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Wie der Dickdarm der Galle widersteht

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Es gibt eine Krankheit namens Galle Reflux, die den Magen schädigen kann. Ich weiß nur nicht, wie der Magen durch Galle geschädigt werden kann, aber der Dickdarm (Dünndarm) kann damit widerstehen?


Die Sulfatierung des Darms ist zum Schutz vor Kolitis und Dickdarmkarzinogenese unerlässlich

Hintergrund und Ziele: Sulfatierung ist eine Konjugationsreaktion, die für zahlreiche biochemische und zelluläre Funktionen in Säugetieren essentiell ist. Die 3'-Phosphoadenosin 5'-Phosphosulfat (PAPS) Synthase 2 (PAPSS2) ist das Schlüsselenzym zur Erzeugung von PAPS, dem universellen Sulfonatdonor für alle Sulfatierungsreaktionen. Das Ziel dieser Studie war es herauszufinden, ob und wie PAPSS2 eine Rolle bei der Kolitis und der Kolonkarzinogenese spielt.

Methoden: Gewebearrays von menschlichen Darmkrebsproben, Genexpressionsdaten und klinische Merkmale von Krebspatienten wurden analysiert. Darmspezifische Papss2-Knockout-Mäuse (Papss2 ΔIE) wurden erzeugt und einer durch Dextran-Natriumsulfat induzierten Kolitis und Kolonkarzinogenese, die durch eine kombinierte Behandlung von Azoxymethan und Dextrannatriumsulfat oder Azoxymethan allein induziert wurde, ausgesetzt.

Ergebnisse: Die Expression von PAPSS2 ist bei Dickdarmkrebs von Mäusen und Menschen vermindert. Die geringere Expression von PAPSS2 bei Patienten mit Dickdarmkrebs korreliert mit einem schlechteren Überleben. Papss2 ΔIE-Mäuse zeigten eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Kolitis und Dickdarmkrebs, indem sie die Darmschleimhautbarriere schädigten, die Darmpermeabilität und die Bakterieninfiltration erhöhten und die Darmtumor-Mikroumgebung verschlechterten. Mechanistisch zeigten die Papss2 ΔIE-Mäuse einen reduzierten Sulfomucingehalt im Darm. Metabolomische Analysen zeigten die Akkumulation von Gallensäuren, einschließlich des Farnesoid-X-Rezeptor-Antagonisten Gallensäure Tauro-β-Muricholsäure, und einen Mangel in der Bildung von Gallensäuresulfaten im Dickdarm von Papss2 ΔIE-Mäusen.

Schlussfolgerungen: Wir haben eine wichtige Rolle der PAPSS2-vermittelten Sulfatierung bei Kolitis und Kolonkarzinogenese aufgedeckt. Die Sulfatierung des Darms kann einen potentiellen diagnostischen Marker darstellen und PAPSS2 kann als potentielles therapeutisches Ziel für entzündliche Darmerkrankungen und Dickdarmkrebs dienen.

Schlüsselwörter: Kolitis Dickdarmkrebs PAPSS2 Sulfomucin.

Copyright © 2021 AGA Institut. Herausgegeben von Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.


Dickdarm-Bedingungen

  • Kolitis: Entzündung des Dickdarms. Entzündliche Darmerkrankungen oder Infektionen sind die häufigsten Ursachen. : Kleine schwache Bereiche in der Muskelwand des Dickdarms lassen die Dickdarmschleimhaut hervortreten und bilden winzige Beutel, die Divertikel genannt werden. Divertikel verursachen normalerweise keine Probleme, können aber bluten oder sich entzünden oder infizieren. : Wenn sich Divertikel entzünden oder infizieren, kommt es zu einer Divertikulitis. Bauchschmerzen, Fieber und Verstopfung sind häufige Symptome. (Blutung): Mehrere potenzielle Dickdarmprobleme können zu Blutungen führen. Im Stuhl ist eine schnelle Blutung sichtbar, eine sehr langsame Blutung jedoch möglicherweise nicht. : Ein Name für Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa. Beide Erkrankungen können eine Dickdarmentzündung (Kolitis) verursachen. : Eine entzündliche Erkrankung, die normalerweise den Dickdarm und den Darm betrifft. Bauchschmerzen und Durchfall (der blutig sein kann) sind Symptome. : Eine entzündliche Erkrankung, die normalerweise den Dickdarm und das Rektum betrifft. Blutiger Durchfall ist wie Morbus Crohn ein häufiges Symptom der Colitis ulcerosa. : Häufiger, lockerer oder wässriger Stuhl wird im Allgemeinen als Durchfall bezeichnet. Die meisten Durchfälle sind auf selbstlimitierende, leichte Infektionen des Dickdarms oder Dünndarms zurückzuführen. : Die Bakterien Salmonellen können Lebensmittel kontaminieren und den Darm infizieren. Salmonellen verursachen Durchfall und Magenkrämpfe, die normalerweise ohne Behandlung verschwinden. : Das Bakterium Shigella kann Lebensmittel kontaminieren und in den Dickdarm eindringen. Symptome sind Fieber, Magenkrämpfe und Durchfall, der blutig sein kann. : Viele verschiedene Bakterien kontaminieren häufig Wasser oder Lebensmittel in Entwicklungsländern. Weicher Stuhlgang, manchmal mit Übelkeit und Fieber, sind Symptome. : Polypen sind kleine Wucherungen. Einige davon entwickeln sich zu Krebs, aber es dauert lange. Sie zu entfernen kann viele Darmkrebsarten verhindern. : Darmkrebs betrifft jedes Jahr mehr als 100.000 Amerikaner. Die meisten Darmkrebserkrankungen sind durch regelmäßige Vorsorgeuntersuchungen vermeidbar.

Resultate und Diskussionen

Bei aktiven Genen im normalen menschlichen Dickdarm werden zwei verschiedene Klassen von 5hmC-Anreicherungsprofilen beobachtet

Wir machten uns zunächst daran, Gene zu identifizieren, die durch 5hmC im Dickdarm durch hmeDIP-seq markiert wurden, um letztendlich deren Methylierungsschicksal bei Krebs zu verfolgen. Anfängliche hmeDIP-seq auf fünf DNA-Proben von normaler Schleimhaut betroffener Patienten zeigten eine 5hmC-Anreicherung an Promotoren, die an der Transkriptionsstartstelle (TSS) fehlte, im Genkörper reichlich vorhanden und in den intergenischen Regionen unterrepräsentiert war (Abbildung 1a und b).

5hmC-Promotorprofile und ihre Assoziation mit aktiven Genen im normalen Dickdarm. (ein) hmeDIP-seq-Profil für alle Gene rund um das TSS in normalem Dickdarmgewebe (n = 5). (B) Quantifizierung von 5hmC-Anreicherungen in genomischen Merkmalen. (C) Es wurden zwei unterschiedliche Promotorprofile identifiziert. Linkes Feld: hohe 5hmC innerhalb eines Promotorfensters (-1 kb bis +0,5 kb) mit einem „schmalen“ Promotorprofil. Rechtes Panel: hohe 5hmC innerhalb von Genkörpern (vom TSS bis zum TTS) mit einem „breiten“ Promotorprofil. Nachfolgend finden Sie Beispiele für jeden Profiltyp. (D) 5hmC- und CpG-Gehalt im Promotor. Hoher, mittlerer und niedriger CpG-Gehalt (HCP, ICP bzw. LCP). Eingefügte Nummern stellen die Anzahl der Promoter für jede Kategorie dar (LCP-Nummern nicht gezeigt). (e) 5hmC-Gehalt an Promotor-CpG-Inseln. Die Niveaus stellen einen Durchschnitt der Population für jeden Promotortyp dar, daher zeigen einzelne Loci möglicherweise nicht unbedingt das vollständige Profil. Zusätzliche Datei 2 zeigt weitere Beispiele. (F) Expressionsniveaus (log2-Mikroarray-Intensität) von Genen, die mit 5hmC-Promotorprofilen assoziiert sind (P Werte wurden durch einen Wilcox-Test erhalten).

Aus der Profilierung des 5hmC-Gehalts über die Gene hinweg identifizierten wir zwei Arten von Anreicherungen an Genpromotoren (Abbildung 1c). Ein „schmaler“ Typ wurde beobachtet, nachdem der 5hmC-Leseinhalt innerhalb eines Fensters von -1 kb bis +0,5 kb des TSS eingestuft wurde, und ein „breiter“ Typ nach dem Rangieren nach dem 5hmC-Leseinhalt im Genkörper (von TSS bis zum TTS). Wir identifizierten 2.156 eindeutige „schmale“ und 2.199 eindeutige „breite“ Promoter (aufgeführt in Zusatzdatei 1).

