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2.6: DNA-Fußabdruck der lac-Operon-CAP-Site – Biologie

2.6: DNA-Fußabdruck der lac-Operon-CAP-Site – Biologie



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Die E coli lac Operon

Abbildung 2.6.1: lac Operon

  • lac Z Codes für b-Galactosidase, ein Enzym, das b-Galactoside (z. B. Laktose) spaltet.
  • lac Ja Codes für durchdringen, das am Transport von b-Galactosiden in die Zelle beteiligt ist.
  • lac EIN Codes für b-Galactosid-Transacetylase, das b-Galactoside acetyliert.
  • Eine Mutation in beiden lac Z oder lac Y kann zu a führen lac- Genotyp, d.h. Zellen, die b-Galactoside nicht als Nährstoff verwerten können.
  • EIN lac Die A-Mutante, der die Transacetylase-Aktivität fehlt, kann immer noch b-Galaktoside verwerten (sie ist immer noch lac+-Genotyp). Seine Rolle im Metabolismus von Bgalactosiden ist nicht klar.

Promoter

eine DNA-Region, die an der Bindung von RNA-Polymerase beteiligt ist, um die Transkription zu initiieren.

Terminator

eine DNA-Sequenz, die bewirkt, dass die RNA-Polymerase die Transkription beendet.

  • Der Cluster aus drei Genen, lac ZYA, wird in eine einzelne mRNA (polycistronisch Nachricht) von a Promoter nur stromaufwärts von der lac Z-Gen.
  • In dem Abwesenheit eines Induktor der Gencluster ist nicht transkribiert.
  • Wenn ein Induktor hinzugefügt wird (z. Lactose oder das nicht hydrolysierbare Analogon Isopropylthiogalactosid - IPTG) die Transkription beginnt an einem einzelnen Promotor (lac P) und schreitet durch die lac-ZYA-Gene zu einer Terminatorsequenz, die sich stromabwärts des . befindet lac A Gen.

Notiz

Die lac-ZYA-mRNA hat eine Halbwertszeit von ~3 Minuten, wodurch die Induktion relativ schnell rückgängig gemacht werden kann (d. h. Zellen stellen die Enzymproduktion nach Beendigung der Induktion schnell ein).

Übung 2.6.1

Mit welchem ​​Molekül interagiert der Induktor (Laktose), um die Transkriptionsregulation (d. h. die Induktion des lac-Operons) zu beeinflussen?

Antworten

Es handelt sich nicht um b-Galactosidase, Permase oder Transacetylase, sondern um ein separates Protein, das als Repressorprotein bezeichnet wird.

  • Die lac-Gene werden durch einen Mechanismus namens . gesteuert negative Regulierung.
    • Dies bedeutet, dass sie werden transkribiert, es sei denn, sie werden durch das Regulatorprotein ausgeschaltet.
    • Eine Mutation, die inaktiviert das Regulatorprotein verursacht die lacZYA-Gene zu sein ständig geäußert.
Da die Funktion des Regulatorproteins darin besteht, die Expression zu verhindern, wird es als a . bezeichnet Repressorprotein.

Es gibt zwei Arten von Genen im lac-Operon:

  1. Strukturgene - sie kodieren für Enzyme, die für einen biochemischen Stoffwechselweg benötigt werden (z. B. lac Z, Y und A).
  2. Regulatorgene - sie kodieren für Proteine, die an der Regulation von Strukturgenen beteiligt sind.
Mutationen in strukturell Gene beeinflussen typischerweise nur die Funktion dieses Strukturgens.
Mutationen in Regler Gene können die Expression aller Strukturgene in einem Operon beeinflussen.

lac I ist das Regulatorgen des lac-Operons.

  • Dieses Gen befindet sich direkt stromaufwärts der Promotorregion für die lac-Strukturgene.
  • Die lac Ich-Gen hat seine eigenen Promoter (konstitutiv) und Terminator.
  • Es macht eine monocistronische Nachricht und kodiert für ein Protein - das lac Repressorprotein.
Das entscheidende Merkmal des lac-„Kontrollkreislaufs“ liegt in der dualen Eigenschaft des lac-I-Repressorproteins:
  1. Es kann die Transkription verhindern
  2. Es kann den niedermolekularen Induktor (Laktose oder IPTG) erkennen und binden.

Verhinderung der Transkription durch den lac-Repressor

  • lac-Repressor (aktiv als a tetramer Protein) bindet an eine DNA-Sequenz namens Operator (lac O-Region).
    • Die Betreiberregion liegt zwischen den lac Promotorregion (Ort der RNA-Polymerase-Bindung und Transkriptionsinitiation) und die lac Z-Gen.
    • Die ersten 26 Basenpaare der lac Das Z-Gen umfasst die Operatorregion.
Wenn der Repressor an die Operatorregion bindet, verhindert seine Anwesenheit, dass die RNA-Polymerase die Transkription am Promotor einleitet.
  • Es ist nicht so, dass das Repressorprotein die Bewegung der RNA-Polymerase durch die lac Z-Gen.
  • Repressorbindung und RNA-Polymerase-Bindung (an den Promotor) sind sich gegenseitig ausschließen Bei der lac Veranstalter/Betreiber (lac PO)-Region.

Wie ändert sich die Repressor/Operator-Interaktion in Gegenwart des Induktormoleküls?

  • Die Induktor kann an den Repressor binden, um a . zu bilden Repressor/Inducer-Komplex, der nicht mehr mit dem Operator assoziiert.
    • Das Hauptmerkmal dieser Interaktion ist, dass das Repressorprotein hat zwei Bindungsstellen, einer für die Induktor und einer für den Operator.
    • Wenn der Induktor an seiner Stelle bindet, ändert er die Konformation des Repressorproteins, so dass die Operator-Bindungsstelle eine stark reduzierte Affinität für die DNA-Operatorregion hat.
    • Diese Art der Steuerung heißt allosterische Kontrolle.
    • Das Ergebnis ist das wenn der Induktor hinzugefügt wird, wird der Repressor in eine Form umgewandelt, die vom Operator freigesetzt wird.

Abbildung 2.6.2: Induktor

Die positive Kontrolle des lac-Operons wird durch den cAMP-CAP-Komplex ausgeübt

  • E coli bevorzugt Glucose gegenüber anderen Kohlenstoffquellen.
Wenn Glukose in eine E. coli-Zelle eindringt, wird sie direkt ohne Induktion neuer Enzyme verwertet.
  • Wann E coli wird auf Glukose angebaut, wenn ein anderer Zucker (z.B. Laktose) hinzugefügt wird die Induktion von Enzymen, den anderen Zucker zu verwerten, erfolgt erst, wenn die Glucose aufgebraucht ist.
  • Wenn E. coli nach Glukose hungert, synthetisiert es ein ungewöhnliches Nukleotid: zyklisches 3'5' Adenosinmonophosphat (zyklischer AMP, oder Lager):

Abbildung 2.6.3: Lager

  1. Bei Bakterien scheint ein Anstieg des cAMP-Spiegels ein „Alarm“-Signal zu sein, das auf einen niedrigen Glukosespiegel hinweist:

Abbildung 2.6.4: Wechselwirkung von cAMP-Spiegel und lac-Operon

Dibutyryl cAMP

  • ein analog von cAMP, das durch die E coli Membran und in die Zelle.
  • Wenn dies zu glukose- und lactosehaltigen Medien hinzugefügt wird, führt dies zu Induktion des lac Operon.
  • Somit ahmt es die chemische Botschaft nach, die die E coli zu reagieren, als ob der Glukosespiegel niedrig.
  • Mutanten von E coli isoliert wurden, die nicht zur Metabolisierung induziert werden können irgendein Zucker außer Glukose. Es gab zwei allgemeine Kategorien von Mutanten:
  1. Klasse I. Defekt im Enzym Adenylatcyclase. Diese Mutanten sind nicht in der Lage, cAMP herzustellen, selbst wenn die Glucosekonzentration niedrig ist.
  2. Klasse II. Fehlt ein bestimmtes Protein, bekannt als cAMP-Rezeptorprotein (CRP) oder auch als Katabolit-Rezeptor-Protein (CRP) bekannt.
  • Maximale Transkription von der lac Operon erfordert die Anwesenheit von a cAMP/CRP Komplex.
    • Der cAMP/CRP-Komplex bindet an eine spezifische Sequenz in der lac-Kontrollregion, die als "DECKEL" Seite? ˅.
    • Die CAP-Site ist nur stromaufwärts von der RNA-Polymerase-Bindungsstelle.
    • Mutationen in der CAP-Stelle, die die cAMP-CRP-Bindung verhindern, verhindern auch eine hohe Expression des lac Operon.
  • Somit gebundener cAMP/CRP-Komplex aktiviert Transkription (Positive Kontrolle), während gebunden lac Unterdrücker hemmt Transkription (Negativkontrolle).
    • Der cAMP/CRP-Komplex hat Affinität für DNA und RNA pol.
    • Verbessert die Komplexbildung von RNA pol mit der DNA-Promotorregion.

Induktion des lac Operon mit Lactose-Analoga

  • Die lac Operon kann induziert werden mit Laktose
    • b-Galactosidase (lacZ-Genprodukt) verstoffwechselt die Laktose
    • Wenn der Laktosespiegel reduziert wird, lac Operon wird wieder von der . verdrängt lac Unterdrücker (lacich Genprodukt)
  • Nicht metabolisierte Lactose-Analoga kann die kontinuierlich induzieren (d lac Operon
    • Isopropyl-b-thiogalactosid oder IPTG, ist ein nicht metabolisiertes Lactose-Analogon

DNA-"Footprinting"-Experimente

  • Wenn ein Protein an eine DNA-Region bindet, es kann diese DNA-Region vor der Verdauung durch DNA schützen (DNAse I: eine Endonuklease an Stellen neben Pyrimidinnukleotiden).
    • Ein DNA-Fragment kann an den 5'-Enden mit . markiert werden 32P und dann die Markierung können vorzugsweise von einem Ende (d. h. dem 3'-Ende eines Gens) durch eine geeignete Restriktionsendonuklease entfernt werden.
    • Wenn dieses DNA-Fragment mit einer Markierung an einem spezifischen Ende einen Komplex mit einem DNA-bindenden Protein bildet, schützt das Protein die DNA-Region, an die es bindet, vor DNAse I-Verdauung.
    • Der Verdau erfolgt unvollständig. Für die Zwecke dieser Diskussion stellen Sie sich vor, dass jedes DNA-Molekül nur einmal gespalten wird. Außerdem wird die Spaltungsstelle zufällig aus den verfügbaren Stellen ausgewählt.
    • Fragmente der DNA, die nach dem Verdau getrennt und nach Größe (mit Gelelektrophorese) analysiert wurden, zeigen die geschützte Region an:

Abbildung 2.6.5: DNA-Fußabdruck

Ergebnisse von Footprinting-Experimenten

lac DNA, die entweder mit cAMP/CAP-Protein oder RNA-Polymerase oder lac I-Repressorprotein inkubiert wurde:

Abbildung 2.6.6: lac-Repressor mit cAMP

RNA-Polymerase interagiert mit spezifischen Promotorsequenzen und erzeugt einen "Fußabdruck" über eine Region von ~70 Basenpaaren.

  • Es wurde beobachtet, dass dieser Schutz auf einem Strang offensichtlicher war als auf dem anderen (d. h. wenn der andere Strang markiert war, zeigten die Ergebnisse nicht so viel Schutz).
  • Diese Region des DNAse-Schutzes umfasste Stellen in der DNA, aus denen Mutagenese-Experimente entweder eine "Aufwärts"-Regulierung oder "Abwärts"-Regulierung der Promotorstärke erzeugten.
  • Diese mutagenen "hot"-Spots, die die Promotorstärke beeinflussten, befanden sich entweder an den Positionen -10 oder -30 stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle (Position +1 im obigen Diagramm):

Abbildung 2.6.7: Mutationen der Promotorstärke

  • Promotoren können nach ihrer „Stärke“ klassifiziert werden.
  • Dies bezieht sich auf den Verwandten Häufigkeit der Transkriptionsinitiation (transkriptionelle Initiationsereignisse pro Minute) und bezieht sich auf die Affinität der RNA-Polymerase für die Promotorregion.
  • Viele Promoter in E coli wurden charakterisiert und eine "Konsens"-Promotorsequenz wurde identifiziert:

Abbildung 2.6.8: Stärke des Konsensvermittlers

Notiz

Der lac-Promotor ist ein relativ schwach Promoter

RNA-Polymerase

  • E coli RNA-Polymerase ist ein Holoenzym bestehend aus den Untereinheiten b', b, a (Dimer) und s70.
    • Das s70 Untereinheit ist die Untereinheit, die an die Promotorregion bindet, aber nicht in der Lage ist, die RNA-Synthese zu initiieren.
    • Nach dem s70 Untereinheit Untereinheit bindet, die anderen Untereinheiten binden und bilden eine funktionelle RNA-Polymerase.
    • Nachdem ungefähr 10 Basenpaare transkribiert wurden, wird das s70 Untereinheit Laub und der Kernpolymerase geht weiter.

Die lac Betreiberregion

  • Die lac Operatorregion besteht aus einem (unvollkommenen) invertierte Wiederholung Region.
  • Es überrascht nicht, dass aktive Repressormoleküle aus einem Homodimer bestehen.
    • In der Homodimer-Struktur gibt es ein Paar von a-Helix-Regionen, die in benachbarte Hauptfurchen der DNA inserieren.
    • Die Trennung ist ungefähr 34 Angström auseinander.

