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Kupfer für Zellinkubator zur Vermeidung von Kontamination

Kupfer für Zellinkubator zur Vermeidung von Kontamination



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Aus irgendeinem Grund scheint das Labor ab und zu ein Problem mit Kontamination zu haben. Es ist praktisch unmöglich, bei jedem Öffnen der Tür das Eindringen von Bakterien, Viren, Pilzen etc. in den Brutschrank zu verhindern. Unser Inkubator ist ziemlich alt, wir haben keine der neuen schickeren Versionen mit reinem Kupfer im Inneren, das Mikroorganismen effektiv abtötet.

Wäre es eine gute Idee, eine Kupferplatte zu kaufen und ins Regal zu stellen, auf die wir unsere Kulturflaschen stellen könnten? Oder würde es den Wärme-/CO2-Fluss zu sehr stören? Wäre es besser, Kupferfolie zu kaufen und die Regale darin einzuwickeln und dann Löcher hineinzustechen, wo sich alle Löcher im Regal befinden?

Wir verwenden gute Zellkulturpraktiken; Ich glaube nicht, dass eine Kontamination stattfindet, weil die Leute nicht wissen, was sie tun. Es passiert einfach mit der Zeit, wenn genug Leute in einem Zellkulturraum arbeiten. Könnte Kupfer im Inkubator helfen? Wir haben wahrscheinlich nicht das Geld, um einen brandneuen Inkubator aus Kupfer zu kaufen. Wäre dies also eine praktikable, wirtschaftliche Alternative?


Als erstes würde ich den HEPA-Filter austauschen. Eine Kupferplatte / -folie kann helfen, und sie wird den Wärmefluss sicherlich nicht stören, da Kupfer unglaublich leitfähig ist (deshalb werden elektrische Drähte daraus hergestellt) und Löcher würden beim Luftstrom helfen, aber ein neuer Filter wird wohl den größten Unterschied machen. Ich habe noch nie einen Vollkupfer-Inkubator verwendet, und die wenigen ernsthaften Kontaminationen, mit denen ich zu kämpfen hatte, standen im Zusammenhang mit dem HEPA-Filter und schlechten TC-Praktiken.

Wenn Sie es noch nicht getan haben, würde ich auch ein gutes Routinereinigungsprogramm einführen. Wechseln Sie das Wasserbad jede Woche (stellen Sie sicher, dass Sie dem Wasser Fungizide hinzufügen) und wischen Sie den gesamten Inkubator mit Bleichmittel ab, gefolgt von einer monatlichen Spülung mit Alkohol. Machen sicher Sie reinigen alle Bleichmittel, da sie Metall korrodieren, wenn sie sehr lange einwirken. Reinigen und autoklavieren Sie gleichzeitig alle abnehmbaren Komponenten wie Regale, Schienen und Wasserwannen.

Viel Glück!


Zurück zu den Grundlagen CO2-Inkubator: Ein Grundnahrungsmittel im Labor

Die Forschung in den Bereichen Zellbiologie, Molekularbiologie, Krebs, Pharmazie usw. hat in den letzten zehn Jahren erstaunliche Fortschritte gemacht, und die in diesen Bereichen eingesetzte Technologie musste Schritt halten. Die Landschaft (oder Laborlandschaft) eines typischen Life-Science-Labors hat sich im Laufe der Jahre dramatisch verändert, aber die CO2 Inkubator ist nach wie vor ein fester Bestandteil des Forschungslabors. Obwohl sich das ultimative Ziel der Aufrechterhaltung von Zellkulturbeständen nicht geändert hat, sind die Funktionsweise und der Betrieb von CO2 Inkubatoren ist genauer, zuverlässiger und komfortabler geworden. CO2 Inkubatoren werden mit Blick auf den Benutzer und seine Anwendungen entwickelt. Drei Hauptprobleme bei der Auswahl eines CO2 Inkubator sind mit Zuverlässigkeit, Kontaminationskontrolle und Benutzerfreundlichkeit ausgestattet. Im Folgenden sind einige der Optionen aufgeführt, die für CO . verfügbar sind2 Inkubatoren.


CO2 Fragen und Antworten zur Inkubator-Feuchteregelung

In einem kürzlich durchgeführten Lab Manager-Webinar haben wir ausführlich besprochen, nach welchen Arten von CO2-Inkubator-Feuchtigkeitskontrolltechnologien gesucht werden muss, um eine optimale relative Luftfeuchtigkeit und Kondensationskontrolle für die Zellkulturarbeit zu gewährleisten. Wenn Sie die Möglichkeit hatten, an diesem Webinar teilzunehmen, können Sie es jederzeit hier auf Abruf ansehen.

Während des Live-Webinars haben wir einige großartige Fragen von Teilnehmern erhalten. Nachfolgend finden Sie eine Zusammenfassung für alle, die für ihre Arbeit Feuchtigkeit und Kondensation kontrollieren müssen.

Beeinträchtigt Kondensation die Integrität des RH-Sensors?

Eine erhebliche Kondenswasserexposition kann dazu führen, dass die Genauigkeit von kapazitiven RH-Sensoren (der Typ, der in den meisten CO2-Inkubatoren verwendet wird) abweicht und zu ihrem Ausfall führen kann, was zu erhöhten Wartungskosten, Ausfallzeiten und den Gesamtbetriebskosten des Inkubators führt. Aus diesem Grund ist es wichtig sicherzustellen, dass der Steuerungsalgorithmus Ihres Inkubators alle relevanten Variablen berücksichtigt, um die Luftfeuchtigkeit zu steuern. Eine Übersicht über diese Faktoren finden Sie in unserem Papier zur Kontrolle von relativer Luftfeuchtigkeit und Kondensation.

Welches Befeuchtungssystem bietet die beste Feuchtigkeitsrückgewinnung? Verdunstung (Wasserwanne) oder Ultraschall (Vernebler)?

Während mit einer Wasserwanne gute Erholungszeiten erreicht werden können, bietet die Ultraschallbefeuchtung die schnellste Erholung. Die CO2-Inkubatoren Cultivo ® Ultra und Ultra Plus von Baker, die einen Zerstäuber verwenden, um Feuchtigkeit zuzuführen, stellen beispielsweise die Feuchtigkeit in nur 8 Minuten nach einer 30-sekündigen Türöffnung auf den Sollwert zurück. Das Basismodell von Cultivo, das eine Wasserwanne verwendet, bringt die Feuchtigkeit nach einer 30-sekündigen Türöffnung in nur 10 Minuten auf den Sollwert zurück. Dies ist zum Teil aufgrund der großen Oberfläche der Wasserwanne möglich. Die meisten Inkubatoren, die kleinere Wasserwannen verwenden, erholen sich nicht so schnell.

Ist es notwendig, Kupfersulfat als Antimykotikum hinzuzufügen?

Dies ist nicht erforderlich, wenn Sie eine Kupferwasserpfanne verwenden. Weitere Informationen zur Kontrolle der Kontamination in Ihrem CO2-Inkubator finden Sie in unserem Papier zur Kontaminationskontrolltechnologie.

Gibt es Inkubatoren, die die Sauerstoffspannung kontrollieren?

Die Sauerstoffspannung (der Partialdruck von O2, das in einer Flüssigkeit wie Blutplasma gelöst ist) kann durch Steuerung der Sauerstoffkonzentration (% O2) in der Atmosphäre der inkubierten Umgebung gesteuert werden. Eine Reihe von Multi-Gas-Inkubatoren und Arbeitsstationen mit kontrolliertem Sauerstoff verwenden Gasmischsysteme, um den atmosphärischen O2-Gehalt &ndash irgendwo von 0,0% (Anoxie) bis 21% (Umgebungs-) O2 mit unterschiedlichen Bereichen und Stabilität zu kontrollieren.

Beeinflusst die Wassermenge in der Wasserwanne den CO2-Gehalt?

Nein, der CO2-Gehalt in der Kammer funktioniert unabhängig vom Wasserstand in der Pfanne.

Gibt es eigenständige Feuchtigkeitssensoren, die in einem Inkubator platziert werden könnten, um aufgezeichnete Messwerte zu erfassen?

Wenn Ihr CO2-Inkubator keinen eingebetteten RH-Sensor hat, sind eigenständige RH-Sensoren erhältlich, die in der Kammer platziert werden können, um die RH zu überwachen. Ein wichtiger Vorteil bei der Verwendung eines Inkubators mit einem eingebetteten RH-Sensor besteht jedoch darin, dass die gesammelten Daten sofort und automatisch an den Steueralgorithmus zurückgegeben werden, der so programmiert ist, dass er nach Bedarf Anpassungen vornimmt, um die Bedingungen in der Kammer stabil zu halten. Dies ist mit einem eigenständigen RH-Sensor einfach nicht möglich.

Wie genau wird der RH-Sensor kalibriert?

Kalibrierverfahren unterscheiden sich je nach Marke. Sie können eine Kopie des Kalibrierverfahrens für Ihren spezifischen CO2-Inkubator beim Hersteller anfordern.

Können Temperatur oder andere Gase die Feuchtigkeitserkennung durch den RH-Sensor beeinflussen?

Wie wir im Webinar besprochen haben, beeinflusst die Temperatur die Genauigkeit von kapazitiven RH-Sensoren. Bei Temperaturschwankungen schwankt die Genauigkeit des RH-Sensors von +/-1,8% bis zu +/-3,8%, wobei die am wenigsten genaue RH-Erkennung bei der häufigsten Temperaturbedingung 37°C erfolgt. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass der Steuerungsalgorithmus des Inkubators eine schwankende RH-Sensorgenauigkeit bei der Steuerung der RH berücksichtigt.