Die „engen“ und „breiten“ Profile unterschieden sich hinsichtlich des Promotor-CpG-Gehalts (Abbildung 1d) und der Verteilung von 5hmC um die Promotor-CpG-Inseln (Abbildung 1e). Promotoren mit dem „schmalen“ Profil wurden für Promotoren mit mittlerem CpG-Gehalt (ICP) angereichert, während die „breiten“ Promotoren meist einen hohen CpG-Gehalt aufwiesen (Abbildung 1d). Beide Promotortypen zeigten, dass 5hmC innerhalb der Ufer von Promotor-CpG-Inseln angereichert ist, mehr noch innerhalb der stromaufwärts gelegenen Küste, und einen höheren Gesamtgehalt von 5hmC für den „schmalen“ Typ (Abbildung 1e). Beachten Sie jedoch, dass die Anreicherung von 5hmC im stromabwärts gelegenen Ufer von ACTN2 ist niedriger als das für AGAP1. Die über den Inseln gemessenen Spiegel stellen einen Durchschnitt der Population für jeden Promotortyp dar, und daher zeigen einzelne Loci möglicherweise nicht unbedingt das vollständige Anreicherungsprofil über die assoziierte Promotor-CpG-Insel. Zusätzliche Datei 2 zeigt weitere Beispiele, um dies zu veranschaulichen. Interessanterweise zeigte der Vergleich der 5hmC-Profile mit Illumina-Expressionsarray-Daten aus vier Normalfällen, dass „schmale“ Promotorgene weniger aktiv sind als die „breite“ Typen (Abbildung 1f), in Übereinstimmung mit früheren Korrelationen für einen höheren 5hmC-Gehalt an Promotoren und reduzierte Genaktivität in Maus- und Human-ES-Zellen [41,42]. Biologische Prozesse typisierten auch die 5hmC-Promotor-Genontologiekategorien, die auf die Darmfunktion hinweisen, wurden für den „schmalen“ Typ angereichert, während die Zelldifferenzierung und -entwicklung für den „breiten“ Typ angereichert wurde (Zusatzdatei 2).

Zusammen zeigen diese Daten, dass der Gehalt und die Verteilung von 5hmC innerhalb von Promotoren und Genkörpern mit Genaktivitäten korreliert, die an der normalen Funktion und Differenzierung des Darmepithels beteiligt sind.

Die 5hmC-Anreicherung ähnelt der 5mC-Anreicherung in Genregionen

Als nächstes untersuchten wir den DNA-Methylierungsgehalt in Bezug auf die 5hmC-Profile, indem wir unsere hmeDIP-seq-Daten mit veröffentlichten meDIP-seq-Daten für normales Dickdarmgewebe verglichen [43] (zusätzliche Datei 3). Wir erstellten Heatmaps für 5hmC- und 5mC-Anreicherungsprofile von -3 kb bis +20 kb um den TSS (Zusatzdatei 3a). Basierend auf der Verteilung von 5hmC und 5mC innerhalb dieses Fensters wurden zehn Cluster generiert. Insgesamt stellten wir fest, dass bei beobachteter 5hmC-spezifischer Anreicherung die Anreicherungsprofile für 5mC ähnlich sind (Zusatzdatei 3a). Die Ausnahme war Cluster 2, bei dem es in der Nähe des TSS mehr DNA-Methylierung gab als 5 hmC. Ein weiterer Vergleich der 5hmC- und 5mC-Profile näher am TSS (-3 kb bis +3 kb) aller Loci legt nahe, dass die Unterschiede in den Anreicherungsmustern für 5hmC und 5mC in der Nähe des TSS und der stromaufwärts gelegenen Promotorregion auftreten (zusätzliche Datei 3b). Dies legt nahe, dass mehrere Genpromotoren eine DNA-Methylierung ohne 5 hmC aufweisen können.

Die Heatmaps identifizierten auch die „schmalen“ Promotoren als typisiert durch die Cluster 3 und 8, während die „breiten“ Promotoren in die Cluster 5, 6, 7 und 9 fielen (zusätzliche Datei 3c). Mit Ausnahme der Cluster 2 und 3, die eine Anreicherung für LCP-Promotoren zeigten, fielen die meisten 5hmC/5mC-Cluster mit Promotoren mit mittlerem oder hohem CpG-Gehalt (Zusatzdatei 3e).

Anschließend verglichen wir die meDIP-seq-Methylierungscluster mit den Methylierungsgraden, die von den Infinium27k-Arrays in 17 normalen Proben unserer Patientenkohorte bewertet wurden (Zusatzdatei 3e). Für die in der Heatmap aufgetragenen Loci beträgt der maximale Abstand der Infinium-Sonden zum TSS 1499 bp. Die höchsten Methylierungsniveaus für diese Sonden waren um die in den Clustern 1 und 2 gruppierten Promotoren, die den meDIP-seq-Daten entsprechen, bei denen die höchste Methylierungsanreicherung beobachtet wurde (zusätzliche Datei 3a und e). In ähnlicher Weise hatten die Cluster 4 bis 9, die alle über geringe Mengen an DNA-Methylierung um den TSS durch meDIP-seq berichteten, auch niedrigere DNA-Methylierungsgrade an den entsprechenden Infinium-Sonden (zusätzliche Datei 3a und e).

Somit stimmen die Infinium-Arrays in unserem normalen Dickdarmgewebe mit meDIP-seq-Anreicherungsmustern in der Nähe des TSS der Gene überein.

Reduzierte 5hmC-Spiegel in Dickdarmtumoren korrelieren nicht mit Veränderungen der TET-Transkriptspiegel

Nachdem wir Profile für 5hmC und 5mC im normalen Dickdarm erstellt hatten, analysierten wir als nächstes ihr Verhalten bei Neoplasie. Unsere Kolonkarzinom-Kohorte besteht aus 47 Normalgeweben, 36 Adenomen und 31 Adenokarzinomen (Zusatzdatei 1). Mit Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LCMS) und Immunfluoreszenz (IF) haben wir bestätigt, dass 5hmC und 5mC während der Progression von Dickdarmkrebs global reduziert werden (Abbildung 2a und b). Der IF zeigt auch, dass 5hmC im differenzierten Kolonepithel konzentriert ist und in der Basis der Krypten und Tumoren in Übereinstimmung mit früheren Berichten niedrig ist [21]. Wichtig ist, dass wir beobachtet haben TET1, TET2 und TET3 konsistent in Normal- und Tumorgewebe transkribiert wurden und dass die absoluten Werte von TET1 waren gering im Vergleich zu TET2 und TET3 durch Sybr-Green qRT-PCR (Abbildung 2c). Weitere Analyse von TET Expression in Fällen mit normalem Tumor-matched durch Taqman qRT-PCR zeigte keine Korrelation mit den Veränderungen der globalen 5hmC-Spiegel (Zusätzliche Datei 4). Darüber hinaus weist das Mining kürzlich veröffentlichter Datensätze [31,44] darauf hin, dass TETs sind in normaler Krypta und differenziertem Epithel und Tumoren vorhanden.

Reduzierte 5hmC in Tumoren ohne globale Veränderungen in TET s Transkripte. (ein) Gesamtgehalt von 5hmC und 5mC in normaler (N), Adenom (Ad) und Adenokarzinom (T) DNA durch Massenspektrometrie (P Werte wurden durch einen Wilcox-Test erhalten). (B) Repräsentative Bilder einer Mikroarray-Immunfluoreszenz von Darmkrebsgewebe. Pfeile zeigen das Epithel an, Pfeilspitzen das Stroma. (C) Absolute Werte von TETs (Standardkurvenmethode) in ausgewählten Fällen aus unserer Dickdarmkrebs-Kohorte. Orange vertikale Bänder repräsentieren den Median. Negative Werte zeigen TETs-Transkripte sind weniger häufig als B2M Transkripte. Es gab keine signifikante Veränderung der Konzentrationen zwischen den Geweben, aber eine beträchtliche Variation innerhalb der Gewebe.