Überarbeitete Antwortzusammenfassung

Meine ursprüngliche Antwort lieferte den Beweis, dass der trp-Repressor ein Dimer ist, und diese Schlussfolgerung gilt insbesondere in Bezug auf seine funktionelle Form. Die Aussage in Wikipedia, dass es sich um ein Tetramer handelt, halte ich immer noch für falsch, obwohl ich jetzt sehe, wie es entstanden sein könnte. Es scheint eine Fehlinterpretation von Ergebnissen in vitro zu sein, die zeigen, dass ein Gleichgewicht zwischen Dimer und Tetramer (nicht nur Tetramer) bestehen kann. Ich habe dies in einem zusätzlichen Abschnitt erweitert.

Ein funktionelles Dimer

Die funktionelle Form von ist sicherlich ein Dimer, wie ursprünglich von Schievitz et al. (1985). Die Zusammenfassung dieses Papiers enthält die Aussage:

„Die Kristallstruktur des trp-Repressors von Escherichia coli wurde mit atomarer Auflösung aufgeklärt. Das dimere Protein hat eine bemerkenswerte Untereinheitsschnittstelle, in der fünf der sechs Helices jeder Untereinheit miteinander verbunden sind.“

Es wurde in Kombination mit der Operator-DNA kristallisiert und die Struktur in der Protein Database (PDB) als 1TRO hinterlegt. Ich reproduziere ein Bild aus dem PDB-Eintrag unten. Viele andere DNA-bindende Proteine ​​haben ebenfalls dimere Strukturen.

In Lösung beobachtetes Dimer-Tetramer-Gleichgewicht

Die Aussage in Wikipedia geht wahrscheinlich auf einen Bericht von Fernando und Royer (1992) zurück, der später bestätigt wurde, dass in Lösung ein Gleichgewicht zwischen dem Dimer und höheren Oligomeren besteht (wobei das Tetramer vorherrscht). Tryptophan verschiebt das Gleichgewicht zum Dimer. Die Autoren behaupten, dass dies eine physiologische Relevanz hat, obwohl dies immer noch ein strittiger Punkt zu sein scheint.


2.6: DNA-Fußabdruck der lac-Operon-CAP-Site – Biologie

BioBuilder&rsquos iTunes-Gerät Aktivität betont die &ldquoteste&rdquo-Phase des Design-Build-Test-Zyklus. Sie arbeiten mit mehreren Varianten eines enzymbildenden genetischen Schaltkreises. Die Schaltkreise weisen kleine Unterschiede in ihren DNA-Sequenzen auf, von denen erwartet wird, dass sie die Menge an Enzym verändern, die die Zellen produzieren. Sie verwenden einen enzymatischen Assay, um die Ausgänge der Schaltkreise quantitativ zu messen. Anschließend vergleichen Sie Ihre Ergebnisse mit dem, was Sie aufgrund des bekannten Verhaltens der leicht unterschiedlichen DNA-Sequenzen vorhersagen würden.

Für die meisten technischen Systeme, signifikante Unterschiede zwischen beobachtetem und vorhergesagtem Verhalten sind inakzeptabel. Wie in Abbildung 7-1, was würde ein Luftfahrtingenieur von einer neuen Flügelform halten, die, wenn sie einem Flugzeugkörper hinzugefügt wird, das Flugzeug auf unerwartete Weise fliegen lässt? Angesichts dieser Ungewissheit zu planen und zu bauen, würde enorme Kosten verursachen und möglicherweise Leben in Gefahr bringen. Ingenieure würden es fast unmöglich finden, mit ihren Designs voranzukommen, wenn die Kombinationen einfacher Teile - seien sie Muttern und Schrauben oder Widerstände und Verstärker - zu unerwarteten Verhaltensweisen führen würden.

Abbildung 7-1. Unbeabsichtigtes Verhalten. Bei der Modifikation des Standardhecks eines Flugzeugs (links) in eine neuartige Form (rechts) muss der Ingenieur über unbeabsichtigte Verhaltensweisen besorgt sein, zum Beispiel Unterschiede, die sich auf die sichere Landung des Flugzeugs auswirken.

Etablierte Engineering-Disziplinen setzen auf modulare Komponenten, die auf vielfältige Weise funktional zusammengebaut werden können, sodass Kombinationen einfach an individuelle Bedürfnisse angepasst werden können. Die Teile müssen nicht nur physikalisch verbunden sein, sondern sich beim Verbinden auch gemäß der Spezifikation verhalten. Einfach gesagt, die Teile müssen beim Zusammenbau wie erwartet funktionieren.

An diesem Punkt auf dem Gebiet der synthetischen Biologie arbeiten Bioingenieure noch an einem solchen funktionellen Zusammenbau genetischer Teile. Obwohl Forscher viele zelluläre Verhaltensweisen auf molekularer Ebene charakterisiert haben&mdass es in vielen Fällen möglich ist, die genetischen Elemente zu katalogisieren, die notwendig und ausreichend sind, um eine biologische Funktion auszuführen&mdashDie Kombination dieser genetischen Komponenten auf neue Weise führt oft zu unerwarteten Ergebnissen. Synthetische Biologen könnten das genetische Material bald relativ leicht physikalisch zusammensetzen, um jede gewünschte Sequenz zusammenzusetzen, aber das Einfügen dieser Sequenz in einen neuen zellulären Kontext kann ihre Funktion auf unsichere und sich ändernde Weise beeinflussen, selbst wenn die Sequenz gründlich untersucht und gut charakterisiert wurde isoliert oder in anderen Zusammenhängen.

Modularität, Isolierung, und Messung von Teilen sind neben der Standardisierung entscheidende Komponenten, um eine solche funktionale Montage zu ermöglichen (siehe die Grundlagen des DNA-Engineering Kapitel zur weiteren Diskussion). In diesem Kapitel untersuchen wir, wie diese zusätzlichen Prinzipien in der Standardtechnik im Allgemeinen und in der synthetischen Biologie im Besonderen angewendet werden. Dann beschreiben wir das iTune Device-Experiment, um eine Vielzahl genetischer Schaltkreise in Zellen zu testen, um ihr erwartetes und ihr gemessenes Verhalten zu vergleichen.

Modularität bezieht sich auf die Idee, dass Ingenieure Systeme entwerfen und generieren können, indem sie funktionale Einheiten oder „Module&rdquo kombinieren. Modularität ist für die Biologie sinnvoll, da wir bestimmten DNA-Schnipseln diskrete Funktionen zuschreiben können– obwohl wir dieses Prinzip heute als selbstverständlich ansehen, war umfangreiche Forschung erforderlich, um es zu bestätigen (siehe folgende Seitenleiste).

GENE ALS MODULE

Die synthetische Biologie geht von einer Reihe genetischer „Teile&rdquo aus, die kombiniert und manipuliert werden können, um ein präzises Verhalten zu erzeugen. Die dieser Prämisse zugrunde liegende Idee, dass Merkmale aus diskreten funktionalen Teilen der DNA entstehen, ist in der Tat relativ neu. Erst als die Ergebnisse von Gregor Mendels Experimenten mit Erbsenpflanzen in den frühen 1900er Jahren wiederentdeckt wurden, begannen Wissenschaftler zu verstehen, dass Merkmale unterschiedlich bleiben könnten, was den Weg für unser heutiges Verständnis der Genetik ebnete.

Lange Zeit glaubte man, dass Nachkommen die genetischen Merkmale der Eltern vereinen. Mendels akribische Arbeit bei der Züchtung von Erbsenpflanzen zeigte, dass nicht immer eine Vermischung stattfand und dass manchmal ein Merkmal treu von einer Mutterpflanze an eine Nachkommenpflanze weitergegeben werden kann. Mendel führte diese Vererbungsstudien durch, indem er einige Schlüsselmerkmale seiner Erbsenpflanzen sorgfältig zählte und vermaß, wie Blütenfarbe und Schotenform. Seine Daten zeigten, dass Merkmale unterschiedlich bleiben konnten und unabhängig in vorhersehbaren Verhältnissen weitergegeben wurden. Seine Ergebnisse legten nahe, dass die Vererbung in Form von diskreten Einheiten betrachtet werden sollte, die er Faktoren nannte, die später jedoch Gene genannt wurden. Seine Arbeit zeigte, wie diese Faktoren auf vorhersehbare Weise zwischen den Generationen weitergegeben wurden. Diese Idee gilt heute als selbstverständlich, war aber zu ihrer Zeit bahnbrechend und führte zur Gründung der klassischen Genetik.

Es dauerte mehr als 50 Jahre, um eine molekulare Erklärung für die von Mendel beobachteten Vererbungsmuster zu liefern. Unser modernes Verständnis beruht weitgehend auf der doppelhelikalen DNA-Struktur, wie sie von Watson und Crick beschrieben wurde, und auf den klassischen Studien der Genexpression im lac-Operon von Jacob und Monod. Dank dieser und anderer wissenschaftlicher Fortschritte verstehen wir heute grundlegende Ideen der Biologie, wie den Fluss genetischer Informationen von der DNA über die RNA bis hin zu Proteinen und die Umformung von Merkmalen in DNA-Sequenzen, die eine Funktion kodieren. Die Idee der DNA-Teile in der synthetischen Biologie ist ein Produkt dieser klassischen Errungenschaften.

Veränderungen in der Musikindustrie bieten ein anständiges (aber nicht perfektes) Beispiel für die Vorteile durch erhöhte Modularität. Während eines Großteils des 20. Jahrhunderts war die Verbreitung von Musik als Schallplatte und später als Kassette und CD die gebräuchlichste und profitabelste Art, Musik zu verbreiten. In all diesen Formaten wurde Musik hauptsächlich als Alben in voller Länge verkauft. Einzelne Songs waren verfügbar, aber deutlich teurer. Selbst wenn die Leute nur einige der Songs auf einem Album mochten, kauften sie im Allgemeinen das Album.Das Album war die Standard-&ldquounit&rdquo für die Musikindustrie und ihre Künstler. Diese Einheit änderte sich zu Beginn des 21. Jahrhunderts vollständig, als die Musik digitalisiert wurde. Mit diesem Fortschritt wurde es einfach, Musik herunterzuladen, anstatt das physische Album zu kaufen. Songs aus einem Album ließen sich leicht entbündeln, wodurch Songs zu unabhängigen Modulen wurden, die die Hörer nach Belieben und Bedarf mischen und anpassen konnten. Die weit verbreitete Möglichkeit, aus diesen modularen Songs maßgeschneiderte Playlists zu erstellen, hat die Art und Weise verändert, wie die Leute über ihre Musiksammlung denken, und hat den Standard &ldquounit&rdquo für die Branche verändert.

Die verbesserte Modularität und Anpassungsfähigkeit, die wir in kommerzieller Musik sehen, rekapituliert unsere sich ändernden Vorstellungen von a Genexpressionseinheit, die den Weg für die Verwendung des Begriffs genetische &ldquoparts&rdquo in der synthetischen Biologie geebnet haben. Mendels frühe Arbeiten zeigten, dass Merkmale eigenständige Einheiten sind. In Analogie zu aufgenommener Musik kann der Organismus, der das Merkmal zeigt, als analog zum vollständigen Album betrachtet werden – das Merkmal existiert nur im Kontext des Organismus, genauso wie das Lied nur im Kontext des vollständigen Albums existiert. Dr. Francois Jacob und Dr. Jacques Monod, deren Arbeiten weiter unten in diesem Kapitel beschrieben werden, haben dieses Bild mit ihrer Beschreibung des Laktosestoffwechsels dramatisch neu formuliert, indem sie Merkmale in Bezug auf dynamische genetische Elemente und nicht auf ganze Organismen mit Merkmalen neu fassen. Bestimmte DNA-Abschnitte wurden identifiziert, die zusammen daran arbeiteten, das Verhalten einer Zelle zu kontrollieren, aber die genetischen Elemente innerhalb dieser Abschnitte waren unteilbar und nicht leicht an einen neuen Zweck angepasst. Dieser Meilenstein kann irgendwo zwischen den Phasen &ldquoalbum&rdquo und &ldquosingle&rdquo der Musikindustrie betrachtet werden. Jetzt, im Zeitalter der Gentechnik und austauschbarer genetischer Teile sind viele genetische Sequenzen, die für bestimmte Funktionen kodieren, bekannt und können präzise manipuliert werden. Wir können eine &ldquoPlaylist&rdquo dieser genetischen Elemente anpassen, indem wir sie auf spezielle Weise neu kombinieren, um unseren Bedürfnissen gerecht zu werden. Die Techniken für diese Manipulation werden ausführlicher in der beschrieben Grundlagen des DNA-Engineering Kapitel. Hier erkunden wir die technischen Möglichkeiten, die sich ergeben, weil wir genetische Teile kombinieren können.