Der im Cultivo verwendete RH-Sensor wurde vorqualifiziert, um unter normalen atmosphärischen Bedingungen sowie bei hohen CO2-Konzentrationen (bis zu 20 %) korrekt zu funktionieren. Baker empfiehlt, Cultivo nicht außerhalb dieser Bedingungen zu betreiben, und das Vorhandensein anderer Gase kann die Lebensdauer und Genauigkeit des RH-Sensors beeinträchtigen. Wenden Sie sich an den Hersteller Ihres Inkubators, um mehr über den jeweiligen RH-Sensor zu erfahren, der in Ihrem System verwendet wird.

Welche Technologien zur Kontaminationskontrolle stehen für den Fall von Kondensat zur Verfügung?

Die gebräuchlichsten Technologien zur Kontaminationskontrolle in CO2-Inkubatoren sind UV-Lampen, Innenkomponenten aus Kupfer und HEPA-Filter. Ein UV-Licht ist nützlich, um die Kontamination in einer Wasserwanne oder einem Wasserbehälter zu kontrollieren, aber seine Wirksamkeit ist begrenzt. Erstens ist die Wirksamkeit eines UV-Lichts nur so gut wie die Intensität der Wellenlänge des Lichts. Diese Intensität nimmt mit der Zeit ab, und da die Glühbirne noch lange nach Abschwächung ihrer keimtötenden Wirkung weiterarbeitet, ist es nicht immer klar, wann die Glühbirne gewechselt werden muss. Zweitens werden nur Schadstoffe abgetötet, die mit den UV-Lichtwellen in Kontakt kommen. Viele UV-Lampen verwenden eine Haube oder einen anderen Teilbehälter, der verhindert, dass die Lichtwellen den größten Teil des Inneren des Inkubators erreichen.

Kupfer hat intrinsische Eigenschaften, die bei der Zerstörung einer Vielzahl von Mikroorganismen helfen können. Als solches ist Kupfer für seine Fähigkeit bekannt, die Kontamination in CO2-Inkubatoren zu kontrollieren. Der Kauf eines Geräts mit Kupferinnenraum oder Kupferinnenkomponenten kann das Kontaminationsrisiko weiter verringern, falls Sie übermäßige Kondensation feststellen. Einige Anbieter von Inkubatoren verwenden in Konstruktion und Design kupferinfundierte Materialien (bei denen ein Prozentsatz des Materials aus Kupfer besteht), während andere einen Innenraum aus 100 % Kupfer bereitstellen. Die Verwendung von Kupfer in einem Inkubator wird von akademischen Forschungslabors auf der ganzen Welt kontinuierlich untersucht. Es ist unklar, ob entweder kupferinfundiert oder 100 % Kupfer mehr oder weniger wirksam ist. Es hängt sicherlich vom Mikroorganismus und seiner Resistenz gegen die antimikrobiellen Eigenschaften von Kupfer ab. Wenn Sie Kupfer als Methode zur Kontaminationskontrolle verfolgen möchten, sind die Grenzen dieser Technologie ziemlich offensichtlich: Alle Oberflächen, die nicht aus Kupfer hergestellt sind, stehen für Kontaminationen zur Verfügung. Dazu gehören Platten, Sensoren, Instrumente, die im Inkubator platziert sind, und alle anderen Innenkomponenten, die nicht aus Kupfer bestehen.

Während ein HEPA-Filter hilft, die Kontamination zu kontrollieren, hilft er bei Kondensation, da er nur Verunreinigungen im Luftstrom auffängt. Wir empfehlen jedoch dennoch die Verwendung eines HEPA-Filters in einem CO2-Inkubator, vorzugsweise eines mit einer großen Oberfläche für die effizienteste Filtration. Basierend auf Tests in unserem Labor ist die Kombination aus einem HEPA-Filter, UV-Licht und Innenkomponenten aus Kupfer am effektivsten, um eine Kontamination im gesamten Inkubator zu verhindern.

Wir arbeiten in einem medizinischen Hochschullabor mit hauptsächlich Studenten. Wie könnten wir von der Feuchtigkeitskontrolltechnologie profitieren? Glauben Sie, dass es für die Schüler von Vorteil wäre?

Kurz gesagt, ja. Die wissenschaftliche Methode beruht auf systematischem Beobachten, Messen und Experimentieren sowie dem Formulieren, Testen und Modifizieren von Hypothesen. Die Werkzeuge, Geräte und Instrumente, die verwendet werden, um einen Hypothesentest durchzuführen, sind entscheidende Verbindungen in diesem System, unabhängig vom Bildungsniveau oder der Komplexität der durchgeführten Forschung. Eine Hypothese sollte durch wiederholbare Ergebnisse gestützt werden. Daher ist es für die Integrität dieses Experiments von entscheidender Bedeutung, die Einschränkungen Ihrer aktuellen Ausrüstung in Bezug auf die Bedingungen, die Ihre Hypothese erfordert, zu verstehen oder zu kontrollieren. Viele Gewebe, Zellen und Mikroorganismen benötigen genaue Umgebungsbedingungen, um zu gedeihen. Ein Inkubator mit Kontrolle von Temperatur, CO2 und relativer Luftfeuchtigkeit kann ein Lernwerkzeug sein, das den Schülern hilft, die Auswirkungen einer Variablen auf eine andere auf diese Kulturen besser zu verstehen und ihnen die Möglichkeit zu geben, eine breite Palette von Forschungsfragen zu untersuchen. Tatsächlich kann die relative Luftfeuchtigkeit in einer Inkubatorkammer diese empfindlichen Zellkulturorganismen beeinträchtigen, ihre morphologischen und elastischen Eigenschaften beeinflussen, was zu einer Veränderung der Struktur einer Zellwand und damit zu Wachstumsraten führt.

Welche Funktionen sollten bei der Anwendung im GMP-Umfeld berücksichtigt werden?

Ein CO2-Inkubator ist ein wesentlicher Bestandteil vieler Bioproduktionsprozesse. Einige Inkubatoren bieten innovative Funktionen innerhalb der Steuerungssoftware und der Benutzeroberfläche, die integraler Bestandteil des Systems sind, die bestimmten Kunden helfen, die Einhaltung der Good Manufacturing Practices (GMP) zu erreichen. Solche Inkubatoren wurden speziell entwickelt, um Benutzern zu helfen, die Anforderungen an Datenprotokollierung, elektronische Aufzeichnungen, Sicherheit und Berechtigungen zu erfüllen. Einige Inkubatoren identifizieren, verfolgen und zeichnen alle Änderungen an den Betriebsparametern auf und protokollieren alle Fehler oder Ereignisse, die für den Betrieb des Systems kritisch sind. Wenn sie in Qualitäts- und Validierungsprotokolle für jede Organisation integriert werden, können diese Funktionen dem Endbenutzer helfen, die Leistungsspezifikation der Ausrüstung selbst in Bezug auf das gewünschte Ergebnis der durchgeführten Forschung oder Arbeit zu validieren. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass es in der Verantwortung des Endbenutzers liegt, die Einhaltung aller geltenden behördlichen Richtlinien, einschließlich der GMP- und FDA 21 CFR Part 11-Konformität, zu erreichen. Ihr Inkubator-Bedienerhandbuch oder Ihr Inkubator-Lieferant kann Ihnen weitere Informationen darüber geben, wie Ihr Inkubator Sie bei der Einhaltung dieser Richtlinien unterstützen kann.

Die neueste RH- und Kondensationskontrolltechnologie

Für einen detaillierteren Überblick über die neueste RH- und Kondensationskontrolltechnologie laden Sie unser Papier &ldquoControlling Relative Humidity and Condensation in a CO2 Incubator&rdquo herunter.


Schwermetalle

Einige der ersten verwendeten chemischen Desinfektionsmittel und Antiseptika waren Schwermetalle. Schwermetalle töten Mikroben, indem sie an Proteine ​​binden und so die enzymatische Aktivität hemmen (Abbildung (PageIndex<3>)). Schwermetalle sind oligodynamisch, was bedeutet, dass sehr geringe Konzentrationen eine signifikante antimikrobielle Aktivität zeigen. Schwermetallionen binden stark an schwefelhaltige Aminosäuren und reichern sich in den Zellen an, wodurch diese Metalle hohe lokalisierte Konzentrationen erreichen können. Dadurch denaturieren Proteine.

Schwermetalle sind für mikrobielle Zellen nicht selektiv toxisch. Sie können auch in menschlichen oder tierischen Zellen bioakkumulieren, und zu hohe Konzentrationen können toxische Wirkungen auf den Menschen haben. Wenn sich beispielsweise zu viel Silber im Körper ansammelt, kann dies zu einer sogenannten Argyrie führen, bei der sich die Haut irreversibel blaugrau verfärbt. Eine Möglichkeit, die potenzielle Toxizität von Schwermetallen zu reduzieren, besteht darin, die Expositionsdauer und Konzentration des Schwermetalls sorgfältig zu kontrollieren.

