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Wie sekretiert man ein rekombinantes Protein aus E. coli?

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Welche sekretorischen Wege können verwendet werden, um ein rekombinantes bakterielles Enzym aus E. coli zu sezernieren?

Ich habe ein rekombinantes Protein (29 kDa), das ich in E. coli BL21-Zellen exprimieren werde. Zur Zeit habe ich E. coli beschallt, um das Enzym zu extrahieren, aber in Zukunft möchte ich, dass E. coli das Enzym absondert.


Laut dem iGEM Kyoto-Team von 2012:

Der Twin Arginat Translocation Path (TAT) ist ein [ein endogenes] Sekretionssystem in E. coli. Dieses System kann Proteine ​​tragen, die torA-Signal-Aminosäuresequenzen am N-Terminus aufweisen. TatA, TatB, TatC und TatD bilden den Tat-Komplex auf der inneren Membran. Der Tat-Komplex erkennt das torA-Signalpeptid und transportiert dann Protein (mit torA) vom Zytoplasma zum Periplasma. Darüber hinaus schneidet Protein, das den TAT-Weg passiert hat, das torA-Signal ab. Proteine, die von diesem System sezerniert werden, haben keine Markierung, die die Aktivierung des Proteins behindert.

Das Team erstellte eine Kassette mit den TAT-Genen, um die Expression des Signalwegs zu erhöhen, und schloss auch das Kil-Gen ein, das die äußere Membran perforiert und möglicherweise die externe Diffusion des sekretierten Proteins unterstützt. Sie haben ziemlich augenzwinkernd festgestellt, dass

Unnötig zu erwähnen, dass die Funktion der äußeren Membran als Membran für das Überleben von E. coli essentiell ist. Mit anderen Worten, eine Überexpression von Kil verursacht den Zelltod. Aus diesem Grund müssen wir eine geeignete Menge an Ausdruck finden.

Notiz: Laut ihrem Labornotizbuch beobachtete das Team nie extrazelluläres GFP mit einem konfokalen Mikroskop (suchen Sie auf dieser Seite nach „konfokal“). So. In acht nehmen :)

Ihre Projektseite enthält auch einige Verweise auf die folgende Literatur:

  • Tracy Palmer und Ben C. Berks "Der Proteinexportweg der Twin-Arginin-Translokation (Tat)"
  • J. H. Choi. S. Y. Lee "Sekretorische und extrazelluläre Produktion rekombinanter Proteine ​​mit Escherichia coli"
  • G. Miksch · E. Fiedler · P. Dobrowolski · K. Friehs "Das durch einen wachstumsphasenabhängigen Promotor gesteuerte kil-Gen des ColE1-Plasmids von Escherichia coli vermittelt die Sekretion eines heterologen periplasmatischen Proteins während der stationären Phase"
  • Brad A. Seibel* und Patrick J. Walsh "Trimethylaminoxid-Akkumulation bei Meerestieren: Beziehung zur Acylglycerol-Speicherung"

Extrazelluläre rekombinante Proteinproduktion aus Escherichia coli

Escherichia coli ist der am häufigsten verwendete Wirt für die rekombinante Proteinproduktion und das Metabolic Engineering. Die extrazelluläre Produktion von Enzymen und Proteinen ist vorteilhaft, da sie die Komplexität eines Bioprozesses stark reduzieren und die Produktqualität verbessern könnte. Die extrazelluläre Produktion von Proteinen ist für metabolische Engineering-Anwendungen notwendig, bei denen Substrate Polymere wie Lignocellulosen oder Xenobiotika sind, da eine ausreichende Aufnahme dieser Substrate oft ein Problem darstellt. Das Dogma, das E. coli kein Protein sezerniert, wurde durch die Erkenntnis sowohl seiner natürlichen Fähigkeit zur Proteinsekretion in üblichen Laborstämmen als auch der erhöhten Fähigkeit zur Proteinsekretion in gentechnisch veränderten Zellen in Frage gestellt. Die bloße Existenz dieses Reviews, der der extrazellulären Produktion gewidmet ist, ist ein Zeugnis für die herausragenden Leistungen, die die Gemeinschaft in dieser Hinsicht gemeinsam geleistet hat. Vier Strategien haben sich entwickelt, um zu entwickeln E. coli Zellen rekombinante Proteine ​​sezernieren. In einigen Fällen wurden beeindruckende Sekretionsmengen von mehreren Gramm pro Liter erreicht. Dieses Sekretionsniveau ist mit anderen eukaryontischen Expressionssystemen vergleichbar. Inmitten des Optimismus ist es wichtig zu erkennen, dass erhebliche Herausforderungen bestehen bleiben, insbesondere wenn man bedenkt, dass der Erfolg nicht a priori vorhersehbar ist und viele Versuche und Irrtümer beinhaltet. Diese Übersicht gibt einen Überblick über die jüngsten Entwicklungen im Ingenieurwesen E. coli für die extrazelluläre Produktion rekombinanter Proteine ​​und eine Analyse der Vor- und Nachteile jeder Strategie.

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Das, A. 1990. Überproduktion von Proteinen in Escherichia coli: Vektoren, Hosts und Strategien. Methoden in Enzymol. 182: 93–112.

Holland, B., Kenny, B., Steipe, B. und Plückthun, A. 1990. Secretion of heterologous protein in Escherichia coli. Methoden in Enzymol. 182: 132–143.

Marston, F. und Hartley, D. 1990. Solubilization of protein aggregats. Methoden in Enzymol. 182: 264–276.

Uhlen, M. und Moks, T. 1990. Genfusionen zum Zweck der Expression: Eine Einführung. Methoden in Enzymol. 185: 129–143.

Bollag, D. M. und Edelstein, S. J. 1990. Proteinmethoden, p. 32–33. Wiley-Liss, New York.

Ybe, J. A. und Hecht, M. H. 1994. Periplasmatische Fraktionierung von Escherichia coli liefert trotz fehlender Signalsequenz rekombinantes Plastocyanin. Proteinexpression und -reinigung 5: 317–323.

Rojas, N. und Hecht, M. H. unveröffentlichte Ergebnisse.

Nikkila, H., Gennis, R. B. und Sligar, S. G. 1991. Cloning and expression of the gene encoding the lösliches Cytochrom B 562 von Escherichia coli. EUR. J. Biochem. 202: 309–313.

Brunet, A. P., Huang, E. S., Huffine, M. E. Loeb, J. E. Weltman, R.J. und Hecht, M. H. 1993. Die Rolle von Windungen in der Struktur eines α-helikalen Proteins. Natur 364: 355–358.

Franks, F. 1981. Biophysik und Biochemie der tiefen Temperaturen und des Gefrierens, p. 3–20. In: Auswirkungen niedriger Temperaturen auf biologische Membranen. Morris, G. J., Clarke, A. (Hrsg.). Akademische Presse, NY.

Lee, B., McKenna, K. und Bramhall, J. 1985. Kinetic Studies of human Erythrocyte Membran Resealing. Biochimica und Biophysica Acta 815: 128–134.