Da modulare Materialien gemischt und aufeinander abgestimmt werden, treten neue Komplikationen auf, einschließlich der erhöhten Wahrscheinlichkeit, dass die Module auf unerwünschte Weise miteinander interagieren. Ein Werkzeug, um unerwartete Wechselwirkungen zwischen Modulen zu minimieren, besteht darin, das Verhalten der Teile zu isolieren. Berücksichtigen Sie beim Autokauf die modularen Optionen. Sie können das Basismodell in vielerlei Hinsicht aufrüsten: verbesserte Lautsprechersysteme, einen stärkeren Motor, beheizbare Rücksitze und mehr. Diese Add-Ons sind zum Teil (ha!) dank des modularen Designansatzes der Autoingenieure verfügbar. Ohne diesen Ansatz wären die Kosten für die Aufrüstung auf ein schickes Lautsprechersystem exorbitant, da die Frontkonsole komplett neu gestaltet werden müsste, um jede Lautsprechermarke aufzunehmen. Stattdessen wurde Flexibilität für Snap-In-Upgrades in den frühen Entwurfsphasen berücksichtigt, und folglich erfordern Änderungen zum Zeitpunkt des Kaufs keinen erheblichen Neuentwurf. Anpassungen für jedes der Automodule wurden erwartet, und die Designer haben von Anfang an harte Arbeit geleistet, um die Teile diskret zu gestalten.

Neben der Herstellung physikalisch diskreter Teile, die auf viele Arten kombiniert werden können, erfordert die funktionale Montage, dass die Teile Verhaltensweisen die von den anderen Elementen um sie herum trennbar sind. Zum Beispiel als Abbildung 7-2 veranschaulicht, darf die Bedienung der Stereoanlage die Bedienung des Lenkrads des Fahrers nicht beeinträchtigen. Es wäre eine echte fahrerische Herausforderung, wenn durch Drehen des Knopfes am Radio auch das Lenkrad gedreht würde. Eine solche Verhaltenstrennung zwischen dem Betrieb von Teilen wird als Isolierung bezeichnet.

Abbildung 7-2. Isolierung im Autodesign. Ein modernes Auto besteht aus mehreren Komponenten, darunter Sitze, Räder, Lenkrad und Stereoanlage. Die Komponenten arbeiten unabhängig voneinander, sodass die Verwendung einer Komponente den Betrieb anderer Komponenten im Auto nicht beeinträchtigt.

Eine ähnliche vorausschauende Gestaltung und Isolierung von genetischen Teilen ist beim Bauen mit genetischen Teilen schwer zu erreichen. Die Zelle ist eine flüssige Umgebung, in der sich Moleküle, Proteine ​​und Zellstrukturen ständig vermischen. Wie ist es möglich, ihr Verhalten zu isolieren, wenn sie ständig auf neue Partner und Nachbarn treffen? Außerdem verhalten sich &ldquo-Upgrades&rdquo auf eine Zelle möglicherweise in einigen Mobilfunkeinstellungen wie erwartet und in anderen nicht wie erwartet. Die Aktivität in der Was für eine bunte Welt Kapitel veranschaulicht diese Herausforderung. Auch wenn die Upgrades auf den ersten Blick zu funktionieren scheinen, ist die lokale Umgebung der Zelle dynamisch und erfordert, dass Zelldesigns unter vielen Umwelt- und Wachstumsbedingungen funktionieren. Schließlich können und werden lebende Materialien im Gegensatz zu jedem anderen technischen Substrat im Laufe der Zeit mutieren, wie wir in der Goldenes Brot Kapitel. Die Entwicklung des entwickelten Produkts macht die Design-Herausforderung noch viel größer.

Um die Komplexität des biologischen Designs zu bewältigen, können wir das leistungsstarke Engineering-Tool von Abstraktion, wie im beschrieben Grundlagen des Biodesigns Kapitel, sodass Entscheidungen zu einem Designelement unabhängig von den Entscheidungen zu anderen Elementen getroffen werden können. Ein Autoradio kann ausgetauscht werden, ohne die Lenkung zu beeinträchtigen. Außerdem, Modularität, Isolierung und Abstraktion sollten Entscheidungen über Geräte ermöglichen, ohne das Systemdesign zu beeinflussen. Um auf die Automobilanalogie zurückzukommen, müssen Sie nicht einen Lastwagen anstelle eines Autos kaufen, nur weil Sie einen Frontantrieb wünschen.

Doch wie gut funktioniert ein solcher Ansatz für die Synthetische Biologie in der Praxis? Synthetische Biologen möchten einen Punkt erreichen, an dem sie Teile mit bekannten Identitäten und relativen Stärken vorhersagbar und rational zu neuen synthetischen Schaltkreisen kombinieren können. Durch die Messung der tatsächlichen Leistung von synthetischen Systemen, die aus gut charakterisierten Teilen bestehen, und den Vergleich der Messungen mit den vorhergesagten, können Biobuilder ihre Designs bewerten und den Erfolg oder Misserfolg zukünftiger Designs näher antizipieren.

Messprinzipien

Manche Dinge sind schwer zu messen. Glück zum Beispiel hat keine Skala oder Einheit, auf die wir uns alle einigen können, und es gibt keine Instrumente, um es zuverlässig zu erkennen. Andere Dinge werden ständig gemessen: Wir können Karten in einem Deck, Notendurchschnitt oder Teamwertungen in einer Sportliga einen numerischen Wert zuordnen. Egal, ob Sie eine Mahlzeit zubereiten oder Kleidung von der Stange kaufen, Sie verlassen sich auf Maße, um Anzahl, Größe, Zeit oder Dinge zu zählen. Messwerte berichten über den Zustand der Elemente und deren Verhalten, Beziehungen oder Eigenschaften.

Wenn etwas gemessen werden kann, bieten uns Einheiten eine übliche Möglichkeit, Artikel zu vergleichen. Die Standardisierung der Einheiten für jede Messung ist nicht trivial, wie wir im Grundlagen des DNA-Engineering Kapitel, aber für viele Punkte gibt es Einheiten, auf die wir uns geeinigt haben. Das Messen der Körpergröße eines Pferdes in &ldquohands&rdquo ist ein großartiges Beispiel. Dank Heinrich VIII., der eine Hand auf 4 Zoll standardisierte, verfügt selbst diese antiquierte Einheit noch über aussagekräftige Messinformationen. Jeder, der mit dem Handmaß vertraut ist, weiß, dass ein Pferd, das 16 Hände hoch steht, 64 (16 x 4) Zoll am Widerrist (nahe der Schulter) hat und dass ein anderes Pferd mit 16,3 Händen 67 (16 x 4 + 3) Zoll misst. nicht 65,2 (16,3 x 4) Zoll.

Aussagekräftige Messungen, unabhängig von der Einheit, sind ein Markenzeichen moderner wissenschaftlicher Ansätze. Wie Mendel uns gezeigt hat, können wir beim Zählen Muster erkennen. Qualitative Daten können auch sehr informativ sein, wie in der Eau das riecht Kapitel. Hier heben wir jedoch hervor, wie leistungsstarke mathematische Messungen es uns ermöglichen, Informationen zu manipulieren und in andere Darstellungen umzuwandeln. Zahlen ermöglichen uns auch Vergleiche und Vorhersagen.

Versuchen Sie beispielsweise, Ihren Schulweg mit dem Ihres Freundes zu vergleichen, wenn Sie nur qualitative Messungen haben. In einem solchen Fall beschränkst du dich darauf, Dinge zu sagen wie: &ldquoDie Schule ist sehr weit von meinem Haus entfernt, viel weiter als von deinem, aber ich gehe schneller als du.&rdquo Aber durch das Messen der Meilen, Zeiten und Geschwindigkeiten ist es plötzlich möglich, Finden Sie heraus, wie früh jeder von Ihnen das Haus verlassen muss, um sich um 8 Uhr morgens in der Schule zu treffen Wenn Sie die Entfernungen und Ihre Gehgeschwindigkeit kennen, können Sie voraussehen, wie lange die Fahrt dauern wird. Anwenden dieser Lektion auf die Technik: Messung gibt uns die Möglichkeit, vorherzusagen, was sehr nützlich sein kann, aber nur, wenn wir entsprechende Messungen vornehmen können. Was eine Messung relevant macht, wird im Folgenden beschrieben.

Was wird normalerweise gemessen?

Ingenieure verwenden Messungen nicht nur, um die zu messenden Objekte zu beschreiben, sondern auch zu kontrollieren, zusammenzubauen und zu verbessern. Der Zusammenbau modularer Teile verdeutlicht die Bedeutung von Messungen. Um ein Teil zuverlässig mit einem anderen zusammenzusetzen, müssen die relevanten Merkmale jedes Teils bekannt sein und einem vereinbarten Standard entsprechen. Ansonsten drehen sich Zahnräder, gewonnene Muttern passen auf Schraubengewinde und Legosteine ​​können zu Modellen des Todessterns und des Eiffelturms zusammengebaut werden. Durch die Einhaltung bestimmter Messnormen wurden modulare Teile die Grundlage für moderne Fabriken und eine effiziente Fließbandfertigung. Einige der Vergleiche und Messungen, auf die sich Ingenieure verlassen, sind in Tabelle 7-1.

Messung

Beschreibung

Statische Leistung

Ordnet eine Reihe von gesteuerten Eingängen einem messbaren Endausgang(en) eines Teils zu

Hilfreich, um sicherzustellen, dass der Ausgang eines Teils ausreicht, um den nächsten Teil in einer Schaltung auszulösen

Dynamische Leistung

Ausgabe eines Teils im Laufe der Zeit als Reaktion auf eine Änderung des Eingangssignals

Zeigt, wie sich ein System bei einer anfänglichen Stimulation verhält, die sich von einem stabilisierten Langzeitverhalten unterscheiden kann

Eingabekompatibilität

Wie ein Teil auf verschiedene Eingaben reagiert

Veranschaulicht die Flexibilität des Teils für die Komposition mit verschiedenen vorgelagerten Teilen/Eingaben

Zuverlässigkeit

Gemessen als mittlere Zeit bis zum Ausfall (MTF)

Wird verwendet, um zu bestimmen, wie lange sich das System voraussichtlich wie ursprünglich spezifiziert verhält

Material- oder Ressourcenverbrauch

Bestimmt die Wahl der Stromversorgung oder des Ressourcenpools

Beeinflusst unter anderem Fahrwerksentscheidungen

Tabelle 7-1. Typische Messungen für Ingenieursdisziplinen

Durchführen und Berichten von Messungen für die Synthetische Biologie

Was Sie messen, sagt Ihnen verschiedene Dinge darüber, wie synthetische DNA-Schaltkreise in einer Zelle funktionieren. Die direkteste Messung der Aktivität eines Schaltkreises wäre möglich, wenn wir auf mikroskopische Größe schrumpfen könnten, genau wie Frau Frizzle in der Magischer Schulbus Buchreihe, und sitzen dann auf magische Weise auf der DNA, um die Anzahl der RNA-Polymerasen zu zählen, die sich jede Sekunde entlang der DNA bewegen. In elektronischer Hinsicht wäre dies wie das Zählen von Elektronen, während sie in einem Strom fließen. Experimentell sinnvoller ist es jedoch, die Produkte von Transkription und Translation zu messen. Wie viele mRNAs werden pro Sekunde hergestellt oder wie reichert sich das Protein im Laufe der Zeit an? Diese RNA- und Proteinmessungen sind möglich, aber apparativ, zeit- und fachtechnisch aufwendig. Um die Dinge in BioBuilders iTunes-Laboraktivität etwas einfacher zu machen, &beta-Galactosidase Die (&beta-gal) Aktivität wird gemessen, was eine indirekte, aber gute Widerspiegelung der Leistung jedes Schaltkreises ist.

Die Erfahrung hat gezeigt, dass, wenn DNA-Schaltkreise von einem biologischen Kontext in einen anderen verschoben werden, Es kann schwierig sein, vorherzusagen, wie die genetischen Teile funktionieren werden. Die Aktivität eines Teils wird auf vielen Ebenen unterschiedlich beeinflusst, einschließlich der Transkriptions-, Translations- und Proteinaktivität in seiner neuen zellulären Umgebung. Zu den Herausforderungen einer zuverlässigen Montage kommt hinzu, dass es beim Zusammensetzen lebender Systeme aus mehreren genetischen Teilen schwierig vorherzusagen ist, wie die Teile miteinander kommunizieren. Beispielsweise kann ein starkes &ldquoon&rdquo-Signal, das von einem Teil erzeugt wird, nicht stark genug sein, um einen nachgeschalteten Teil auszulösen, mit dem es arbeiten soll.

Die synthetische Biologie ist jedoch nicht die erste technische Anstrengung, die sich diesen Herausforderungen bei der Montage stellt. Ein Ansatz, den etabliertere Ingenieurdisziplinen verfolgt haben, ist die Entwicklung von Datenblätter, die beschreiben, wie ein bestimmtes Teil in Abhängigkeit von bestimmten Parametern funktioniert. Um solche Datenblätter zu erstellen, müssen Ingenieure genügend Daten sammeln, um ihr Teil vollständig zu beschreiben, und sie mit bestimmten Eingaben und unter vielen verschiedenen Bedingungen und Umgebungen testen.

Synthetische Biologen können ähnliche Datenblätter für ihre Teile erstellen. Ein Datenblatt, das beispielsweise für einen Transkriptionsfaktor im Register der biologischen Standardteile veröffentlicht wurde, zeigt die statische Leistung, die dynamische Leistung, die Eingabekompatibilität und die Zuverlässigkeit des Teils an. Dies sind die gleichen Parameter, die zuvor in beschrieben wurden Tabelle 7-1. Im Idealfall würden diese Messungen und Beschreibungen des Verhaltens des Teils gelten, wann immer es verwendet wird. Allerdings sogar Wenn sich sein Verhalten je nach Kontext unterscheidet, können die Anweisungen und Informationen auf dem Datenblatt des Teils es einem Biobuilder ermöglichen, diese Variabilität zu berücksichtigen. Dieser &ldquoDatenblatt&rdquo-Ansatz funktioniert nur für Teile, die auf zuverlässige und vorhersehbare Weise variieren, was nicht immer der Fall ist, aber es ist ein wichtiger erster Schritt zur funktionalen Standardisierung.