Abbildung (PageIndex<3>): Schwermetalle denaturieren Proteine, beeinträchtigen die Zellfunktion und verleihen ihnen dadurch starke antimikrobielle Eigenschaften. (a) Kupfer in Vorrichtungen wie diesem Türgriff tötet Mikroben ab, die sich sonst auf häufig berührten Oberflächen ansammeln könnten. (b) Essgeschirr enthält kleine Mengen Silber, um das mikrobielle Wachstum zu hemmen. (c) Inkubatoren werden üblicherweise mit Kupfer ausgekleidet, um die Kontamination der darin gelagerten Zellkulturen zu minimieren. (d) Antiseptische Mundspülungen enthalten üblicherweise Zinkchlorid. (e) Dieser Patient leidet an Argyrie, einem irreversiblen Zustand, der durch die Bioakkumulation von Silber im Körper verursacht wird. (Credit b: Modifikation der Arbeit von &ldquoShoshanah&rdquo/Flickr Credit e: Modifikation der Arbeit von Herbert L. Fred und Hendrik A. van Dijk)

Quecksilber

Quecksilber ist ein Beispiel für ein Schwermetall, das seit vielen Jahren verwendet wird, um das mikrobielle Wachstum zu kontrollieren. Es wurde viele Jahrhunderte lang zur Behandlung von Syphilis verwendet. Quecksilberverbindungen wie Quecksilberchlorid sind hauptsächlich bakteriostatisch und haben ein sehr breites Wirkungsspektrum. Verschiedene Formen von Quecksilber binden an schwefelhaltige Aminosäuren in Proteinen und hemmen deren Funktionen.

In den letzten Jahrzehnten hat die Verwendung solcher Verbindungen aufgrund der Quecksilbertoxizität abgenommen. Es ist in hohen Konzentrationen giftig für das Zentralnerven-, Verdauungs- und Nierensystem und hat negative Auswirkungen auf die Umwelt, einschließlich der Bioakkumulation in Fischen. Früher wurden häufig topische Antiseptika wie Mercurochrom, das Quecksilber in geringen Konzentrationen enthält, und Merthiolat, eine Tinktur (eine in Alkohol gelöste Quecksilberlösung), verwendet. Aufgrund von Bedenken hinsichtlich der Verwendung von Quecksilberverbindungen werden diese Antiseptika jedoch in den Vereinigten Staaten nicht mehr verkauft.

Silber

Silber wird seit langem als Antiseptikum verwendet. In der Antike wurde Trinkwasser in Silberkrügen aufbewahrt. 8 Silvadene-Creme wird häufig zur Behandlung topischer Wunden verwendet und ist besonders hilfreich bei der Vorbeugung von Infektionen bei Verbrennungswunden. Früher wurden Silbernitrattropfen routinemäßig auf die Augen von Neugeborenen aufgetragen, um sich vor Ophthalmia neonatorum zu schützen, Augeninfektionen, die durch die Exposition gegenüber Krankheitserregern im Geburtskanal auftreten können, aber heute werden häufiger antibiotische Cremes verwendet. Silber wird oft mit Antibiotika kombiniert, wodurch die Antibiotika tausendmal wirksamer werden. 9 Silber wird auch häufig in Katheter und Bandagen eingearbeitet, was sie antimikrobiell macht. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass Schwermetalle auch die Selektion auf Antibiotikaresistenz verstärken können. 10

Kupfer, Nickel und Zink

Mehrere andere Schwermetalle weisen ebenfalls antimikrobielle Aktivität auf. Kupfersulfat ist ein gängiges Algizid, das zur Bekämpfung des Algenwachstums in Schwimmbädern und Aquarien verwendet wird. Auch die Verwendung von metallischem Kupfer zur Minimierung des mikrobiellen Wachstums wird immer weiter verbreitet. Kupferauskleidungen in Inkubatoren helfen, die Kontamination von Zellkulturen zu reduzieren. Der Einsatz von Kupfertöpfen zur Wasserspeicherung in unterentwickelten Ländern wird zur Bekämpfung von Durchfallerkrankungen untersucht. Kupferbeschichtungen werden auch für häufig gehandhabte Gegenstände wie Türklinken, Schrankbeschläge und andere Einrichtungsgegenstände in Gesundheitseinrichtungen immer beliebter, um die Verbreitung von Mikroben zu reduzieren.

In ähnlicher Weise werden nun auch Nickel- und Zinkbeschichtungen verwendet. Andere Formen von Zink, einschließlich Zinkchlorid und Zinkoxid, werden ebenfalls kommerziell verwendet. Zinkchlorid ist für den Menschen ziemlich sicher und wird häufig in Mundwässern gefunden, wodurch deren Wirksamkeit erheblich verlängert wird. Zinkoxid ist in einer Vielzahl von Produkten enthalten, darunter topische antiseptische Cremes wie Galmeilotion, Windelsalben, Babypuder und Schuppenshampoos.

Warum sind viele Schwermetalle sowohl antimikrobiell als auch toxisch für den Menschen?


Schützen Sie sich vor Zellkulturkontamination

Kontaminationen reichen von kleinen Ärgernissen bis hin zu großen Katastrophen und verursachen Zeit-, Geld- und Arbeitsverluste, die für die Entwicklung von Kulturen und die Einrichtung von Experimenten aufgewendet werden.

Verunreinigungen können alle Zelleigenschaften (z. B. Wachstum, Stoffwechsel und Morphologie) beeinträchtigen und zu unzuverlässigen oder fehlerhaften Versuchsergebnissen beitragen. Die Kontamination von Zellkulturen wird wahrscheinlich eine Wiederholung von Experimenten erforderlich machen, was zu frustrierenden Zeitverzögerungen und kostspieligen Reagenzienverschwendung führt. Daten aus unentdeckten kontaminierten Kulturen können in wissenschaftlichen Zeitschriften veröffentlicht werden, sodass andere Hypothesen aus zweifelhaften Ergebnissen aufbauen können. Die Kontamination von Zellkulturen kostet allein in den Vereinigten Staaten jedes Jahr Millionen von Dollar, und es scheint immer schlimmer zu werden. Das Problem wird und wird zwar niemals vollständig besiegt werden, aber es kann bekämpft werden.

Schützen Sie sich vor Zellkulturkontamination

Der erste Schritt zur Vermeidung einer Kontamination von Zellkulturen besteht darin, potenzielle Quellen zu kennen und Praktiken zu entwickeln, die das Risiko einer Kontamination durch diese Quellen reduzieren.

Bevor Laborpersonal in einer Gewebekulturanlage arbeiten darf, sollte es von einem erfahrenen Mitarbeiter umfassend in aseptischen Zellkulturtechniken geschult werden. Obwohl jedes Labor seine eigenen Standardarbeitsanweisungen in Bezug auf die Verwendung von Inkubatoren, Autoklavieren, Kennzeichnung von Kulturen, Medienlagerung und Abfallentsorgung hat, enthalten die Richtlinien in der Regel die folgenden Tipps:


Kontamination von Zellkulturen.

Sooooo ich habe meine erste Kontamination meiner Zellkultur. Ich trete mir wirklich selbst in die Quere, weil ich normalerweise so über den Dingen stehe. Ich bin mir nicht sicher, woher es kam. Ich habe eine kontaminierte Flasche mit Medien gefunden, die ich weggeworfen habe, also hoffe ich, dass ich die Quelle losgeworden bin. Ich bin dankbar, dass es zumindest bakteriell und nicht pilzartig war. Jetzt reinige ich gründlich alles im Zimmer. Ich werde den Inkubator reinigen, aber wir haben keinen Autoklaven, der groß genug ist, um die Regale hineinzupassen. Wir haben eines dieser winzigen Bioklaven-Dinge, die praktisch nichts enthalten. Wie effektiv wäre es, UV und Ethanol zu verwenden? mein PI schlug vor, diese Clorox-Tücher und dann auch Ethanol zu verwenden. Ich würde mich sehr über einen Rat freuen, damit ich mir keine Sorgen machen muss, wenn ich meine Zellen wiederbelebe!

Zunächst einmal - Kontaminationen passieren jedem gelegentlich. Es ist in Ordnung, denken Sie nur daran, dies in Zukunft zu verhindern, und fahren Sie fort. Nicht ausflippen, das passiert jedem.

Vertrauen Sie nicht der UV-Strahlung, verwenden Sie Bleichmittel und Ethanol, um die Regale abzuwischen. Darauf werde ich später noch eingehen.

Die Vorschläge von /u/kroxywuff sind alle gut und könnten Ihnen helfen, Ihre Kontamination aufzuspüren. Denken Sie jedoch daran, dass es Ihnen sagt, wo Ihre Kontamination ist, nicht woher sie stammt.

Der Versuch, Ihre Kontamination bis zur Quelle zurückzuverfolgen, wird Sie wahrscheinlich mehr Zeit und Geld kosten, als einfach alles wegzuwerfen und von vorne zu beginnen. Wenn es einmal passiert, keine große Sache. Wenn es immer wieder passiert, müssen Sie mit der Untersuchung beginnen. Für mich hört sich das so an, als wäre dies dein erster und du überreagierst. Es hört sich auch so an, als ob Ihre Medien kontaminiert wurden.

Ich habe einige Vorschläge, und sie werden mit ein wenig meiner Meinung und einigen prekären Sachen kombiniert, die ich entwickelt habe, nachdem ich in den letzten 10 Jahren mit Gewebekulturen gearbeitet habe Körnchen Salz, wenn Sie denken, dass etwas davon keinen Sinn ergibt, aber ich werde Ihnen meine ehrliche Meinung sagen:

Kontamination kommt von Technikfehlern. Etwas, das nicht in der Kultur sein sollte, kam herein. Das war's. Nun, vielleicht wurde ein Paket oder ein Behälter geknackt oder beschädigt, aber 99% (keine echte Statistik) der Kontaminationen werden durch menschliches technisches Versagen verursacht. Wir vermeiden diese Fehler, indem wir die richtige aseptische Technik anwenden.