Morris, G. J. 1981. Liposomen als Modellsystem zur Untersuchung von Frostschäden, p. 241–262. In: Auswirkungen niedriger Temperaturen auf biologische Membranen. Morris, G. J., Clarke, A. (Hrsg.). Akademische Presse. NY.

Hecht, M. H., Richardson, J. S., Richardson, D. C. und Ogden, R. C. 1990. De novo Design, Expression und Charakterisierung von Felix: Ein Vier-Helix-Bündelprotein mit nativer Sequenz. Wissenschaft 249: 884–891.

Kamtekar, S., Schiffer, J. M., Xiong, H., Babik, J. M. und Hecht, M. H. 1993. Protein design by binary patterning of polar and unpolar aminosäuren. Wissenschaft 262: 1680–1685.

Studier, F. W. und Moffatt, B. A. 1986. Verwendung von Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase, um die selektive Expression von klonierten Genen auf hohem Niveau zu steuern. J.Mol. Biol. 189: 113–130.

Amman, E., Brosius, J. und Ptashne, M. 1983. Vektoren mit einem Hybrid trp-lac Promotor nützlich für die regulierte Expression von klonierten Genen in Escherichia coli. Gen 25: 167–178.


Sekretorische und extrazelluläre Produktion von rekombinanten Proteinen unter Verwendung von Escherichia coli

Escherichia coli ist einer der am häufigsten verwendeten Wirte für die Produktion rekombinanter Proteine. Es gibt jedoch oft Probleme bei der Gewinnung von beträchtlichen Ausbeuten an korrekt gefalteten Proteinen. Ein Ansatz zur Lösung dieser Probleme besteht darin, rekombinante Proteine ​​in den periplasmatischen Raum oder das Kulturmedium sezernieren zu lassen. Die sekretorische Produktion rekombinanter Proteine ​​hat mehrere Vorteile, wie z. B. einfache Reinigung, Vermeidung von Proteaseangriffen und N-terminaler Met-Verlängerung und eine bessere Chance auf korrekte Proteinfaltung. Neben dem etablierten Sec-System wird seit kurzem das Twin-Arginin-Translokationssystem (TAT) zur effizienten Sekretion gefalteter Proteine ​​eingesetzt. Es wurden auch verschiedene Strategien für die extrazelluläre Produktion von rekombinanten Proteinen entwickelt. Für die sekretorische Produktion komplexer Proteine ​​können periplasmatische Chaperone und Protease manipuliert werden, um die Ausbeuten an sezernierten Proteinen zu verbessern. Dieser Aufsatz diskutiert die jüngsten Fortschritte bei der sekretorischen und extrazellulären Produktion rekombinanter Proteine ​​unter Verwendung von E coli.

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4. Ergebnisse

4.1. Isolierung von Plasmid

Die Plasmid-DNA von S. simulans extrahiert und die Konzentration wurde auf 4 μg/μL eingestellt, die als Matrize für die Amplifikation des Gen-kodierten Lysostaphins verwendet wurden.

4.2. Konstruktion des rekombinanten Plasmids pET-lys

Das Sequenzierungsergebnis wurde durch den Vergleich mit der Datenbank unter Verwendung der Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)-Software bestätigt. Das Enzymverdauverfahren, der PCR-Assay und das Sequenzierungsergebnis zeigten, dass das Zielgen korrekt in das rekombinante Plasmid pET-lys eingefügt wurde (Daten sind nicht gezeigt).

4.3. Expression und Reinigung von rekombinantem reifen Lysostaphin

Das positive rekombinante Plasmid wurde in den Wirt transformiert, E coli BL21 (DE3). Die Zugabe von IPTG induzierte die Überexpression von rekombinantem Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 42 kDa. Das exprimierte Protein wurde erfolgreich mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ni-NTA-Harz gereinigt ( 1 ). Der Reinigungs- und Dialyseprozess führte zu einer Ausbeute von etwa 30 mg gereinigtem Protein aus 1 L E coli BL21 (DE3) + pET-lys-Kultur.

Die SDS-PAGE-Gele zeigen uninduzierten Zellextrakt aus E coli BL21(DE3)+PET-lys für eine Stunde (Spur 1) und zwei Stunden (Spur 2), induzierter Zellextrakt für zwei Stunden (Spur 3) und vier Stunden (Spur4) und extrahierte Proteine ​​nach Ni-NTA-Affinitätschromatographie ( Bahn 5). Ein Marker mit hohem Molekulargewicht ist auf der linken Seite gezeigt (Spur M).


Abschluss

Wir haben LARDs basierend auf der vergleichenden Modellierung von P. fluoreszenz Lipase und bindet sie genetisch an GFP und EGF. Zwei verschiedene LARDs (LARD0 und LARD1) enthielten eine β-Roll-Struktur und entweder einen Pro-Gly-Linker oder eine Faktor-Xa-Stelle zwischen Fusionsproteinen und LARDs. Wir haben auch die gesamte Lipase (TliA) genetisch an GFP, EGF und CTP gebunden. Die Fusionsproteine ​​mit der gesamten Lipase wurden in sezerniert E coli mit dem ABC-Transporter und zeigte Lipaseaktivität als intakte fusionierte Form im Überstand. Das mit LARDs oder TliA fusionierte GFP und EGF wurden in das extrazelluläre Medium exportiert E coli mit ABC-Transporter von P. fluoreszenz und E. chrysanthemie. Nur in diesem Bericht E coli wurde als Expressionswirt für die Möglichkeit eines ABC-Transporters für die rekombinante Proteinproduktion untersucht. Die sekretorische Expression von Fusionsproteinen in E coli wird sich auf diejenigen ausdehnen P. fluoreszenz in denen die ABC-Transporter TliDEF besser exprimiert werden [13]. P. fluoreszenz ergänzt mit TliDEF produzierte extrazelluläre Lipase bis zu etwa 15% Gesamtproteine ​​[13]. Es wird erwartet, dass eine effiziente Fabrik zur Herstellung von Proteinen unter Verwendung von Pseudomonas als Gastgeber.