Ein weiterer Faktor, der zur wahrgenommenen Robustheit eines Teils (oder deren Fehlen) beiträgt, ist die normale Variabilität der Messtechniken von Labor zu Labor. Selbst zwei Personen im selben Labor, die dasselbe messen, werden aufgrund subtiler Unterschiede in der Technik, den Medien, dem Zellwachstumszustand und wer weiß was sonst noch nicht zu identischen Werten kommen. Synthetische Biologen sind bestrebt, die zugrunde liegenden Ursachen dieser Variationen zu identifizieren, wissen jedoch, dass dies ein langfristiges Ziel ist. In der Zwischenzeit, Sie können Kalibrierreferenzen verwenden, um Messungen an einem Ort mit Messungen an einem anderen Ort zu vergleichen. BioBuider&rsquos iTune Device Lab verwendet aus diesem Grund einen Referenzstandard.

Grundlegende Konzepte für das iTune Device Lab

In dieser BioBuilder-Aktivität können Sie die biologische Aktivität genetischer Teile untersuchen, von denen erwartet wird, dass sie in Kombination unterschiedliche Mengen eines Enzyms erzeugen. Jeder dieser Teile wurde unabhängig als &ldquoschwach,&ldquo &ldquomittel&rdquo&rdquo oder „stark&rdquo charakterisiert. In dieser Übung wird gefragt, wie gut Sie das Verhalten dieser individuell charakterisierten Teile voraussehen können, wenn sie auf unterschiedliche Weise kombiniert werden. Ein gewisses Verständnis der Genexpression und der Rolle von Promotor- und Ribosomenbindungsstellenteilen, wie als nächstes beschrieben, ist wichtig, um zu beginnen.

Promoter und RBS

Das Mantra „DNA macht RNA macht Protein“ wird oft als „zentrales Dogma“ der Genexpression bezeichnet und steht für den Grundsatz, dass Proteine ​​durch Translation von RNA-Sequenzen zusammengesetzt werden und RNA-Sequenzen aus DNA-Sequenzen transkribiert werden. Proteine ​​erfüllen viele Schlüsselaufgaben in einer Zelle, daher steuern Transkription und Translation viele der Verhaltensweisen und Merkmale der Zelle. Es überrascht daher nicht, dass Transkription und Translation umfassend untersucht wurden, und viele der Kernkomponenten, die für die kontrollierte Genexpression notwendig und ausreichend sind, sind bekannt (Abbildung 7-3).

Abbildung 7-3. Symbolische Darstellung einer Genexpressionseinheit. Die Promotorsequenz, dargestellt durch den Pfeil auf der linken Seite, bindet RNA-Polymerase, um die Transkription zu initiieren. Die Ribosomenbindungsstelle, abgekürzt als &ldquoRBS&rdquo und dargestellt durch einen Halbkreis, ist eine DNA-Sequenz, die das Segment der mRNA codiert, an das das Ribosom bindet, um die Translation zu initiieren. Der offene Leserahmen, abgekürzt &ldquoORF&rdquo und dargestellt durch den Pfeil auf der rechten Seite, repräsentiert eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert. Die Richtung der Pfeile für den Promotor und ORF geben die Richtung an, in der sie gelesen werden.

Für die Transkription, Promoter sind die DNA-Sequenzen, die RNA-Polymerase, ein komplexes Multiprotein-Enzym, binden, um die Bildung von RNA-Ketten aus der DNA-Matrize zu initiieren. Für die Translation wird die Initiationsstelle als bezeichnetRibosomenbindungsstelle (RBS), da das Ribosom diese Sequenz erkennt, um die Proteinsynthese aus der RNA-Matrize zu beginnen. Diese Sequenzen sind größtenteils für die natürlich vorkommende Transkriptions- und Translationsregulation verantwortlich, und synthetische Biologen können sie auch verwenden, um ihre eigenen Regulationsschemata einzuführen. Basierend auf den vielen bekannten Promotor- und RBS-Sequenzen haben Forscher a Konsensussequenz für diese Teile, wie in gezeigt Abbildung 7-4. Die Konsensus-Promotorsequenz wurde beispielsweise durch einen Vergleich der Nukleotide an jeder Position in vielen Promotorsequenzen bestimmt. Der Konsensus wird aus dem Nukleotidmuster aufgebaut, das am häufigsten in jeder Position gefunden wird.

Abbildung 7-4. Konsensussequenzen definieren. Mehrere „Sequenzen&rdquo für einen Satz (links) und ein Gen (rechts) werden ausgerichtet, um eine Konsensussequenz zu erzeugen, die in der unteren Zeile grau dargestellt ist. Grün gefärbte Buchstaben repräsentieren die am häufigsten vorkommenden Buchstaben an jeder Position, die die Konsensussequenz definieren. Rote Buchstaben sind an dieser Position nicht die häufigsten Buchstaben und werden daher nicht in die Konsensussequenz aufgenommen.

Konsensussequenzen sind für die synthetische Biologie relevant, da ein Teil im Allgemeinen am besten funktioniert, wenn er eng mit der Konsensussequenz übereinstimmt. Umgekehrt gilt: Je mehr Nukleotide von der Konsensussequenz abweichen, desto weniger kann dieser Teil seine Aufgabe erfüllen. Somit ist eine Konsensus-Promotorsequenz wahrscheinlich ein „starker Promotor&rdquo, was bedeutet, dass sie wahrscheinlich die RNA-Polymerase gut bindet und häufig die Transkription initiiert, wohingegen eine Promotor- oder RBS-Sequenz, die vom Konsensus abweicht, „schwach&rdquo ihre Aufgabe weniger effizient erledigen wird als eine Sequenz mit bessere Übereinstimmungen. Stark bedeutet jedoch nicht unbedingt besser. Abhängig von der Anwendung möchte ein Ingenieur möglicherweise nur ein geringes Maß an Aktivität, wenn beispielsweise eine Pore auf der Zelloberfläche hergestellt oder eine Zelltodreaktion reguliert wird.

Das Lac Operon

Die Fähigkeit einer Zelle, Genprodukte nach Bedarf ein- und auszuschalten, ist für ihr Überleben entscheidend. In den 1960er Jahren identifizierten Dr. Francois Jacob und Dr. Jacques Monod grundlegende Prinzipien der Genexpression durch ihre Studien zum Laktosetransport und -metabolismus in Bakterien. Die Gene für den Laktosestoffwechsel sind in der lac Operon (Abbildung 7-5), aber die Bakterien sparen Energie, indem sie diese Gene nur aktivieren, wenn Glukose fehlt.Bakterien bevorzugen Glukose als Nahrungsquelle und werden sich nur bemühen, Laktose zu verwerten, wenn ihre bevorzugte Nahrung fehlt. Die molekularen Details in Jacobs und Monods Erklärung für seine Regulation sind ein klassisches Modell für induzierbare Gene. Hier besprechen wir nur die Details, die für das iTune Device Lab relevant sind.

Abbildung 7-5. Symbolische Darstellung des lac-Operons. Das lac-Operon besteht aus einem einzelnen Promotor (pLac, grüner Pfeil), der drei stromabwärts gelegene RBS&ndashORF-Paare (grüne Halbkreise bzw. blaue Pfeile) steuert. Das Operon produziert die für den Zuckerstoffwechsel notwendigen Enzyme nur dann, wenn keine Glukose vorhanden ist.

Das Schlüsselprotein für den Laktosestoffwechsel ist ein Enzym namens &beta-Galactosidase, oft abgekürzt &beta-gal, und es wird auf der DNA vom ORF namens lacZ codiert. Das β-Gal-Enzym spaltet Laktose in Glukose und Galaktose, die von der Zelle verwendet werden kann, um ihre anderen Funktionen zu erfüllen. Forscher haben auch herausgefunden, dass &beta-gal mit einer Vielzahl von laktoseähnlichen Molekülen reagiert, einschließlich synthetischer Analoga wie ONPG, die Sie im Labor für iTunes-Geräte verwenden werden.

Die LacZ-Expression und die des gesamten lac-Operons werden auf Transkriptionsebene sowohl positiv als auch negativ reguliert (Abbildung 7-6). Positive Regulierung tritt auf, wenn ein DNA-bindendes Protein die Transkriptionsmenge durch DNA-Elemente stromabwärts von seiner DNA-Bindungsstelle erhöht. Umgekehrt, negative Regulierung ist der Begriff, der verwendet wird, um den Fall zu beschreiben, in dem DNA-bindende Proteine ​​die Transkriptionsmenge verringern, wenn sie die DNA binden. Für das lac-Operon sind die positiven und negativen regulatorischen Faktoren empfindlich gegenüber der Zuckerart in der Bakterienumgebung. Wenn Glukose vorhanden ist, schalten die regulatorischen Faktoren die Transkription der stromabwärts gelegenen ORFs aus. Wenn Laktose vorhanden ist und Glukose fehlt, ändern dieselben transkriptionsregulierenden Faktoren ihr Verhalten, und die Transkription des Operons führt zum Transport und Metabolismus von Laktose.

Derselbe positiv und negativ regulierte Promotor, der lacZ kontrolliert, kontrolliert auch die anderen lac-Operon-Gene, einschließlich desjenigen, das das Lactose-Transportprotein kodiert. Eine einzelne mRNA wird vom lac-Operon&rsquos-Promotor transkribiert, wodurch die zahlreichen Proteinprodukte entstehen, die für den Laktosemetabolismus und -transport benötigt werden. Die Translation jedes Produkts kann dank der RBSs, die mit jedem ORF assoziiert sind, von der einzelnen mRNA aus erfolgen. Es ist eine kompakte und elegante genetische Architektur, die die Natur so abgestimmt hat, dass sie bei Bedarf die benötigten Mengen jedes Proteins produziert.

Abbildung 7-6. Lac-Operon-Regulierung. Der lacI-ORF kodiert für einen Transkriptionsrepressor, der das P . blockiertlac Promotor und blockiert daher die Expression des gesamten Operons. Lactose oder ihr Analogon IPTG hemmt das LacI-Repressorprotein, wodurch die Plac Promotor zu funktionieren und die Hemmung des stromabwärts gelegenen Operons zu lindern.

Zusätzliche Lektüre und Ressourcen

§ Canton, B., Labno, A., Endy, D. Verfeinerung und Standardisierung von synthetischen biologischen Teilen und Geräten. Natur Biotechnologie 2008 26:787-93.

& Abschnitt Jacob F., Monod J. Genetic Regulationsmechanismen in der Synthese von Proteinen. JMB. 19613:318-56.

& Sect Kelly, J. R. et al. Messung der Aktivität von BioBrick-Promotoren unter Verwendung eines In-vivo-Referenzstandards. Zeitschrift für Bioingenieurwesen (2009)3:4.

§ McFarland, J. Nephelometer: ein Instrument zum Schätzen der Anzahl von Bakterien in Suspensionen, die zur Berechnung des opsonischen Index und für Impfstoffe verwendet werden. JAMA. 190714:1176-8.

& Sect Miller, J. H. Experimente in der Molekulargenetik Cold Spring Harbor 1972 Cold Spring Harbor Laborpresse.

& Sek. Salis, H.M. Der Rechner für die Ribosomenbindungsstelle. Methoden Enzymol. 2011498:19-42.

§-Website: Register biologischer Teile (http://parts.igem.org/Main_Page).

iTunes-Gerätelabor

Dieses Labor konzentriert sich auf die Proteine ​​und DNA-Sequenzen, die zur Expression eines Gens benötigt werden (Promotoren, ORFs, RNA-Polymerase usw.) und dient auch als Einführung in die grundlegende Enzymologie. Die technischen Konzepte der Modularität, Isolierung und Messung werden durch die Analyse von neun Genregulationsdesigns untersucht. Jedes Design weist eine einzigartige Kombination aus Promotor und RBS auf, die die Expression eines Enzyms, Beta-Galactosidase, kontrollieren. Spektrophotometrische Analyse und enzymkinetische Assays sind die wichtigsten biotechnologischen Fähigkeiten, die in diesem Labor betont werden.

Design-Auswahl

Im Gegensatz zum natürlich vorkommenden lac-Operon sind die genetischen Architekturen der Genschaltkreise des iTune-Geräts einfachere Strukturen, wobei ein Promotor und ein RBS einen ORF kontrollieren (siehe Abbildung 7-7). Um die Auswirkungen dieser positiven und negativen regulatorischen Faktoren auf die iTune Device-Messungen zu mildern, werden die Zellen in reichen Medien, jedoch ohne das positive regulatorische Protein der Zelle und in Gegenwart von IPTG, einem Molekül, das das negative regulatorische Protein hemmt, gezüchtet. Wir können das Verhalten der iTunes-Schaltungen aufgrund des modularen Verhaltens jedes DNA-Teils anpassen. Wie Jacob und Monod beschrieben für E coli&rsquos natürliches Lac-Operon, die Teile des iTune Device &rsquos verfügen über diskrete Funktionen und Leistungsmerkmale, die synthetische Biologen für das Biodesign zu ihrem Vorteil nutzen.