Vermutlich betreiben Sie Ihre Kultur in einer Biosicherheitswerkbank, die im letzten Jahr gewartet wurde. Das BSC ist das wichtigste Ausrüstungsteil und wird am meisten missbraucht.

Entfernen Sie alles aus dem Schrank und reinigen Sie es. Sie können sogar erwägen, das Tablett herauszunehmen (wenn möglich) und darunter zu reinigen (lesen Sie die Bedienungsanleitung und verwenden Sie geeignete PSA!). Sie können für einige Minuten eine 10%ige Bleichlösung verwenden, gefolgt von 70%igem Ethanol. Denken Sie daran, alles mit Ethanol zu spülen, da eine langfristige Chlorbelastung Edelstahl nach einiger Zeit beschädigen kann.

Lassen Sie beim Arbeiten im BSC keine Gegenstände für längere Zeit im Schrank. Entfernen Sie Gegenstände und wischen Sie sie vor und nach dem Gebrauch ab. Wenn Sie Kartons mit Pipettenspitzen darin aufbewahren, werfen Sie die vorhandenen weg und holen Sie sich neue. Halten Sie den Arbeitsbereich frei von allem, was Sie nicht benötigen. Blockieren Sie niemals die Grills! Ich sehe, dass Leute dies die ganze Zeit mit Notizbüchern, Papier, Werkzeugen, Flaschen usw. tun. Das Blockieren des Luftstroms beeinträchtigt die sterile Umgebung des Schranks. Es ist sehr schlecht. Sehen Sie sich online Videos an und bitten Sie Ihre Einrichtung um eine Schulung in der richtigen aseptischen Technik.

UV-Lichter sind ein Streitpunkt. Ich mag UV in BSCs aus mehreren Gründen nicht. Das Licht desinfiziert nur Dinge von außen und nur die dem Licht zugewandte Seite. Sie brauchen je nach Organismus und UV-Leistung mehrere Minuten bis mehrere Stunden, um effektiv zu desinfizieren. Auch die Wirksamkeit von UV-Lampen lässt mit der Zeit nach. Ich habe keine Daten, aber ich habe verschiedene Zahlen gehört, die von einigen Wochen bis zu einigen Monaten reichen. Es ist wahrscheinlich, dass Ihre Glühbirne nur einmal im Jahr ausgetauscht wird oder wenn sie durchbrennt, sodass sie möglicherweise nicht so effektiv ist, wie Sie es möchten. Außerdem zerstört UV-Kunststoff Kunststoff, es brennt alle Verschüttungen, die Sie nicht entfernen, und hinterlässt einen Fleck auf der Gehäuseoberfläche Haut. Ich benutze die UV nie persönlich, aber einige Leute schwören darauf. Wenn Sie sie verwenden, lassen Sie keine Kunststoffe im BSC, während es eingeschaltet ist. Die CDC rät davon ab, UV in BSCs zu verwenden. Die UV-Strahlung ist jedenfalls kein Ersatz für eine Bleich-/Ethanol-Reinigung. info: https://cfo.asu.edu/node/2667?destination=node%2F2667

Für den Inkubator können Sie das gleiche Reinigungsverfahren für die Regale verwenden, obwohl ich davon abraten würde, Bleichmittel in die warme Umgebung des Inkubators zu sprühen, für diese können Sie Tücher und Ethanol verwenden. Entfernen Sie das gesamte alte Wasser und ersetzen Sie es durch neues DI (sterilisieren Sie das DI, wenn Sie können).

Erinnern: ein Inkubator ist gemacht um Dinge wachsen zu lassen. Sobald Sie es öffnen, setzen Sie es der Außenluft und allen Mikroorganismen in der Umgebung aus. Wenn es nicht in einem Reinraum aufbewahrt wird, ist es zusammen mit dem Wasserbad wahrscheinlich das schmutzigste Ding in Ihrem Labor. Machen Sie einen Zeitplan und reinigen Sie sie mindestens vierteljährlich. Ich empfehle monatlich oder wöchentlich für das Wasserbad. Wenn Sie möchten, können Sie Chemikalien und Algizide im Wasser verwenden, aber denken Sie daran, dass sie möglicherweise auf frühreifere Organismen selektieren, sodass nichts eine gründliche Reinigung und einen guten Wasserwechsel ersetzen kann.

Solange Ihre Vorräte steril und nicht beeinträchtigt sind, sollten sie in Ordnung sein. Die Flaschen sollten angemessen verschließen und die Luft filtern, damit nichts eindringt, während sie im Inkubator stehen. Ich habe Leute mit Doktortiteln über etwas reden hören, das ich als Magie von Bakterien bezeichnen würde, die 'irgendwie' in geschlossene Behälter im Brutkasten gelangen, aber jagen Sie nicht Geistern, weil Sie sich nur verrückt machen.

Das BESTE, was Sie tun können, ist, ALLE Reagenzien, die Sie für diese Kultur verwendet haben, wegzuwerfen und neu zu beginnen. Wenn dies nicht möglich ist, sterilfiltrieren Sie Ihre Reagenzien und vervollständigen Sie die Medien vor der Verwendung mit einem 0,22 um-Filter. Es empfiehlt sich, alle Medien nach der Herstellung steril zu filtern.

Ein guter Techniker, der eine geeignete aseptische Technik und sterile Reagenzien und Verbrauchsmaterialien verwendet, sollte eine zu mehr als 90 % kontaminationsfreie Zellkultur ohne den Einsatz von Antibiotika haben. Stellen Sie also sicher, dass Ihre Technik gut ist, und es wird Ihnen gut gehen. Schwitzen Sie nicht 1 Kontamination, weil das Leben zu kurz ist.

TLDR: Machen Sie sich keine Sorgen um 1 Kontamination, verwenden Sie eine gute Technik, verwenden Sie Bleichmittel und Ethanol zum Reinigen, vertrauen Sie nicht auf UV, werfen oder filtern Sie Reagenzien, Techniktechnik!


Laborkontamination: Kontamination verhindern

Im zweiten Teil dieser Laborkontaminationsserie geben Experten von Thermo Fisher Scientific ihre Top-Tipps zur Vermeidung von Laborkontaminationen.

Der zweite Teil, präsentiert von Mary Kay Bates, globaler Spezialist für Zellkulturen, und Douglas Wernerspach, Business Director, Thermo Fisher Scientific, trägt den Titel: Tipps zur Vermeidung von Kontaminationen.

Im ersten Teil dieser Serie haben wir Arten von biologischen Kontaminanten diskutiert und gelernt, dass Laborpersonal und Verfahrensfehler die größten Kontaminationsquellen sein können, aber was können wir dagegen tun?

„Kontaminationen treten am häufigsten durch vermeidbare Verfahrensfehler auf

Moderne Labore sind geschäftige Umgebungen, in denen das Personal Geräte an überlappenden Arbeitsplätzen teilt, die sich in der Nähe von stark frequentierten Bereichen und stark frequentierten Instrumenten befinden können.

Die Anwendung einer guten aseptischen Technik ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Reinheit von Zellkulturen sowie für eine sichere Laborumgebung.

Einige der grundlegendsten Laborverfahren sind die wichtigsten, einschließlich der Anwendung einer geeigneten aseptischen Technik, des Tragens sauberer Laborkittel und des Händewaschens, um das Risiko der Einschleppung von Mikroorganismen in Säugerzellkulturen zu verringern.

Im Folgenden besprechen wir andere Techniken, die nicht so einfach sind – gutes Labordesign, konsistente Kultivierungsverfahren mit regelmäßigen Identitätstests zur Dokumentation der Authentizität von Zelllinien und Reinigungsschemata.

Diese Verfahren erhalten derzeit möglicherweise nicht die Aufmerksamkeit, die sie verdienen.

Jedes Labor sollte einen eigenen Bereich für die Zellkultur haben, der von stark frequentierten Laborbereichen getrennt ist.

Nur notwendiges Personal sollte direkten Zugang zum Zellkulturbereich haben. Die Platzierung von Wasser- und HLK-Einheiten sollte ebenfalls sorgfältig überlegt werden.

Da beispielsweise Leitungswasser eine Quelle mikrobieller Kontamination sein kann, sollten Spülbecken und Wasserbäder weit genug entfernt aufgestellt werden, um Spritzer auf sterile Arbeitsplätze zu vermeiden.

Außerdem sollten die Luftauslässe von HLK-Geräten nicht direkt über Inkubatoren installiert werden, da Schimmelpilzsporen und andere Verunreinigungen in den Arbeitsbereich geblasen werden könnten.

Kleine Labore müssen beim Labordesign besonders vorsichtig sein, da das Layout des Labors mit zunehmendem Wachstum und der Einführung neuer Instrumente anfälliger für Kontaminationen werden kann.

Kultivierungsverfahren

Das Praktizieren einer guten aseptischen Technik wird dazu beitragen, die Forschung von der ersten Passage über die Genomanalyse bis hin zum Verständnis der Ursachen der Krankheit voranzubringen.

Der erste Schritt in einem aseptischen Kultivierungsverfahren besteht darin, Kreuzkontaminationen zu vermeiden, indem jeweils nur mit einer Zelllinie gearbeitet wird.

Ein versehentliches Wechseln von Zelllinien und Kreuzkontaminationen zwischen Kulturen treten häufig auf und können zu falschen oder irreführenden Daten führen.