ABSTRAKT

Standardkultivierungsprotokolle für rekombinante Kulturen mit hoher Zelldichte E coli verlassen sich auf die Anreicherung der Luft mit Sauerstoff, um eine Sauerstofflimitierung zu verhindern. Diese Art der Erhöhung der Sauerstoffzufuhr wirkt sich aufgrund der hohen Kosten für reinen Sauerstoff auf die Prozessökonomie aus. Die Reaktordruckbeaufschlagung ist ein alternativer Ansatz, um den Sauerstoffmassentransfer zu verbessern. In der vorliegenden Studie wurde die Leistung des Druckluftheber-Bioreaktors im wachsenden rE coli Zellen ausgewertet. Die Experimente wurden in einem druckbeaufschlagten Airlift-Bioreaktor (ALB) und in einem drucklosen Rührkesselreaktor (STR) durchgeführt, beide mit 5 L Arbeitsvolumen, ausgestattet mit einem System zur automatischen Steuerung und Überwachung von Druck, Temperatur, pH, und gelöster Sauerstoff. Die Druckbeaufschlagung erwies sich als entscheidend für die Verbesserung der ALB-Leistung bei der Biomassebildung (29 gDCW L −1 ) und Proteinproduktion (201 mgProtein gDCW −1 ), was zu einer Proteinproduktivität (240 mgProtein −1 h −1 ) und Energieeffizienz (11 gProtein kWh −1 ) ähnlich wie bei STR (200 mg .)Protein L −1 h −1 und 13 gProtein kWh –1 ). Aufgrund der hohen Kosten für reinen Sauerstoff erwies sich eine Luftanreicherung für ALB als wirtschaftlich nicht machbar. Durch Druckbeaufschlagung des Bioreaktors mit bis zu 0,41 MPa ohne reine Sauerstoffzufuhr wird eine 8,7-fache Steigerung der Wirtschaftlichkeit geschätzt, was das Potenzial dieser innovativen Strategie für aerobe Kulturen zeigt.


Kulturbedingungen und Wachstumsüberwachung

Die Änderung der Kulturbedingungen ist der einfachste Weg, um das Wachstum von zu ändern E coli und wirkt sich direkt auf die volumetrische Ausbeute des rekombinanten Proteins aus. Forscher übersehen oft die Vorteile der Optimierung externer Faktoren (außer der Temperatur der Kultur nach der Induktion). Zuvor haben wir darauf hingewiesen, dass Luria-Bertani (LB) Medium (wohl das beliebteste Medium für den Anbau) E coli) ist bei weitem nicht das geeignetste Medium für die Proteinüberproduktion. 4 Der einfache Wechsel zu reichhaltigeren Brühen (wie Terrific Broth) führt zu höheren Endzelldichten. Auch Autoinduktionsmedien haben an Popularität gewonnen, und viele Beispiele für eine erfolgreiche Proteinproduktion durch Wachstum E coli in Autoinduktionsmedien gibt es in der Literatur zuhauf. Autoinduktionsmedien bestehen aus mindestens zwei Kohlenstoffquellen: Glukose und Laktose (zur Erhöhung der Ausbeute wird auch Glycerin zugesetzt). 62 Glukose ist die bevorzugte Kohlenstoffquelle, und sobald sie aufgebraucht ist (typischerweise während des exponentiellen Wachstums), wird Laktose verbraucht. Dies wiederum induziert die Proteinproduktion aus Systemen, die auf dem lac Promoter. Die Verwendung von Autoinduktionsmedien hat mehrere Vorteile: Es werden höhere Bakteriendichten erreicht, der Zeitpunkt der Induktion ist sehr gut reproduzierbar und ein Stoppen der Kultur für die IPTG-Zugabe ist nicht mehr erforderlich. Briand et al. haben gezeigt, dass Autoinduktion auch durch eine interne Veränderung des Zellstoffwechsels erreicht werden kann. Sie entdeckten zufällig, dass die Produktion von menschlichem Hsp70 in E coli stört irgendwie die Funktion des endogenen Enzyms Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, was indirekt und folglich zur Entfernung von LacI und nachfolgender Expression des interessierenden Gens führt, wenn es unter dem Einfluss eines lac-basierten Promotors steht. 63 Diese Plattform (mit dem Namen SILEX, SElf-ichnducibLe Expression) ermöglicht die Autoinduktion ohne jegliche Mediumsanpassung und funktioniert unter vielen Kulturbedingungen.

Komplexe Medien bieten eine reichliche Verfügbarkeit von Nährstoffen, aber wenig Kontrolle über den Stoffwechselzustand der Zellen in Kultur. Die Proteinproduktion wird durch eine Verringerung der Wachstumsrate begünstigt, sodass das Gleichgewicht zwischen Synthese und Faltung erreicht werden kann. Die Kulturtemperatur ist der einfachste Weg, um die Wachstumsrate zu manipulieren. In großen Bioreaktoren kann die Temperaturkontrolle jedoch die Produktionskosten exponentiell erhöhen, so dass andere Mittel zur Kontrolle der Wachstumsrate verwendet werden. Wir stimmen der Ansicht von Krause et al. dass es eine Diskrepanz zwischen den Prinzipien gibt, die bei der rekombinanten Proteinproduktion in Fed-Batch-Kulturen und Schüttelkolbenkulturen angewendet werden. 64 Bei ersteren werden der Belüftungsgrad und die Geschwindigkeit der Glukosefütterung genau überwacht, da diese Parameter für die Erzielung hoher Erträge von größter Bedeutung sind. Im Labormaßstab wird dies jedoch selten berücksichtigt. Glücklicherweise zeigen Fortschritte in diesem Bereich vielversprechende Ergebnisse, die zu ihrer Annahme führen werden. Zum Beispiel wurde eine kontrollierte Zufuhr von Kohlenstoffquellen in Schüttelkolben durch kontrollierte Freisetzung von Glucose durch ihre Diffusion aus Silikonkügelchen 65 oder in situ-Abbau von Polysacchariden erreicht. 66 Die Sauerstoffverfügbarkeit kann durch geeignetes Kolbendesign 67 oder durch Zugabe nicht mischbarer sauerstoffhaltiger Öle moduliert werden. 68 Schließlich wurden Geräte, die diese und andere Parameter überwachen, für Kulturen in Mikrotiterplatten und Schüttelkolben angepasst, damit die besten Bedingungen für die rekombinante Proteinproduktion gefunden werden können. 69 Da die Überwachung der Kulturbedingungen im Schüttelkolben-Maßstab jedoch spezielle Hardware erfordert, wird sie noch immer nicht weit verbreitet verwendet.

Schließlich könnte Licht bald zu einem weiteren Parameter werden, der während der Kultivierung mit der Einführung von durch blaues Licht induzierbaren T7RNAPs (Opto-T7RNAPs) angepasst werden muss. 70 Zur Herstellung von Opto-T7RNAP wurde die Polymerase in zwei Teile gespalten, die dann jeweils an lichtinduzierbare Dimerisierer fusioniert wurden. Beim Beleuchten der Kultur mit blauem Licht emittierenden LEDs interagieren die Dimerisierer und es wird ein funktionelles T7RNAP erzeugt. Somit wirkt blaues Licht als Ausdrucksmittel. Darüber hinaus dissoziiert Opto-T7RNAP im Dunkeln und ermöglicht so eine dynamische und präzise Kontrolle der Proteinproduktion. Die Blaulicht/Opto-T7RNAP-Systeme können IPTG als Induktor ersetzen, was insbesondere bei Fermentationen im großen Maßstab ein attraktives Merkmal ist.


Produktion, Sammlung und Reinigung von rekombinanten Proteinen

Mehrere Proteine ​​wurden durch Säuger-Expressionsvektoren hergestellt. Die Ausbeute der Proteinsynthese wird in einigen Fällen durch Einfügen eines Introns zwischen dem Promotor und dem klonierten Gen erhöht. Der Grund dafür ist jedoch nicht klar.