Mutationen an den Fe2- und a-KG-Bindungstaschen könnten für eine fehlende TET-Aktivität verantwortlich sein [30], aber diese wurden in unserem Probensatz durch gezielte exonische Sequenzierung (Zusatzdatei 5a und zusätzliche Methoden) gezielt ausgeschlossen. Wir haben an anderer Stelle in den katalytischen Domänen von . nicht-synonyme Mutationen identifiziert TETs, aber ihr Vorhandensein korrelierte nicht mit den Veränderungen der globalen 5hmC-Pegel (Zusatzdatei 5b). Die Reduktion von 5hmC in Tumoren kann auch auf die Hemmung von TETs durch Metaboliten zurückzuführen sein, die durch Mutation von IDH1/2, Fumarathydratase (FH) oder Succinatdehydrogenase (SDH) akkumulieren [39,45]. In unserer Studie wurden IDH1/2-Mutationen in einer Untergruppe von Proben (nicht gezeigt) ausgeschlossen, und neuere größere Studien haben gezeigt, dass IDH1/2-, FH- oder SDH-Mutationen bei Dickdarmkrebs selten sind oder fehlen [31,40].

Wir haben keine TET-Proteindaten, die mit unserem Probensatz verbunden sind, und können daher nicht ausschließen, dass die globale Reduktion von 5hmC auf posttranskriptionelle Ereignisse zurückzuführen ist, die sich auf Variationen in der Stabilität oder Aktivität von TETs auswirken. Der Nachweis von mRNA in ähnlichen Konzentrationen wie in normalen Geweben legt jedoch nahe, dass die reduzierten Konzentrationen von 5hmC, die wir in allen unseren Dickdarmtumoren entdecken, wahrscheinlich nicht auf das Fehlen oder die Mutation von TETs oder eine Hemmung durch derzeit bekannte Onko-Metaboliten zurückzuführen sind.

5hmC wird im gesamten Genom von Tumoren mit geringer Auswirkung auf die Gentranskription reduziert

Wir haben 5hmC in vier übereinstimmenden Adenokarzinomen profiliert. Der hmeDIP-seq-read-Gehalt in Tumoren zeigte eine insgesamt ähnliche Verteilung wie im normalen Gewebe, jedoch mit deutlich reduzierten 5hmC-Spiegeln im gesamten Genom, wie anhand des 5hmC-Gehalts in repetitiven Elementen (Zusatzdatei 6) und innerhalb von Genen (Zusatzdatei 7a und b) bewertet wurde. Der im Vergleich zu normalen reduzierten 5hmC-Spiegel in Tumoren wurde an ausgewählten Loci durch einen glycosylase-restriktionsenzymsensitiven Assay (gluc-MS-qPCR – Zusatzdatei 7c) bestätigt, was darauf hinweist, dass Gene weiterhin durch eine reduzierte Menge von 5hmC in Tumoren markiert sind.

Illumina-Expressionsarray-Daten, die von vier normalen und 14 Tumoren generiert wurden, zeigten eine kleine, aber statistisch signifikante Verringerung der Genaktivität für Gene mit „breiten“ 5hmC-Promotoren (Zusatzdatei 7d). Obwohl 5hmC mit aktiver Gentranskription assoziiert, wurde die Reduktion von 5hmC in Tumoren von sehr kleinen Veränderungen des Expressionsniveaus begleitet. Diese Ergebnisse zeigen, dass Gene, die 5hmC im normalen Dickdarm erwerben, in Tumoren transkriptionell aktiv sind und legen nahe, dass niedrige 5hmC-Spiegel die Transkription nicht behindern.

Im Normalfall mit 5hmC markierte Loci haben eine angeborene Resistenz gegen DNA-Hypermethylierung bei Krebs

Um festzustellen, ob Promotoren, die normalerweise mit 5hmC markiert sind, Veränderungen der DNA-Methylierung bei Dickdarmkrebs erfahren, haben wir die DNA-Methylierung in 17 Tumoren untersucht, die mit dem normalen Gewebe unter Verwendung von Infinium-Methylierungs-Arrays übereinstimmen. Die Infinium27k-Arrays sind eine robuste Plattform für die quantitative Messung des DNA-Methylierungsstatus von 27.578 CpG-Stellen, die sich in den Promotorregionen von 14.495 proteinkodierenden Genen befinden [43,46]. Die Infinium-Technologie basiert auf einer Bisulfit-Umwandlung, die nicht zwischen 5 mC und 5 hmC unterscheidet. 5hmC macht jedoch nur einen kleinen Prozentsatz der modifizierten Cytosine im normalen Dickdarm und einen noch geringeren Anteil im Dickdarmkrebsgewebe aus. Basierend auf den durch LCMS nachgewiesenen Medianwerten von 5 hmC (Abbildung 2) sind wahrscheinlich nur etwa 2,4 % von 5 mC, die in den Infinium-Daten angegeben sind, von 5 hmC in normalen Zellen und etwa 0,7 % in Tumoren nicht zu unterscheiden.

Methylierungsveränderungen in unserer Patientenkohorte zeigten sowohl eine Zunahme als auch einen Verlust der Promotor-DNA-Methylierung (Abbildung 3a). Um unsere Analyse des 5hmC-Gehalts auf Veränderungen der DNA-Methylierung an den von der Infinium-Plattform bewerteten Promotoren zu verfeinern, zählten wir die hmeDIP-seq-Reads von Normalen in 200-bp-Fenstern um die Infinium-Sonden herum (Abbildung 3b). Nach dem Ranking nach gelesenem Inhalt identifizierten wir die Top 3.000 mit 5 hmC angereicherten Loci (5 hmC-hoch) sowie 3.000 Loci, bei denen 5 hmC niedrig oder unentdeckt war (5 hmC-niedrig). Interessanterweise haben wir bei dieser Messung der Read-Counts um die Infinium-Sonden herum beobachtet, dass Promotoren mit hohem 5hmC im Normalzustand entweder resistent gegenüber Methylierungsänderungen sind oder anfällig für Methylierungsverlust sind (79% Verlust gegenüber 21% Gewinn von 676 Sonden mit signifikanter Änderung). von 3.000) und dass 5hmC-markierte Promotoren häufiger mit einer Reihe von mittleren Methylierungsniveaus im Normalfall assoziieren (Abbildung 3c, linkes Feld und d). Niedrige 5hmC-Promotoren waren bei normalen Patienten häufiger mit niedrigen Methylierungsniveaus verbunden und zeigten eine erhöhte Neigung zu einer Methylierungszunahme, obwohl auch ein Methylierungsverlust beobachtet wurde (56% Zunahme gegenüber 44% Verlust bei 379 Sonden mit einer signifikanten Änderung von 3.000) (Abbildung 3c rechte Tafel und d). Wir stellen auch fest, dass die zur Methylierung neigenden Gene, denen 5hmC im normalen Gewebe fehlt, ein niedriges Expressionsniveau im normalen Gewebe aufweisen (Abbildung 3d, rechtes Feld), in Übereinstimmung mit einem kürzlich veröffentlichten Bericht, in dem die Neigung zur Methylierungszunahme in Tumoren häufig bei Promotoren von Gene mit geringer Expression im Normalgewebe [47].

Promotoren, die im normalen Dickdarm mit 5hmC markiert sind, widerstehen der Zunahme der DNA-Methylierung in Tumoren. (ein) Veränderungen der DNA-Methylierung bei Adenokarzinomen (n = 17) im Vergleich zu passenden normalen Geweben (n = 17) (Infinium-Arrays). Jeder Punkt steht für einen CpG (graue Punkte sind Änderungen mit P <0.01). (B) 5hmC Leseinhalt gemessen in Fenstern um die Infinium-Sonden (schwarze Balken). CpG-Insel (CpGi) als oranger Balken. (C) Überlagerung von 5hmC hohen oder 5hmC niedrigen Promotoren auf den Methylierungszuständen. (D) Linkes Feld: 5hmC-Gehalt um die Infinium-Sonden von Promotoren mit einer signifikanten Änderung der Methylierung. Promotoren mit hohem 5hmC neigen in Tumoren zum Verlust der DNA-Methylierung, wohingegen Promotoren mit niedrigem 5hmC in Tumoren zu einer Zunahme der Methylierung neigen (limma geneSetTest). Mittleres Feld: 5 hmC-Gehalt im Normalbereich und DNA-Methylierungsniveau im Normalbereich, um zu zeigen, dass Methylierungszunahme oder -verlust über eine Reihe von Methylierungsniveaus im Normalbereich auftritt (P Werte aus einem Wilcox-Test). Rechtes Feld: 5hmC-Gehalt im Normalzustand und Expressionsniveau im Normalzustand. Gene, die zur DNA-Methylierung neigen (5hmC niedrig) haben eine geringe Expression im normalen Gewebe (P Werte aus einem Wilcox-Test). (e) Heatmap zum Vergleich der 5hmC- und 5mC-Spiegel im Normalzustand mit den 5mC-Veränderungen in Tumoren an ausgewählten Loci.