Biologische Sicherheitswerkbänke (BSCs) und Arbeitsbereiche sollten zwischen den Kultursitzungen streng gereinigt und desinfiziert werden.

Fortschrittliche Protokolle in einem modernen Zellkulturlabor erfordern häufige Tests.

Ein monatlicher Test auf Mykoplasmen wird empfohlen. Um eine Kreuzkontamination und Vermischung von Zelllinien zu vermeiden, arbeiten Sie jeweils nur mit einem Zelltyp.

Vermeiden Sie schließlich routinemäßige Antibiotika in Zellkulturmedien, da Antibiotika eine zugrunde liegende Kontamination maskieren können, auf die die Antibiotika nicht abzielen.

Ein sauberes, gut organisiertes Labor mit mehreren Benutzern mit unterschiedlichen Erfahrungsstufen sollte auch die Good Pipetting Practice (GPP) anwenden, um sowohl die Genauigkeit als auch die Probensicherheit zu gewährleisten.

Der erste Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass Labormitarbeiter nicht versehentlich mit der Pipettenspitze nicht sterile Medien und Oberflächen berühren.

Wenn ein solcher Fehler auftritt, sollte dieser Tipp verworfen werden.

Darüber hinaus erfordern Zellkulturprozesse vom Wachstum über die Passage bis hin zur Analyse sichere Pipettiersysteme mit präziser Reproduzierbarkeit.

Das F1-ClipTip-Pipettiersystem von Thermo Scientific verhindert, dass die Pipettenspitze während der Anwendung abfällt.

Ein sicheres Siegel für jede Probe mit genauen Probenvolumina macht ClipTip zu einem unschätzbaren Werkzeug, um die Entdeckung zu beschleunigen.

Die Verwendung von hochwertigen Verbrauchsmaterialien, Kulturmedien und Reagenzien von namhaften Herstellern ist eine einfache Möglichkeit, eine konstante Leistung im Labor zu gewährleisten.

Verbrauchsmaterialien und sterile Behälter sollten aus Harzen hergestellt werden, die frei von Zusatzstoffen sind, die in Proben oder Reagenzien auslaugen und Forschungsergebnisse negativ beeinflussen könnten.

Reinigungsverfahren

Um sichere und sterile Arbeitsflächen zu erhalten, muss ein Standardarbeitsverfahren für die ordnungsgemäße Wartung, Reinigung und Desinfektion von Geräten, Arbeitsflächen und Nichtarbeitsflächen implementiert werden.

Die Laborreinigung sollte alle hochebenen Oberflächen umfassen, z. B. die Oberseiten von Kühlschränken, Gefrierschränken und Inkubatoren, auf denen sich Staub und andere potenzielle Verunreinigungen ansammeln können.

Ähnlich wie ein Tresor Ihre Wertsachen schützt, beginnt der Schutz von Zelllinien mit einem zuverlässigen BSC.

Wählen Sie einen BSC, der eine sichere Luftfiltration gewährleistet und eine Probenkontamination verhindert, die auf Benutzerfreundlichkeit und Probensicherheit ausgelegt sind.

Nährmedien sollten nur im BSC geöffnet werden und das Laborpersonal sollte Unordnung im BSC-Arbeitsbereich vermeiden.

Verwenden Sie sanfte Armbewegungen, um Störungen in der sauberen Downflow-Luft während der Arbeit zu reduzieren.

Die Integrität von Filter und Luftstrom sollte jährlich von einem zertifizierten Spezialisten getestet werden. Inner surfaces should be cleaned and disinfected after each working session and all surfaces, including the tray under the working surface, should be cleaned and disinfected monthly with 70% ethanol or another appropriate disinfectant.

Furthermore, procedures need to be optimised to minimise the number of times the user removes their hands and arms from the BSC work area while manipulating samples.

The work should be planned so that the BSC can be loaded with the samples and supplies needed for the procedures and then to remove waste and clean-up after the procedure.

During the procedure the BSC operator only needs to work with items already inside the BSC work area. Regular cleaning procedures must be followed and spills must be cleaned immediately.

Today’s new procedures and innovative protocols require a CO2 incubator with advanced features that help prevent contaminants from becoming established within the incubator or invading cultures once inside.

Understanding the fundamental features of CO2 incubators and assay requirements for successful experimentation is important to making an informed decision when purchasing an incubator.

Because microorganisms are our constant companions and they can enter any incubator each time the door is opened, investing in leading-edge technology incubator design is imperative to combating cell culture contamination.

Look for an incubator that works with you to control and combat contamination.

The Thermo Scientific Forma incubator, for example, can offer HEPA filtration that scrubs the entire chamber air volume every 60 seconds to establish ISO 5 cleanroom conditions within five minutes after every door opening.

This feature is available in either a water-jacketed or a direct heat format. Direct heat incubators can offer additional protection with an automated high temperature cycle that saves time by eliminating the need to autoclave internal parts.

The Thermo Scientific Heracell CO2 incubator provides a 100% pure copper internal chamber and parts, as well as high temperature decontamination.

Also available today are advanced, precise microprocessor features for CO2 sensors, humidity control and onboard data monitoring that allow researchers to perform their best work in a trouble-free environment.

Key features for an incubator include:

  • Easy-to-clean surfaces
  • Copper interior chambers
  • Good air filtration - HEPA filters
  • Automated high-temperature disinfection cycle
  • Solid-glass, divided, gas-tight inner door
  • External water source
  • Data logging and touch screen controls
  • Advanced CO2 and O2 sensors

Contamination most frequently occurs through avoidable procedural errors.

Without good aseptic practices and consistently applied cell culture management procedures, chronic contamination problems have a higher probability of occurrence.

A properly managed laboratory will provide researchers with an environment that reduces the chances of accidents and errors and leads to more consistent and reliable performance.

The third and final part of the series will provide useful advice on how to choose a membrane and filtration product.


Incubator-Clean™

Avantor ® , a Fortune 500 company, is a leading global provider of mission-critical products and services to customers in the biopharma, healthcare, education & government, and advanced technologies & applied materials industries. Unser Portfolio kommt in nahezu allen Phasen der wichtigsten Forschungs-, Entwicklungs- und Produktionsaktivitäten der von uns bedienten Industrien zum Einsatz. Eine unserer größten Stärken liegt darin, dass wir über eine globale Infrastruktur verfügen, die strategisch so positioniert ist, dass sie die Bedürfnisse unserer Kunden unterstützt. Unsere globale Präsenz ermöglicht es uns, mehr als 225.000 Kundenstandorte zu bedienen und bietet uns umfassenden Zugang zu Forschungslabors und Wissenschaftlern in mehr als 180 Ländern. Wir setzen die Wissenschaft in Bewegung, um eine bessere Welt zu schaffen. For information visit, www.avantorsciences.com and find us on LinkedIn, Twitter and Facebook.

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Protokoll

1. Prepare a Sterile Workspace

Before starting any sterilization procedures in your work area, wash your hands thoroughly with antiseptic soap and warm water.

Be sure to re-wash your hands any time you suspect you have contamination from your experimental manipulations.

Clear away all materials cluttering your work area on the laboratory bench. Remove a pre-moistened disinfectant wipe from the canister and wipe down the entire area. Allow the disinfectant to evaporate - do not wipe dry!

Use disinfectants such as alcohol (isopropanol or 70% ethanol) or phenolic compounds (o-phenylphenol) .

Verhindern aerosolization, or the production of a fine mist containing bacterial cells, and spread of microbial contaminants, avoid dispensing disinfectant from a squeeze bottle.

Desiccation of microorganisms is one of the most effective ways to decontaminate surfaces.

Even if someone has recently used the laboratory bench and the bench top was wiped down with disinfectant, ALWAYS begin your laboratory time by wiping down the bench.

After the disinfectant has dried completely, use an igniter to light the Bunsen burner. Adjust the flame so that a blue cone can be seen in the middle of the flame. The flame is now producing an updraft, or air convection currents in which warm air rises up and away from the flame (Abbildung 1). As heat rises, microorganisms and dust particles are forced upward and away from the immediate work area. Work slowly, carefully, and deliberately at all times within this area created by the Bunsen burner, referred to as a sterile field. Keep the Bunsen burner on during the entire procedure.

The tip of the blue cone is the hottest part of the flame.

Be careful not to disturb the updraft by rapid movements that dramatically change the air currents around the laboratory bench. Creating an updraft with the Bunsen burner minimizes the possibility of microorganisms and dust falling onto the bench or into open bottles, tubes or flasks in the work area.

Arrange all the supplies needed for the procedure on the laboratory bench near the sterile field. Make sure all the materials are properly labeled.

Supplies may include serological pipettes and micropipettors, sterile culture tubes, sterile flasks, media bottles containing broth, sterile microcentrifuge tubes, micropipettor tips, racks for tubes, bacterial cell cultures, and phage stocks.

Liquid media should be sterilized in an autoclave at 121 ଌ for at least 15 minutes on the liquid setting. Larger volumes of media (> 1L) require longer autoclave times. Labware should be sterilized in an autoclave at 121 ଌ for at least 30 minutes on gravity (dry) setting.

In general, sterile solutions may be stored at 4 ଌ for up to 5 months. Note that storage time is significantly reduced for solutions containing unstable components such as antibiotics - always check the manufacturer's recommendations.

2. Transferring Liquids Using Serological Pipettes

Serological pipettes come in many sizes and options: plastic or glass, disposable or reusable, plugged or unplugged. These are calibrated to deliver volumes ranging from a 0.1 ml to 25 ml.