Abbildung 7-7. Modifikation des lac-Operons. Bei genetischen Konstrukten, wie denen, die in der iTune-Geräteaktivität untersucht werden, wurde das zweite und dritte RBS-ORF-Paar entfernt. Die resultierende Genexpressionseinheit trägt einen einzelnen Promotor-RBS-ORF.

Experimentelle Frage

Im BioBuilder iTune Device-Labor messen Sie die Aktivität des lacZ-Genprodukts &beta-gal, um die Leistung verschiedener Promotor- und RBS-Kombinationen zu beurteilen. Die Promotor- und RBS-Teile wurden als „schwach &ldquo „mittel" oder „stark" basierend auf ihrer Ausrichtung an Konsensussequenzen für solche Teile charakterisiert. Wie sie in Kombination funktionieren, kann jedoch von den Kulturmedien, dem Stammhintergrund und den Techniken zu ihrer Bewertung abhängen. Wenn Sie Zeit oder Interesse haben, können Sie diese Messungen in verschiedenen Bakterienstämmen, in Stämmen in verschiedenen Wachstumsstadien oder mit zusätzlichen DNA-Kreisen im lebenden System durchführen. Jeder dieser Faktoren könnte die Funktionsweise dieser einfachen Promotor:RBS:lacZ-Schaltungen in der Zelle verändern.

Was könnten Sie über die Aktivität dieser Kreisläufe vorhersagen, bevor Sie das Labor betreiben, um sie zu messen? Tabelle 7-2 kann Ihnen dabei helfen, Ihre &ldquoguestimates&rdquo zu organisieren und Vorurteile in Ihrem Denken und Lücken in Ihrem Verständnis aufzudecken. Wenn wir willkürlich vermuten, dass die Kombination eines schwachen Promotors und eines schwachen RBS zu 10 Einheiten führt und die Kombination stark/stark zu 1.000 Einheiten führt, wie können wir dann alles dazwischen schätzen? Die Anfangswerte in der Tabelle sind theoretisch und spiegeln möglicherweise nicht die Zahlen wider, die Sie für diese Schaltungen erhalten, wenn Sie dieses Experiment durchführen. Der Punkt ist, zu fragen, was es braucht, um eine gute Vorhersage zu treffen.


1*. Transkription (aktivieren/unterdrücken)2. RNA-Processing (alternatives Spleißen)3. mRNA-Transport (im Kern steckengeblieben=degradiert)4*. mRNA-Translation (Rate & Re-Initiation: 5'cap/polyA-Schwanz)5. mRNA-Abbau (Langer polyA-Schwanz = längere Lebensdauer)6. Proteinaktivität/-abbau (post-translationale Modifikation)

CIS -- ENHANCER SEQUENCE ON DNA (regulatorisch)

TRANS- EIN AKTIVATORPROTEIN BINDET CIS-SEQUENZ

CIS-Elemente = Regulatorische DNA-Seq. wo TFs binden
--- dh: (Promoter/Enhancer)

TRANS-Gen-regulatorische Proteine, die cis-Elemente erkennen.
---- dh: (TFIID, Aktivatoren)


Milchbiotechnologie

Alle Stoffwechselfunktionen in einer Zelle in Bezug auf sowohl Abbau- als auch Biosynthesewege in Prokaryonten und Eukaryonten werden durch die Expression spezifischer Gene, die auf ihrer DNA für Wachstum und Entwicklung kodiert sind, ausgeführt. Allerdings werden nicht alle Gene, die in einer Zelle vorhanden sind, ständig exprimiert, es sei denn, ihre Funktionen sind absolut unverzichtbar. Die Mehrheit der Gene wird nur dann eingeschaltet, wenn die Produkte solcher Gene für das Wachstum in einer bestimmten Umgebung (Signal) benötigt werden. Ihre Expression wird ausgeschaltet, wenn ihre Produkte entweder nicht mehr benötigt werden oder die Zelle bereits über ausreichende Mengen dieser Produkte verfügt. Dieses Ein- und Ausschalten der Genexpression in einer Zelle stellt ein sehr leistungsfähiges, streng reguliertes System zur Kontrolle der Genfunktionalität dar. Durch das Abschalten der Expression von Genen, wenn ihre Produkte nicht benötigt werden, kann ein Organismus unnötige Energieverschwendung vermeiden, da die in einer Zelle verfügbaren Energieressourcen begrenzt sind. Die Zelle muss die konservierten Energieressourcen sehr umsichtig nutzen, um Produkte zu synthetisieren, die die Zellwachstumsrate maximieren. Die Genexpression in einer Bakterienpopulation wird hauptsächlich durch drei Mechanismen reguliert, d. h. konstitutive, induzierbare und reprimierbare Systeme, die in diesen Organismen funktionieren.

7.2 Konstitutiver Ausdruck

Die konstitutive Genexpression wird nicht reguliert, was typisch für Gene ist, deren Produkte für zelluläre Funktionen unverzichtbar sind. Diese Gene bleiben immer eingeschaltet und produzieren kontinuierlich und stabil die gewünschten Enzyme oder Proteine ​​für das Wachstum und das Überleben der Zelle. Solche Gene werden als Haushaltsgene oder konstitutive Gene bezeichnet, die RNA und Proteine ​​mit basalen Vitalfunktionen wie rRNA, ribosomale Proteine ​​und glykolytische/respiratorische Enzyme kodieren.

7.3 Induzierbare und reprimierbare Gene

Induzierbare und reprimierbare Genprodukte werden nur unter bestimmten Umständen benötigt. Induzierbare Gene werden als Reaktion auf das Vorhandensein eines Substrats (Induktors) in der Umgebung, z.B. Lactose im Lac-Operon.

Unterdrückbare Gene werden als Reaktion auf ein Umweltsignal, z.B. die gleichzeitige Anwesenheit von Lactose/Glucose oder Xylose/Glucose, die die Gene unterdrückt, die für die Verwertung von Lactose oder Xylose erforderlich sind.

7.4 Negative und positive Regulation der Genexpression

Bakterien verändern die Genexpression durch positive oder negative Regulation. Der grundlegende Unterschied zwischen positiver und negativer Regulation besteht darin, ob das regulatorische Molekül, dh der Repressor allein (lac-Operon) oder der Repressor zusammen mit dem Induktor/Endprodukt ('trp-Operon') an den Promotor bindet und ob das Molekül ansteigt (Induktor) oder abnimmt (Repressor) die Genexpression.

Die prokaryontische Genexpression wird auf der Ebene der Transkription, Translation und Enzymfunktionen streng reguliert. Da Transkription und Translation in Prokaryonten gekoppelt sind, ist das Kontrollniveau der Genexpression auf Transkriptionsebene relativ höher.


Ein Operon stellt einen genetischen Schalter dar, der nur in Prokaryoten funktioniert, um einen Cluster von Genen, die an Stoffwechselwegen (degradativ und biosynthetisch) beteiligt sind, hinsichtlich ihrer Funktionalität koordiniert zu regulieren. Diese Gene werden zusammen unter der Kontrolle des gleichen Promotors in eine einzelne polycistronische mRNA transkribiert, die schließlich in ihre individuellen Polypeptide translatiert wird. Operon besteht aus drei Grundelementen: Den Strukturgenen, den regulatorischen Sequenzen, d.h. Promotor- und Operatorregionen und das regulatorische Gen. Das bekannteste Beispiel für das Operonsystem ist das „lac-Operon“ in E. coli, das heute umfassend als Modell zum Verständnis des Mechanismus der Laktoseverwertung in Bakterien verwendet wird.


Ein Operon ist eine funktionelle Einheit der Genexpression in Bakterien. Dies stellt das einzigartige Genregulationssystem dar, das nur in Prokaryonten funktioniert. Das „lac-Operon“-Modell wurde 1961 von Jacob und Monod vorgeschlagen, um die koordinierte Regulation von Genen zu beschreiben, die Enzyme codieren, die für die Verwertung von Laktose in E. coli benötigt werden.

7.6.1 Elemente des „lac-Operons“

Das ‚lac-Operon‘ besteht aus den folgenden Schlüsselelementen, wie in Abb.7.1 gezeigt.

7.6.1.1 Drei Strukturgene

Das „Lac-Operon“ besteht aus drei Strukturgenen, nämlich. lacZ, lacY und lacA, die Enzyme/Proteine ​​codieren, die funktionell verwandt sind, um den Laktosestoffwechsel in E. coli zu bewirken. Alle diese drei Gene stehen unter der Kontrolle eines einzigen Promotors und sind am Abbau von Laktose beteiligt.

i) LacZ kodiert für β-Galactosidase, die Lactose in Glucose und Galactose abbaut.

ii) LacY kodiert für Lactosepermease, die für den Transport von Lactose in E. coli-Zellen benötigt wird.

iii) LacA kodiert für Thiogalactosid-Transacetylase, deren genaue Funktion noch nicht bekannt ist.


7.6.1.2 Regulatorische Abläufe

Die regulatorischen Sequenzen des „lac-Operons“ umfassen die folgenden.

i) LacO – die Operatorregion (O), an der der „lac“-Repressor bindet, um den Promotor für die RNA-Polymerase-Bindung zu blockieren, wodurch das „lac-Operon“ ausgeschaltet wird.

ii) LacP – die Promotorregion (P), an der RNA-Polymerase bindet, um die Transkription der Strukturgene in polycistronische mRNA einzuleiten.

iii) LacI – das regulatorische Gen, das das trans-wirkende „lac“-Repressorprotein codiert, das an die Operatorregion bindet, um die Transkription in Abwesenheit von Laktose zu blockieren – der Induktor des lac-Operons. Tatsächlich ist der eigentliche Induktor des lac-Operons die Allo-Lactose, ein Isomer der Laktose.

iv) LacI befindet sich nicht innerhalb des lac-Operons, sondern stromaufwärts einige Nukleotide vom lac-Operon entfernt, zusammen mit seinem eigenen Promotor, um den „lac“-Repressor zu synthetisieren

Abgesehen davon gibt es einige Effektormoleküle, die die Bindung des Repressors oder der RNA-Polymerase an ihre jeweiligen Stellen an den Promotor-Operator-Regionen des lac-Operons entweder aktivieren oder deaktivieren. Die Organisation des „lac-Operons“ und seine Funktion bei der Regulation der für den Laktosestoffwechsel benötigten Strukturgene in E. coli sind im Folgenden schematisch dargestellt

Das lac-Operon wird in Gegenwart oder Abwesenheit des Induktors, d. h. Lactose (Allolactose), unterschiedlich reguliert, wie unten beschrieben

7.7.1 In Abwesenheit von Laktose

Wenn Lactose in dem mit E. coli beimpften Wachstumsmedium fehlt, wird lac-Repressor synthetisiert, indem lacI von seinem Promotor mit Hilfe von RNA-Polymerase in aktiver Form exprimiert und in das Medium diffundiert wird, um die Operatorstelle im Operon zu erreichen. Die Bindung des Repressors an den Operator blockiert die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor und somit werden die Strukturgene abgeschaltet und somit wird die polycistronische mRNA nicht vom Operon synthetisiert. Die Regulation des „lac-Operons“ in Abwesenheit eines Induktors, d. h. Laktose, ist in Abb. 7.2 dargestellt.

7.7.2 In Gegenwart von Laktose

Wenn Lactose im Wachstumsmedium verfügbar ist, bindet sie mit dem Repressor an seiner Induktor-Bindungsstelle und verändert die Konformation des Repressors, der nicht länger an die Operatorstelle des lac-Operons binden kann. Somit wird die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor nicht behindert und daher werden alle drei Strukturgene in eine polycistronische mRNA transkribiert, aus der alle drei für den Laktosestoffwechsel benötigten Enzyme unabhängig translatiert werden, um ihre spezifischen Funktionen zu erfüllen. Die Regulation des „lac-Operons“ in Gegenwart eines Induktors, d. h. Laktose, ist in Abb. 7.3 dargestellt.

Tatsächlich ist der eigentliche Induktor des lac-Operons nicht Lactose, sondern sein Isomer Allolactose, das mit Hilfe von β-Galactosidase aus Lactose hergestellt wird. Die Haupteinschränkung von Lactose (Allolactose), die als Induktor dient, wenn sie dem Medium zugesetzt wird, ist jedoch ihre konstante Nutzung durch E. coli während des Wachstums und muss daher kontinuierlich aufgefüllt werden, um die Induktion des lac-Operons in Gang zu halten. Dieses Problem wurde im Großen und Ganzen mit der Synthese von IPTG (Iso Propyl Thio Galactoside) gelöst, einem strukturellen Analogon der Lactose - einem unentgeltlichen Induktor des lac-Operons, der als effizienter künstlicher Induktor wirkt, ohne vom Bakterium metabolisiert zu werden und daher dort verbleibt im Wachstumsmedium auf unbestimmte Zeit. IPTG wird in großem Umfang im Labor verwendet, um die Expression heterologer Gene in E. coli für die Produktion hochwertiger rekombinanter Proteine ​​im großen Maßstab zu induzieren.