Koordinierter Ausdruck:

Durch Koordination der Expression eines klonierten Gens und eines ausgewählten Markers kann die Produktion von rekombinantem Protein gesteigert werden. Die koordinierte Expression von DHFR (Marker) und einem klonierten Gen ist in Abb. 11.5 dargestellt. Das DHFR-Gen wird in der Nähe eines klonierten Gens eingefügt und beide stehen unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors und von Terminations-(Polyadenylierungs-)Sequenzen. Das DHFR-Gen wird von einer Intron-entfernenden Sequenz flankiert. Wenn die Gene exprimiert werden, wird DHFR durch das primäre Transkript synthetisiert, während das rekombinante Protein aus gespleißter mRNA gebildet wird.

Expression von zwei geklonten Genen:

Einige Proteine ​​bestehen aus zwei oder mehr Untereinheiten. Hämoglobin ist beispielsweise ein Tetramer mit zwei Kopien jeder Untereinheit, d. h. α2β2. Jede Untereinheit kann durch das entsprechende klonierte Gen separat synthetisiert werden, und sie werden dann gemischt, um das multimere Protein in vitro zu bilden. Dieses Verfahren ist nicht sehr zufriedenstellend, da der in vitro-Zusammenbau multimerer Proteine ​​nicht effizient ist. In den letzten Jahren wurden Techniken entwickelt, um zwei verschiedene Proteine ​​(d. h. Untereinheiten eines multimeren Proteins) gleichzeitig in derselben Zelle zu produzieren.

Zwei-Vektor-Expressionssystem:

Zwei Expressionsvektoren, von denen jeder ein kloniertes Gen für jede Untereinheit trägt, werden in Wirtszellen cotransfiziert (Abb. 11.6). Diese Gene kodieren für die entsprechenden Proteinuntereinheiten. Sie fügen sich dann zu einem funktionellen Protein zusammen. Das Zwei-Vektor-Expressionssystem hat bestimmte Einschränkungen – Verlust eines Vektors, Überexpression des klonierten Gens in einem der Vektoren. Dies führt zu einem Ungleichgewicht bei der Bildung und Montage von Untereinheiten.

Zwei-Gen-Expressionsvektor:

Ein einzelner Vektor, der zwei klonierte Gene trägt, wird verwendet, um das obige Problem zu überwinden. Die beiden Gene können unter die unabhängige Kontrolle von Promotoren und Polyadenylierungssequenzen gestellt werden (Abb. 11.7), um das zusammengesetzte Protein mit zwei Untereinheiten herzustellen. Dieses Verfahren gewährleistet jedoch nicht die Produktion gleicher Mengen von zwei Untereinheiten.

Dicistronischer Expressionsvektor:

Ein dicistronischer Vektor kann mit zwei klonierten Genen konstruiert werden, die zu einer kleinen DNA-Sequenz verbunden sind, die eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) enthält. IRESs, die in Säugerviren gefunden werden, ermöglichen eine gleichzeitige Transkription und Translation, um das zusammengesetzte Protein zu produzieren (Abb. 11.8). Die Transkription von Gen-IRES-Gen wird von einem einzigen Promotor und Terminationssignalen kontrolliert. Durch Verwendung eines dicistronischen Expressionsvektors kann die Synthese gleicher Mengen der Proteinuntereinheiten erreicht werden.

Sammlung und Reinigung rekombinanter Proteine:

Wenn die rekombinanten Proteine ​​von den klonierten Genen produziert werden, beginnen sie sich zu akkumulieren. Die nächste Aufgabe besteht darin, das spezifische Genprodukt, d. h. das erforderliche Protein, zu sammeln und zu reinigen. Dies ist keine leichte Aufgabe, da das rekombinante Protein oft fremd für die Wirtszelle ist, die eine Enzymmaschinerie besitzt, um die äußeren Proteine ​​abzubauen.

Somit kann Humaninsulin, das in den bakteriellen Wirtszellen produziert wird, durch die Proteasen abgebaut werden. Dieses Problem kann durch die Verwendung von Bakterienstämmen (z. B. E. coli) mit Mangel an Proteasen gelöst werden. Es gibt jedoch einen Nachteil, da die Proteasen Abwehrenzyme sind und daher die neuen Stämme, denen diese Enzyme fehlen, leicht zerstört werden können.

Bei einem alternativen Ansatz werden die rekombinanten Proteine ​​mit den nativen Wirtsproteinen fusioniert. Die Fusionsproteine ​​sind resistent gegen Proteaseaktivität. Manchmal reichern sich Fremdproteine ​​als Aggregate im Wirtsorganismus an, wodurch der Proteaseabbau minimiert wird. Das Problem bei Proteinaggregaten besteht darin, dass die biologische Aktivität verloren gehen kann, während das Protein aus den Aggregaten extrahiert wird.

Export und Sekretion rekombinanter Proteine:

Die Produktionsausbeute rekombinanter Proteine ​​ist effizient, wenn sie schnell exportiert und in die Umgebung (Umgebungsmedium) sezerniert werden. Außerdem ist die Gewinnung und Reinigung von Fremdproteinen aus den exportierten Proteinen einfacher. Es wurden ernsthafte Anstrengungen unternommen, um Verfahren zur Erhöhung des Exports von rekombinanten Proteinen zu entwickeln.

Einige der Spezies des Bakteriums, Bacillus subtilis, sezernieren normalerweise große Mengen extrazellulärer Proteine. Eine kurze DNA-Sequenz, die als Signalsequenz von solchen Arten bezeichnet wird, wird in andere B. subtilis eingeführt. Diese Bakterien produzieren rekombinante DNA, die mit einem Signalpeptid markiert ist, das den Export und die Sekretion fördert (Abb. 11.9). Das Signalpeptid kann nach Reinigung von Fremdprotein entfernt werden.

Signalsequenz und Signalpeptid wurden tatsächlich effektiv für die Produktion von rekombinantem Insulin verwendet.

Reinigung rekombinanter Proteine:

Zur Reinigung rekombinanter Proteine ​​aus einer Mischung sekretierter Proteine ​​werden verschiedene Techniken verwendet.

Fusionsproteine ​​und Aufreinigung:

Die Herstellung von Fusionsprotein wurde beschrieben. Neben der Reduzierung des Abbaus vereinfachen Fusionsproteine ​​die Reinigung rekombinanter Proteine. Nachfolgend werden einige Reinigungstechniken kurz diskutiert.

Affinitäts-Tagging:

Bei dieser Technik wird eine kleine DNA-Sequenz, die für ein Peptid (eine kurze Aminosäuresequenz) kodiert, an das klonierte Gen ligiert. Dieses Peptid wiederum hat eine Affinität, an eine Verbindung oder ein Makromolekül oder sogar ein Element zu binden. Die markierte Aminosäuresequenz, die einen Teil des rekombinanten Proteins bildet, fungiert als Affinitäts-Tag oder Identifikations-Tag. Die Verwendung des Hexahistidin-Tags wird in der nächsten Spalte kurz beschrieben.