Wichtig ist, dass das reziproke Muster von hohen/niedrigen 5hmC bei Normal mit Verlust/Zunahme der Methylierung bei Adenokarzinomen bereits in den Adenomstadien vorhanden war (Zusatzdatei 8a und b) und an CpG-Inseln und Inselküsten beobachtet wurde (Zusatzdatei 8c). Dieses reziproke Muster war auch bei zuvor identifizierten Dickdarmkrebs-spezifischen kleinen Regionen der differentiellen DNA-Methylierung (sDMRs) [8] (Zusatzdatei 8d) vorhanden und wurde bei einer Reihe von Dickdarmkrebs-relevanten Genpromotoren eindeutig beobachtet und verifiziert (Abbildung 3e und Zusatzdatei 9).

Zusammen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass mit 5hmC markierte Genpromotoren in normalen Tumoren selten hypermethyliert werden, wenn 5hmC in Tumoren reduziert wird. Tatsächlich neigen diese Promotoren dazu, bei Krebs die DNA-Methylierung zu verlieren. Wir identifizierten auch 117 Promotoren, bei denen 5hmC immer noch in Adenokarzinomen nachgewiesen wurde, wenn auch in sehr geringen Mengen, und stellten fest, dass diese dreimal häufiger die Methylierung verloren als zunehmen (27 % bzw. 8,5 %) (Zusatzdatei 10) . Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass die DNA-Demethylierung an einer Untergruppe der proximalen Promotoren über Hydroxymethylierung vermittelt werden könnte und/oder dass die Anwesenheit von 5hmC dazu beiträgt, DNA-Methylierungskomplexe abzuwehren, wie zuvor vorgeschlagen [48,49].

Es gibt starke Hinweise aus Zellmarkierungsexperimenten, dass Dickdarmkrebs aus dem Stammzell-/Vorläuferkompartiment stammen kann [50]. Unsere Daten und die anderer [21], die zeigen, dass die globalen 5hmC-Spiegel im Stammzellkompartiment und in Krebsgeweben niedrig sind, könnten darauf hindeuten, dass 5hmC bei Dickdarmkrebs nicht verloren geht. Vielmehr kann sich 5hmC aufgrund eines abweichenden Vorläufer-ähnlichen proliferativen Zustands nicht akkumulieren. Eine Erklärung dafür, warum die Loci, die 5hmC bei der terminalen Differenzierung akkumulieren würden, scheinbar resistenter gegen die Zunahme der DNA-Methylierung bei Krebs sind, im Gegensatz zu Loci, die 5hmC nicht akkumulieren, könnte darin bestehen, dass die TETs in Krebszellen an ihre Zielpromotoren gebunden sind verhindern de novo DNA-Methylierung.

TET2 markiert Promotoren in Krebszellen, die der Zunahme der DNA-Methylierung in Primärtumoren widerstehen, aber nicht erforderlich sind, um einen demethylierten Zustand aufrechtzuerhalten

Um zu untersuchen, ob TETs in Krebszellen an DNA gebunden sind, wandten wir uns der Darmkrebszelllinie HCT116 zu. Diese Zelllinie zeigt niedrige globale Werte von 5hmC und TET2 und TET3 Transkriptspiegel vergleichbar mit denen in normalem Gewebe und Adenokarzinomgewebe (Zusatzdatei 11a bis c). Trotz des extrem niedrigen Gesamtgehalts von 5hmC in diesen Zellen, der niedriger ist als der in den primären Geweben, können TET2- und TET3-Proteine ​​in der Kernfraktion nachgewiesen werden (Zusatzdatei 11d), obwohl eine beträchtliche Menge an TET2 im Zytoplasma vorhanden ist (Zusatz Datei 11d und e). Eine ähnliche subzelluläre Verteilung von TET2 wird in normalen Dickdarmkrypten und Tumoren durch Immunhistochemie beobachtet (Zusatzdatei 12).

Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung (ChIP-seq) zeigte, dass TET2 bevorzugt an Genpromotoren innerhalb von 1 kb des TSS bindet (Abbildung 4a und b). Insgesamt wurden 3.144 Promotoren als TET2-Targets identifiziert (Zusatzdatei 1), von denen die große Mehrheit CpG-Insel enthaltende Promotoren des HCP-Typs waren (Abbildung 4c und d). Von TET2 gebundene CpG-Inseln waren weitgehend unmethyliert, wie mit Infinium450k-Arrays (von GSE29290) gemessen wurde, und CpG-Inselküsten zeigten niedrigere Methylierungsgrade an den TET2-gebundenen Stellen im Vergleich zu denen, die nicht von TET2 gebunden wurden (Abbildung 4e). Wir validierten eine Reihe von Loci, die in TET2 ChIP-seq durch ChIP-qPCR identifiziert wurden (Zusatzdatei 13). Interessanterweise ist das Vorhandensein von TET2 mit aktiven Genen assoziiert, gemessen durch Expressionsarrays (GSE36133) oder nachgewiesen durch eine beträchtliche Überlappung mit RNA-Pol2-Bindungsstellen (ENCODE Pol2 ChIP-seq) (Abbildung 4f und g).

TET2 bindet Promotoren aktiver Gene in Krebszellen. (ein) Beispiel für das TET2-Bindungsprofil in HCT116-Kolorektalkrebszellen. (B) TET2 bindet nahe an TSSs und (CD) hauptsächlich an CpG-Inseln innerhalb von HCP-Promotoren. (e) TET2-gebundene Inseln sind größtenteils unmethyliert und (f, g) mit aktiven Genen assoziieren.

Wenn die TETs an DNA binden und in Tumoren vor Hypermethylierung schützen, dann wäre zu erwarten, dass Promotoren, die für einen DNA-Methylierungsgewinn in Dickdarmtumoren anfällig sind, eine eigene Gruppe mit einer minimalen Überlappung mit TET-Zielpromotoren bilden würden. Wir untersuchten daher, ob Loci, die in unseren Primärtumoren eine DNA-Methylierung erhielten (1.597 Sonden für 1.077 Promotoren), wahrscheinlich TET2-Zielpromotoren (4.201 Sonden für 3.144 Promotoren) waren. Diese Analyse zeigte eine Überlappung von weniger als 1% zwischen Loci, die in Tumoren DNA-Methylierung erlangen, und den an TET2 gebundenen Promotoren (Abbildung 5a). Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass TET2 Teil eines Mechanismus sein könnte, der Promotoren vor de novo DNA-Methylierung. Um dies zu untersuchen, haben wir TET2 in HCT116-Zellen durch stabile Transfektion von shRNAs abgereichert (Abbildung 5b und c). In einem Fall verwendeten wir shRNA gegen TET2 allein (TET2C) und in dem anderen shRNA gegen TET2 und TET3 (TET2 + 3, wo TET3-mRNA nicht betroffen war und behandeln diese Probe daher nur als TET2-Knockdown) (Abbildung 5c). LCMS nach TET2-Depletion zeigte eine deutliche Verringerung des globalen 5hmC-Spiegels (Abbildung 5d), was die TET2-Oxygenase-Aktivität in HCT116 bestätigte, ohne Veränderungen der globalen 5mC-Werte (Abbildung 5d), aber dies könnte auf den geringen Beitrag der Promotor-Methylierung zu zurückzuführen sein das Methylom. Infinium-Arrays identifizierten mehrere Loci mit Veränderungen der DNA-Methylierung (Abbildung 5e), die größtenteils von geringer Größe waren (Median der Veränderung betrug 10,4 % nicht gezeigt). Ähnliche Veränderungen der DNA-Methylierung wurden kürzlich nach TET1-Depletion in differenzierten Zellen beobachtet [51]. In unserer Studie waren die Methylierungsniveaus an TET2-gebundenen CpG-Inseln jedoch nach der TET2-Verarmung (weniger als 1 %, Abbildung 5e) weitgehend unbeeinflusst, was darauf hindeutet, dass diese Promotoren keine hohen TET2-Werte benötigen, um den methylierungsfreien Zustand aufrechtzuerhalten, und intrinsisch resistent gegen . sind Methylierung verändert.