7.7.3 Lac-Operon steht sowohl unter negativer als auch unter positiver Regulation

Das Lac-Operon ist ein klassisches Beispiel für ein Operon, das sowohl einer negativen als auch einer positiven Regulation unterliegt. Die negative Regulation wird, wie bereits erwähnt, durch das Repressormolekül vermittelt, das in Abwesenheit des Induktors den Operator bindet und somit die Strukturgene durch Hemmung ihrer Transkription abschaltet. Die positive Regulation des lac-Operons wird durch ein Signalmolekül namens cAMP (Cyclic Adenosine Monophosphate) ausgelöst, das die Abnahme der Glukosekonzentration im Medium erkennt (wenn E. coli-Zellen unter Hungerbedingungen stehen). Bei hoher Glukosekonzentration im Medium sinkt der cAMP-Spiegel in der Zelle und umgekehrt steigt bei niedrigen Glukosekonzentrationen der cAMP-Spiegel in der Zelle an. cAMP aktiviert ein anderes Protein namens CRP (cAMP Receptor Protein), das auch als CAP (Catabolite Activator Protein) bezeichnet wird und nur dann an die CRP-Stelle im lac-Operon in der Nähe des lac-Promotors bindet, wenn es mit cAMP komplexiert wird. Die Bindung des aktiven CRP wird die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor verstärken, wodurch die Expression des lac-Operons beträchtlich erhöht wird. Das Funktionieren der positiven Regulation des „lac-Operons“ wurde in Abb. 7.4 demonstriert.

Weiterführende Literatur

Fundamentale Bakterielle Genetik, Nancy Trun, Janine Trempy (Hrsg.), Wiley-Blackwell, 2003, ISBN: 978-0-632-04448-1

From Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology, 3. Auflage, Jeremy W. Dale, Malcolm von Schantz, Nicholas Plant (Hrsg.), Wiley-Blackwell, 2011, ISBN: 978-0-470-68386-6

Mikrobielle Genetik, 2. Auflage, Stanly R. Maloy, John Cronan, David Freifelder, Narosa, ISBN: 8173196974

Molecular Biology of the Gene, Sechste Auflage, James D. Watson (Herausgeber) Cold Spring Harbor Press und Benjamin Cummings, ISBN 978-080539592-1


MILCHBIOTECHNOLOGIE

Alle Stoffwechselfunktionen in einer Zelle in Bezug auf sowohl Abbau- als auch Biosynthesewege in Prokaryonten und Eukaryonten werden durch die Expression spezifischer Gene, die auf ihrer DNA für Wachstum und Entwicklung kodiert sind, ausgeführt. Allerdings werden nicht alle Gene, die in einer Zelle vorhanden sind, ständig exprimiert, es sei denn, ihre Funktionen sind absolut unverzichtbar. Die Mehrheit der Gene wird nur dann eingeschaltet, wenn die Produkte solcher Gene für das Wachstum in einer bestimmten Umgebung (Signal) benötigt werden. Ihre Expression wird ausgeschaltet, wenn ihre Produkte entweder nicht mehr benötigt werden oder die Zelle bereits über ausreichende Mengen dieser Produkte verfügt. Dieses Ein- und Ausschalten der Genexpression in einer Zelle stellt ein sehr leistungsfähiges, streng reguliertes System zur Kontrolle der Genfunktionalität dar. Durch das Abschalten der Expression von Genen, wenn ihre Produkte nicht benötigt werden, kann ein Organismus unnötige Energieverschwendung vermeiden, da die in einer Zelle verfügbaren Energieressourcen begrenzt sind. Die Zelle muss die konservierten Energieressourcen sehr umsichtig nutzen, um Produkte zu synthetisieren, die die Zellwachstumsrate maximieren. Die Genexpression in einer Bakterienpopulation wird hauptsächlich durch drei Mechanismen reguliert, d.h.konstitutive, induzierbare und unterdrückbare Systeme, die in diesen Organismen wirken.

7.2 Konstitutiver Ausdruck

Die konstitutive Genexpression wird nicht reguliert, was typisch für Gene ist, deren Produkte für zelluläre Funktionen unverzichtbar sind. Diese Gene bleiben immer eingeschaltet und produzieren kontinuierlich und stabil die gewünschten Enzyme oder Proteine ​​für das Wachstum und das Überleben der Zelle. Solche Gene werden als Haushaltsgene oder konstitutive Gene bezeichnet, die RNA und Proteine ​​mit basalen Vitalfunktionen wie rRNA, ribosomale Proteine ​​und glykolytische/respiratorische Enzyme kodieren.

7.3 Induzierbare und reprimierbare Gene

Induzierbare und reprimierbare Genprodukte werden nur unter bestimmten Umständen benötigt. Induzierbare Gene werden als Reaktion auf das Vorhandensein eines Substrats (Induktors) in der Umgebung, z.B. Lactose im Lac-Operon.

Unterdrückbare Gene werden als Reaktion auf ein Umweltsignal, z.B. die gleichzeitige Anwesenheit von Lactose/Glucose oder Xylose/Glucose, die die Gene unterdrückt, die für die Verwertung von Lactose oder Xylose erforderlich sind.

7.4 Negative und positive Regulation der Genexpression

Bakterien verändern die Genexpression durch positive oder negative Regulation. Der grundlegende Unterschied zwischen positiver und negativer Regulation besteht darin, ob das regulatorische Molekül, dh der Repressor allein (lac-Operon) oder der Repressor zusammen mit dem Induktor/Endprodukt ('trp-Operon') an den Promotor bindet und ob das Molekül ansteigt (Induktor) oder abnimmt (Repressor) die Genexpression.

Die prokaryontische Genexpression wird auf der Ebene der Transkription, Translation und Enzymfunktionen streng reguliert. Da Transkription und Translation in Prokaryonten gekoppelt sind, ist das Kontrollniveau der Genexpression auf Transkriptionsebene relativ höher.


Ein Operon stellt einen genetischen Schalter dar, der nur in Prokaryoten funktioniert, um einen Cluster von Genen, die an Stoffwechselwegen (degradativ und biosynthetisch) beteiligt sind, hinsichtlich ihrer Funktionalität koordiniert zu regulieren. Diese Gene werden zusammen unter der Kontrolle des gleichen Promotors in eine einzelne polycistronische mRNA transkribiert, die schließlich in ihre individuellen Polypeptide translatiert wird. Operon besteht aus drei Grundelementen: Den Strukturgenen, den regulatorischen Sequenzen, d.h. Promotor- und Operatorregionen und das regulatorische Gen. Das bekannteste Beispiel für das Operonsystem ist das „lac-Operon“ in E. coli, das heute umfassend als Modell zum Verständnis des Mechanismus der Laktoseverwertung in Bakterien verwendet wird.


Ein Operon ist eine funktionelle Einheit der Genexpression in Bakterien. Dies stellt das einzigartige Genregulationssystem dar, das nur in Prokaryonten funktioniert. Das „lac-Operon“-Modell wurde 1961 von Jacob und Monod vorgeschlagen, um die koordinierte Regulation von Genen zu beschreiben, die Enzyme codieren, die für die Verwertung von Laktose in E. coli benötigt werden.

7.6.1 Elemente des „lac-Operons“

Das ‚lac-Operon‘ besteht aus den folgenden Schlüsselelementen, wie in Abb.7.1 gezeigt.

7.6.1.1 Drei Strukturgene

Das „Lac-Operon“ besteht aus drei Strukturgenen, nämlich. lacZ, lacY und lacA, die Enzyme/Proteine ​​codieren, die funktionell verwandt sind, um den Laktosestoffwechsel in E. coli zu bewirken. Alle diese drei Gene stehen unter der Kontrolle eines einzigen Promotors und sind am Abbau von Laktose beteiligt.

i) LacZ kodiert für β-Galactosidase, die Lactose in Glucose und Galactose abbaut.

ii) LacY kodiert für Lactosepermease, die für den Transport von Lactose in E. coli-Zellen benötigt wird.

iii) LacA kodiert für Thiogalactosid-Transacetylase, deren genaue Funktion noch nicht bekannt ist.


7.6.1.2 Regulatorische Abläufe

Die regulatorischen Sequenzen des „lac-Operons“ umfassen die folgenden.

i) LacO – die Operatorregion (O), an der der „lac“-Repressor bindet, um den Promotor für die RNA-Polymerase-Bindung zu blockieren, wodurch das „lac-Operon“ ausgeschaltet wird.

ii) LacP – die Promotorregion (P), an der RNA-Polymerase bindet, um die Transkription der Strukturgene in polycistronische mRNA einzuleiten.

iii) LacI – das regulatorische Gen, das das trans-wirkende „lac“-Repressorprotein codiert, das an die Operatorregion bindet, um die Transkription in Abwesenheit von Laktose zu blockieren – der Induktor des lac-Operons. Tatsächlich ist der eigentliche Induktor des lac-Operons die Allo-Lactose, ein Isomer der Laktose.

iv) LacI befindet sich nicht innerhalb des lac-Operons, sondern stromaufwärts einige Nukleotide vom lac-Operon entfernt, zusammen mit seinem eigenen Promotor, um den „lac“-Repressor zu synthetisieren

Abgesehen davon gibt es einige Effektormoleküle, die die Bindung des Repressors oder der RNA-Polymerase an ihre jeweiligen Stellen an den Promotor-Operator-Regionen des lac-Operons entweder aktivieren oder deaktivieren. Die Organisation des „lac-Operons“ und seine Funktion bei der Regulation der für den Laktosestoffwechsel benötigten Strukturgene in E. coli sind im Folgenden schematisch dargestellt

Das lac-Operon wird in Gegenwart oder Abwesenheit des Induktors, d. h. Lactose (Allolactose), unterschiedlich reguliert, wie unten beschrieben

7.7.1 In Abwesenheit von Laktose

Wenn Lactose in dem mit E. coli beimpften Wachstumsmedium fehlt, wird lac-Repressor synthetisiert, indem lacI von seinem Promotor mit Hilfe von RNA-Polymerase in aktiver Form exprimiert und in das Medium diffundiert wird, um die Operatorstelle im Operon zu erreichen. Die Bindung des Repressors an den Operator blockiert die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor und somit werden die Strukturgene abgeschaltet und somit wird die polycistronische mRNA nicht vom Operon synthetisiert. Die Regulation des „lac-Operons“ in Abwesenheit eines Induktors, d. h. Laktose, ist in Abb. 7.2 dargestellt.

7.7.2 In Gegenwart von Laktose

Wenn Lactose im Wachstumsmedium verfügbar ist, bindet sie mit dem Repressor an seiner Induktor-Bindungsstelle und verändert die Konformation des Repressors, der nicht länger an die Operatorstelle des lac-Operons binden kann. Somit wird die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor nicht behindert und daher werden alle drei Strukturgene in eine polycistronische mRNA transkribiert, aus der alle drei für den Laktosestoffwechsel benötigten Enzyme unabhängig translatiert werden, um ihre spezifischen Funktionen zu erfüllen. Die Regulation des „lac-Operons“ in Gegenwart eines Induktors, d. h. Laktose, ist in Abb. 7.3 dargestellt.

Tatsächlich ist der eigentliche Induktor des lac-Operons nicht Lactose, sondern sein Isomer Allolactose, das mit Hilfe von β-Galactosidase aus Lactose hergestellt wird. Die Haupteinschränkung von Lactose (Allolactose), die als Induktor dient, wenn sie dem Medium zugesetzt wird, ist jedoch ihre konstante Nutzung durch E. coli während des Wachstums und muss daher kontinuierlich aufgefüllt werden, um die Induktion des lac-Operons in Gang zu halten. Dieses Problem wurde im Großen und Ganzen mit der Synthese von IPTG (Iso Propyl Thio Galactoside) gelöst, einem strukturellen Analogon der Lactose - einem unentgeltlichen Induktor des lac-Operons, der als effizienter künstlicher Induktor wirkt, ohne vom Bakterium metabolisiert zu werden und daher dort verbleibt im Wachstumsmedium auf unbestimmte Zeit. IPTG wird in großem Umfang im Labor verwendet, um die Expression heterologer Gene in E. coli für die Produktion hochwertiger rekombinanter Proteine ​​im großen Maßstab zu induzieren.

7.7.3 Lac-Operon steht sowohl unter negativer als auch unter positiver Regulation

Das Lac-Operon ist ein klassisches Beispiel für ein Operon, das sowohl einer negativen als auch einer positiven Regulation unterliegt. Die negative Regulation wird, wie bereits erwähnt, durch das Repressormolekül vermittelt, das in Abwesenheit des Induktors den Operator bindet und somit die Strukturgene durch Hemmung ihrer Transkription abschaltet. Die positive Regulation des lac-Operons wird durch ein Signalmolekül namens cAMP (Cyclic Adenosine Monophosphate) ausgelöst, das die Abnahme der Glukosekonzentration im Medium erkennt (wenn E. coli-Zellen unter Hungerbedingungen stehen). Bei hoher Glukosekonzentration im Medium sinkt der cAMP-Spiegel in der Zelle und umgekehrt steigt bei niedrigen Glukosekonzentrationen der cAMP-Spiegel in der Zelle an. cAMP aktiviert ein anderes Protein namens CRP (cAMP Receptor Protein), das auch als CAP (Catabolite Activator Protein) bezeichnet wird und nur dann an die CRP-Stelle im lac-Operon in der Nähe des lac-Promotors bindet, wenn es mit cAMP komplexiert wird. Die Bindung des aktiven CRP wird die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor verstärken, wodurch die Expression des lac-Operons beträchtlich erhöht wird. Das Funktionieren der positiven Regulation des „lac-Operons“ wurde in Abb. 7.4 demonstriert.