Die DNA-Sequenz, die für sechs Histidinreste kodiert (His6) wird an ein kloniertes Gen ligiert. Das Fusionsprotein (d. h. mit His . markiertes rekombinantes Protein6) kann isoliert werden, indem das Zellextraktgemisch durch eine mit Nickel-Triessigsäure-Agarosekügelchen gepackte Säule geleitet wird.

Das gewünschte rekombinante Protein bindet über seine Hexahistidinreste an die Nickelionen (Ni 2+ ). Der Rest der Proteine ​​kann leicht von der Säule eluiert werden. Die gebundenen Fusionsproteine ​​können dann durch Absenken des pH-Wertes der Pufferlösung eluiert werden. Alternativ können die Fusionsproteine ​​durch Bindung des Heaxahistidin-Tags an eine Konkurrenzverbindung wie Imidazol selektiv entfernt werden.

Der nächste Schritt besteht darin, das Hexahistidin-Tag zu entfernen. Dies kann durch Verdau mit Proteasen erfolgen, die spezifisch an der Stelle des Tags wirken. Es besteht nur dann die Notwendigkeit, Hexahistidinreste zu entfernen, wenn das rekombinante Protein als therapeutisches Mittel verwendet wird. Für alle anderen Zwecke ist Hexahistidin-Tag akzeptabel, da es die normale Struktur und Funktion der Proteine ​​nicht stört.

Immunaffinitätsreinigung:

Die immunaffinitätschromatographische Reinigungstechnik von Fusionsproteinen unter besonderer Bezugnahme auf humanes Interleukin-2 wird beschrieben. Das Interleukin-2-Gen, das mit einer kleinen DNA-Sequenz verbunden ist, die für ein Markerpeptid kodiert (das 8 Aminosäuren synthetisiert, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), erzeugt ein Fusionsprotein in Hefe (S. cerevisiae). Das Markerpeptid hat eine Doppelfunktion – es reduziert den Abbau von Interleukin-2 und hilft bei seiner Reinigung.

Das an ein Markerpeptid gebundene Fusionsprotein Interleukin-2 kann durch Immunoaffinitätschromatographie gereinigt werden (Abb. 11.10). Die spezifischen monoklonalen Antikörper (MAb) gegen das Markerpeptid sind auf einem Polypropylenträger immobilisiert. Diese MAb dienen als Ligand (Anti-Marker-Peptid-Antikörper) und binden selektiv an mit Marker-Peptid markierte Fusionsproteine. Die restlichen Proteine ​​passieren jedoch die Immunaffinitätssäule. Die immungereinigten Fusionsproteine ​​können später von der Säule eluiert werden.


7 Schritte zur Herstellung einer rekombinanten DNA

Die folgenden Punkte heben die sieben Schritte hervor, die bei der Herstellung einer rekombinanten DNA beteiligt sind. Die Schritte sind: 1. Auswahl der Ziel-DNA 2. Auswahl einer geeigneten Klonierungsvektor-DNA oder Vehikel-DNA 3. Auswahl von Restriktionsendonukleasen 4. Verfahren zur Herstellung von rekombinanter DNA (rDNA) 5. Einführung der rDNA in eine Wirtszelle 6. Auswahl der transformierten/transfizierten Zellen und 7. Isolierung der Zelle, die die Insert-Vektor-rDNA enthält, die das interessierende Gen enthält

Schritt # 1. Auswahl der Ziel-DNA:

Die Ziel-DNA wird unter Berücksichtigung der folgenden Punkte ausgewählt:

(a) Es sollte leicht aus seiner natürlichen Existenzquelle extrahiert werden können.

(b) Es sollte in den Vektor an einer solchen Stelle eingebaut werden können, wo es wie gewünscht repliziert, transkribiert und translatiert werden kann.

(c) Das produzierte Genprodukt (Protein) sollte entweder kommerziell wichtig oder für Forschungszwecke wichtig sein.

(d) Die interessierende fremde DNA (Gen) kann viral, bakteriell, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein.

Die Gene für die folgenden Proteine ​​werden im Allgemeinen kloniert, d. h. in die Vektor-DNA eingefügt, und die rekombinanten DNAs werden hergestellt und das Protein für den menschlichen Gebrauch extrahiert.

Schritt # 2. Auswahl einer geeigneten Klonierungsvektor-DNA oder Vehikel-DNA:

Der Klonierungsvektor ist das DNA-Molekül, in das die Ziel-DNA eingeführt wird, wodurch das rekombinante DNA-Molekül entsteht. Ein gutes Klonierungsvehikel ist eines, das nur eine einzige Stelle zum Schneiden durch eine bestimmte Restriktionsendonuklease aufweist. Es gibt verschiedene Arten von Vektoren, die verwendet werden können, um Fragmente fremder DNA zu klonieren und sie in einem geeigneten Wirt zu vermehren (zu klonen).

Plasmid:

Dies sind extrachromosomale genetische Elemente, die in einer Vielzahl von Bakterienarten vorkommen. Sie sind doppelsträngige, geschlossene zirkuläre DNA-Moleküle mit einer Größe von 1 kb bis 200 kb. Plasmide enthalten oft Gene, die für Enzyme kodieren, die unter Umständen für den bakteriellen Wirt von Vorteil sind.

Die von verschiedenen Plasmiden verliehenen Phänotypen sind:

ich. Resistenz gegen Antibiotika.

ii. Produktion von Antibiotika.

iii. Abbau komplexer organischer Verbindungen.

NS. Produktion von Colicinen.

v. Produktion von Enterotoxinen.

vi. Herstellung von Restriktions- und Modifikationsenzymen.

Um als Klonierungsvektor nützlich zu sein, sollte das Plasmid mehrere Eigenschaften besitzen, wie:

ich. Es sollte einen oder mehrere selektierbare Marker tragen, um die Identifizierung von Transformanten zu ermöglichen und das Plasmid in der Bakterienpopulation zu erhalten.

ii. Es sollte eine einzelne Erkennungsstelle für ein oder mehrere Restriktionsenzyme in den Regionen des Plasmids enthalten, die für die Replikation nicht essentiell sind.

iii. Es sollte relativ klein sein und sich entspannt replizieren.

NS. Vorzugsweise sollten sich diese Restriktionsstellen, in die Fremd-DNA inseriert werden kann, innerhalb der für selektive Marker kodierenden Gene befinden, so dass die Insertion eines Fremd-DNA-Fragments das Gen inaktiviert.

Einige häufig verwendete Plasmide als Vektoren zur Herstellung rekombinanter DNA sind-pMB-9, pBR-322, pBR-325, pKC-7, pAC-4, C-184, pAC-105, pMK-16, pMF-3, pBRH1, pUB-110 und pCB-16.