Common sizes for serological pipettes are 5 ml, 10 ml and 25 ml and should be used for aseptic liquid transfers of 0.1 ml or more (panel A of Figur 2). There also are larger serological pipettes that can deliver volumes up to 100 ml however, the focus of this protocol is on the more common, smaller sized pipettes.

Pre-sterilized pipettes with a cotton wool plug are needed for microbiology and tissue culture experiments. The plug should not be removed from the top of the pipette it is designed to function as a barrier to overfilling the pipette.

Different applications call for plastic versus glass serological pipettes. Glass is needed for organic solvents. Either can be used when performing BSL-1 experiments on the laboratory bench top. Only plastic may be used when working in a Biosafety cabinet with BSL-2 organisms where a Bunsen burner cannot be used. It also is recommended that plastic be used for applications involving transfer of molten agar.

Serological pipettes are of two types: TC ("to contain") or TD ("to deliver"). TC pipettes deliver all the volume, including the tip, and must be "blown out" or rinsed to get the specified volume. TD pipettes are calibrated to leave a tiny bit in the tip that should nicht be delivered. Be sure to check the label on the body of the pipette near the top to ascertain which type it is (Figur 3). The most commonly used are TD pipettes, which are marked with double rings at the top.

Take a sterile plastic serological pipette (also called a volumetric transfer pipette) and carefully remove the paper sleeve at the end with the cotton wool plug by peeling it away like the skin of a banana - do not remove the entire sleeve, protecting the tip of the pipette that will come in contact with the liquid to be transferred. Touch only the top of the pipette (above the graduation marks) with your hands.

Never go into a sterile solution with a used pipette, even if great care has been taken to keep it sterile.

Glass serological pipettes are typically stored in metal canisters (panel B of Figur 2). Loosen the top of the canister then carefully remove the cap, and flame the open ends of the cap and canister. Place the cap down, on its side, on the disinfected bench. Remove one pipette from the canister by holding it horizontally and gently shaking it so the tops of one or two pipettes stick out about an inch and can be easily grasped. Lay down the canister on its side and remove one pipette, but be cautious not to touch the other pipettes in the container. Do not touch the bottom tip of the pipette with your hands, and avoid contact of the tip with other non-sterile surfaces.

Affix a pipette aid such as a bulb, pump, or gun to the top end of the serological pipette. Remove the paper sleeve from the plastic pipette. Hold the pipette aid in your right hand.

If using a glass pipette, pass the bottom third of the pipette through the blue cone in the Bunsen burner flame for 1-3 seconds. Rotate the pipette 180° as it passes through the flame. Plastic pipettes and tubes cannot be flamed.

If left-handed, hold the pipette aid in your left hand and conduct subsequent manipulations of culture bottles and tubes with your right hand.

Contamination tends to occur with plastic pipettes when withdrawing the final inches of the pipette from the sleeve because the sterile tip comes into contact with the part of the sleeve touched by your hands.

Remove the cap of the bottle containing sterile media. Do not place the cap on the laboratory bench but hold it between your ring finger and palm of the right hand while manipulating the pipette aid with the thumb, index and middle fingers of the same hand (Figur 4). Holding the bottle at a 45° angle, pass the rim of the bottle through the flame of the Bunsen burner, creating a sterile field around the open bottle.

Although best avoided, if you must put the cap down, place it face down on a disinfected surface. With a cap that faces up, there is a greater chance of contamination from movements of objects or hands, creating air currents that cause microorganisms and dust particles to descend to the inside surface of the cap.

The purpose of flaming is not to sterilize but to warm the opening of the bottle and create air convection currents up and away from the opening (i.e., updraft). The warm, rising air helps prevent dust particles and other contaminants from entering the bottle.

Keep the sterile container open for as little time as possible. It is important to keeping the points of entry of airborne microorganisms to a minimum throughout the procedure.

Avoid coughing, sneezing, talking, and other inadvertent movement while sterile containers are open.

Never pass hands and fingers over the top of a sterile field (i.e., open bottles or flasks, the inside of tubes and bottle caps) once they have been passed through the Bunsen burner flame.

Always work with an open flame when opening sterile tubes or bottles. Never have more than one tube, bottle, or flask open on the bench at a time. Flaming should be done immediately upon opening and just before closing tubes, bottles and flasks.

Place the tip of the serological pipette into the bottle containing the sterile media then aspirate, or draw the sample aseptically, from the bottle. Use the pipette aid to control the flow of the sample into the pipette. Precisely read the volume drawn into the pipette by aligning the meniscus formed on top of the liquid column to the graduation marks on the calibrated pipette (Abbildung 5).

DO NOT MOUTH PIPET! Always use a pipet aid (pump, bulb, or gun).

Pay attention to the sequence of numbers when determining the volume aspirated. The numbers may be printed tip to top, or vice versa, or often times in both directions.

When reading the volume, always hold the pipette vertically, perpendicular to the ground, and view the liquid meniscus dead-on at eye level.

Serological pipettes are only as accurate as the smallest marked increment, which is typically 0.1 ml for 5 ml and 10 ml pipettes and 0.2 ml for 25 ml pipettes. If greater precision is needed, a serological pipette may be used in combination with a micropipettor.

Pass the rim of the bottle through the Bunsen burner flame once again, then place the cap back on the bottle. Set the media bottle aside.

Don't burn yourself with the Bunsen burner in a rush to close the bottle.

Hold a test tube or flask in your left hand. Remove and hold the cap as described in step #4 above. Create a sterile field by flaming the rim of the tube or flask in the Bunsen burner.

Dispense the media in the pipette into the tube or flask. Control the flow of the sample so it does not splash out of the tube or flask.

Volumes may be measured such that the entire volume is delivered and the pipette drains completely, or a specific volume is achieved by doing a point-to-point delivery (one volume marking to another).

Pass the rim of the tube or flask through the Bunsen burner flame once again, then replace the cap. Set the tube or flask aside. Remove the pipette aid, and discard the pipette into the proper waste receptacle.

Plastic serological pipettes are disposable, while glass serological pipettes can be sterilized and used again. Proper disposal requires plastic pipettes be placed in a designated sharps container (rigid box lined with plastic disposal bag) while glass pipettes initially should be immersed in a container with 10% bleach solution to disinfect the inside and outside surfaces. Then the glass pipettes should be thoroughly washed with laboratory detergent, rinsed with distilled water, and sterilized in an autoclave.

These same steps should be followed when inoculating media with a bacterial culture or phage stock or when performing serial dilutions.

3. Transferring Liquids Using Micropipettors

Precisely measuring and dispensing minute volumes can be accomplished using micropipettors (also referred to as Pipetman Panel A of Abbildung 6). These instruments come in different sizes each with a specific volume range: P2 for 0.2-2 μl , P10 for 1-10 μl, P20 for 2-20 μl, P200 for 20-200 μl, and P1000 for 200-1000 μl.

Treat micropipettors with care, as they are precision instruments. Do not leave them lying on the laboratory bench unattended where they can be knocked off and damaged. Do not allow pipettes to come into contact with corrosive chemicals.

For volumes greater than 1000 μl, use a serological pipette.

Although working within the sterile field created by the Bunsen burner, do not flame micropipettors, tubes and plastic tips. The tubes and tips should be pre-sterilized. The micropipettors may be wiped down with a pre-moistened disinfectant wipe prior to use.

A numeric volumeter showing the dispensed volume can be set by turning adjustment knob. Adjust the volume Vor proceeding to step #3.

NEVER TURN THE ADJUSTMENT KNOB ABOVE THE INTENDED RANGE!

To obtain maximum accuracy when decreasing the volume setting on the micropipettor, slowly dial down the thumb wheel, making sure not to overshoot the graduation mark.

To obtain maximum accuracy when increasing the volume setting on the micropipettor, dial the thumb wheel up, passing the desired graduation mark by 1/3 of a turn. Then slowly dial down the thumb wheel to reach the intended volume, making sure not to overshoot the graduation mark.

The volumeter shows three numbers. Depending on the micropipettor, the numbers are interpreted differently. Note that each micropipettor is only as accurate as the smallest graduation mark.P2: For volumes between 0.2-2.0 μl. The top number denotes volume in microliters. The second number indicates tenths of a microliter (0.1 μl), and the third number represents hundredths of a microliter (0.01 μl). Each graduation mark equals an increment of two one-thousandths (0.002 μl) of a microliter.P10: For volumes between 1.0-10.0 μl. The top number is for tens of microliters this usually is set at "0" and should only be set at "1" with the other two numbers set at "0" when dispensing 10.0 μl. The middle number denotes volume in microliters. The third number indicates tenths of a microliter (0.1 μl). Each graduation mark equals an increment of two one-hundredths (0.02 μl) of a microliter.P20: For volumes between 2.0-20.0 μl. The top number in black is for tens of microliters this should only be set at "2" with the other two numbers set at "0" when dispensing 20.0 μl. The second number in black denotes the volume in microliters. The third number in red indicates tenths of a microliter (0.1 μl). Each graduation mark equals an increment of two one-hundredths (0.02 μl) of a microliter.P200: For volumes between 20.0-200 μl. The top number is for hundreds of microliters this should only be set at "2" with the other two numbers set at "0" when dispensing 200 μl. The middle number indicates the dispensed volume in tens of microliters, and the third number denotes volume in microliters. Each graduation mark equals an increment of two one-tenths (0.2 μl) of a microliter.P1000: For volumes between 200-1000 μl. The top number is for thousands of microliters this usually is set at "0" and should only be set at "1" with the other two numbers set at "0" when dispensing 1000 μl. The middle number is for hundreds of microliters. The bottom number is for tens of microliters. Each graduation mark equals an increment of two (2 μl) microliters.