Weiterführende Literatur

Fundamentale Bakterielle Genetik, Nancy Trun, Janine Trempy (Hrsg.), Wiley-Blackwell, 2003, ISBN: 978-0-632-04448-1

From Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology, 3. Auflage, Jeremy W. Dale, Malcolm von Schantz, Nicholas Plant (Hrsg.), Wiley-Blackwell, 2011, ISBN: 978-0-470-68386-6

Mikrobielle Genetik, 2. Auflage, Stanly R. Maloy, John Cronan, David Freifelder, Narosa, ISBN: 8173196974

Molecular Biology of the Gene, Sechste Auflage, James D. Watson (Herausgeber) Cold Spring Harbor Press und Benjamin Cummings, ISBN 978-080539592-1


Prüfung 2 Gewebeverletzung und Verteidigung des Gastgebers

1) Die Wachstumskurve wird anders sein:
Verzögerungsphase -> exponentiell -> stationär -> WIEDER EXPONENTIELL (im Gegensatz zu einer einzigen Kohlenstoffquelle, z.
- Lag-Phase = zw. Verwertung von Glucose & ” Laktose, bc Proteine, die die Laktose verdauen müssen, müssen „transkribiert”/erzeugt werden.
- PLATEAU in Laktose, da es einige Zeit dauert, bis die Laktose eingebracht und die Enzyme induziert werden

E.Coli verwendet zuerst Glukose, dann Laktose (wenn beides vorhanden ist):
1) Wenn Glukose vorhanden ist, wird der Laktosetransport in die Zelle gehemmt!
ENZYM II (für Glukose) ist UNPHOSPHORILIERT.
Lac Permease ist NICHT funktional
2) Wenn Glucose vorhanden ist, wird die Transkription von "Laktose-metabolisierenden Enzymen" "unterdrückt"!
Enzym II (für Glucose) unphosphoryliert.
KEINE Allolactose (kann nicht in die Zelle induziert werden - „Induktor-Ausschluss”), so dass der „Lac-Repressor“ auf dem Operator verbleibt und KEINE Transkription von Lactose-metabolisierenden Enzymen. [Normalerweise bindet Allolactose, wenn Laktose vorhanden ist, an den Repressor (Lac I-Gen)/verdrängt ihn, sodass die RNA dorthin gelangen kann, wo sie war und die Transkription von Laktose-metabolisierenden Genen durchführen kann].
3) Wenn Glukose vorhanden ist, ist die positive Regulation (Aktivierung der Transkription) durch CAP des "lac-Operons" INAKTIVIERT! (Inaktivierung des positiven Reglers)!
Enzym II (für Glucose) unphosphoryliert.
kann nicht interagieren und Adenylatzyklase aktivieren -> keine zyklische-AMP-Produktion -> kein CAP-cAMP-Komplex = CAP-Protein NICHT AKTIV und KANN NICHT binden (positive Regulatoren binden stromaufwärts des Promotors an viele Gene/Stellen) an die DNA, um das lac-Operon transkriptional zu aktivieren . [Anmerkung: CAP muss mit zyklischem Amp verbunden sein, um an die DNA zu binden, kann dies nicht alleine tun und cAMP wird aus ATP (wissen Sie) über das in der Membran gefundene Adenylatzyklase-Enzym hergestellt].

2) Lac-Permease = inaktiv [INDUCER-AUSSCHLUSS] (beide vorhanden), aktiv (nur Lactose).

3) Lac Repressor = Aktiv [NEGATIVE REGULIERUNG] (beide vorhanden) Inaktiv (nur Laktose).

4) Adenylatcyclase, cAMP-Produktion = inaktiv/niedrig (beide vorhanden) aktiv/hoch (nur Laktose)

5) CAP-cAMP-Komplex = Inaktiv (beide vorhanden) aktiv [POSITIVE REGULIERUNG] (nur Laktose)

6) Lac Operon Expression = Off (beide vorhanden) On (nur Lactose).

1. Aktiver Lac-Repressor <--Allolactose--> inaktiv ".
2. Aktiver CAP-Aktivator <----cAMP---> inaktiv.
3. Aktiver CcpA-Repressor <---Fructose-1,6-BP----> inaktiv.

1) Aerobes Wachstum, e-Akzeptor = Sauerstoff =
Cytochromoxidase produziert H2O

2) Anaerobes Wachstum, organischer e-Akzeptor = Fumarat oder Nitrat = Fumarat-Reduktase produziert Succinat, Nitrat-Reduktase produziert Ammoniak.

FNR = ist der Schlüsselregulator der Atmung. Funktioniert anaerob als Aktivator und Repressor

P
D. Die Aktivität der Adenylatcyclase wird durch Oxidation reguliert
E. Alle oben genannten Punkte

Phagozyten = definiert durch seine Funktion aka
Aufnahme von Partikeln [Reißverschluss-ähnliche Mode] = Struktur hat eine Reihe von Rezeptoren auf der Oberfläche und hat innere Organellen.

Makrophagen:
- Lang gelebt
- In Geweben vorhanden (wenn reif)
- O2-abhängiges Töten nicht energisch
- Bedingungen zugänglich für
intrazelluläres Wachstum von Krankheitserregern
- Pathogen-Taktiken im Kampf =
a) Umgehen Sie den Atemausbruch
b) Ausbrechen aus Phagosom
c) Phagolysosom-Fusion verhindern
d) Granulatinhalt widerstehen

Rezeptortypen, die an der Phagozytose beteiligt sind:
1) PHAGOZYTISCHE REZEPTOREN definieren, was Fresszellen sind
1a) "KOMPLEMENT-REZEPTOREN", die positive Proteine ​​der Serum-KOMPLEMENT-KOMPONENTE auf der Oberfläche von Pathogenen erkennen.
- 3 ROLLEN FÜR KOMPLEMENTKOMPONENTEN = Bakterien-Lyse, Phagozyten-Chemotaxis, Bakterien-Opsonisierung [wichtig für diese Klasse]
1b) Fc-Rezeptoren – bindet auf Phagozyten die konstante Region des Antikörpers.
1c) Lektine = direkte Erkennung bestimmter Kohlenhydrate. einen bestimmten Rezeptor. ADV: erworbene Immunität und Aktivierung der Komplementkaskade ist nicht erforderlich, aber.. DISADV: Der Bug muss die richtigen Kohlenhydrate an der Oberfläche haben. DECTINE sind die Hauptklasse von Phagozytenlektinen, die an der Erkennung von Pilzpathogenen beteiligt sind. Haben einen doppelten Nutzen: auch an der angeborenen, immunologischen Signalübertragung beteiligt.

2) ADHÄSIONSREZEPTOREN: im Gewebe mobilisieren, wenn sie vom Kreislauf zur Entzündungsstelle wechseln oder auch bewegen.

3) AKTIVIERUNGSREZEPTOREN: die Natur der phagozytischen Zelle verändern (sie in der Lage sein, Mikroorganismen abzutöten = Toll-like-Rezeptoren, Il-1-Rezeptor, TNF-Rezeptor, iFN-Gamma-Rezeptor =
3a) Frühe "M1-Makrophagen" = "KLASSISCHE AKTIVIERUNG (rot) = (1) Entzündung, (2) bakterielle und virale Erkrankungen. [KLASSISCHE AKTIVIERUNG -> DENTAL PROFESSIONAL].
- Eigenschaften von klassisch aktivierten Phagozyten (kennen Sie diese):
1. Erhöhte Phagozytoserate
2. Erhöhte Produktion von toxischem reaktivem Sauerstoff
Zwischenprodukte (antimikrobiell)
3. Erhöhte Produktion von NO (Stickoxid)
antimikrobiell)
4. Verstärkte Phagosom-Lysosom-Fusion.
5. Erhöhte Anzahl von MHC-Klasse-II-Molekülen
6. Sekretion von IL-12: Differenzierung von CD4-T-Zellen.
3b) Später - "M2-Makrophagen" = "ALTERNATIVE AKTIVIERUNG (rot)" = (1) nicht entzündlich, (2) beseitigt Gewebeschäden, (3) oft weniger restriktiv gegenüber Pathogenen.

Was führt zu ("verursacht") Opsonisierung? ENTWEDER:

(1) Alternative Pathway ermöglicht die Erkennung von Pathogenen (Oberfläche) in Abwesenheit von Antikörper => Komplementaktivierung => Rekrutierung von Entzündungszellen + Opsonisierung von Pathogenen + Abtötung von Pathogenen.
- Der Alternative Pathway beginnt mit der Opsonisierung, indem das C3-Fragment auf der Pathogenoberfläche gespalten und abgelagert wird: Opsonin -> Die C3b-Opsonisierung wird durch ein Enzym amplifiziert.

(2) Opsonisierung durch Komplementkomponente: Komplementkomponenten (erkannt durch Komplementrezeptoren, eine Art von phagozytischen Rezeptoren) haben drei Rollen = (a) Bakterienlyse, (b) Phagozyten-Chemotaxis, (c) Bakterienopsonisierung.
- VORTEILE DER ERGÄNZUNG = Benötigt keine Antikörper & Kann eine Vielzahl von Krankheitserregern erkennen.

2) Selbstmord durch NADPH-Oxidase setzt antimikrobielle "NETS" frei

3) Sauerstoffabhängige Mechanismen treten VOR der Verschlingung auf (siehe andere fc)

2) Opsonisierung hemmen oder Phagozytose inaktivieren
1. Kapsel: S. pneumoniae
2. M-Protein: S. pyogenes
3. Signalübertragung unterbrechen: RhoGAP-Proteine
" Z.B. Phagozyten können Streptokokken nicht aufnehmen
pnuemoniae mit einer Kapsel"

Wozu ist Schaden gut? (Warum verursachen Krankheitserreger Krankheiten?) =
1. Erzeugt neue Kolonisationsstandorte,
2. Erleichtert die Verbreitung im Gastgeber oder von Mensch zu Mensch
3. Erzeugt Nährstoffe
4. Wirkt der Abwehr des Wirts entgegen.
[Beispiel: Streptococcus pneumoniae sezerniert Enzyme, um die Epithelbarriere des Nasopharynx zu durchdringen. Setzt auch Faktoren ab, die die Phagozytose (z. B. Pneumolysin) und die Antikörperfunktion hemmen. Streptococcus pneumoniae = Normaler Bestandteil des Nasopharynx, Krankheit durch Ausbreitung auf distale Stellen. z.B. Strep pneumonae Meningitis - induzierter Hirninfarkt (vom Nasopharynx zum Gehirn)]

- PATHOGENE SCHÄDEN AN IHREN WIRTEN, UM DAS WACHSTUM ZU FÖRDERN (IMMUNSYSTEM VERMEIDEN, NEUE KOLONISATIONSSTELLEN SCHAFFEN, NÄHRSTOFFE ERZEUGEN, VERBREITUNG ERLEICHTERN).

- KRANKHEITEN VERURSACHEN SCHÄDEN ENTWEDER DIREKT (Z. B. TOXINE) ODER INDIREKT, INDEM SIE DEN WIRT VERURSACHEN, SCHÄDEN ZU VERURSACHEN (Z. B. ENTZÜNDUNG, AUTOIMMUNITÄT)

Endotoxin: Lipid-Zucker-Komponente der Zellhülle von Gram-negativen Bakterien, die sehr immunstimulierend sein kann

Exotoxin: ein Toxin, das in das extrazelluläre Milieu sezerniert wird (im Vergleich zu einem durch das Sekretionssystem injizierten Toxin)
z.B. AB-Toxine, abbauende Enzyme

Enterotoxin: Toxin, das im Magen-Darm-Trakt wirkt
z.B. Cholera-Toxin

Neurotoxin: Toxin, das im neuronalen System wirkt
z.B. Tetanus und Botulinumtoxin

Molekulare Mimikry: Antigene Ähnlichkeit zwischen Antigenen, die von Pathogenen hergestellt werden, und Wirts-(Selbst-)Antigenen. Antikörper oder T-Zellen, die zur Erkennung des erregerspezifischen Antigens induziert werden, kreuzreagieren mit dem Selbstantigen (Autoimmunität).

DREI ARTEN VON TOXINEN:
(1) membranaktiv (extrazellulär) = SUPERANTIGENE porenbildende Toxine.
(1a) diejenigen, die die Zellsignalisierung stören:
SUPERANTIGENE =: TCR (T-ZELLE) SIGNALIERUNG. & CHOLERA-TOXIN = cAMP-Signalisierung.
(1b) CLOSTRIDIALE NEUROTOXINE =
TETANUS-TOXIN (Hemmung des Zellhandels)
BOTULINUMTOXIN

= MEMBRANE-AKTIVE TOXINE (TSST-1), die von einer Untergruppe von S. aureus sezerniert werden, WIRKEN EXTRAZELLULÄR, die ein TOXISCHES SCHOCK-SYNDROM verursachen.

Superantigene verursachen UNSPEZIFISCHE (antigenunabhängige) T-ZELL-AKTIVIERUNG (2-20%) = massive Proliferation
ÜBERMÄSSIGE ENTZÜNDUNG verursacht Organversagen (toxischer Schock)

= Intrazelluläre Ziele (innerhalb der Zellen)
Problem: Wie gelangen diese Toxine an diese Ziele?
WIE A-B TOXINE DAS PROBLEM LÖSEN, DASS SIE ÜBER HOSTMEMBRANEN KOMMEN:
1. VON BAKTERIEN SEEKRETIERTES A-B-TOXIN: AKTIVITÄT DER A-UNTEREINHEIT (ENZYMATISCHE DOMAIN).
2. B-UNTEREINHEIT: BINDUNG AN ZELLREZEPTOR(EN)
3. ENDOKYTOSE VON TOXIN
4. ÜBERTRAGUNG UND FREIGABE DER A-UNTEREINHEIT.