Durchdringende Aufrechterhaltung eines methylierungsfreien Zustands an TET2-gebundenen Promotoren. (ein) Die Zunahme der DNA-Methylierung in Primärtumoren war bei den in HCT116-Zellen identifizierten TET2-gebundenen Promotoren bemerkenswert gering (P <0,0001, Binomialtest). (B) Western Blot für TET2 und Beta-TUBULIN aus Ganzzellextrakten von HCT116-Zellen, die stabil mit einer nicht-zielenden shRNA-Kontrolle (shCtrl.) oder mit shRNA auf TET2 (TET2C) oder auf TET2 und TET3 (TET2 + 3) transfiziert wurden. Die Faltungsänderung im Knockdown wurde relativ zur shCtrl berechnet. (C) qRT-PCR für TET2 und TET3. (D) Globale Werte von 5hmC und 5mC durch LCMS. (e) DNA-Methylierungsänderungen durch Infinium-Arrays nach Abreicherung von TET2.

Überlebensergebnisse, die aus öffentlich zugänglichen Datensätzen zum Dickdarmkrebs geschätzt wurden [52,53] weisen weiter darauf hin, dass TET2 Expressionsspiegel sind nicht signifikant mit dem Überleben der Patienten verbunden, was mit dem kleinen Effekt übereinstimmt, den wir in diesen sehen in vitro TET2-Studien. TET2 scheint daher eine moderate Rolle bei der Kontrolle von Cytosin-Modifikationen während der Darmtumorogenese zu spielen.

Promotoren mit hohen 5hmC-Spiegeln im normalen Dickdarm überlappen mit bivalent markierten Promotoren in humanen embryonalen Stammzellen, die bei Dickdarmkrebs nicht methyliert werden

Wenn Tumoren aus Darmzellen in der Krypta entstehen und 5hmC ein Zeichen für terminal differenzierte Zellen ist, wie erklären wir dann die Resistenz von 5hmC-Promotoren gegenüber dem Methylierungsgewinn in Tumoren, bevor sie sich 5hmC in normalem Gewebe anreichern? Die TET2-Erschöpfung hat nur einen mäßigen Einfluss auf die DNA-Methylierung in Krebszellen, was darauf hindeutet, dass der Schutzmechanismus wahrscheinlich nicht auf eine kontinuierliche TET2-Bindung an Zielpromotoren zurückzuführen ist. Obwohl TET2 möglicherweise nicht an der Aufrechterhaltung des unmethylierten Zustands seiner Zielpromotoren beteiligt ist, können wir nicht ausschließen, dass andere Proteine ​​innerhalb eines TET-Komplexes beteiligt sind. Es kann jedoch alternative Erklärungen geben, von denen eine darin besteht, dass 5hmC-Promotoren während der frühen Entwicklung epigenetisch markiert sind, was es ihnen an sich unwahrscheinlich macht, dass sie im Soma Eigenschaften wie H3K27me3 entwickeln, die für eine Zunahme der DNA-Methylierung prädisponieren.

Präzedenzfälle für eine frühe epigenetische Markierung sind das genomische Imprinting und die X-Inaktivierung, aber auch der kürzlich beschriebene instruktive Prozess zur Gewinnung der Methylierung bei Krebs, der an Promotoren mit Histon H3K4- und H3K27-Trimethylierung (sogenannten bivalenten Promotoren) in menschlichen Embryonen auftritt Stammzellen (hESC) [54-58]. ESCs weisen im Gegensatz zu den meisten anderen proliferierenden Zellen bereits hohe 5hmC-Spiegel auf. In Maus-ESCs findet sich Tet1 entweder am TSS bivalenter Promotoren zusammen mit Silencing-Komplexen unabhängig von 5hmC oder stromabwärts des TSS zusammen mit 5hmC und dem PRC2-Komplex [59,60]. In humanen ESC wurde 5hmC mehr an aktiven Genpromotoren und Enhancern gefunden als an balancierten (bivalenten) Enhancern [61].

Ein Vergleich unseres Datensatzes von 5hmC-markierten Promotoren mit einem veröffentlichten Datensatz von bivalenten hESC-Promotoren [57] bestätigte, dass etwa 65 % der Promotoren, die in unserer Dickdarmkrebs-Kohorte methyliert werden, auch in hESC bivalent markiert sind (Abbildung 6a und b). Folglich untersuchten wir auch das Ausmaß, in dem Promotoren, die durch 5hmC im normalen Dickdarm markiert sind, mit bivalent markierten Promotoren in hESCs überlappen. Wir fanden heraus, dass 30 % aller 5hmC-Promotoren mit bivalenten Genen in hESCs überlappten (Abbildung 6a und b). Interessanterweise fielen diese meist mit bivalenten Promotoren zusammen, die bei Darmkrebs nicht hypermethyliert werden. Diese Beobachtung weist darauf hin, dass bivalente Promotoren grob in diskrete instruktive Kategorien unterteilt werden können: eine für die Stilllegung nach Gewebedifferenzierung und anfällig für Methylierungsgewinn bei Krebs und eine andere für die ausgeglichene Aktivierung und Akquisition von 5hmC mit Resistenz gegen Methylierungsgewinn bei Krebs. Wenn 5hmC als Endpunkt der instruktiven Aktivierung erfasst wird, würde dies mit unseren Daten übereinstimmen, wo wir sehen, dass sich 5hmC in terminal differenzierten Zellen an Genen ansammelt, die sowohl in Krebs als auch in normalem Gewebe aktiv sind.

5hmC-markierte Promotoren unterliegen keinem durch Histon-Bivalenz vermittelten Methylierungsgewinn. Venn-Diagramme zur Veranschaulichung einer hohen Inzidenz von Promotor-Methylierungsgewinnen in unserer Kohorte bei Promotoren mit H3K4me3/K27me3-Bivalenz in humanen embryonalen Stammzellen (hESCbiv). Die Inzidenz einer Methylierungszunahme ist bei hESCbiv-Promotoren, die durch 5hmC im normalen Dickdarm gekennzeichnet sind, gering. (ein) Für schmale und (B) breite 5hmC-Promotoren.


Pankreas

Darmdrüsen

Diese werden durch Modifikation des Oberflächenepithels des Dünndarms gebildet. Die beiden wichtigsten Darmdrüsen sind Brunner-Drüse und Krypten von Lieberkühn.

  1. Brunner-Drüsen finden sich nur in den ersten Zentimetern des Zwölffingerdarms. Sie sezernieren große Mengen alkalischen Schleims, um die Zwölffingerdarmwand vor stark saurem Magensaft zu schützen und Salzsäure zu neutralisieren.
  2. Krypta des Lieberkühns sind kleine Gruben, die sich über die gesamte Oberfläche des Dünndarms befinden und zwischen den Darmzotten liegen. Sie sind von Epithel bedeckt, das aus zwei Zelltypen besteht. 1) Becherzellen: Schleim absondern. 2) Enterozyten: Wasser und Elektrolyt absondern, auch Wasser und Elektrolyt zusammen mit dem Endprodukt der Verdauung über die Oberfläche benachbarter Zotten reabsorbieren. An der Basis dieser Krypten, panethZellen und argentaffine Zellen sind anwesend. Paneth-Zellen, die hauptsächlich im Duodenum vorkommen, sind reich an Zink und enthalten azidophile Granula. Argentafin-Zellen synthetisieren das Hormon Sekretin und 5-Hydroxytryptamin.