Bakteriophagen:

Bakteriophagen werden allgemein als Phagen bezeichnet. Sie sind die Viren, die Bakterien infizieren. Ähnlich wie andere Viren sind die Phagen sehr einfach und enthalten eine Proteinhülle namens Kapsid, die als Genom DNA- oder RNA-Moleküle einschließt. Die Gene in diesem Genom umfassen das Replikationsgen für DNA/RNA des Phagen und das Gen für die Proteinhülle.

Bakteriophage Lambda (λ):

Die Infektion wird durch das Phagenpartikel verursacht, indem es das Bakterium von außen angreift und sein DNA-Chromosom in die Zelle injiziert. Diese DNA, etwa 50 kb, linear-doppelsträngig, mit einzelsträngigen komplementären Enden von 12 Nukleotiden Länge (kohäsive Enden), wird in der Wirtszelle durch Paarung von kohäsiven Enden kreisförmig angeordnet und während der frühen Phase als zirkuläres Molekül transkribiert der Infektion. Während dieser Phase kann der Phagen entweder eine lytische Phase oder eine lysogene Phase annehmen.

Während der lytischen Phase bleibt die Phagen-DNA in der Zelle unabhängig, repliziert, kodiert für Kapsidproteine ​​und bildet innerhalb der Zelle eine Vielzahl von Phagenpartikeln, was zur Lyse (Bruch) der Bakterienzelle und damit zur Freisetzung des Phagenpartikels führt. Im Laufe der lysogenen Phase wird die Phagen-DNA in das Bakterienchromosom eingebaut und existiert so für zahlreiche Zellteilungen, wobei sie Kapsidkomponenten synthetisiert und gelegentlich Phagenpartikel freisetzt. Diese kann jederzeit in die lytische Phase übergehen.

Bakteriophage M13:

Es ist ein sehr kleiner, einzelsträngiger DNA-Phagen von 10 Kb. Die Injektion eines M13-DNA-Moleküls in einen E. coli erfolgt über den Pilus, also die Struktur, die zwei Zellen während der sexuellen Konjugation verbindet. Innerhalb der Zelle synthetisiert die DNA einen komplementären Strang und wird zum doppelsträngigen Zwischenprodukt, das als replikative Form (RF) bekannt ist.

Der ursprüngliche Strang ist (+)-Strang und der komplementäre Strang ist der (-)-Strang, der in den Bakterien hergestellt wird. Nur der (+)-Strang wird in die neuen Phagenhüllen verpackt. RF von Ml3 wirkt wie ein Plasmid, das leicht aus E. coli-Zellen gewonnen und für die rDNA-Technologie verwendet werden kann. Einige der M13-Vektoren sind M13 mp2, M13 mp5, fdl01, fdl07, fd-tet.

Kosmide:

Cosmid ist ein Klonierungsvektor, der aus der Lambda-cos-Stelle (einzelsträngige kohäsive Verlängerungen an den Enden des DNA-Moleküls) besteht, die in ein Plasmid eingefügt ist, das verwendet wird, um DNA-Fragmente mit einer Größe von bis zu 40 Kb zu klonieren. Die maximale Größe der DNA, die in ein beliebiges Plasmid eingeführt werden kann, beträgt 5 kb und die des Bakteriophagen M13 beträgt weniger als 3 kb.

Daher wird es schwierig, große Gene einzufügen und zu klonen, insbesondere die von eukaryontischer DNA. Ex. Das Alpha-2-Kollagen-Gen des Huhns ist 38 Kb groß. Daher wurde das Lambda-Genom des Bakteriophagen 1978 von Collins und John modifiziert, indem einige Basen entfernt und einzelsträngige komplementäre Verlängerungssequenzen an den Enden seines DNA-Moleküls, der Lambda-Cos-Stelle, eingeführt wurden, um die Insertion und Klonierung großer DNA-Moleküle zu erleichtern.

Aufgrund ihrer Fähigkeit, große DNAs zu halten, werden Cosmide verwendet, um eine genomische Bibliothek aufzubauen, d. h. einen Satz rekombinanter Gene, die die gesamte DNA enthalten, die in einem individuellen Organismus vorhanden ist. Die Konstruktion von Bibliotheken in Bakteriophagen-X-Vektoren hat sich als wirksames Mittel zur Isolierung von DNA-Abschnitten aus komplexen eukaryontischen Genomen erwiesen.

Cosmide werden identifiziert durch:

1. Ein Arzneimittelresistenzmarker und ein Plasmid-Replikationsursprung.

2. Eine oder mehrere einzigartige Restriktionsschnittstellen zum Klonen.

3. Ein DNA-Fragment, das die ligierten kohäsiven Enden (cos-Stelle) für den Bakteriophagen X trägt.

4. Kleine Größe, um die eukaryontischen DNA-Fragmente mit einer Länge von 40-45 kb aufzunehmen.

Schritt # 3. Auswahl von Restriktionsendonukleasen:

Sie sind Endonukleasen (Enzyme), die DNA-Moleküle nur an einer begrenzten Anzahl spezifischer Nukleotidsequenzen schneiden, die unmethylierte Palindrome sind. Die Wirkung einiger Endonukleasen ergibt DNA-Fragmente mit klebrigen/kohäsiven Enden, während andere DNA-Fragmente mit glatten Enden ergeben. In der Abbildung sind einige Restriktionsendonukleasen gezeigt.

Schritt # 4. Verfahren zur Herstellung von rekombinanter DNA (rDNA):

(a) Herstellung von Klonierungsvektor-insert DNA-Konstrukten:

Die Ziel-DNA wird aus dem Ausgangsorganismus, der entweder ein Bakterium, ein Pilz, eine Pflanzen- oder eine tierische Zell-DNA sein kann, durch verschiedene analytische Verfahren extrahiert, wobei die Zellen zuerst aufgebrochen werden, um den Inhalt entweder durch mechanisches Aufbrechen (Zerkleinern von gefrorenem Material) oder . freizusetzen durch die Verwendung von Chemikalien wie Lysozym, EDTA, Detergens-Natriumdodecylsulfat (SDS) usw., entweder allein oder in Kombination mit einer oder mehreren Chemikalien.

Anschließend wird die DNA aus dem Zellextrakt gereinigt, wobei der Extrakt mit Proteasen und Endonukleasen behandelt und anschließend die Proteine ​​mit Phenol und Chloroform ausgefällt und schließlich zentrifugiert werden. Die DNA wird in einem Spektrophotometer bei 260 nm gemessen, bei dieser Wellenlänge wird die Extinktion (A260) von 1,0 entspricht 50 pg doppelsträngiger DNA/ml.

Diese Ultraviolett-Absorption kann auch verwendet werden, um die Reinheit einer DNA zu überprüfen, wobei das Verhältnis der DNA-Absorption bei 260 nm und 280 nm (A260/EIN280) ist 1,8. Ein Verhältnis von weniger als 1,8 zeigt an, dass das Präparat entweder mit Protein oder Phenol verunreinigt ist. Ein ähnliches Verfahren wird befolgt, um die DNA aus den Vektoren zu extrahieren. The target DNA is then inserted into the vector DNA, by various procedures.

