Lebens aufrecht, indem sie jede Minute Tausende von chemischen Reaktionen ausführen. Diese Reaktionen laufen nicht zufällig ab, sondern werden durch biologische Katalysatoren namens . gesteuert Enzyme. Enzyme beschleunigen die Geschwindigkeit chemischer Reaktionen, indem sie die Aktivierungsenergie benötigt, um die Reaktion auszulösen. Ohne Enzyme würden chemische Reaktionen nicht schnell genug ablaufen, um das Leben zu unterstützen. Enzyme sind typischerweise Proteine ​​und jedes besteht aus einer spezifischen Sequenz von Aminosäuren. Wasserstoffbrücken bilden sich zwischen bestimmten Aminosäuren und helfen dabei, die dreidimensionale Form zu erzeugen, die für jedes Enzym einzigartig ist. Die Form eines Enzyms, insbesondere seine aktive Seite, diktiert katalytische Spezifität eines bestimmten Enzyms. Jedes Enzym bindet nur an bestimmte Moleküle, da diese Moleküle wie ein Schloss und ein Schlüssel in das aktive Zentrum des Enzyms passen müssen.

Ein Molekül, das an ein Enzym bindet und eine chemische Umlagerung durchmacht, heißt a Substrat. Das Enzym &ldquoE&rdquo verbindet sich mit dem/den Substratmolekül(en) &ldquoS&rdquo am aktiven Zentrum und bildet ein temporäres Enzym-Substrat Komplex &ldquoES&rdquo, wo die spezifische Reaktion stattfindet. Das modifizierte Substratmolekül ist das Produkt &ldquoP&rdquo der Reaktion. Das Produkt trennt sich vom Enzym und wird dann von der Zelle oder dem Körper verwendet. Das Enzym wird durch die Reaktion weder verbraucht noch verändert und kann in anderen katalytischen Reaktionen verwendet werden, solange zusätzliche Substratmoleküle verfügbar sind.

Ein einzelnes Enzymmolekül kann mehrere tausend katalytische Reaktionen pro Sekunde ermöglichen, und daher wird nur eine geringe Enzymmenge benötigt, um große Mengen an Substratmolekülen in Produkt umzuwandeln. Die Menge eines bestimmten Enzyms, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle gefunden wird, ist relativ zu der Geschwindigkeit, mit der das Enzym synthetisiert wird, im Vergleich zu der Geschwindigkeit, mit der es abgebaut wird. Wenn kein Enzym vorhanden ist, wird die durch dieses Enzym katalysierte chemische Reaktion nicht mit einer funktionellen Geschwindigkeit ablaufen. Wenn jedoch die Konzentration des Enzyms ansteigt, nimmt die Geschwindigkeit der katalytischen Reaktion zu, solange die Substratmoleküle zugänglich sind.

Verschiedene Faktoren können inaktivieren oder denaturieren Enzyme, indem sie ihre dreidimensionale Form verändern und ihre Substratbindungseffizienz hemmen. Viele Enzyme funktionieren am besten in einem engen Temperatur- und pH-Bereich, da erhebliche Temperatur- oder pH-Änderungen ihre Wasserstoffbrückenbindungen zerstören und ihre Form verändern. Eine Änderung der Enzymform verändert typischerweise die Form des aktiven Zentrums und beeinflusst seine Fähigkeit, an Substratmoleküle zu binden. Es ist das einzigartige strukturelle Bindungsmuster eines Enzyms, das seine Empfindlichkeit gegenüber Temperatur- und pH-Änderungen bestimmt.

In der folgenden Übung werden Sie die Auswirkungen von pH-Wert und Temperatur auf die Aktivität des Enzyms Amylase untersuchen. Amylase kommt im Speichel von Menschen und anderen Tieren vor, die Stärke als Teil ihrer Nahrung aufnehmen. Stärke ist ein pflanzliches Polysaccharid, das aus vielen miteinander verbundenen Glukosemolekülen besteht. Amylase kontrolliert die anfängliche Verdauung von Stärke, indem sie sie in Disaccharid-Maltose-Moleküle zerlegt. Maltose wird schließlich im Dünndarm in Glukosemoleküle zerlegt, wenn andere Enzyme verwendet werden.

Abbildung 1: Verzweigungsstruktur von Stärke.

Die Geschwindigkeit, mit der Stärke zu Maltose verdaut wird, ist ein quantitatives Maß für die enzymatische Reaktion. Die Geschwindigkeit des Stärkeabbaus ist relativ zu der Geschwindigkeit, mit der Maltose produziert wird, jedoch ist es einfacher, das Vorhandensein von Stärke zu testen, als die Geschwindigkeit der Maltoseproduktion zu messen. ich2KI wird als Indikator für das Vorhandensein von Stärke verwendet. Wenn Stärke vorhanden ist, I2KI wird blau-schwarz. In Gegenwart von Maltose, I2KI reagiert nicht und bleibt bernsteinfarben.

[ Stärke + I_2KI ightarrow ext keine Nummer]

[ Maltose + I_2KI ightarrow ext keine Nummer]

Ihre Gruppe wird beauftragt, eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten (teilweise oder vollständig) durchzuführen:

I. Die Wirkung des pH-Werts auf die Amylaseaktivität

II. Der Einfluss der Temperatur auf die Amylaseaktivität

Die Ergebnisse jeder Übung werden der Klasse präsentiert und die Schüler sind für die Informationen und Ergebnisse aller Übungen verantwortlich.