EnzymSubstratAktionsort
Ptyalin (Speichelamylase) Stärke Mund
Pepsin
Magenlipase
Renin
Proteine
Wenig Fett
Kasein
Magen
Bauch des Kindes
Pankreas-Amylase
Trypsin
Chymotrypsin
Elastase
Carboxypeptidase
Pankreaslipase
Nuklease
Enterokinase
Aminopeptidase
Dipeptidase
Disaccharidase
Darmlipase
Nukleotidase
Nukleosidase
Stärke
Proteine
Proteine
Eiweiß (Elastin)
Große Peptide
Fette (Triglyceride)
Nukleinsäuren (DNA, RNA)
Trypsinogen
Große Peptide
Dipeptide
Disaccharid
Fette
Nukleotid
Nukleosid
Dünndarm


Informationen zum Autor

Mitgliedschaften

Medizinische Abteilung, Dienst für Infektionskrankheiten, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, 10065, New York, USA

Charlie G. Buffie, Peter T. McKenney, Melissa Kinnebrew, Ying Taur und Eric G. Pamer

Lucille Castori Center for Microben, Inflammation and Cancer, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, 10065, New York, USA

Charlie G. Buffie, Peter T. McKenney, Lilan Ling, Asia Gobourne, Daniel No, Melissa Kinnebrew, Eric Littmann, Ying Taur, Nora C. Toussaint, Joao B. Xavier und Eric G. Pamer

Computational Biology Program, Sloan-Kettering Institute, New York, 10065, New York, USA

Vanni Bucci, Richard R. Stein, Chris Sander, Nora C. Toussaint & Joao B. Xavier

Department of Biology, University of Massachusetts Dartmouth, North Dartmouth, 02747, Massachusetts, USA

Donald B. und Catherine C. Marron Cancer Metabolism Center, Sloan-Kettering Institute, New York, 10065, New York, USA

Genomics Core Laboratory, Sloan-Kettering Institute, New York, 10065, New York, USA

Medizinische Klinik, Knochenmarktransplantationsdienst, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, 10065, New York, USA

Marcel R. M. van den Brink & Robert R. Jenq

Immunologieprogramm, Sloan-Kettering Institute, New York, 10065, New York, USA

Marcel R. M. van den Brink & Eric G. Pamer

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Beiträge

C.G.B. und E.G.P. designed the experiments and wrote the manuscript with input from co-authors. C.G.B. performed animal experiments and most analyses. V.B., R.R.S., J.B.X., C.S. and C.G.B. performed microbiota time-series inference modelling and analysis. P.T.M. and C.G.B designed and performed Ex-vivo Experimente. L.L., A.G., A.V. D.N. and M.K. performed 16S amplicon quantification and multiparallel sequencing (454, MiSeq) and contributed to data analysis. M.R.M.v.d.B., R.R.J., Y.T., E.L., C.G.B. and E.G.P. assessed clinical parameters and supervised patient cohort analysis. N.C.T. and C.G.B. performed metagenomic shotgun sequencing analysis. J.R.C. and H.L. developed the metabolomics analysis platform and performed quantification of bile acid species.

Korrespondierender Autor


Immunohistochemistry and Colon Cancer

Immunohistochemical applications surrounding colon cancer are seen at several levels such as: characterization of the tumor (endocrine or epithelial type), hereditary disposition, and for prognostic purposes (MSI testing). MSI testing has been discussed previously and thus will not be discussed, in detail, here other than to say that the Bethesda protocol is rapidly gaining acceptance regarding this testing. The more prevalent use of IHC is in the presence of possible or suspected metastatic disease in which the colon is a possible primary. The common locations for metastases from colon cancers are the liver and lung both organs of which can produce cancer morphology essentially identical to metastases from the colon.


Scientists uncover how high-fat diet drives colorectal cancer growth

As cancer death rates drop overall, doctors have noted a frightening anomaly: deaths from colorectal cancer in people under 55 appear to be creeping up. According to the American Cancer Society, deaths in this younger group increased by 1 percent between 2007 and 2016.

A new study led by Salk Institute scientists suggests that high-fat diets fuel colorectal cancer growth by upsetting the balance of bile acids in the intestine and triggering a hormonal signal that lets potentially cancerous cells thrive. The findings, which appeared in Zelle on February 21, 2019, could explain why colorectal cancer, which can take decades to develop, is being seen in younger people growing up at a time when higher-fat diets are common.

"This study provides a new way to lower inflammation, restore intestinal health and to dramatically reduced tumor progression," says Professor Ronald Evans, director of the Gene Expression Laboratory, Howard Hughes Medical Institute investigator and holder of Salk's March of Dimes Chair in Molecular and Developmental Biology.

The research, conducted in a mouse model, suggests how lifestyle and genetics converge. The researchers found that animals with an APC mutation, the most common genetic mutation found in humans with colorectal cancer, developed cancer faster when fed a high-fat diet.

"It could be that when you're genetically prone to get colon cancer, something like a high-fat diet is the second hit," says study co-author Ruth Yu, a staff researcher in the Gene Expression Laboratory at Salk.

The intestine and colon (commonly lumped together as the "gut") are hard-working organs. As you eat, your gut needs to constantly regenerate its lining to undo the damage done by digestive acids. To do this, the gut houses a population of stem cells that can replenish lining cells when needed.

Scientists have found that colorectal cancers often originate from mutations in these stem cells. The most common colorectal cancer-linked mutation is in a gene called APC, which normally acts as a "tumor suppressor" gene because it controls how often cells divide. Mutations in the APC gene can remove that control and allow cells to divide rapidly and become cancerous.

Over the last four decades, Evans and his colleagues have investigated the roles of bile acids. (30 types of bile acids float around in the gut to help digest food and absorb cholesterol, fats and fat-soluble nutrients.) Among the lab's discoveries was the revelation that bile acids send hormonal signals to intestinal stem cells through a protein called the Farnesoid X receptor (FXR). For the new study, the researchers uncovered how high-fat diets affect that hormonal signaling.

Study first author Ting Fu, a postdoctoral fellow at Salk, began by following a clue in a mouse model with an APC mutation. These mice develop early signs of colorectal cancer, so she decided to monitor bile acid levels in the mice at the same time. She discovered that types of bile acids known to interact with FXR increased at the same time as cancer initiation -- and that the presence of additional bile acids accelerated cancer progression.

"We saw a very dramatic increase in cancer growth correlated to bile acid," says Michael Downes, a senior staff scientist at Salk and co-corresponding author of the study. "Our experiments showed that maintaining a balance of bile acids is key to reducing cancer growth."

The researchers showed that feeding these mice a high-fat diet was like adding fuel to a fire: high-fat diets increased levels of two specific bile acids that dampen the activity of FXR. The gut wants to repair itself, and FXR keeps the process slow, steady and safe. When bile acids inhibit FXR, a group of stem cells starts growing rapidly and accumulating DNA damage.

"We knew that high-fat diets and bile acids were both risk factors for cancer, but we weren't expecting to find they were both affecting FXR in intestinal stem cells," says Annette Atkins, a staff researcher at Salk and co-author of the study.

The mice with APC mutations developed benign growths called adenomas. In humans, adenomas are common in the intestine and are routinely removed during colonoscopies. These growths normally take decades to turn into malignant adenocarcinomas. Yet the adenomas in these mice quickly turned cancerous when given high-fat diets.

At last, the researchers had found a possible cellular mechanism to explain the rise in colorectal cancer deaths in younger people. Their theory is that as high-fat diets have become more common in the United States, more people with an APC mutation are accelerating their cancer growth through these diets.

Next, the researchers decided to test a new cancer-fighting weapon. They used a molecule called FexD, developed at Salk, to activate FXR in intestinal stem cells. FexD appeared to counteract the damage done by unbalanced bile acids in both mouse organ models and human colon cancer cell lines.

While more experiments need to be done before FexD is tested in humans, the team says the drug candidate has some promising qualities: it can reach the colon and it only acts on FXR, so it should produce fewer side effects than other drugs.

"While colon cancer is considered 'incurable,' Ting's work opens up an entirely new frontier in the understanding and treatment of the disease," says Evans.


Gastrointestinal Microbiology in the Normal Host

Molecular Studies of the Microflora of the Colon

Molecular studies of colonic flora give a better picture of the true flora than cultural studies. Molecular identification of isolates also gives greater accuracy and speed than phenotypic identification. Both types of studies, used together, give more accurate identification of certain taxa and studies of additional genes (beyond 16S rDNA) are needed for certain organisms (viz., streptococci and staphylococci). Various molecular approaches to the study of the colonic microflora have been used. Included are denaturing gradient gel electrophoresis and temperature gradient gel electrophoresis when these approaches are combined with cloning and sequencing, the results are improved. Group-specific primers have been used for detection and identification of predominant groups of bacteria in feces. This approach, combined with FISH, is effective but only small portions of the total bacteria have been detected in some fecal samples in some studies. The study of emergent bowel resection, mentioned above in the section on ileal flora, found that there were no significant differences in overall numbers of bacteria in different parts of the colon. Real-time PCR showed that bifidobacteria counts were significantly higher in the large bowel than in the terminal ileum, Eubacterium rectale und F. prausnitzii were dominant in the ascending and descending colons, and lactobacilli were more prominent in the distal large bowel. Benno’s group has had good results with T-RFLP studies of bowel flora, using a data base that they have developed for this purpose. The use of group-specific probes with real-time PCR is a very good technique which provides a good snapshot of the bowel flora with quantitation if one uses an extensive set of appropriate primer-probes. This approach has been used to compare the microbiota of different groups of individuals such as infants and elderly people with the general population. Detection limits with real-time PCR are as low as 10 1 or fewer organisms of a particular phylotype per sample. With the newly available real-time PCR equipment, extremely high throughput is now available included are trays with 384 wells so that if one develops all the appropriate primer-probes, it is now feasible to study a large number of individual genera and/or species rather than groups or clusters of organisms. DNA microarray analysis cannot be used effectively by most smaller laboratories unless reliable commercially available kits are available but one study showed good results with a microarray of 40 species commonly encountered in the gut. A problem with several of these techniques such as FISH, real-time PCR, and microarrays is that one can only find the organisms or groups that one has specific primer-probes for and there is still a considerable portion of the bowel flora that remains uncharacterized.