Performance check: These instruments should be calibrated annually, ensuring accuracy and precision are maintained to stay within ± 5% of specifications. Use an analytical scale to measure water, making sure the minimum and maximum settings correspond to the intended volume. For example, use a P1000 to transfers 200 μl of water to a weigh dish on the scale. Since water has a density of 1, then 1 ml of water is equivalent to 1 gram (g). Thus, 200 μl (0.2 ml) of water should be equal to 0.2 g. Also, make sure the tip does not leak and can maintain the desired volume until dispensed using plunger system.

Micropipettors must be used with plastic disposable tips at all times. Fit a tip tightly onto the end of the barrel of the micropipettor. Press down and twist slightly to ensure an airtight seal.

Tips are usually packed into plastic boxes that can be sterilized by autoclaving. Open the tip box to retrieve a tip, then close the tip box to minimize contact with contaminants in the air.

Some tips have filters similar to the cotton wool plugs on serological pipettes. These tips are often more expensive than regular tips and thus are used for specialized applications. For instance, when measuring volatile chemicals such as chloroform or radioactive liquids such as 32 P-labeled DNA, using filter tips helps prevent the barrel of the micropipettor from getting contaminated.

Hold the micropipettor in a vertical position.

Keeping the micropipettor upright will prevent liquids from running inside and contaminating the barrel of the micropipettor.

The micropipettor has three positions: (1) Rest position, (2) First stop, and (3) Second stop (Abbildung 6, panel B). The instrument has a two-stop plunger system. The first stop has two functions. The first is to draw in the desired volume of liquid into the tip when releasing the plunger from the first stop to the rest position. The second function is to dispense the majority of liquid from the tip when depressing the plunger from the rest position to the first stop. Further depressing the plunger to the second stop dispenses whatever liquid remains in the tip. Depress the pushbutton on the plunger from the rest position to the first stop. Air equal to the volume of the setting will be displaced.

Immerse the tip into the liquid while holding down the pushbutton to the first stop.

Do not touch the micropipettor itself to the sides of bottles, tubes and flasks otherwise the inside surfaces of these vessels will become contaminated. Only the tips are sterile.

Release the pushbutton slowly to aspirate the liquid into the tip. Stop once the pushbutton is back to the rest position. Wait a moment so liquid can be drawn into the tip.

The volume of liquid in the tip will equal the volume of the setting of the micropipettor.

Viscous liquids such as those containing glycerol require more time to enter the tip.

Remove the tip from the liquid, and visually inspect the tip to confirm that the liquid drawn up has reached the expected level in the tip and there are no air bubbles in the tip.

If necessary, expel the liquid and manually tighten the tips onto the micropipettor. Draw up the liquid and check again.

Place the tip at an angle (10 ° to 45 °) against the wall of the tube receiving the liquid. To expel the liquid, slowly depress the pushbutton on the plunger to the first stop. Wait a moment then press the pushbutton to the second stop to expel any residual liquid in the tip.

Depressing the plunger too quickly may cause the liquid being expelled to splatter or will produce undesirable bubbles in the tube.

Before releasing the plunger to the rest position, remove the tip from the liquid.

Discard tips into designated sharps waste container by pressing the ejection button on the micropipettor.

4. Cleaning Up The Work Space

When finished with an experiment requiring use of aseptic technique, turn off the Bunsen burner, then put away all supplies and reagents. Wipe down the outside surfaces of labware (bottles, micropipettors, pipette tip boxes) with a pre-moistened disinfectant wipe to ensure contaminants are not transferred to the storage location.

Place contaminated glassware and hazardous waste materials into the proper disposal receptacle. Laboratory waste includes labware such as gloves, pipettes, tips, and tubes. Non-infectious hazardous waste is generated when performing experiments with non-pathogenic organisms (BSL-1) while infectious hazardous waste is generated when using pathogenic organisms (BSL-2 or above). Infectious waste must be autoclaved or disinfected before it is discarded. Follow laboratory safety guidelines described in BMBL (5 th Ed.) as well as those provided by OSHA and institutional Environmental Health and Safety departments.

Wipe down the entire work area on the laboratory bench with a pre-moistened disinfectant wipe from the canister, once again allowing the disinfectant to evaporate.

Wash hands thoroughly with antiseptic soap and warm water before leaving the laboratory.

5. Representative Results

A sample application for using serological pipettes to transfer liquids is shown in Abbildung 7. These pipettes often are used in the microbiology laboratory to prepare media for inoculation with bacterial cultures. For example, sterile flasks first are filled with a specified volume of culture broth, in this case Luria Broth (LB), then a small number of cells (such as E coli) are added to the media. Using a serological pipette, first the broth must be aseptically transferred from the media bottle to the flask. In this case, 25 ml of LB was added to a 125 ml sterile flask using a 25 ml serological pipette. Next, the broth must be inoculated with E coli Zellen. Here, 10 μl of cells were transferred aseptically using a P20 micropipettor from a previously growing culture flask to the 25 ml of fresh LB. The flask is incubated in a growth chamber for a particular amount of time, allowing the cells to replicate (for this example, the E coli cells were incubated overnight at 37 ଌ on a shaking platform). The result is a turbid bacterial cell culture that can be used for subsequent experiments.

Serological pipettes also may be used to transfer media originally supplied in a bottle to test tubes, or between test tubes, as is done when making dilutions of a bacterial culture. If aseptic technique is not maintained throughout these types of media manipulations, then cultures will become contaminated, and subsequent experiments using those cultures will be delayed because fresh, uncontaminated cultures will need to be prepared. Errors occur because a sterile field is not maintained throughout the procedure. For instance, you may forget to disinfect the laboratory bench or flame the rim of a culture bottle or tube. You may touch the tip of the pipette or set the cap of a bottle or test tube on the bench instead of holding it in your hand. Proper procedure is critical for keeping contamination of media and cultures to a minimum. Figure 8A provides an example of a pure versus contaminated culture of E coli in a tube containing 5 ml of LB. The left panel shows a culture displaying uniform fine turbidity typical of a pure E coli Kultur. In contrast, the right panel shows a contaminated culture in which the growth characteristics deviate from those expected for this bacterial strain.

Technical errors may occur when manipulating serological pipettes resulting in transfer of incorrect volumes of media between test tubes. For instance, you may read the volume on the pipette incorrectly (i.e., top versus bottom of the meniscus) or you may expel the media completely from a TD pipette, which was designed to leave a tiny bit in the tip not to be delivered. When performing a point-to-point delivery of media, you may use the wrong calibration marks and dispense the incorrect volume. Figure 8B shows an example of test tubes with correct versus incorrect volumes of media. The tube on the left contains 3.5 ml of LB measured with a 5 ml serological pipette. The student conducted a point-to-point delivery of the media in which LB was drawn up to the 5.0 ml graduation mark and dispensed to the 1.5 ml mark. The tube on the right contains 2.5 ml of LB measured with a pipette of the same size because the student who performed the point-to-point delivery of media incorrectly dispensed it from the 5.0 ml mark to the 2.5 ml mark. This mistake will result in a bacterial culture that will be at a higher concentration than planned, causing subsequent dilutions to be incorrect. This propagation of errors can result in a failed experiment that would need to be repeated with the correct cell concentrations.

A sample application for using micropipettors to transfer liquids is shown in Abbildung 9. These pipettors are used for a variety of experiments in molecular biology and microbiology including preparing samples for PCR and gel electrophoresis or inoculating sterile media or buffer with small volumes (less than 1.0 ml) of bacterial cells or phage particles. In the example provided, the student transferred 12.5 μl of TE buffer into a 1.8 ml microcentrifuge tube (left tube in panel A note that dye has been added to the buffer to facilitate visualization of the liquid inside the clear microcentrifuge tubes). This procedure required the student first to select the correct micropipettor, in this case a P20, and next to set the volumeter to the correct volume (panel B). A tip was used that contains a cotton wool plug at the end to prevent possible contamination that could be expelled from the barrel of the micropipettor from reaching the buffer sample in the tip. This precaution is not necessary if care is taken when aspirating liquids into the tips, depressing the plunger slowly so the liquid does not splash into the pipettor barrel. Technical errors may occur that result in transfer of incorrect volumes. For example, you may select the wrong micropipettor for the job or set the volumeter on the correct micropipettor to an incorrect volume. Before immersing the tip into the buffer, you may push the plunger past the first stop, causing an excess of buffer to be drawn into the tip when releasing the plunger. Alternatively, you may not immerse the tip far enough into the buffer, so air is drawn into the tip instead of buffer. You may forget to push the plunger to the second stop when dispensing buffer into the microcentrifuge tube causing less than the desired volume to be released from the tip. The right tube in panel A of Abbildung 9 shows a microcentrifuge tube containing the incorrect volume of buffer relative to the tube on the left. Instead of dispensing 12.5 μl of buffer, the student dispensed 125 μl. In this case, although the numbers are set identically on the volumeter, the wrong micropipettor was selected for the job (the student used a P200 instead of a P20 panel B) resulting in the delivery of a substantially larger volume of buffer. If this solution was being used to prepare a mixture of reagents for an application such as PCR, then this mistake will change the final concentration of all reagents subsequently added to the same tube. Consequently, it is unlikely that the experiment will be successful, since molecular biology procedures such as PCR require all components to be at specific concentrations for the reaction to work properly.