Two of them are described below:

(i) rDNA formation by the use of restriction endonuclease creating sticky ends:

To join together two duplex DNAs from different species, the two DNAs are separately acted upon by the same restriction endonuclease (BamHI) giving staggered (cohesive/sticky) two stranded cut. Therefore the staggered ends of the two DNAs will be complementary in sequence. Then the two cut DNAs are heated, mixed and cooled, so the sticky ends will base-pair to produce a new kind of recombinant DNA which is joined by DNA ligase.

(ii) rDNA formation by use of restriction endonuclease creating blunt ends:

Both the target DNA and the vector DNA are acted Upon by the same restriction endonuclease (Haelll) producing blunt ends. Poly ‘G’ tails are added at the 3′ ends on both strands of the target duplex DNA and poly ‘C’ tails at the 3′ end of the vector DNA by the use of enzyme terminal transferase. Since these two added tails are complementary to each other, they will enable the two DNAs to be paired with the created cohesive ends upon heating and cooling. The nicks are joined by the enzyme ligase.

(b) Preparation of Complementary DNA (cDNA):

It is a cloning technique which involves the con­version of purified mRNA to DNA, prior to its insertion into a vector. Depending upon the source of mRNA its purification procedure varies and in fact many methods for purification of mRNA are avail­able.

The mRNA of interest i.e. beta-globin gene mRNA is obtained by lysing the reticulocytes and the polyribosomes are collected by centrifugation and treated with antibody specific for this protein. The antibody will attach to the just complete protein on the polyribosome and precipitate it. From this precipitate the mRNA is obtained by affinity column chromatography.

The mRNA obtained so, is used as a template and a complementary DNA (cDNA) is made with the enzyme reverse transcriptase. All eukaryotic mRNAs contain poly ‘A’ tails at the 3′ end. Therefore a poly T nucleotide is added, which base pairs with the poly ‘A’ tail of mRNA. This serves as the primer for the enzyme reverse transcriptase that now tran­scribes the mRNA to make a new complementary strand of cDNA.

The mRNA is then removed and the single stranded cDNA is now replicated by DNA polymerase-I to yield a ‘hairpin’ double stranded DNA. The hair pin and poly A & T tails are cleaved by nucleases. Thus a synthetic double stranded cDNA, specific for the protein beta-globin is produced.

The complimentary DNA prepared above is inserted into a vector (plasmid, phage-DNA etc.). For insertion, a poly ‘A’ tail is added to the opposite 3′ ends of the two strands of the duplex cDNA by terminal transferase. Then the plasmid or vector is opened at a single point to yield the linear DNA by the action of restriction endonuclease producing flush/blunt ends.

Conversely, poly ‘T’ tails are attached to the two 3′ ends of the linear plasmid vector. The tailed linear plasmid and the tailed DNA are allowed to undergo base pairing by heating, mixing and cooling, thereby forming an enlarged circular plasmid containing the new gene i.e. the rDNA. The ends are joined by ligase.

(c) Construction of a DNA Probe:

If the amino acid sequence of a protein/peptide is known then a DNA probe can be chemically synthesized and used to prepare a rDNA and thus clone it in a suitable host. This DNA probe can also be used to screen the gene for this particular protein/peptide in the genomic library.

The DNA probe obtained by this method is not the exact sequence as present naturally in the genomic DNA, because the genetic code is degenerate i.e. more than one codon exists for some of the amino acids. Hence all the possible coding sequences for a given amino acid sequence have to be prepared.

Supposing the following is the amino acid sequence of a part of a peptide:

The nucleotide sequence obtained in any one of the mentioned sequences above, will serve the purpose of formation of rDNA and it’s cloning, resulting in the production of the same desired protein/peptide.

Schritt # 5. Introduction of the rDNA into a Host Cell:

The rDNA produced in the 4 th step above can be cloned (made into many copies) and/or its gene product expressed by introducing it into a suitable host. Various methods are adopted for introduction of the different vectors into different hosts. Any DNA molecule can be introduced into any living cell and the process is called transformation. Transfection is a process of introduction of purified phage DNA.

(a) When the DNA molecule is kept in close proximity of bacterial cells, most species of bacteria are able to take up DNA molecules from the medium without any difficulty.

(b) Some species of bacteria cannot take DNA easily hence they have to be treated physically and/ or chemically in order to make them competent to take up DNA molecules.

(c) E. coli cells incubated with ice-cold solution of 50 mM calcium chloride at 4°C for 30 minutes, become competent to take up DNA molecules, wherein the DNA molecules get attached to the cell exterior. Later the DNA molecules enter the cell upon incubation at 42°C for 2 minutes.

(d) Even after the above mentioned physical/and/or chemical treatment, only 0.01% of the bacterial cells in the same culture gets transformed. Hence the transformed cells have to be selected from non-transformed cells.

(e) Transfection of phage DNA into bacterial cells is also done by the same procedure as that of plasmid introduction into E. coli cells, described above (a) to (d).

(f) Transfection can also be done by packaging the phage DNA into the mature lambda phage particle and then infecting the bacterial cells with it.

(g) The yeast cells of Saccharomyces cerevisiae are transformed by treatment with lithium chloride or lithium acetate.

(h) Calcium phosphate, DEAE dextran and protoplast fusion are used to introduce DNA into the ani­mal cells.

(i) The cell wall of fungal and plant cells are broken by enzymes to get the intact protoplast, which can easily take up DNA. In some cases, the transformation of protoplast is stimulated by a special technique called electroporation. The transformed protoplast reforms the cell wall, divide and regenerate a transformed organism.

(j) An alternative method of introducing any DNA into any of the living cells is by microinjection, using a fine syringe, DNA molecules are directly injected into the nucleus of the cell to be transformed.

Schritt # 6. Selection of the Transformed/Transfected Cells:

All the cells, incubated in the same culture with the rDNA do not take up the DNA even after physical and/or chemical treatment. Only 0.01% of the total cells incubated becomes competent and takes up DNA to be inserted. Rest of the cells remain without taking up the DNA. Therefore there should be some procedure by which the cells that have taken up the external DNA can be sorted out from those cells which have not taken up the external DNA.

There are various methods for distinguishing the transformed cells from the non-transformed cells, which depends upon the type of vector used and the type of the cell transformed. The basic principle in all these methods is the use of a ‘marker’ i.e. either the vector or the transformed cell will either be resistant or sensitive to an antibiotic and/or will synthesize or be devoid of an enzyme acting on a metabolite and converting it into some recognizable product. Thus the ‘markers’ are the antibiotics and/or enzymes to which the transformed cells respond.

One of the example based on which all the above phenotypic markers are selected, is that of the plasmid cloning vector pBR322. E. coli cells are normally sensitive to the antibiotic ampicillin and tetracycline i.e. they die if the medium in which they are grown is supplied with these antibiotics.