A tedious and time-consuming study of clone libraries, and one not suitable for high throughput at this time, is nonetheless an excellent procedure for detailed analysis of colonic or other diverse and complicated microfloras. Newly available pyrosequencing machines, when fully developed, will greatly assist in this type of analysis. The clone library approach has been used effectively by a number of investigators and has provided outstanding data from the study of small numbers of individuals. For this procedure, DNA is recovered from the sample to be studied, it is enriched and amplified for the 16S rDNA using broad-range primers, and then the PCR products are cloned into Escherichia coli by established procedures. The 16S rDNA nucleotide sequences of the clone inserts are determined by cycle sequencing and trimmed to remove vector sequence, chimeras, and sequences of poor quality. Sequences are grouped into phylotypes so that the least similar pair within the phylotype has 99% similarity (some use 98% as the cutoff). In an elegant study of the diversity of the human intestinal flora, both fecal samples and mucosal biopsies from six different colonic sites were obtained from three healthy adults. In all, these workers performed phylogenetic analyses on a total of 11 831 bacterial and 1524 archaeal near-full-length 16S rDNA sequences ( Figures 2 und 3 ). From this, they identified 395 bacterial phylotypes and a single archaeal phylotype (Methanobrevibacter smithii). Most of the bacteria were members of the Firmen und Bakteroidetäten phyla. Innerhalb des Firmen phylum, there were 301 phylotypes, 191 of which were novel 95% of the Firmen sequences were members of the class Clostridien. Known butyrate-producing bacteria represented 2454 sequences and 42 phylotypes, all belonging to clostridial clusters IV, XIVa, and XVI. There were 65 Bakteroidetäten phylotypes, with large variations between the three study subjects. Bacteroides thetaiotaomicron was present in all three individuals. Relatively few sequences were associated with the Proteobacteria, Actinobacteria, Fusobacteria, und Verrukomikrobien phyla. Both the observed and estimated richness of the flora increased in parallel fashion with additional sampling the authors estimate that one unique phylotype would be expected for every 100 additional clones sequenced ( Figur 4 ). There was relatively little variability between the six mucosal sites studied. The greatest amount of variability overall was related to differences between the three subjects whose specimens were analyzed ( Abbildung 5 ) with the next greatest variability related to differences between feces and mucosal analyses. Overall, a majority of the bacterial sequences encountered belonged to uncultivated species and novel bacteria. The authors of this study point out that the limited sensitivity of broad-range PCR may hinder detection of rare phylotypes and that their methods did not distinguish between living and dead microorganisms. Studies by various groups proceeded beyond the above approach to analyze the metagenomics (metabolic function analysis) of the bowel flora.

Figure 2 . Phylogenetic tree based on the combined human intestinal 16S rDNA sequence data set. The label for each clade includes, in order, the total number of recovered sequences, phylotypes, and novel phylotypes (in parentheses). The angle where each triangle joins the tree represents the relative abundance of sequences, and the lengths of the two adjacent sides indicate the range of branching depths within that clade. Six of the seven phyla represented by sequences recovered in this study are shown in red the unclassified clade near cyanobacteria is not pictured in the inset. Reproduced with permission from Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, et al. (2005) Diversity of the human intestinal microbial flora. Wissenschaft 308: 1635–1638.

Figure 3 . Relative abundance of sequences from stool and pooled mucosal samples per subject. The sequence frequencies are grouped according to phylum, colored according to Figur 2 . ‘Other’ represents the fusobacteria, actinobacteria, and unclassified near cyanobacteria phyla, each containing less than 0.2% of the total sequences. ‘M’ denotes pooled mucosal sequences per subject and ‘S’ refers to stool sample. Reproduced with permission from Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, et al. (2005) Diversity of the human intestinal microbial flora. Wissenschaft 308: 1635–1638.

Figur 4 . Individual-based rarefaction curves for combined sequences at multiple operational taxonomic unit (OTU) cutoff levels. The slopes of the curves decrease as the OTU definitions relax toward 95%. The curves seem to plateau at OTU cutoffs 90% for example, at the 90% cutoff, the last 430 clones sampled do not change the final richness value of 90 phylotypes. Every clone sampled has been seen more than once at the 83% OTU cutoff. The total numbers of OTUs per definition are listed in the inset, as calculated by dissimilarity matrices and DOTUR. Reproduced with permission from Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, et al. (2005) Diversity of the human intestinal microbial flora. Wissenschaft 308: 1635–1638.

Abbildung 5. Individual-based rarefaction curves for sequences from each anatomic site per subject. Phylotypes were defined using the 99% operational taxonomic unit (OTU) cutoff. Reproduced with permission from Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, et al. (2005) Diversity of the human intestinal microbial flora. Wissenschaft 308: 1635–1638.

One group recently proposed a novel approach for comparing 16S rRNA gene clone libraries that is independent of both DNA sequence alignment and definition of bacterial phylogroups they used direct comparisons of microbial communities from the human GI tract in an absolute evolutionary coordinate space.


Best Foods for Colon Cancer Prevention

A low-fiber diet is a key driver of microbiome depletion, the disappearance of diversity in our good gut flora.

Transkript

Below is an approximation of this video’s audio content. To see any graphs, charts, graphics, images, and quotes to which Dr. Greger may be referring, watch the above video.

We have � trillion micro-organisms” residing in our gut, give or take a few trillion, but “the spread of the Western lifestyle has been accompanied by microbial changes,” which may be contributing to our epidemics of chronic disease. The problem is that we’re eating these meat-sweet diets, characterized by “a high intake of animal products and sugars, [processed foods], and a low intake of [whole plant foods].”

Contrary to the fermentation of the carbohydrates that make it down to our colon—the fiber and resistant starch that benefit us “through the generation of [these magical] short-chain fatty acids” like butyrate—”microbial protein fermentation [when excess protein is consumed…that] generates potentially toxic and pro-carcinogenic metabolites involved in [colorectal cancer].” And so, what we eat can cause an imbalance in our gut microbiome, and potentially create “a ‘recipe’ for colorectal cancer,” where a high-fat, high-meat, high-processed food diet tips the scale towards dysbiosis and colorectal cancer, whereas a high-fiber and -starch, lower-meat diet can pull you back into symbiosis with your friendly flora, and away from cancer.

We now have evidence from interventional studies suggesting that “adopting a plant-based, minimally processed high-fiber diet may rapidly reverse the effects of meat-based diets on the gut microbiome.” So, what may be “a new form of personalised…microbiome…medicine for chronic disease”? It’s called food, which can “rapidly and reproducibly alter…the human gut microbiome.” Switch people between a whole food plant-based diet and more of an animal food-based diet, and you can see dramatic shifts within two days, which can result in toxic metabolites. Switch people to an animal food-based diet, and levels of deoxycholic acid go up, which is “a secondary bile acid known to promote DNA damage” and liver cancers. Why do levels go up? Because the bad bacteria producing the stuff triple—in just two days.

And, over time, the richness of the microbial diversity in our gut is disappearing. Here’s our bacterial tree of life that’s getting depleted. Warum passiert dies? The “fiber gap.” “A low-fiber diet is a key driver of microbiome depletion.” Yeah, there’s antibiotics, and Caesarean sections, and indoor plumbing, but “the only factor that has been empirically demonstrated to be important is a diet low in…MACs’ (not Big Macs), “microbiota-accessible carbohydrates,” which is just a fancy name for fiber found in a whole plant foods and resistant starch, found mostly in beans, peas, lentils, and whole grains.

Our “intake of dietary fiber,” our intake of whole plant foods, “is negligibly low in the Western world” when compared to what we evolved to eat over millions of years. “Such a low-fiber diet provides insufficient nutrients for [our] gut microbes, leading not only to the loss of [bacterial diversity and richness], but also to a reduction in the production of [those beneficial] fermentation end products…” that they make with the fiber. We are, in effect, “starving our microbial self.”