Because it is not always feasible to ensure micropipettors (especially the inside of the barrel) are sterile, stock solutions can become contaminated causing even troubleshooting efforts to fail when performing experiments. If using micropipettors to transfer sterile solutions, it is strongly recommended that aliquots of stock solutions (media, buffer, water) be made using aseptic technique with serological pipettes. It is common to maintain working stock solutions in 15 ml or 50 ml sterile conical tubes. These are often easier to manipulate while operating a micropipettor and can be replaced with a fresh aliquot of the stock solution if contaminated during volume transfers.

Abbildung 1. Sterile field created by updraft of Bunsen burner flame. To minimize contamination of sterile solutions and cultures, it is critical that all manipulations be conducted within the sterile field. The rims of glass culture tubes and flasks should be passed through the tip of the blue cone, the hottest part of the flame. Plastic tubes and tips cannot be flamed - these should be pre-sterilized by alternative methods prior to use.

Figur 2. Serological pipettes used for aseptic transfer of liquids. (A) Shown from left to right are drawings of 25 ml, 10 ml, and 5 ml pipettes. (B) Serological pipettes may be plastic or glass. Plastic pipettes are disposable (one-time use) and typically are individually wrapped in paper and plastic sleeves in which all inside surfaces are sterile (left side). Glass pipettes can be used multiple times provided they are cleaned and sterilized between uses these typically are stored in metal canisters (right side).

Figur 3. Serological pipettes are of two types: TC ("to contain") or TD ("to deliver"). Shown is the explanatory label of a TD 5 ml pipette.

Figur 4. Aseptic technique. When aspirating liquids from a bottle, flask, or tube with caps, never place the cap on the bench. Instead, hold the cap in the same hand as pipette aid while manipulating the vessel containing the liquid with the opposite hand as shown.

Abbildung 5. Meniscus formed when drawing liquid into serological pipette. The volume corresponds to the graduation mark on the pipette where the bottom of the meniscus aligns. In this example, the meniscus aligns with the 2.5 ml graduation mark.

Abbildung 6. Single channel micropipettor. (A) Shown is a sample micropipettor with a plastic tip attached to the bottom of the barrel tip holder. Indicated are the locations of the volumeter, the thumb wheel for changing the volumeter setting, the barrel tip holder, the tip ejector button, and the pushbutton for the plunger. (B) Two-stop plunger system on a micropipettor.

Abbildung 7. Using serological pipettes to transfer media into sterile 125 ml flasks. The left flask has 25 ml of media only (LB), while the right flask is a culture of E coli resulting from inoculating LB with cells then incubating overnight at 37 ଌ. Note how the media in the flask on the right is turbid due to cell growth.

Abbildung 8. Using serological pipettes to transfer media into sterile test tubes. (A) The left tube contains 5 ml of a pure E coli culture, while the right tube contains 5 ml of a contaminated bacterial cell culture. Note the differences in growth characteristics between the two cultures. Although both are turbid, the culture on the right has been contaminated with a fungus or other airborne microorganisms giving the culture a different color and consistency from that expected for E coli Zellen. (B) The left culture tube contains 3.5 ml LB while the right tube contains only 2.5 ml LB. This volume difference resulted from a mistake made while conducting a point-to-point delivery of media to the tubes.

Abbildung 9. Using micropipettors to transfer buffer into sterile microcentrifuge tubes. (A) The left microcentrifuge tube contains only 12.5 μl of TE buffer, while the right tube contains 125 μl. Note that a dye has been added to the buffer to facilitate visualization of the liquid inside the clear microcentrifuge tubes. (B) The left volumeter is from a P20 micropipettor, while the right volumeter is from a P200 micropipettor. A common mistake is selecting the wrong micropipettor. Although the numbers are set identically on the P20 and P200 volumeter, selection of the wrong micropipettor results in transfer of incorrect volumes.

Abbildung 10. Laminar flow hood used to prevent contamination of solutions and cultures. Shown is a biosafety cabinet approved for work with BSL-2 organisms.


Einführung

These days, the application of cells in research laboratories (1, 2), regenerative medicine (3, 4) and biotechnological productions is growing extensively. Cells are used in wide-ranging activities from studies on cell proliferation to the production of biologically active substances. Due to restrictions on the use of laboratory animals by animal protection laws, the use of cell cultures will continue to increase in the future. In order to achieve reproducible results from cells, good cell culture conditions are vital. Despite the importance of bacterial and fungal contaminations in cell culture, they are not such a serious problem because they are usually obvious and easily detected. The most serious problem is mycoplasma infection since these microorganisms are subtle (5, 6).

Mycoplasma has generated considerable interest due to its ability to contaminate cell lines used in research as well as in manufacturing bioproducts (7-13). The lack of a cell wall in mycoplasmas besides their adherence to the cell surface makes them invisible to the naked eye. In the past, the use of animal sera in cell cultures was the main source of Mycoplasma arginini, Mycoplasma hyorhinis or Acholaeplasma laidlawii. Pipetting through mouth is the source of Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma salivarium and Mycoplasma pirum (14, 15). Culture supernatants and cell membranes are suitable for the growth of mycoplasma. Mycoplasmas are resistant to commonly used antibiotics and they cannot be detected visually by turbidity of fluid or under the inverted microscope. The frequency and impact of mycoplasma contamination in cell culture have been extensively discussed (12, 15-17). The incidence of single mycoplasma contamination is still high, being 15 to 35% worldwide with extreme incidences of 65 to 80%, whereas incidences of multiple mycoplasma infections with two or more mycoplasma species are between 7 and 60% (9, 10, 18, 19). Mycoplasma contamination can be persistent and difficult to detect for the affected lab (10). Between 5 and 35% of cell cultures are infected with the species Acholeplasma laidlawii, M. arginini, M. fermentans, M. hyorhinis und M. orale (12). It is estimated that about 5 to 30% of the world's cell lines are contaminated with mycoplasmas [5-16%, (14) 5-87%, (15) 25.7% (20) 29% (21) and 23% (22)]. Mycoplasmal contamination influences almost every parameter within the cell culture system (8, 23).

The use of contaminated cells endangers almost all aspects of cell physiology, and often leads to erroneous results or causes the loss of unique cell lines (24, 25). Even though the mycoplasma contamination does not slow down cell metabolism, it may contaminate the final product (such as a vaccine) resulting in the loss of the batch (26). Mycoplasmal infection of cell cultures might often linger for an extended period of time without noticeable cell damage (7, 23, 27). Therefore, it is important to use efficient detection methods to inspect mycoplasma contamination (12, 5, 28, 29). Usually, investigation of mycoplasma is carried out by direct and indirect detection methods (30). The direct method detects the colony growth of mycoplasma on agar however, the indirect detection technique consists of measuring a gene product that is linked to mycoplasmas rather than to the mammalian cells in culture. Moreover, DNA staining of mycoplasma after inoculation of suspected cell onto indicator cells is another type of indirect detection method of mycoplasma (31, 13).

The first source of contamination is usually contaminated media or their components (7, 32). Most cell culture media are not autoclavable therefore, filtration of the media through proper filters to remove mycoplasma is very important to protect cell culture lines. The prevention of mycoplasma contamination can be divided into three categories: cell culture facility, cell culture procedures, and operator technique (33). To prevent mycoplasma effectively, it is recommended that a good aseptic technique be used, accidents in the laboratory be reduced, the laboratory be kept clean, and the positive cultures be discarded (34- 37). In the case of valuable and unique cultures, it is possible to eliminate the contaminants effectively. Therefore, treatment of mycoplasma-positive cell cultures has become a feasible option (18, 27).

What are mycoplasmas?

The name of mycoplasma was chosen because of its mycelated fungi-like structure with a flowering plasma-like structure (38, 39). Mycoplasma is a kind of bacteria. One of the differences between mycoplasma and the other bacteria is the absence of cell wall and their flexible membrane in mycoplasma which results in taking different shapes and consequently difficulties in identifying even under a high powered electron microscope. The small size of mycoplasma (0.15-0.3µm) is the main reason for their escape through filtering systems and also their growth in high concentration in mammalian cell cultures without any turbidity or other obvious symptoms (40). However, there is some exception in the size of mollicutes. Recently it has been shown that different nutritional conditions can affect the size of Acholeplasma laidlawii. Folmsbee et al. showed Acholeplasma laidlawii cultures in tryptic soy broth (TSB) cannot penetrate 0.2µm rated filters to the same degree in other media such as mycoplasma broth or TSB supplemented with 10% horse serum (41).

Ways in which cells are contaminated by mycoplasma

Mycoplasmas can bind to their host cells using special tip organelles. These tip organelles have a high concentration of adhesins, to attach to eukaryotic cells and penetrate the host cell. The lack of a stiff wall in mycoplasma may help it to fuse with the membrane of the host cell and exchange its membrane and cytoplasmic components (38, 42, 43).

Frequency and sources of mycoplasma species

There are a number of different sources for mycoplasma contamination in cell cultures associated with human, bovine and swine species. Personnel in the laboratories are the main sources of M. orale, M. fermentans, and M. hominis. These species of mycoplasmas account for more than half of all mycoplasma infections in cell cultures and physiologically are found in the human oropharyngeal tract (44). M. arginini and A. laidlawii are two other mycoplasmas contaminating cell cultures and originate in fetal bovine serum (FBS) or newborn bovine serum (NBS). Trypsin solutions provided by swines are a major source of M. hyorhinis (45). Figure 1 is a diagram showing the normal host and frequency of different species of mycoplasma occurring in cell culture.