1. B-Untereinheit: bindet Ganglioside & Blutgruppenantigene = B-UNTEREINHEIT: BINDET INTESTINALE EPITHELZELLEN.
2. Eine Untereinheit: ADP-RIBOSYLTRANSFERASE-Aktivität Substrat = Adenylatcyclase = A UNTEREINHEIT: ADP-RIBOSYLTRANSFERASE-AKTIVITÄT UNTERBREITET DIE TRANSPORTERFUNKTION, DIE ZU MASSIVER FLÜSSIGKEITSSEKRETION IN DAS DARMLUMEN FÜHRT.
3. Erhöhte zyklische AMP-Werte (cAMP)
a) Massiver Efflux von Cl--Ionen in das Lumen
b) Na+ und Cl- Absorption gehemmt

Botulinumneurotoxin (BoNT) – was ist das?

TETANUS UND BOTULINUM TOXINE HABEN ÄHNLICHES _______, ABER ___________ ANDERS.

Take Home on Clostridien Neurotoxine = BOTULINUM UND TETANUS TOXINE
- "A UNTEREINHEIT" = ZERSTÖRT MEMBRANE FUSIONSKOMPONENTEN IN NEURONEN UND VERHINDERT DAMIT NEUROTRANSMISSION.
-"B UNTEREINHEIT" = SEHR ÄHNLICH

BINDENDE SPEZIFITÄT (NEURONE) FÜR BEIDE TOXINE.
- UNTERSCHIEDLICH: B&T-TOXINE HABEN "ENTGEGENGESETZTE WIRKUNGEN" [B = schlaffe Lähmung T = Spastische Lähmung] BC ACT BEI DIF. SITES (LOKAL VS. ZENTRALES NERVENSYSTEM).- TETANUS TOXIN (Hemmung des Zellverkehrs)
BOTULINUMTOXIN

BOTULINUM NEUROTOXIN (BoNT) = MUSKELENTSPANNUNG BOTULUS = WURST Hinweis: asoc. w Botox = tx für eine tmd, tmj + Migräne.

CD4+ T-Zellen = exprimieren auf der Membran ein Molekül namens CD4 = ERKENNEN NUR fremde Peptide, die von MHC Klasse 2 EXPRESSED auf APC präsentiert werden [CD4 bindet an MHC Klasse 2 (exprimiert auf APC)]
- Wirkung: MHC Klasse 2 plus Peptid exprimiert auf APC (dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen - Anmerkung: diese exprimieren auch MHC Klasse 1. ) interagiert mit CD4+ T-Zellen => CYTOKINE SYNTHESE.
- wissen, was zur Zytokinsynthese führt.

CD8+ T-Zellen = haben CD8 auf ihrer Membran = erkennen nur fremde Peptide, die von MHC Klasse 1 EXPRESSED ON auf ALLEN kernhaltigen Zellen präsentiert werden. [CD8 bindet MHC Klasse 1 (exprimiert auf allen kernhaltigen Zellen).
- Wirkung: MHC Klasse 1 plus Peptid, das auf jeder kernhaltigen Zelle exprimiert wird, interagiert mit CD8+T-Zelle => führt zum TÖTEN der HOST-Zelle.

MHC-KLASSE 2 = APC'S (DENDRITISCHE ZELLEN, MAKROPHAGEN, B-ZELLEN) = HLA-DP, DQ, DR (3 von Mama, 3 von Papa) sind die menschliche Klasse 2 = Verarbeitung von EXOogenen Antigenen (außerhalb der Zelle, schwebend herum) = = haben eine PEPTID BINDING GROOVE (kann Peptid und mhc zusammen binden).

IMP - APC'S SIND NUKLEIERTE ZELLEN -> HABEN SOWOHL MHC1 UND MHC2 (BEIDE MENSCHLICHE KLASSEN AUCH!).

1) Dendritische Zellen (DC)
2) Makrophagen (M0)
3) B-Zellen

2. INC. in der GRÖSSE eines Organs oder Gewebes verursacht durch eine INC. in der ANZAHL der Zellen (kommt nur in Zellen vor, die sich teilen können, z.B. Zahnfleisch – Neuronen und Herzmuskel, die sich nicht teilen können)

3. DEZ. in der GRÖSSE eines Organs oder Gewebes aufgrund einer ABNAHME der MASSE bereits vorhandener Zellen. (Ergebnisse aus: Nichtgebrauch, Nahrungs- oder Sauerstoffmangel, verminderter endokriner Stimulation, Alterung, Denervation) - Kann generalisiert oder lokalisiert, pathologisch oder physiologisch sein (häufig während der Entwicklung) Folge einer verminderten Proteinsynthese und erhöhtem Proteinabbau (Ubiquitin-Weg verantwortlich)

4. Physiologische DEZ. in der ANZAHL der Zellen auf ihre normale ANZAHL, z. Thymusdrüse dreht sich während der Adoleszenz (Unterschied zwischen Kindheit und Erwachsenen), z. Myometrium Evolventen während der Geburt. = Form der Atrophie, beinhaltet die Apoptose von Zellen.

5. Lipofuscin (Lipochrom) = ABNUTZUNGSPIGMENT (häufig bei älteren Patienten an, am häufigsten mit Hepatozyten, Myokardzellen und Gehirn gefunden), BRAUNE ATROPHIE (Ansammlung von Lipofuszin und Atrophie von Oganen. gelbliches bis hellbraunes, fettlösliches Pigment Mischung aus Lipiden/Phospholipiden und Protein Zeichen einer Schädigung durch freie Radikale - zB STRRIATED MUSCLE AND LEVER.

6. Bilirubin = Katabolisches Produkt der Häm-Einheit von Hämoglobin und Myoglobin.
- pathologischer Zustand (Jauntice) = Ansammlung in Blut, Sklera, Schleimhaut, Organen. Gelbe Verfärbung. Ex. Hämolytischer Ikterus (Zerstörung von Erythrozyten), obstruktiver Ikterus (intra/extrahepatische Zerstörung der Gallenwege), hepatozellulärer Ikterus (parenchymale Leberschädigung).

HINWEIS: Metastatische Verkalkungen treten in normalem Gewebe auf.

1. KONGESTION – ERHÖHEN SIE DEN BLUTFLUSS INNERHALB VON GEFAHREN GEBÄNDE, DIE DILATIERT UND MIT ROTEN BLUTZELLEN (ERYTHROZYTEN) VERPACKT WERDEN.

2. Ödeme – ERHÖHUNG DER INTERSTITIALFLÜSSIGKEIT BEI VERBREITERUNG DES RAUMS ZWISCHEN INTERSTITIALKOMPONENTEN VERURSACHT SCHWELLEN AUSSER KNOCHEN

3. BLUTUNG – AKKUMULATION VON BLUT AUSSERHALB DER GEFAHREN EXTRAVASATION ROTER BLUTZELLEN IN GEWEBE ODER ÄUSSERE OBERFLÄCHE

4. Thrombose – Klumpen in einem Blutgefäß, das sich im Laufe des Lebens gebildet hat.

5. EMBOLUS – ABGELÖSTE INTRAVASKULÄRE FESTE, FLÜSSIGE ODER GASFÖRMIGE MASSE, DIE IM BLUT AN DIE VOM HERKUNFT ENTFERNT ENTFERTE STELLE BEFÖRDERT WIRD – Bsp. FETT, LUFTBLASE ODER N, ATHEROSKLEROTISCHE PLAQUE, TUMOR, KNOCHENMARK, FREMDKÖRPER, THROMBUS.

- Zellschäden verursachen durch (Schädigung durch freie Radikale):
-- Lipidperoxidation von Membranen - ausgedehnte Membranschäden.
-- Proteine ​​modifizieren - Fehlfaltung und Zusammenbruch verursachen
-- DNA-Schäden- verursachen Einzel- und Doppelstrangbrüche -> führen zu Zellalterung -> maligne Transformation

D - DNA-Abbau durch Endonukleasen - nukleosomale Chromatinfragmente -
Aussehen der DNA-Leiter
Aktivierung von Transglutaminasen (Cross-Link apoptotischer zytoplasmatischer Proteine)
Keine Entzündungsreaktion apoptotischer Körper

MARKIERTE ENTZÜNDLICHE REAKTION:
- LYSOSOMALE ENZYME - VERDAUUNGSZELLENMEMBRANEN, ZERSTÖREN ZELLEN
- MAKROPHAGEN NACH FREISETZUNG CHEMOTAKTISCHER FAKTOREN
- SCHMUTZENTFERNUNG DURCH PHAGOZYTISCHE MAKROPHAGEN

Allgemeine und zelluläre Eigenschaften:
1
2. Kernveränderungen - Lichtmikroskopie
Fortschreitende Kernkondensation mit eventuellem Verschwinden färbbarer Kerne. kennen diese nuklearen Veränderungen siehe Bild.
2a. PYKNOSIS - "SCHRUMPFUNG" DES NUKLEUS ZU KLEINEN, TIEF BASOPHILISCHEN/SCHWARZEN CHROMATIN-Klumpen
2b. KARYORRHEXIS - "FRAGMENTATION" NUKLEUS IN MEHRERE KLEINE SCHWARZE PUNKTE/STÜCKE
2c. KARYOLYSE - "FADING" VON NUKLEUS WENIGER UND WENIGER BASOPHILIC BIS VERSUCHT.

ARTEN:
1) KOAGULATIVE NEKROSE [[z.B. akuter Myokardinfarkt Verätzung (Aspirin)]
= HÄUFIGSTER TYP = PLÖTZLICHER VERLUST DER BLUTVERSORGUNG DES ORGANS (ISCHÄMIE): HERZ UND NIERE (ARTERIEN MIT EINGESCHRÄNKTER KOLLATERALER ZIRKULATION), NEBENDRÜSEN, NICHT IM GEHIRN ZU SEHEN = DENATURIERUNG VON PROTEINEN = FRÜHE STUFEN W. GEWEBEERHALTUNG = HIITELOGIE w. ALLGEMEINE ARCHITEKTUR GUT ERHALTEN, Progressive Kernkondensation mit eventuellem Verschwinden färbbarer Kerne
Erhöhte rosa Zytoplasma ("eosinophile", "glasige") "geisterähnliche" Strukturen.
2) LIQUEFAKTIVE NEKROSE = VERDAUUNG VON GEWEBE BRUTTO = FLÜSSIGE HISTOLOGIE: WEICHUNG UND VERFLÜSSIGUNG VON GEWEBE ÜBLICH ISCHÄMISCHE VERLETZUNG DES ZNS ÜBLICH BAKTERIELLE INFEKTION AUCH EITERE INFEKTIONEN (PUS-BILDUNG) (AKUTE W. INFLAMMATION)
VERFLÜSSIGT GEWEBESCHMUTZ UND INTENSIVE ENTZÜNDUNGSREAKTION VON NEUTROPHILEN = ABSZESS (fokale Ansammlung von Neutrophilen).

3) FÄLLIGE NEKROSE = AM HÄUFIGSTEN BEI TUBERKULOSE
= KÄSE-ÄHNLICHE KONSISTENZ = HISTOLOGIE: ARCHITEKTUR NICHT ERHALTEN AMORPHOUS PINK, GRANULAR WENIGE NUCLEI (KEIN GEISTIGES ERSCHEINUNGSBILD) = KOMBINIERT MERKMALE DER KOAGULATIVEN UND LIQUEFAKTIVEN NEKROSE = KOMMT ALS TEIL DER GRANUMALOMATOUS (EP) ALS TEIL DER GRANUMALOMATODEN HÖHEREN AUF LYMPHOZYTEN, &Amp MULTI-NUKLEIERTE RIESENZELLEN. z.B. an der Lunge - Abb.

4) GANGRENÖSE NEKROSE = UMFASSEND = UNTERBRECHUNG DER BLUTVERSORGUNG AN UNTERE EXTREMITIEN ODER DEN DARM (SEKUNDÄR ZUM GEFÄSSOKKLUSION) = HÄUFIG BAKTERIELLE INFEKTIONEN = ENTWEDER: (A) "NASS" GANGREN W. & GANGREN W. & GANGRENE & GANGRENE & GANGRENE " W. KOAGULATIVE NEKROSE OHNE VERFLÜSSIGUNG. (UNTERSCHIED ZWISCHEN NASS UND TROCKEN KENNEN!) - z.B. Bild von NOMA.

5) FIBRINOIDE NEKROSE = NUR BEI MIKROSKOPISCHEN UNTERSUCHUNGEN ZU ERKENNEN = OFT IN VERBINDUNG MIT IMMUNVERMITTELTER VASKULITIS = BINDEGEWEBE UND MUSKEL ERSETZT DURCH HOMOGENES ROSA MATERIAL, DAS FIBRIN ÄHNLICH IST = Bsp. ABLAGE VON FIBRIN-ÄHNLICHEM MATERIAL IN DEN ARTERIALWÄNDEN


Schau das Video: A2 Biology - the lac operon (September 2022).