Einführung

Effizientes computergestütztes de novo-Enzymdesign ist seit langem ein Ziel von Proteiningenieuren und würde es ermöglichen, die katalytische Kraft von Enzymen auf eine Reihe von industriell und medizinisch wichtigen chemischen Reaktionen auszurichten. Studien haben gezeigt, dass, obwohl ein De-novo-Design möglich ist, die unvollkommenen Designs oft eine Optimierung durch Laborevolution erfordern 1,2 . Unsere Fähigkeit, Enzyme zu entwickeln, beruht auf unserem grundlegenden Verständnis der Enzymkatalyse, doch die biophysikalischen und chemischen Grundlagen ihrer katalytischen Effizienz bleiben ein Diskussionsthema 3,4,5 . Es gibt Hinweise auf Beiträge zur Katalyse von der Stabilisierung des elektrostatischen Übergangszustands (TS), Konformationsänderungen und Quantentunneln 6,7,8 . Es hat sich gezeigt, dass die konformative Probenahme Enzymen ermöglicht, spezifische Konfigurationen anzunehmen, die für verschiedene Schritte in ihrem Katalysezyklus geeignet sind, und neuere Arbeiten haben gezeigt, wie entfernte Mutationen die Konformationslandschaft verändern können, um die Probenahme bestimmter konformativer Unterzustände zu erhöhen 7,9. Es wurde auch vorgeschlagen, dass Schwingungsbewegungen zum chemischen Schritt in der Katalyse beitragen, indem sie die Wahrscheinlichkeit der Übertragung durch die TS-Barriere in einigen Enzymen durch quantenmechanisches Wasserstofftunneln 8,10 ändern.

Die Kemp-Eliminierung (Protonen-Eliminierung aus 5-Nitrobenzisoxazol Abb. 1) wurde aufgrund der Einfachheit der basenkatalysierten Ringöffnungsreaktion 11 und des Fehlens natürlicher Kemp-Eliminasen 1 häufig als Modellsystem im Enzymdesign verwendet, obwohl einige Enzyme katalysiert die Kemp-Eliminierung promiskuitiv 12,13 . Das computergestützte Design von KE07 umfasste die Konstruktion eines Theozyms zur Katalyse der chemischen Reaktion, das dann in das Gerüst der Imidazol-Glycerinphosphat-Synthase (HisF) aus . gepfropft wurde Thermotoga Maritima 1. Katalytisch essentielle Reste aus dem ursprünglichen Design umfassen eine Base (Glu101), die die Spaltung der C‐H‐Bindung erleichtert, einen H‐Brücken‐Donor (Lys222) zur Stabilisierung des Phenoxid‐Intermediats und einen π-stapelnden Rest (Trp50), der zur Stabilisierung den Übergangszustand und begünstigen die Substratbindung durch Wechselwirkungen mit dem aromatischen Ring des Substrats. Dieses anfängliche KE07-Design (Runde 1 R1) katalysiert die Spaltung von 5-Nitrobenzisoxazol (1), mit 10 3 -facher Geschwindigkeitsbeschleunigung gegenüber der nichtkatalysierten Reaktion und einer Umsatzgeschwindigkeit (kKatze) von 0,018 s −1 . Sieben Generationen der gerichteten Evolution steigerten dann diese Umsatzrate um das 100-fache 1 .

Reaktionsschema für die Kemp-Eliminierung von 5-Nitrobenzisoxazol. Das nukleophile Sauerstoffatom der Base (B) spendet Elektronen an das elektrophile 3′-H von 5-Nitrobenzisoxazol und das elektronegative Sauerstoffatom der Isoxazolgruppe bildet eine Wasserstoffbrücke mit einer Säure (A) (1), die einen Übergangszustand bilden, in dem die C‐H‐ und N‐O‐Bindungen geschwächt sind (2). Die Entfernung des 3′-H vom Substrat führt zu einer anionischen Phenoxid-Zwischenstufe, die dann protoniert wird und das Endprodukt bildet (3)

Obwohl die Verbesserungen an KE07 teilweise durch experimentelle und rechnerische Charakterisierung der mutierten Proteine ​​14,15,16,17 rationalisiert wurden, war die Berücksichtigung der Auswirkungen von entfernten Mutationen in späteren Runden eine Herausforderung. KE07 ist nicht die effizienteste der verschiedenen Kemp-Eliminasen, die jetzt entwickelt wurden 18,19,20 , aber im Zusammenhang mit dem Verständnis, wie die Enzymaktivität durch schrittweise Mutationen schrittweise verbessert werden kann, macht es seine geringe Effizienz zu einem idealen Modellsystem, um die Mechanismen zu untersuchen, indem welche Evolution oder Technik einen ineffizienten Ausgangspunkt verbessern kann.

In dieser Studie verwenden wir eine Kombination aus Proteinkristallographie, Enzymkinetik und Computeransätzen, um die Struktur, Funktion und Dynamik einer Reihe verbesserter Varianten der KE07-Reihe zu untersuchen. Indem wir Kristalle verschiedener KE07-Varianten mit Substrat tränken, fangen wir die Enzyme mit einer Reihe unterschiedlicher Konfigurationen des aktiven Zentrums ein. Mit Hilfe von Molekulardynamiksimulationen zur Untersuchung der Probenahme der verschiedenen konformativen Subzustände zeigen wir, dass die evolutionäre Verbesserung von KE07 die Konformationsauswahl einer alternativen, nicht entworfenen Konfiguration des aktiven Zentrums beinhaltet.


Schau das Video: Enzyme Aktualisiert (Januar 2023).