What are we going to do about “the deleterious consequences of a diet deficient in” whole plant foods? Create new-fangled “functional foods,” of course, and supplements, and drugs—prebiotics, probiotics, synbiotics. Think how much money there is to be made! Or, we could just eat the way our bodies were meant to eat. What kind of value is that going to get your Aktionäre, though? Don’t you know probiotic pills may be “the next big source” of Big Pharma billions?

Why eat healthy though, when you can just have someone else eat healthy for you, and then get a fecal transplant from a vegan! Researchers compared the microbiomes of vegans versus omnivores, and found the vegan’s friendly flora were churning out more of the good stuff, showing that a plant-based diet may result in more beneficial metabolites in the bloodstream and less of the bad stuff like TMAO. But while the impact of a vegan diet on what the bacteria were making was “large,” the “effect on the composition of the gut microbiome [was] surprisingly modest.” They “only [found] slight differences between the gut microbiomes of omnivores [versus] vegans”? That was a shocker to the researchers this “very modest difference…juxtaposed against the significantly enhanced dietary consumption of fermentable plant-based foods.” The vegans were eating nearly twice the fiber. Anyone see the problem here? The vegans just barely made the Minimum daily intake of fiber. Wieso den? Because Oreos are vegan, Cocoa Pebbles are vegan, french fries, Coke, potato chips there are vegan Doritos and Pop-Tarts. You can eat a abscheulich vegan diet.

Burkitt showed that you need to get at least 50 grams a day (of fiber) for colon cancer prevention. And that’s only half of what our bodies were entworfen to get. We evolved getting about 100 grams a day. And that’s what you see in modern populations that are immune to epidemic colorectal cancer. So, what if instead of feeding people a vegan diet, you just fed people that kind of diet, a diet centered around whole plant foods? We’ll find out, next.

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Quellen

  • Gagnière J, Raisch J, Veziant J, et al. Gut microbiota imbalance and colorectal cancer. World J Gastroenterol. 201622(2):501-18.
  • Derrien M, Veiga P. Rethinking Diet to Aid Human-Microbe Symbiosis. Trends Mikrobiol. 201725(2):100-112.
  • Vipperla K, O'keefe SJ. Diet, microbiota, and dysbiosis: a 'recipe' for colorectal cancer. Food Funct. 20167(4):1731-40.
  • Pallister T, Spector TD. Food: a new form of personalised (gut microbiome) medicine for chronic diseases?. J R Soc Med. 2016109(9):331-6.
  • David LA, Maurice CF, Carmody RN, et al. Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Natur. 2014505(7484):559-63.
  • Segata N. Gut Microbiome: Westernization and the Disappearance of Intestinal Diversity. Curr Biol. 201525(14):R611-3.
  • O'Keefe SJ, Li JV, Lahti L, et al. Fat, fibre and cancer risk in African Americans and rural Africans. Nat. Komm. 20156:6342.
  • Deehan EC, Walter J. The Fiber Gap and the Disappearing Gut Microbiome: Implications for Human Nutrition. Trends Endocrinol Metab. 201627(5):239-242.
  • Sonnenburg ED, Sonnenburg JL. Starving our microbial self: the deleterious consequences of a diet deficient in microbiota-accessible carbohydrates. Zellmetab. 201420(5):779-786.
  • Arkan MC. The intricate connection between diet, microbiota, and cancer: A jigsaw puzzle. Semin Immunol. 201732:35-42.
  • Wu GD, Compher C, Chen EZ, et al. Comparative metabolomics in vegans and omnivores reveal constraints on diet-dependent gut microbiota metabolite production. Gut. 201665(1):63-72.
  • Jew S, Abumweis SS, Jones PJ. Evolution of the human diet: linking our ancestral diet to modern functional foods as a means of chronic disease prevention. J Med Food. 200912(5):925-34.

Danksagung

Image credit: Kristina DeMuth. Image has been modified.

Topics

Below is an approximation of this video’s audio content. To see any graphs, charts, graphics, images, and quotes to which Dr. Greger may be referring, watch the above video.

We have � trillion micro-organisms” residing in our gut, give or take a few trillion, but “the spread of the Western lifestyle has been accompanied by microbial changes,” which may be contributing to our epidemics of chronic disease. The problem is that we’re eating these meat-sweet diets, characterized by “a high intake of animal products and sugars, [processed foods], and a low intake of [whole plant foods].”

Contrary to the fermentation of the carbohydrates that make it down to our colon—the fiber and resistant starch that benefit us “through the generation of [these magical] short-chain fatty acids” like butyrate—”microbial protein fermentation [when excess protein is consumed…that] generates potentially toxic and pro-carcinogenic metabolites involved in [colorectal cancer].” And so, what we eat can cause an imbalance in our gut microbiome, and potentially create “a ‘recipe’ for colorectal cancer,” where a high-fat, high-meat, high-processed food diet tips the scale towards dysbiosis and colorectal cancer, whereas a high-fiber and -starch, lower-meat diet can pull you back into symbiosis with your friendly flora, and away from cancer.

We now have evidence from interventional studies suggesting that “adopting a plant-based, minimally processed high-fiber diet may rapidly reverse the effects of meat-based diets on the gut microbiome.” So, what may be “a new form of personalised…microbiome…medicine for chronic disease”? It’s called food, which can “rapidly and reproducibly alter…the human gut microbiome.” Switch people between a whole food plant-based diet and more of an animal food-based diet, and you can see dramatic shifts within two days, which can result in toxic metabolites. Switch people to an animal food-based diet, and levels of deoxycholic acid go up, which is “a secondary bile acid known to promote DNA damage” and liver cancers. Why do levels go up? Because the bad bacteria producing the stuff triple—in just two days.

And, over time, the richness of the microbial diversity in our gut is disappearing. Here’s our bacterial tree of life that’s getting depleted. Warum passiert dies? The “fiber gap.” “A low-fiber diet is a key driver of microbiome depletion.” Yeah, there’s antibiotics, and Caesarean sections, and indoor plumbing, but “the only factor that has been empirically demonstrated to be important is a diet low in…MACs’ (not Big Macs), “microbiota-accessible carbohydrates,” which is just a fancy name for fiber found in a whole plant foods and resistant starch, found mostly in beans, peas, lentils, and whole grains.

Our “intake of dietary fiber,” our intake of whole plant foods, “is negligibly low in the Western world” when compared to what we evolved to eat over millions of years. “Such a low-fiber diet provides insufficient nutrients for [our] gut microbes, leading not only to the loss of [bacterial diversity and richness], but also to a reduction in the production of [those beneficial] fermentation end products…” that they make with the fiber. We are, in effect, “starving our microbial self.”

What are we going to do about “the deleterious consequences of a diet deficient in” whole plant foods? Create new-fangled “functional foods,” of course, and supplements, and drugs—prebiotics, probiotics, synbiotics. Think how much money there is to be made! Or, we could just eat the way our bodies were meant to eat. What kind of value is that going to get your Aktionäre, though? Don’t you know probiotic pills may be “the next big source” of Big Pharma billions?

Why eat healthy though, when you can just have someone else eat healthy for you, and then get a fecal transplant from a vegan! Researchers compared the microbiomes of vegans versus omnivores, and found the vegan’s friendly flora were churning out more of the good stuff, showing that a plant-based diet may result in more beneficial metabolites in the bloodstream and less of the bad stuff like TMAO. But while the impact of a vegan diet on what the bacteria were making was “large,” the “effect on the composition of the gut microbiome [was] surprisingly modest.” They “only [found] slight differences between the gut microbiomes of omnivores [versus] vegans”? That was a shocker to the researchers this “very modest difference…juxtaposed against the significantly enhanced dietary consumption of fermentable plant-based foods.” The vegans were eating nearly twice the fiber. Anyone see the problem here? The vegans just barely made the Minimum daily intake of fiber. Wieso den? Because Oreos are vegan, Cocoa Pebbles are vegan, french fries, Coke, potato chips there are vegan Doritos and Pop-Tarts. You can eat a abscheulich vegan diet.

Burkitt showed that you need to get at least 50 grams a day (of fiber) for colon cancer prevention. And that’s only half of what our bodies were entworfen to get. We evolved getting about 100 grams a day. And that’s what you see in modern populations that are immune to epidemic colorectal cancer. So, what if instead of feeding people a vegan diet, you just fed people that kind of diet, a diet centered around whole plant foods? We’ll find out, next.


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