E. coli cells which take up the plasmid vector pBR 322 become resistant to ampicillin and tetracycline antibiotics because pBR 322 has two sets of genes, one set of gene that codes for P-lactamase enzyme that modifies ampicillin into a form that is non-toxic to the bacterium and a different set of genes that codes for enzymes that detoxify tetracycline.

So, those E. coli cells which have taken pBR322 (i.e. transformed cells) can be sorted out from the cells which have not taken pBR322 (i.e. non-transformed cells) by growing all the cells in medium containing ampicillin and tetracycline wherein the cells containing the plasmid pBR322, survive, whereas the cells devoid of pBR322 die.

This is to say that the E. coli cells have transformed from ampicillin and tetracycline sensitive (amp s -tet s ) to ampicillin and tetracycline resistant (amp R -tet R ) cells. rDNA prepared using the plasmid pBR322, when entered into an E. coli cell exhibits only ampicillin resistance but not tetracycline resistance, because the restriction endonuclease (Bam-II) used, cleaves pBR322 in the gene for tetracycline resistance, hence this gene gets inactivated.

Schritt # 7. Isolation of the Cell Containing Insert-vector rDNA Holding the Gene of Interest:

In the 6 th step the transformed cells i.e. those cells that have taken up the rDNA are sorted out. Now from these cells the cell containing the gene of interest has to be isolated. The complete human genomic DNA is cleaved into about 7,00,000 pieces by the action of the restriction endonuclease and all of these DNA fragments can be inserted into a cosmid and such an insert containing all the genomic DNA of an organism is called genomic library.

An E. coli genomic library contains all E. coli genes and likewise human genomic library contains all human genes, so on and so forth. From this gene library any one gene, which is commercially important i.e. for example insulin gene, beta-globin gene, growth hormone gene etc., has to be isolated. For this each cell is cloned separately and different procedures are adopted to select the desired clone.

All these procedures are based on two basic themes:

1. Direct Selection of the Desired Gene:

This is just like marker selection procedure, described above, where selection occurs directly in the culture plate itself by the detection of the presence of the protein product of that gene.

2. Identification of the Clone from a Genomic Library:

In this an initial “shot gun” cloning is done to clone all the genes in the genomic library and each gene clone is identified separately by one of the following methods:

(a) By analysing the expression of the gene product.

(b) A DNA probe can be synthesized chemically with a complementary sequence to the desired gene and used to hybridize the DNA from each clone.

(c) A complementary DNA (cDNA) can be prepared from mRNA for a particular gene and then hybridized with the DNA insert.

Hybridization of DNA with another DNA can be done or DNA with RNA or RNA can be hybrid­ized with another RNA, for which different methods are developed.

A few among them are:

ich. When DNA-DNA hybridization is made then it is known as southern blotting.

ii. When DNA-RNA hybridization occurs, it is known as northern blot.

iii. When RNA-RNA hybridization occurs, it can be called eastern blot. Actually eastern blot is named for hybridization between protein and ginseng (plant glycoside) so as to identify small molecules like cholesterol, phospholipids etc.

NS. When protein-protein hybridization takes place, it is known as western blotting.

Southern and northern blot hybridization:

DNA is fragmented by restriction endonuclease and then separated by electrophoresis. The DNA is then denatured and filtered on nitrocellulose. To this filter is added radio labelled 32 P-DNA probe, with base sequence complementary to the DNA (gene) of interest, which will hybridize (stick/base pair/anneal) to the complementary DNA. The position of hybridization is detected by autoradiography. The radiolabelled probe specific for gene under study can be purified RNA, a cDNA, or a segment of DNA cloned in E. coli.

In AIDS diagnosis, the component protein of HIV-virus are separated in polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and trans blotted onto nitrocellulose strips, which are then incubated with individual’s serum. Any HIV antibodies present, bind to viral proteins contained on test strip. The bound antibody visualized by using a conjugate enzyme and chromogenic.

Dot-blot hybridization:

The procedure is the same as southern/northern blotting, but the only difference is that the DNA fragments are not separated by electrophoresis, instead they are directly applied as a dot on nitrocellulose and hence it is known as dot-blot hybridization.

Uses of rDNA technology/gene cloning:

The uses of rDNA technology/gene cloning are enormous and wide spread in all the fields of biological sciences. rDNA technology is being implemented in newer and newer fields of application.

To quote a few uses of rDNA in use at present are:

(1) By the use of rDNA technology, genes of interest can be inserted, so as to treat various diseases.

(2) Hereditary diseases can be diagnosed in the fetus itself.

(3) rDNA and gene cloning helps in the sequencing of DNA/gene.

(4) Various genes in the chromosomes can be located and the integrated viral genes can be traced out in it.

(5) Mechanism of gene regulation can be studied.

(6) Desired proteins like insulin, hormones, interferon’s, vitamins can be manufactured in bacteria on an industrial basis.

(7) Improved antibiotics can be produced from mixtures of genes from different bacteria.

(8) Recombinant vaccines can be produced by rDNA technology.

Synthesis of human insulin (humulin) using rDNA technology:

Diabetic patients, whose elevated sugar levels are due to impaired insulin production, have been treated with insulin derived from the pancreatic glands of abattoir animals. Though bovine and porcine insulin are similar to human insulin, their composition is slightly different. Consequently, a number of patients’ immune systems produce antibodies against it, neutralizing its actions and resulting in inflammatory responses at injection sites.

This led to synthesizing human insulin i.e. ‘humulin’ by inserting the insulin gene into a suitable vector, the E. coli bacterial cell, to produce insulin that is chemically identical to its naturally produced counter­part. The genetic code for insulin is found in the DNA at the top of the short arm of the eleventh chromosome. It contains 153 nitrogen bases (63 in the chain A and 90 in the chain B).

Manufacturing humulin:

DNA with specific nucleotide sequences for A and B polypeptide chains of insulin are synthesized chemically. 63 nucleotides are required for synthesizing the chain A and 90 for the B chain, plus a codon at the end of each chain, signalling the termination of protein synthesis.

An anticodon, incorporating the amino acid methionine, is then placed at the beginning of each chain which allows the removal of the insulin protein from the bacterial cell’s amino acids. The synthetic A and B chain ‘genes’ are then separately inserted into the gene for a bacterial enzyme β-galactosidase, which is carried in the vector’s plasmid. Insertion of the A gene is carried out by use of the restriction enzyme EcoRl and for B gene Hind-III is used. The recombinant plasmids are then introduced into E. coli cells. The insulin gene is expressed as it replicates with the P-galactosidase as the cell multiplies.


Mitgliedschaften

UC Davis Genome Center, University of California, Davis, USA

Martin Dragosits & Ilias Tagkopoulos

Department of Biomedical Engineering, University of California, Davis, USA

Department of Computer Science, University of California, Davis, USA

Department of Chemistry, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, Vienna, Austria

Martin Dragosits, Daniel Nicklas & Ilias Tagkopoulos

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